RU2791738C1 - Method for obtaining autologous regulatory t-lymphocytes by ex vivo cultivation in presence of human chorionic gonadotropin - Google Patents
Method for obtaining autologous regulatory t-lymphocytes by ex vivo cultivation in presence of human chorionic gonadotropin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791738C1 RU2791738C1 RU2022122345A RU2022122345A RU2791738C1 RU 2791738 C1 RU2791738 C1 RU 2791738C1 RU 2022122345 A RU2022122345 A RU 2022122345A RU 2022122345 A RU2022122345 A RU 2022122345A RU 2791738 C1 RU2791738 C1 RU 2791738C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- lymphocytes
- regulatory
- treg
- cultivation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 title claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 8
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 6
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 claims description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 abstract 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 30
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 14
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 14
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 14
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 3
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 3
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Natural products CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000010009 steroidogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
Изобретение относится к области клеточной биотехнологии и может применяться в медицине для лечения ряда аутоиммунных расстройств, а также в реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), которая возникает при отторжении тканей и органов в случаях их аллогенной пересадки. Кроме того, изобретение может найти применение в научных исследованиях. Изобретение направлено на разработку способа получения композиции, основу которой составляют регуляторные Т-клетки, пригодной для лечения и профилактики таких заболеваний и состояний, как отторжение трансплантата, аутоиммунные патологии.The invention relates to the field of cellular biotechnology and can be used in medicine for the treatment of a number of autoimmune disorders, as well as in the host-versus-graft reaction (ECPT), which occurs when tissues and organs are rejected in cases of allogeneic transplantation. In addition, the invention may find application in scientific research. The invention is aimed at developing a method for obtaining a composition based on regulatory T cells, suitable for the treatment and prevention of diseases and conditions such as transplant rejection, autoimmune pathologies.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
В настоящее время известные методы получения регуляторных Т- клеток (Treg) можно разделить на две основные стратегические группы: выделение Treg из периферической крови различными методами сортировки или выделение Т-хелперов и дальнейшая направленная дифференцировка в Treg in vitro с использованием специально разработанных для этого наборов.At present, the known methods for obtaining regulatory T cells (Treg) can be divided into two main strategic groups: isolation of Treg from peripheral blood by various sorting methods or isolation of T helpers and further directed differentiation into Treg in vitro using specially designed kits.
К первой группе относится технология получения регуляторных Т-лимфоцитов из цельной крови с использованием позитивной и негативной селекции клеток [1]. Суть ее сводится к тому, что методом иммуномагнитной сепарации из суспензии сначала удаляют CD8+ CD14+ и CD19-клетки, а затем оставшиеся клеточные популяции подвергают позитивной селекции по маркеру CD25+. Минусом данной стратегии является невозможность выделения Treg сразу по нескольким характеристикам.The first group includes the technology for obtaining regulatory T-lymphocytes from whole blood using positive and negative cell selection [1]. Its essence boils down to the fact that CD8 + CD14 + and CD19 cells are first removed from the suspension by immunomagnetic separation, and then the remaining cell populations are subjected to positive selection for the CD25 + marker. The disadvantage of this strategy is the impossibility of isolating Treg by several characteristics at once.
Известен метод выделения Treg, основанный на сортировке клеток по нескольким маркерам. Данный метод предполагает использование проточной сортировки сразу по нескольким соответствующим маркерам, тем самым позволяя получить чистую популяцию целевых Treg. В целом приведенный метод решает проблему использования сразу нескольких клеточных характеристик, однако для подтверждения супрессорной функции Treg осуществляется внутриклеточное измерение уровня транскрипционного фактора FOXP3. Несмотря на очевидные плюсы этой стратегии, есть также очевидные недостатки, в частности, малочисленность Treg в периферической крови (5-10% среди всех CD4 Т-лимфоцитов), а также непригодность дальнейшего использования клеток в клинической практике из-за необходимой пермеабилизации и фиксации клеточной мембраны. Этот минус критичен для проведения клинических исследований, при котором важен большой выход функционально - активной клеточной популяции, поскольку известно, что для подавления РХПТ требуются большие дозы Treg. Эта проблема может быть решена разработкой протоколов генерации и экспансии функционально-активных регуляторных клеток ex vivo.A known method for isolating Treg based on cell sorting by several markers. This method involves the use of flow sorting for several relevant markers at once, thereby allowing a clean population of target Tregs to be obtained. In general, this method solves the problem of using several cellular characteristics at once, however, to confirm the suppressor function of Treg, an intracellular measurement of the level of the FOXP3 transcription factor is carried out. Despite the obvious advantages of this strategy, there are also obvious disadvantages, in particular, the small number of Treg in the peripheral blood (5-10% of all CD4 T-lymphocytes), as well as the unsuitability of further use of cells in clinical practice due to the necessary permeabilization and fixation of the cell wall. membranes. This minus is critical for conducting clinical trials, in which a large yield of a functionally active cell population is important, since it is known that large doses of Treg are required to suppress ECPT. This problem can be solved by developing protocols for the generation and expansion of functionally active regulatory cells ex vivo.
С этой точки зрения привлекают внимание две описанных стратегии генерации регуляторных Т-клеток in vitro.From this point of view, two described strategies for generating regulatory T cells in vitro attract attention.
