RU2794991C1 - Способ прогнозирования развития детского ожирения в Республике Башкортостан - Google Patents
Способ прогнозирования развития детского ожирения в Республике Башкортостан Download PDFInfo
- Publication number
- RU2794991C1 RU2794991C1 RU2022115163A RU2022115163A RU2794991C1 RU 2794991 C1 RU2794991 C1 RU 2794991C1 RU 2022115163 A RU2022115163 A RU 2022115163A RU 2022115163 A RU2022115163 A RU 2022115163A RU 2794991 C1 RU2794991 C1 RU 2794991C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- obesity
- locus
- risk
- gabra2
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 208000007683 Pediatric Obesity Diseases 0.000 title description 16
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 101150099997 GABRA2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101150045355 akt1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101000893333 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 108010045717 Proto-Oncogene Proteins c-akt Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000005765 Proto-Oncogene Proteins c-akt Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 6
- 102000017695 GABRA2 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 101000779418 Homo sapiens RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 13
- 102100033810 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 6
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 5
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 4
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 4
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 3
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 208000030814 Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000019454 Feeding and Eating disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101150104779 HTR2A gene Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101150023417 PPARG gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000003641 Yates's correction for continuity Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 208000003770 biliary dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 235000014632 disordered eating Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000009862 primary prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования развития ожирения у детей, проживающих в Республике Башкортостан. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК. Проводят амплификацию локуса rs3803300 гена протеинкиназы 1 AKT1 и локуса rs279845 гена рецептора гамма-аминомасляной кислоты GABRA2. При выявлении генотипов AG или AA полиморфного локуса rs3803300 гена AKT1 и генотипов АТ или АА полиморфного локуса rs279845 гена GABRA2 прогнозируют риск развития ожирения у ребенка. Способ обеспечивает повышение точности прогноза за счет выявления факторов предрасположенности к развитию заболевания. 2 табл., 5 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования развития ожирения в детском возрасте в Республике Башкортостан.
В настоящее время наблюдается рост детского ожирения во всем мире и в России [Бочарова О.В., Теплякова Е.Д. Ожирение у детей и подростков - проблема здравоохранения XXI века. Казанский мед. ж. 2020. Том 101, №3. С. 381-388]. К причинам детского ожирения относят нарушение пищевого поведения, заболевания, прием лекарственных средств, гиподинамия, наследственная предрасположенность. Наличие детского ожирения обуславливает риск метаболического синдрома, сахарного диабета 2, инсулинорезистентности [Петеркова В.А., Васюкова О.В. К вопросу о новой классификации ожирения у детей и подростков // Проблемы эндокринологии. 2015. Том 61, №2. С. 39 44]. По данным ВОЗ 50% детей с избыточным весом в детском возрасте страдают ожирением во взрослом, а в подростковом - эта вероятность увеличивается до 80% [Саидова Л.Б., Бадритдинова М.Н., Раупов А.А. Эпидемиология и состояние выявляемости ряда экстрагенитальных заболеваний, метаболического синдрома среди женщин фертильного возраста (обзор литературы) // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. 2018. №6. С. 131-141].