Одна из таких стратегий - направленная цитокиновая индукция дифференцировки наивных Т-клеток (CD4+CD45R0+) в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов. Особенностью данной методики является получение пула наивных Т-хелперных клеток из периферической крови донора и дальнейшее их культивирование с цитокинами IL-2 и TGF-β [2], а также с антителами против CD3 и CD28 [3]. В ряде случаев в среду культивирования вносят ретиноевую кислоту, рапамицин и бутират [4]. Стоит отметить, что количество наивных Т-хелперов (CD4+CD45R0+) в периферической крови крайне мало, что создает препятствия для получения этих клеток.One such strategy is targeted cytokine induction of differentiation of naive T cells (CD4 + CD45R0 + ) into the phenotype of regulatory T lymphocytes. A specific feature of this technique is obtaining a pool of naive T-helper cells from the peripheral blood of a donor and their further cultivation with cytokines IL-2 and TGF-β [2], as well as with antibodies against CD3 and CD28 [3]. In some cases, retinoic acid, rapamycin, and butyrate are added to the culture medium [4]. It should be noted that the number of naive T-helpers (CD4 + CD45R0 + ) in the peripheral blood is extremely small, which creates obstacles for obtaining these cells.
Второй путь основан на получении пула Т-хелперов (CD4+) из периферической крови донора, с дальнейшим их культивированием с цитокинами, что на сегодняшний день является наиболее перспективным и оправданным, поскольку позволяет получить популяцию Treg в достаточном для адаптивного переноса объеме, с сохранением функциональной активности клеток [5].The second way is based on obtaining a pool of T-helpers (CD4 + ) from the donor's peripheral blood, with their further cultivation with cytokines, which is the most promising and justified today, since it allows obtaining a Treg population in a volume sufficient for adaptive transfer, while maintaining the functional cell activity [5].
Наиболее близким к заявляемому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ, предложенный Быковской и соавт. [6]. Суть его сводится к тому, что из крови выделяют мононуклеарные клетки периферической крови, которые подвергают позитивной селекции CD4+-клеток методом магнитной сепарации. После чего полученные клетки помещают во флаконы 25 см3 в полную питательную среду и добавляют смесь цитокинов - IL-2, TGF-β и антитела к CD2, CD3 и CD28. Затем клетки инкубируют в СО2-инкубаторе в условиях содержания 5% СО2 при 37°С в течение 7-12 суток. Смена среды производится каждые 3-4 суток. В итоге можно получить популяцию CD4+CD25+Foxp3+ Т-лимфоцитов человека.Closest to the claimed solution in terms of technical essence and the achieved result is the method proposed by Bykovskaya et al. [6]. Its essence boils down to the fact that peripheral blood mononuclear cells are isolated from the blood, which are subjected to positive selection of CD4 + cells by magnetic separation. After that, the obtained cells are placed in 25 cm 3 flasks in a complete nutrient medium and a mixture of cytokines - IL-2, TGF-β and antibodies to CD2, CD3 and CD28 is added. Then the cells are incubated in CO 2 -incubator under conditions of 5% CO 2 at 37°C for 7-12 days. The medium is changed every 3-4 days. As a result, a population of CD4 + CD25 + Foxp3 + human T-lymphocytes can be obtained.
С позиции критики необходимо отметить, что, несмотря на эффективность схемы, в данном случае происходит пролиферация и эффекторных клеток тоже, поскольку активированные Т-клетки начинают временно экспрессировать молекулу CD25, правда в меньшей степени. Поэтому главной проблемой культивирования Treg является существенная контаминация CD25+FOXP3- Т-клетками. Существует и другой аспект проблемы получения Treg, связанный со стабильностью молекулы FOXP3, которая индуцируется только TGF-β. Дело в том, что под действием таких цитокинов, как IL-6 или IL-1 может произойти переход Treg в Th17-клетки и экспрессия FOXP3 будет потеряна [7].From the standpoint of criticism, it should be noted that, despite the effectiveness of the scheme, in this case, proliferation of effector cells also occurs, since activated T cells begin to temporarily express the CD25 molecule, although to a lesser extent. Therefore, the main problem of Treg cultivation is a significant contamination of CD25 + FOXP3 - T-cells. There is another aspect of the problem of obtaining Treg, associated with the stability of the FOXP3 molecule, which is induced only by TGF-β. The fact is that under the action of cytokines such as IL-6 or IL-1, Treg can be transferred to Th17 cells and FOXP3 expression will be lost [7].
Заявляемый способ позволяет решать задачу повышения стабильности экспрессии белка FOXP3 за счет добавления в ростовую среду при культивировании Treg хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Хорионический гонадотропин - это гормон, вырабатываемый тканью хориона после имплантации эмбриона. Помимо своих прямых функций, а именно, стероидогенеза и поддержания функциональной активности плаценты, он способен проявлять также иммуномодулирующие функции во время беременности. В данном случае важно, что одним из известных свойств этого белка является определенный молекулярный механизм передачи сигнала через цАМФ, повышение которого приводит к экспрессии молекулы FOXP3 [8]. Этот аспект может послужить дополнительным сигналом, приводящим к экспрессии FOXP3, что отразится на стабильности функционально активных Treg.The claimed method makes it possible to solve the problem of increasing the stability of FOXP3 protein expression by adding human chorionic gonadotropin (hCG) to the growth medium during Treg cultivation. Chorionic gonadotropin is a hormone produced by the chorion tissue after embryo implantation. In addition to its direct functions, namely, steroidogenesis and maintaining the functional activity of the placenta, it is also able to exhibit immunomodulatory functions during pregnancy. In this case, it is important that one of the known properties of this protein is a certain molecular mechanism of signal transduction through cAMP, the increase of which leads to the expression of the FOXP3 molecule [8]. This aspect can serve as an additional signal leading to FOXP3 expression, which will affect the stability of functionally active Tregs.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективного способа выделения и культивирования регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) в количестве и качестве, удовлетворяющем перспективам применения их в осуществлении способов лечения заболеваний, при которых свойственно снижение концентрации и/или функциональной активности Treg. Такой способ подразумевает изначальное выделение CD4+-Т-лимфоцитов из крови пациентов, для их дальнейшей обработки смесью цитокинов, антител и ХГЧ с целью последующего введения аутологичных клеток, обогащенных регуляторными Т-лимфоцитами, этому же пациенту. Кроме того, предлагаемый способ получения Treg может быть использован при трансплантации органов для уменьшения реакции «хозяин против трансплантата» (РХПТ), что заметно повышает шансы приживления аллотрансплантата. Преимуществом использования клеточной аллоспецифичной терапии является также то, что Treg будут осуществлять свою модулирующую функцию в области аллоантигена, а не системно во всем организме, как при применении медикаментозной терапии.The task to be solved by the claimed invention is to develop an effective method for isolating and cultivating regulatory T-lymphocytes (Treg) in an amount and quality that satisfies the prospects for their use in the implementation of methods for treating diseases in which a decrease in the concentration and / or functional activity of Treg is characteristic. This method involves the initial isolation of CD4 + -T-lymphocytes from the blood of patients, for their further processing with a mixture of cytokines, antibodies and hCG with the aim of subsequent introduction of autologous cells enriched in regulatory T-lymphocytes to the same patient. In addition, the proposed method for obtaining Treg can be used in organ transplantation to reduce the host-versus-graft reaction (HRPT), which significantly increases the chances of engraftment of the allograft. The advantage of using cellular allospecific therapy is also that Tregs will carry out their modulating function in the alloantigen region, and not systemically throughout the body, as in the case of drug therapy.
Представленная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа «Умник»).The presented work was carried out with the financial support of the Foundation for the Promotion of Small Forms of Enterprises in the Scientific and Technical Sphere (Umnik program).
Сущность изобретения.The essence of the invention.
Достигаемый изобретением технический результат заключается в том, что достигается значимый прирост числа Т-регуляторньгх клеток, позволяющий сократить время культивирования с 7-14 суток до трех.The technical result achieved by the invention lies in the fact that a significant increase in the number of T-regulatory cells is achieved, which makes it possible to reduce the cultivation time from 7-14 days to three.
Из крови, полученной венепункцией, выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (ρ=1,077). После чего из фракции МПК методом магнитной сепарации выделяют CD4+ Т-лимфоциты. Полученную клеточную суспензию помещают в 96-луночный планшет, добавляя смесь цитокинов и антител, которые обеспечивают дальнейшее развитие клеток в популяцию Treg. Эта смесь содержит цитокины IL-2, TGF-β, моноклональные антитела к CD2, CD3, CD28 - антигену человека, а также гормон беременности - хорионический гонадотропин человека. После этого планшет с клетками, активирующей смесью и полной питательной средой культивируют в СО2-инкубаторе при 5% СО2, 37°С в течение трех суток. В результате происходит дифференцировка и пролиферация функционально активных регуляторных Т-клеток.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are isolated from the blood obtained by venipuncture by centrifugation in ficoll-urografin density gradient (ρ=1.077). After that, CD4 + T-lymphocytes are isolated from the IPC fraction by magnetic separation. The resulting cell suspension is placed in a 96-well plate, adding a mixture of cytokines and antibodies, which ensure the further development of cells in the Treg population. This mixture contains cytokines IL-2, TGF-β, monoclonal antibodies to CD2, CD3, CD28 - human antigen, as well as pregnancy hormone - human chorionic gonadotropin. After that, the plate with cells, activating mixture and complete nutrient medium is cultured in CO 2 -incubator at 5% CO 2 , 37°C for three days. As a result, differentiation and proliferation of functionally active regulatory T cells occur.