Известен способ оценки индивидуального риска формирования избыточной массы тела и ожирения у детей, потребляющих питьевую воду с повышенным содержанием хлороформа и тетрахлорметана, характеризующийся тем, что осуществляют отбор пробы крови, определение в ней концентрации хлороформа и тетрахлорметана, определение уровней общего холестерина и липопротеида низкой плотности (ЛПНП). Проводят анамнестическое обследование ребенка по трехбалльной шкале и генотипирование. Риск формирования у ребенка избыточной массы тела прогнозируют в случае повышения уровня общего холестерина выше 3,9 ммоль/л и уровня ЛПНП выше 1,8 ммоль/л, наличия у ребенка 6 и более баллов при анамнестическом обследовании, наличия гетерозиготного генотипа гена HTR2A rs7997012, повышения концентрации тетрахлорметана в крови выше референтной и концентрации хлороформа в пределах 5,17-5,59 мкг/л. Риск формирования ожирения прогнозируют при концентрации хлороформа равной или более 5,79 мкг/л [Патент RU 2619872, 2017]. Недостатком способа является то, что он может быть использован только в группе детей, употребляющих воду с повышенным содержанием хлороформа и тетрахлорметана.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ прогнозирования риска развития ожирения в детском возрасте, заключающийся в том, что проводят определение факторов риска и расчет по формуле. Из анамнеза выявляют такие факторы риска как отягощенная наследственность по артериальной гипертензии, отягощенная наследственность по ожирению, отягощенная наследственность по обменным нарушениям - ожирение и сахарный диабет у лиц I, II степени родства, патологическое течение беременности - преэклампсия, неполная семья, низкая физическая активность, носительство изоформы Е4 гена АРОЕ, носительство G-аллеля гена PPARG. Выясняют длительность исключительно грудного вскармливания. Риск развития ожирения определяют по формуле [Патент RU №2696446, 2019]. Недостатками метода являются трудоемкость ввиду сбора множественной информации об обследуемом лице, а также невысокая точность, поскольку не всегда возможно оценить наследственную отягощенность по всем перечисленным признакам.
Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа прогнозирования развития ожирения в детском возрасте, позволяющего в количественном отношении оценить риск возникновения данного заболевания у детей, проживающих в Республике Башкортостан.
Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогноза.
Самым эффективным в предотвращении взрывного роста детского ожирения являются профилактические мероприятия. Под первичной профилактикой подразумевается выявление групп повышенного риска по ожирению среди детей с использованием данных о молекулярно-генетических биомаркерах чувствительности. Применение на практике разработанного способа обеспечит выявление детей с высоким риском развития ожирения.
Предлагаемый способ прогнозирования риска развития детского ожирения в Республике Башкортостан осуществляется следующим образом.
ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0,48% лимонной кислоты, 1,32% цитрата натрия, 1,47%) глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.
Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press. - 1984. - V. 2. -P. 31-34).
1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляют 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl2, 10мМ трисНCl (рН 7,6).
2. Смесь центрифугируют 20 мин. при 4000 об./мин.
3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8,0, суспензируют.
4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.
Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.
1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7,8.
2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин.
3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.
4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.
5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.
6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н20; раствор хранят при -20°С.
В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации локуса rs3803300 гена протеинкиназы 1 AKT1 и локуса rs279845 гена рецептора гамма-аминомасляной кислоты GABRA2. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия ПЦР-анализа полиморфных локусов подбирались с помощью пакета программ DNA Star 5.05 и баз данных http//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp.
Состав реакционной смеси для ПЦР был следующим: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.5 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждо-го дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 10 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 60 mM Tris-HCl, рН 8.5 при 25°С, 1.5 mM MgCl2, 25 mM KCl; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон Х-100. Далее добавляют 5 единиц Taq- ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 5 мин, 95°С - 30 секунд, 60°С -30 секунд, 72°С - 30 секунд. После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 5 минут.
Нуклеотидные замены в положении в промоторном регионе гена AKT1 и интронныйе полиморфный маркер гена GABRA2, выявляют при помощи ПЦР-ПДРФ анализа. Для этого 7 мкл амплификата смешивают с 5 ед. соответствующих эндонуклеаз рестрикции, смесь выдерживают при 37°С в течение 10-12 часов в термостате для рестриктаз Alw26 I и Hinf I. Затем проводят электрофорез в вертикальном 7% полиакриламидном геле. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0.089 М трис HCl рН=7.8; 0.089 М борная кислота, 0.002 М ЭДТА с рН=8.0). Данные о размерах получаемых фрагментов представлены в таблице 1.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с применением программного обеспечения MS Office Excel. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля применялся критерий χ2 для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой Йейтса на непрерывность [http://www.biometrica.tomsk.ru/]. При обнаружении статистически значимых различий (р<0,05) между исследуемыми выборками проводилась оценка показателя отношения шансов (odds ratio, OR), а также границ его 95%-ого доверительного интервала (CI 95%). Наблюдаемое распределение частот аллелей и генотипов по всем исследованным локусам соответствует ожидаемым из уравнения Харди-Вайнберга.