Признаки способа, отвечающие критерию новизны, состоят в том, что предлагаемый способ увеличения количества аутологичных регуляторных Т-лимфоцитов пациента в условиях in vitro с использованием смеси цитокинов, антител и ХГЧ для обработки CD4+- клеток пациента. В результате достигается высокая гомогенность получаемой популяции лимфоцитов, а также стабильность маркера FOXP3, отражающего функциональную активность Treg. Помимо того, что достигается значимый прирост клеток (в среднем на 64%), данная экспериментальная схема предполагает и сокращение времени культивирования клеток- с 7-14 суток до трех. В целом данная технология позволяет получить стабильную экспрессию FOXP3 за счет применения ХГЧ, сократить объем забираемого образца и времени культивирования клеток.Features of the method that meet the criterion of novelty are that the proposed method of increasing the number of autologous regulatory T-lymphocytes of the patient in vitro using a mixture of cytokines, antibodies and hCG to treat CD4 + cells of the patient. As a result, a high homogeneity of the resulting population of lymphocytes is achieved, as well as the stability of the FOXP3 marker, which reflects the functional activity of Treg. In addition to the fact that a significant increase in cells is achieved (on average by 64%), this experimental scheme also implies a reduction in the time of cell cultivation - from 7-14 days to three. In general, this technology makes it possible to obtain a stable expression of FOXP3 through the use of hCG, to reduce the volume of the sample taken and the time of cell cultivation.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
Сущность заявляемого изобретения поясняется графическими изображениями.The essence of the claimed invention is illustrated by graphic images.
На фигуре 1 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg в популяции клеток, выделенных методом магнитной сепарации до начала культивирования клеток.The figure 1 shows representative graphs of the expression of Treg markers in a population of cells isolated by magnetic separation before cell culture.
Фиг. 1а. График прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. На графике выделен гейт лимфоцитов (19%).Fig. 1a. Direct scatter (FSC) and side scatter (SSC) graph. The gate of lymphocytes (19%) is highlighted on the graph.
Фиг. 1б. График жизнеспособных лимфоцитов, несущих маркер CD3 (CD3+ 7-AAD-, Т-лимфоциты) - 98,13%. Жизнеспособность была определена с помощью витального красителя 7-AAD. Фиг. 1в. Гистограмма общего пула жизнеспособных Т-лимфоцитов, несущих маркер CD4 (CD3+CD4+, Т-хелперы) - 99,58%.Fig. 1b. Graph of viable lymphocytes carrying the CD3 marker (CD3 + 7-AAD - , T-lymphocytes) - 98.13%. Viability was determined using the 7-AAD vital stain. Fig. 1c. Histogram of the total pool of viable T-lymphocytes carrying the CD4 marker (CD3 + CD4 + , T-helpers) - 99.58%.
Фиг. 1г. График четырех популяций Т-хелперов, основанных на экспрессии молекул CD25 и CD127. Левый верхний квадрант - эффекторные Т- клетки (CD3+CD4+CD25-CD127+), правый верхний квадрант - активированные Т-хелперы (CD3+CD4+CD25+CD127+), левый нижний квадрант - неактивированные Т-хелперы (CD3+CD4+CD25-CD127-), правый нижний квадрант - регуляторные Т-лимфоциты (CD3+CD4+CD25+CD127-). Уровень Treg периферической крови после магнитной сепарации - 3,15%.Fig. 1g Graph of four T helper populations based on the expression of CD25 and CD127 molecules. Upper left quadrant - effector T cells (CD3 + CD4 + CD25 - CD127 + ), upper right quadrant - activated T helper cells (CD3 + CD4 + CD25 + CD127 + ), lower left quadrant - inactivated T helper cells (CD3 + CD4 + CD25 - CD127 - ), lower right quadrant - regulatory T-lymphocytes (CD3 + CD4 + CD25 + CD127 - ). The Treg level of peripheral blood after magnetic separation is 3.15%.
На фигуре 2 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 10 МЕ/ мл. Тактика гейтирования соответствует таковой на фигуре 1.The figure 2 shows representative graphs of the expression of Treg markers after three days of cell cultivation with the addition of hCG at a concentration of 10 IU/ml. The gating tactic corresponds to that in figure 1.
Фиг. 2а. Общий гейт лимфоцитов (32%). Увеличение процента лимфоцитов в сравнении с первым днем культивирования связано с активированием клеток.Fig. 2a. Total lymphocyte gate (32%). The increase in the percentage of lymphocytes in comparison with the first day of cultivation is associated with cell activation.
Фиг. 2б. живые CD3+- лимфоциты (96,69%).Fig. 2b. live CD3 + lymphocytes (96.69%).
Фиг. 2в. Т-хелперы (98,22%).Fig. 2c. T-helpers (98.22%).
Фиг. 2г. Treg (62,02%).Fig. 2y. Treg (62.02%).
После трех суток инкубирования растет процент Treg (%), при этом роста остальных популяций не происходит, что показывает специфичность действия выбранных цитокинов, активатора и ХГЧ.After three days of incubation, the percentage of Treg (%) increases, while the growth of the remaining populations does not occur, which shows the specificity of the action of the selected cytokines, activator, and hCG.
На фигуре 3 представлены репрезентативные графики экспрессии маркеров Treg, после трех суток культивирования клеток с добавлением ХГЧ в концентрации 100 МЕ/ мл.The figure 3 shows representative graphs of the expression of Treg markers after three days of cell cultivation with the addition of hCG at a concentration of 100 IU/ml.
Фиг. 3а. Общий гейт лимфоцитов (28,91%).Fig. 3a. Total lymphocyte gate (28.91%).
Фиг. 3б. Живые CD3+- лимфоциты (96,55%).Fig. 3b. Live CD3 + - lymphocytes (96.55%).
Фиг. 3в. Т-хелперы (97,82%).Fig. 3c. T-helpers (97.82%).
Фиг. 3г. Treg (64,43%). При сравнении двух схем культивирования с добавлением разных физиологических концентраций ХГЧ, является очевидным отсутствие дозозависимого эффекта, что позволяет использовать белок в диапазоне концентраций 10-100 МЕ/мл.Fig. 3y. Treg (64.43%). When comparing two cultivation schemes with the addition of different physiological concentrations of hCG, it is obvious that there is no dose-dependent effect, which allows the use of the protein in the concentration range of 10-100 IU/ml.
Предлагаемое техническое решение иллюстрируется следующими примерами.The proposed technical solution is illustrated by the following examples.
Нижеследующие примеры приводятся только с целью демонстрации возможностей настоящего изобретения, и не ограничивают спектр клеток-мишеней и их свойств, которые могут быть использованы и/или улучшены при помощи предлагаемого способа культивирования.The following examples are provided only for the purpose of demonstrating the possibilities of the present invention, and do not limit the range of target cells and their properties that can be used and/or improved using the proposed method of cultivation.
Приводимые в тексте и примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.The specific quantitative parameters given in the text and examples, even in the indicated ranges, are not fixed by the claims, because they are not fundamental conditions for the implementation of the proposed method.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION
Пример 1Example 1
1. Способ выделения и культивирования CD3+CD4+CD25high CD 127 low/- 1. Method for isolating and cultivating CD3 + CD4 + CD25 high CD 127 low/-
Все процедуры проводят в ламинарных шкафах II класса биологической защиты с использованием стерильной одноразовой посуды и реагентов.All procedures are carried out in laminar cabinets of class II biological protection using sterile disposable tableware and reagents.
Периферическую кровь получают методом венепункции из локтевой вены в стерильные пробирки с гепарином (2 пробирки объемом по 9 мл).Peripheral blood is obtained by venipuncture from the cubital vein into sterile tubes with heparin (2 tubes of 9 ml each).
Выделение мононуклеарных клетокIsolation of mononuclear cells
Образцы крови разводят в соотношении 1:1 раствором Хэнкса (ПанЭко, Россия), после чего наслаивают на раствор фиколл-урографина (ρ=1,077 г/см3, ДиаМ, Россия) в пробирках объемом 15 мл. Пробирки центрифугируют при 400g в течение 40 минут при комнатной температуре. В процессе центрифугирования происходит стандартное разделение крови на фракции: эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а кольцо мононуклеарных клеток располагается на границе градиента. Отобранную пипеткой фракцию МПК разводят раствором Хэнкса в два раза, проводят двукратную отмывку центрифугированием в течение 20 минут при 350 g и комнатной температуре, после чего ее избавляют от тромбоцитов. Для этого извлекают супернатант, а клетки ресуспендируют в растворе Хенкса, до конечного объема суспензии 14 мл и центрифугируют при 200 g и 4°С в течение 20 минут.Blood samples are diluted in a ratio of 1:1 with Hanks' solution (PanEco, Russia), after which they are layered on a solution of ficoll-urografin (ρ=1.077 g/cm 3 , DiaM, Russia) in 15 ml test tubes. The tubes are centrifuged at 400g for 40 minutes at room temperature. During centrifugation, the standard separation of blood into fractions occurs: erythrocytes and granulocytes settle to the bottom of the tube, and the ring of mononuclear cells is located at the gradient boundary. The IPC fraction selected with a pipette is diluted with Hanks solution twice, washed twice by centrifugation for 20 minutes at 350 g and room temperature, after which it is disposed of platelets. To do this, the supernatant is removed, and the cells are resuspended in Hank's solution to a final suspension volume of 14 ml and centrifuged at 200 g and 4°C for 20 minutes.
Супернатант удаляют пипеткой, а осадок клеток ресуспендируют в 1 мл раствором Хэнкса для дальнейшего подсчета общего количества выделенных МПК и оценки числа жизнеспособности клеток.The supernatant is removed with a pipette, and the cell pellet is resuspended in 1 ml of Hanks' solution for further calculation of the total number of isolated MICs and evaluation of cell viability.
Для определения количества живых МПК к 25 мкл суспензии клеток добавляют 25 мкл красителя трипанового синего (Sigma Aldrich, Англия). Подсчет жизнеспособности клеток проводят в камере Горяева, процент живых клеток при описанных условиях составляет не менее 96%.To determine the amount of live PBMCs, 25 µl of trypan blue dye (Sigma Aldrich, England) was added to 25 µl of cell suspension. Cell viability is calculated in a Goryaev chamber; the percentage of living cells under the described conditions is at least 96%.
Иммуномагнитная сепарация CD4+-клеток из МПК по технологии MACSImmunomagnetic separation of CD4 + cells from MPCs using MACS technology
Суспензию МПК осаждают центрифугированием 10 минут при 300 g. Осадок клеток ресуспендируют в буфере Auto Macs Rinse Solution, содержащем 0,5% BSA, из расчета 80 мкл на каждые 107 клеток. В полученную суспензию добавляют парамагнитные микрочастицы, конъюгированные с мышиными моноклональными антителами против молекулы CD4 лимфоцитов человека (Miltenyi Biotec, Германия), исходя из расчета 20 мкл частиц на 107 клеток. Полученную смесь инкубируют 15 минут при 4°С.The IPC suspension is precipitated by centrifugation for 10 minutes at 300 g. The cell pellet is resuspended in Auto Macs Rinse Solution buffer containing 0.5% BSA at a rate of 80 μl for every 10 7 cells. Paramagnetic microparticles conjugated with mouse monoclonal antibodies against the CD4 molecule of human lymphocytes (Miltenyi Biotec, Germany) are added to the resulting suspension, based on the calculation of 20 μl of particles per 10 7 cells. The resulting mixture is incubated for 15 minutes at 4°C.