При выявлении генотипов AG или АА полиморфного локуса rs3803300 гена AKT1 и генотипов AT или АА полиморфного локуса rs279845 гена GABRA2 прогнозируют риск развития ожирения у ребенка.
Нами были исследованы образцы ДНК у 263 ребенок с ожирением и 409 детей без ожирения. Средний возраст испытуемых с ожирением составил 6.5 лет, детей в контрольной группе 7.2 лет.
Исследование полиморфных вариантов rs3803300 гена AKT1 и rs279845 гена GABRA2 среди детей с ожирением выявило следующие результаты (табл. 2). В группе детей с ожирением статистически значимо повышена частота генотипов AG-AA rs3803300 гена AKT1 и частота генотипов АТ-АА полиморфного локуса rs279845 гена GABRA2. Повышенный риск детского ожирения ассоциирован с вариантами AG-AA локуса rs3803300 гена AKT1 и АТ-АА локуса rs279845 гена GABRA2.
Для количественной оценки относительного риска развития заболевания для каждого из вышеуказанных генетических маркеров мы вычислили показатель соотношения шансов (oddsratio - OR). Для этого мы использовали формулу, предложенную Бландом [Bland, J.M. The odds ratio / J.M. Bland, D.G. Altaian // Br. Med. J. - 2000. - Vol.320. - P. 1468]: OR=(a×d)/(b×c), где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера (аллеля или генотипа) среди больных; с и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. Повышенный риск развития детского ожирения диагностируются при OR более 1.0.
Приводим пример конкретного расчета. В группе детей с ожирением идентифицировано 53 ребенка с генотипами риска AG-AA по полиморфному локусу rs3803300 гена AKT1, т.е. а=53. У 210 детей с ожирением генотипы риска не идентифицированы, поэтому b=210. В контрольной группе выявлено 55 испытуемых с генотипами AG-AA, следовательно, с=55. В контрольной группе варианты риска отсутствуют у 354 детей, это значит, что d=354. Подставив эти значения в вышеприведенную формулу, получим:
OR=(53×354)/(210×55)=18762/11550=1.62. Следовательно, у лиц, имеющих варианты гомозигот по редкому аллелю и гетерозигот AG-AA, риск развития детского ожирения повышен в 1.62 раз по сравнению с контролем. Вычисленные по результатам исследования показатели OR в дальнейшем используются в ходе разработки генетического паспорта пациента. Полученные в нашем исследовании показатели OR при наличии рисковых генотипов по локусам AKT1 rs3803300 и GABRA2 rs279845 представлены в таблице 2.
Изобретение иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Пациент Р., 16 лет, страдает ожирением с 10 лет. В семье было выявлено наличие факторов риска: мама страдает ожирением III степени. У ребенка было произведен забор биологического материала 4 мл крови. Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 в реакционной смеси, содержащей 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели рестрикцию, а далее электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250- 300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса AKT1 rs3803300 был выявлен генотип АА, при котором показатель соотношения шансов развития ожирения составляет 3.37 (табл. 2). По локусу GABRA2 rs279845 также был выявлен генотип риска АА в этом случае вероятность развития ожирения повышается в 0.81 (табл. 2).
Родителям пациента были предложены мероприятия по коррекции веса ребенка, медикаментозные препараты, увеличение двигательной активности. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, при обследовании через два года у ребенка был диагностирован сахарный диабет 2 типа, вес продолжал увеличиваться.
Пример 2.
Мама пациентки У. больна метаболическим синдромом и ожирением в течение последних двух лет. Обратилась по вопросу генетического консультирования дочери 6 лет, также страдающей ожирением с рождения. Для проведения генетического тестирования было взято 4 мл крови у мамы и дочери. Выделение ДНК было осуществлено с помощью метода фенольно-хлороформной экстракции с последующим проведением ПЦР-ПДРФ анализа локусов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845
У дочери было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР для каждого локуса. Было осуществлено расцепление полученных амплификатов маркеров rs3803300 гена AKT1 с добавлением фермента Alw26 I и rs279845 гена GABRA2.