После инкубации к смеси клеток и магнитных частиц добавляют буфер Auto Macs Rinse Solution, содержащий 0,5% BSA, из расчета 1-2 мл на 107 клеток и проводят процедуру отмывки центрифугированием в течение 10 минут при 300g и 4°С.After incubation, the Auto Macs Rinse Solution buffer containing 0.5% BSA is added to the mixture of cells and magnetic particles at the rate of 1-2 ml per 10 7 cells, and washing is carried out by centrifugation for 10 minutes at 300g and 4°C.
Супернатант удаляют и ресуспендируют клетки в том же буфере из расчета 500 мкл на 108 клеток. В колонку, находящуюся в магнитном поле, вносят 500 мкл буфера для ее промывки, а затем весь объем полученной клеточной суспензии. Колонку промывают буфером, извлекают ее из магнитного поля сепаратора и резким нажатием поршня проводят элюцию CD4+-лимфоциты в стерильную пробирку. Все процедуры магнитной сепарации проводят на холоде. Описанную процедуру позитивной селекции осуществляют по протоколу изготовителя набора (Miltenyi Biotec, Германия).The supernatant is removed and the cells are resuspended in the same buffer at a rate of 500 μl per 10 8 cells. 500 μl of buffer for washing it is added to the column in a magnetic field, and then the entire volume of the resulting cell suspension. The column is washed with buffer, removed from the magnetic field of the separator, and by sharply pressing the piston, CD4 + lymphocytes are eluted into a sterile tube. All magnetic separation procedures are carried out in the cold. The described positive selection procedure is carried out according to the protocol of the kit manufacturer (Miltenyi Biotec, Germany).
Часть клеток отбирают для подсчета в камере Горяева, а часть для оценки чистоты полученных CD4+- клеток. Для этого клетки окрашивают антителами и анализируют методом проточной цитофлуориметрии. Тактика гейтирования представлена на фиг. 1 Чистота составляла CD4+- клеток составляет в среднем 97% (n=5). На фигуре 2 представлены основные маркеры Treg и чистота выделенных CD4-лимфоцитов.Some of the cells are selected for counting in the Goryaev chamber, and some for assessing the purity of the resulting CD4 + - cells. For this, cells are stained with antibodies and analyzed by flow cytometry. The gating strategy is shown in Fig. 1 Purity of CD4+ cells averaged 97% (n=5). Figure 2 shows the main Treg markers and the purity of isolated CD4 lymphocytes.
2. Направленная дифференцировка и экспансия Treg (CD4+CD25highCD127-/low) ex vivo2. Targeted differentiation and expansion of Treg (CD4 + CD25 high CD127 -/low ) ex vivo
Полученные CD4+- клетки вносят в лунки 96-луночного планшета в концентрации 1 млн/мл в культуральную среду, содержащую среду TexMACS (Miltenyi Biotec), 1% смеси антибиотиков (стрептомицин, амфотерицйн, пенициллин, «BI», Израиль), 10% ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка, BI, Израиль), 2 мМ L-глутамина и 10 мМ Hepes («ICN Ph.», США). Кроме того, в культуральную среду добавляют цитокины TGF-β (в подобранной концентрации 5 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия) и IL-2 (166 нг/мл, Miltenyi Biotec, Германия). Концентрации рассчитаны исходя из биологической активности каждого цитокина. Помимо этого, в культуру вносят активатор, включающий мышиные моноклональные антитела к рецептору CD2, CD3 и CD28 (Miltenyi Biotec, Германия) из расчета 25 мкл активирующих частиц на каждые 5 млн клеток. Хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) (Ovidrell, Merck Serono, Италия) вносят в двух физиологических концентрациях 10 и 100 МЕ/мл, которые характеризуют начало и окончание первого триместра беременности.The resulting CD4 + - cells are introduced into the wells of a 96-well plate at a concentration of 1 million/ml in a culture medium containing TexMACS medium (Miltenyi Biotec), 1% of a mixture of antibiotics (streptomycin, amphotericin, penicillin, BI, Israel), 10% FBS (fetal calf serum, BI, Israel), 2 mM L-glutamine, and 10 mM Hepes (ICN Ph., USA). In addition, the cytokines TGF-β (adjusted concentration of 5 ng/ml, Miltenyi Biotec, Germany) and IL-2 (166 ng/ml, Miltenyi Biotec, Germany) are added to the culture medium. Concentrations are calculated based on the biological activity of each cytokine. In addition, an activator is added to the culture, including mouse monoclonal antibodies to the CD2, CD3 and CD28 receptor (Miltenyi Biotec, Germany) at the rate of 25 µl of activating particles for every 5 million cells. Human chorionic gonadotropin (hCG) (Ovidrell, Merck Serono, Italy) is applied at two physiological concentrations of 10 and 100 IU/ml, which characterize the beginning and end of the first trimester of pregnancy.