После амплификации проводили электрофорез фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе.
При исследовании полиморфного локуса AKT1 rs3803300 был выявлен генотип АА при котором показатель соотношения шансов развития ожирения составляет 3.37 и генотип AT rs279845 гена GABRA2, в этом случае риск составляет 0.66 (табл. 2).
Учитывая высокий генетический риск ожирения у ребенка, родителям были предложены превентивные мероприятия по коррекции веса ребенка изменение образа жизни, диетотерапию, расширение физической активности. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, дочь пациентки продолжила набирать вес.
Пример 3.
Пациент Н., 14 лет, страдает ожирением с 8 лет. В семье было выявлено наличие факторов риска: мама страдает ожирением III степени. У папы ребенка ожирение II степени и артериальная гипертензия. На консультации у эндокринолога родителям ребенка было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития детского ожирения. У пациента был произведен забор биологического материала 4 мл крови. Результаты проведенного молекулярно-генетического анализа с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 в реакционной смеси, содержащей 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели рестрикцию, а далее электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250- 300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса AKT1 rs3803300 был выявлен генотип AG при котором показатель соотношения шансов развития ожирения составляет 1.56 и генотип АА rs279845 гена GABRA2, в этом случае риск составляет 0.81 (табл. 2).
Родителям пациента были предложены мероприятия по коррекции веса ребенка: диетотерапия, медикаментозные препараты, увеличение двигательной активности. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, при обследовании через два года у ребенка была диагностирована артериальная гипертензия, ожирение сохранялось.
Пример 4.
Пациент Б., 8 лет, находился на лечении в стационаре по поводу обструктивного бронхита. Дополнительно было диагностировано эндогенно-конституциональное ожирение I степени. У мамы пациента выявлен метаболический синдромом и ожирением в течение последних десяти лет.Семье рекомендовали консультацию эндокринолога. Пациенту было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития детского ожирения. Для проведения молекулярно-генетического анализа у пациента К. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250- 300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса AKT1 rs3803300 был выявлен генотип AG при котором показатель соотношения шансов развития ожирения составляет 1.56 и генотип AT rs279845 гена GABRA2, в этом случае риск составляет 0.66 (табл. 2).
Родителям ребенка были предложены превентивные мероприятия по коррекции веса ребенка путем диетотерапии и расширения физической активности. Данные рекомендации не были выполнены в полном объеме, сын пациентка продолжил набирать вес, что было зафиксировано на повторной консультации у эндокринолога через год.
Пример 5.
Пациент К., 4 года, обратился к гастроэнтереологу по поводу болей в животе. Была диагностирована дискинезии желчевыводящих путей и ожирение I степени. Семье рекомендовали консультацию эндокринолога. Пациенту было предложено проведение молекулярно-генетического исследования для определения риска развития детского ожирения. Для проведения молекулярно-генетического анализа у пациента К. было взято 4 мл венозной крови с последующим выделением ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацией фрагментов генов AKT1 rs3803300, GABRA2 rs279845 в реакционной смеси, содержащей 0,1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После амплификации провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250- 300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. При исследовании полиморфного локуса AKT1 rs3803300 был выявлен генотип пониженного риска GG (показатель соотношения шансов развития ожирения в этом случае составляет 0.61), а при исследовании полиморфного локуса GABRA2 rs279845 был выявлен протективный генотип ТТ (OR=1.60) (табл. 2).
Для данных вариантов прогноз развития ожирения в дальнейшем является благоприятным. В последующем родители к эндокринологу не обращались.
Приведенные примеры демонстрируют прогностическую и диагностическую значимость предлагаемого способа. Способ позволяет прогнозировать риск развития детского ожирения до его клинических проявлений и развития коморбидных состояний заболевания.