Клетки культивируют в плоскодонных 96-луночных планшетах в СО2 -инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение трех суток.Cells are cultured in flat-bottomed 96-well plates in a CO 2 incubator at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 for three days.
Для идентификации Treg на проточном цитометре CytoFLEX S (Beckman Coulter, США) клетки окрашивают антителами к CD3 (АРС / Су7), CD4 (FITC), CD25 (АРС) и CD 127 (РЕ / Су7) (BioLegend, США) по методике, предложенной производителем. Для оценки жизнеспособности клеток используют краситель 7-AAD (PC 5.5), входящий в панель идентификации Treg. В результате после трех суток культивирования жизнеспособность клеток варьирует от 89 до 98%.To identify Treg on a CytoFLEX S flow cytometer (Beckman Coulter, USA), cells are stained with antibodies to CD3 (APC / Cy7), CD4 (FITC), CD25 (APC) and CD 127 (PE / Cy7) (BioLegend, USA) according to the method suggested by the manufacturer. Cell viability was assessed using the 7-AAD dye (PC 5.5) included in the Treg identification panel. As a result, after three days of cultivation, cell viability varies from 89 to 98%.
Для оценки уровня FOXP3 производят внутриклеточное окрашивание с предварительной пермеабилизацией клеток.To assess the level of FOXP3, intracellular staining is performed with preliminary cell permeabilization.
В таблице представлены результаты цитофлуориметрического анализа CD4+-клеток до начала и после трех суток культивирования.The table shows the results of cytofluorimetric analysis of CD4+ cells before and after three days of cultivation.
После трех суток культивирования CD4+- лимфоцитов с ХГЧ, общее количество Treg увеличивается на 64±4,4%, при этом процент эффекторных Т-лимфоцитов уменьшается (табл. 1). Использование ХГЧ в качестве дополнительной стимуляции увеличивает общий выход Treg на 23±4,1%. Уровень регуляторных Т-лимфоцитов, экспрессирующих FOXP3, увеличивается в 2 раза (данные не представлены). Обе концентрации ХГЧ (10 и 100 МЕ/ мл) демонстрируют одинаковый эффект на дифференцировку Treg и экспрессию FOXP3, что позволяет использование ХГЧ в диапазоне выбранных концентраций.After three days of culturing CD4 + - lymphocytes with hCG, the total amount of Treg increases by 64±4.4%, while the percentage of effector T-lymphocytes decreases (Table 1). The use of hCG as an additional stimulation increases the total Treg output by 23±4.1%. The level of regulatory T-lymphocytes expressing FOXP3 increased by 2 times (data not shown). Both concentrations of hCG (10 and 100 IU/ml) show the same effect on Treg differentiation and FOXP3 expression, which allows the use of hCG in the range of selected concentrations.
Таким образом предложенный способ направленной дифференцировки CD4+-клеток в фенотип регуляторных Т-лимфоцитов позволяет получить существенное увеличение количества функционально активных жизнеспособных Treg за счет добавления в культуру ХГЧ. При этом получаемый эффект позволяет сократить время культивирования до трех суток, что в свою очередь не требует замены среды. Данное обстоятельство обеспечивает стабильность процесса культивирования, что существенным образом нивелирует негативное влияние процедурных операций.Thus, the proposed method for the directed differentiation of CD4 + cells into the phenotype of regulatory T-lymphocytes makes it possible to obtain a significant increase in the number of functionally active viable Tregs by adding hCG to the culture. At the same time, the obtained effect makes it possible to reduce the cultivation time to three days, which, in turn, does not require replacement of the medium. This circumstance ensures the stability of the cultivation process, which significantly eliminates the negative impact of procedural operations.
Применение разработанного способа может найти свою реализацию не только в научных исследованиях, но и в разработке подходов к лечению ряда аутоиммунных расстройств и снижении рисков возникновения реакции «хозяин против трансплантата».The application of the developed method can find its implementation not only in scientific research, but also in the development of approaches to the treatment of a number of autoimmune disorders and reduce the risk of host-versus-graft reactions.
Библиографический списокBibliographic list
1. Riley J.L., June С.Н., Blazar B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning // Immunity. 2009. Vol. 30. №5. P. 656-65. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.04.006.1. Riley J.L., June S.N., Blazar B.R. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning // Immunity. 2009 Vol. 30. No. 5. P. 656-65. DOI: 10.1016/j.immuni.2009.04.006.
2. Schmidt A., Éliás S., Joshi R.N., Tegner J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naive CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol // J Vis Exp. 2016. Vol. 118. DOI: 10.3791/55015.2. Schmidt A., Éliás S., Joshi R.N., Tegner J. In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Naive CD4+ T Cells Using a TGF-β-containing Protocol // J Vis Exp. 2016. Vol. 118. DOI: 10.3791/55015.
3. Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhti S., Bonyhadi M.L., Bluestone J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation // Clin Immunol. 2005. Vol. 115. №1. P. 3-9. DOI: 10.1016/j. clim 2005.02.017.3. Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhti S., Bonyhadi M.L., Bluestone J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation // Clin Immunol. 2005 Vol. 115. No. 1. P. 3-9. DOI: 10.1016/j. climate 2005.02.017.