Claims (1)
- Способ прогнозирования развития ожирения у детей, проживающих в Республике Башкортостан, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что проводят амплификацию локуса rs3803300 гена протеинкиназы 1 AKT1 и локуса rs279845 гена рецептора гамма-аминомасляной кислоты GABRA2 и при выявлении генотипов AG или AA полиморфного локуса rs3803300 гена AKT1 и генотипов АТ или АА полиморфного локуса rs279845 гена GABRA2 прогнозируют риск развития ожирения у ребенка.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2794991C1 true RU2794991C1 (ru) | 2023-04-27 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834501A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 首都儿科研究所 | 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用 |
| RU2696446C1 (ru) * | 2018-03-13 | 2019-08-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования риска развития ожирения в детском возрасте |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106834501A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-13 | 首都儿科研究所 | 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用 |
| RU2696446C1 (ru) * | 2018-03-13 | 2019-08-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Уральский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России) | Способ прогнозирования риска развития ожирения в детском возрасте |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BAUER L.O. et al. GABRA2 Genotype, Impulsivity, and Body Mass. Am J Addict. 2012; 21(5): 404-410. ZHAO J. et al. Combined effects of AKT serine/threonine kinase 1 polymorphisms and environment on congenital heart disease risk: a case-control study. Medicine. 2020; 99: 26(e20400). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6162604A (en) | Methods for determining genetic predisposition to autoimmune diseases by genotyping apoptotic genes | |
| Babar et al. | Genes of the interleukin-18 pathway are associated with susceptibility to Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma | |
| Lagier-Tourenne et al. | Homozygosity mapping of Marinesco–Sjögren syndrome to 5q31 | |
| CN109906275A (zh) | 检测心血管疾病易感性的组合物和方法 | |
| O'Byrne et al. | Association of folate receptor (FOLR1, FOLR2, FOLR3) and reduced folate carrier (SLC19A1) genes with meningomyelocele | |
| CN106062213A (zh) | 与自杀风险关联的遗传标志物及其使用方法 | |
| Milanifard et al. | Vitamin D receptor gene polymorphisms in patients with relapsing multiple sclerosis | |
| Xue et al. | Novel FOXL2 mutations in two Chinese families with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome | |
| Stevenson et al. | Renpenning syndrome maps to Xp11 | |
| Allegue et al. | Prevalence of HCM and long QT syndrome mutations in young sudden cardiac death-related cases | |
| RU2794991C1 (ru) | Способ прогнозирования развития детского ожирения в Республике Башкортостан | |
| Yang et al. | Novel, heterozygous, pathogenic variant (c. 4272delA: p. I1426Ffs* 2) for the NF1 gene in a large Chinese family with neurofibromatosis type 1 | |
| US20160186263A1 (en) | Using plexin-a4 as a biomarker and therapeutic target for alzheimer's disease | |
| KR102063486B1 (ko) | Rnf213 단일염기다형성과 한국인 모야모야병 발병 위험도의 연관성 | |
| Raje et al. | Genetic epidemiology of osteoporosis across four microsatellite markers near the VDR gene | |
| WO2012108527A1 (ja) | 肝細胞癌への進展予測マーカー | |
| Murphy et al. | Beckwith Wiedemann imprinting defect found in leucocyte but not buccal DNA in a child born small for gestational age | |
| Joseph et al. | Retinoblastoma: genetic testing versus conventional clinical screening in India | |
| CN107686861A (zh) | Erbb2‑r113q突变基因用于制备评判乳腺癌遗传易感性试剂盒的应用 | |
| JP5643933B2 (ja) | Ｚｎｆ５１２ｂ遺伝子の一塩基多型に基づく筋萎縮性側索硬化症の検査方法 | |
| CN103266181B (zh) | 一种用于检测ttr基因突变g307c的试剂盒 | |
| Zhou et al. | Association between single nucleotide polymorphisms on chromosome 17q and the risk of prostate cancer in a Chinese population | |
| RU2688208C1 (ru) | Способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у населения башкортостана | |
| JP5888756B2 (ja) | 遺伝子多型を用いた２型糖尿病の検査方法 | |
| RU2830467C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития рака молочной железы у женщин с ожирением на основе данных о полиморфизме генов JMJD1C, PPP1R21 и PRMT6 |