4. Schmidt A., Eriksson M., Shang M.-M., Weyd H., Tegnér J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate// PLoS ONE. 2016. Vol. 11. №2.4. Schmidt A., Eriksson M., Shang M.-M., Weyd H., Tegnér J. Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid , Rapamycin and Butyrate // PLoS ONE. 2016. Vol. 11. No. 2.
5. Kanjana K., Paisooksantivatana K., Matangkasombut P., Chevaisrakul P., Lumjiaktase P. Efficient short-term expansion of human peripheral blood regulatory T cells for co-culture suppression assay // J Immunoassay Immunochem. 2019. Vol. 40. №6. P. 573-589. DOI: 10.1080/15321819.2019.1659813.5. Kanjana K., Paisooksantivatana K., Matangkasombut P., Chevaisrakul P., Lumjiaktase P. Efficient short-term expansion of human peripheral blood regulatory T cells for co-culture suppression assay // J Immunoassay Immunochem. 2019 Vol. 40. No. 6. P. 573-589. DOI: 10.1080/15321819.2019.1659813.
6. СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ CD4+CD25+FOXP3+T-КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ex vivo //Патент РФ №2010131841/10. 2008 / Быковская Светлана Нюневна, Караулов Александр Викторович, Лысюк Елена Юрьевна.6. METHOD OF ENRICHMENT OF REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-HUMAN CELLS ex vivo // RF Patent No. 2010131841/10. 2008 / Bykovskaya Svetlana Nyunevna, Karaulov Alexander Viktorovich, Lysyuk Elena Yurievna.
7. Yang Х.О., Nurieva R., Martinez G.J., Kang H.S., Chung Y., Pappu B.P. et al. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs // Immunity. 2008. Vol. 29. №1. P. 44-56.7. Yang H.O., Nurieva R., Martinez G.J., Kang H.S., Chung Y., Pappu B.P. et al. Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs // Immunity. 2008 Vol. 29. No. 1. P. 44-56.
8. Bodor J., Bopp T., Vaeth M., Klein M. et al. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells // Eur J Immunol. 2012. Vol. 42. №6. P. 1375-84.8. Bodor J., Bopp T., Vaeth M., Klein M. et al. Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells // Eur J Immunol. 2012. Vol. 42. No. 6. P. 1375-84.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2791738C1 true RU2791738C1 (en) | 2023-03-13 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437933C1 (en) * | 2010-07-29 | 2011-12-27 | Светлана Нюневна Быковская | METHOD OF HUMAN REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-CELL ENRICHMENT ex vivo |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437933C1 (en) * | 2010-07-29 | 2011-12-27 | Светлана Нюневна Быковская | METHOD OF HUMAN REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-CELL ENRICHMENT ex vivo |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BODOR J., BOPP T., VAETH M., KLEIN M. ET AL., Cyclic AMP underpins suppression by regulatory T cells, Eur J Immunol, 2012, Vol. 42. (6), P. 1375-84. YANG Х.О., NURIEVA R., MARTINEZ G.J., KANG H.S., CHUNG Y., PAPPU B.P. ET AL., Molecular antagonism and plasticity of regulatory and inflammatory T cell programs, Immunity, 2008, Vol. 29 (1), P. 44-56. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU637702B2 (en) | T-lymphocyte progenitor cell assay | |
| US20250122477A1 (en) | Immunomodulating mesenchymal stem cells | |
| Alikarami et al. | The immunosuppressive activity of amniotic membrane mesenchymal stem cells on T lymphocytes | |
| AU724703B2 (en) | Methods for measurement of lymphocyte function | |
| Attiogbe et al. | An in vitro autologous, vascularized, and immunocompetent Tissue Engineered Skin model obtained by the self-assembled approach | |
| El-Sahrigy et al. | Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial | |
| US9700585B2 (en) | Multipotent prenatal stem cells | |
| US20230015932A1 (en) | Method of generation of lympho-myeloid niches | |
| WO2023216799A1 (en) | Human nkt cell line and use thereof | |
| RU2791738C1 (en) | Method for obtaining autologous regulatory t-lymphocytes by ex vivo cultivation in presence of human chorionic gonadotropin | |
| CN111197029B (en) | A method for inducing myeloid suppressor cells by sodium urate | |
| Asl et al. | Cord blood stem cell-generated KIR+ NK cells effectively target leukemia cell lines | |
| Piekarska et al. | Identification of circulating regulatory T lymphocytes with membrane markers—a new multiparameter flow cytometry protocol | |
| RU2437933C1 (en) | METHOD OF HUMAN REGULATORY CD4+CD25+FOXP3+T-CELL ENRICHMENT ex vivo | |
| Vega-Sánchez et al. | Check Chapter 2 updates | |
| CN114591908B (en) | A stimulating factor, culture medium, method and application for inducing Tregs to obtain embryonic antigen-specific iTregs | |
| CN115896015B (en) | In-vitro culture method of myeloid-derived suppressor cells | |
| US20070243576A1 (en) | Method to confirm immunosuppression in human patients by measuring lymphocyte activation | |
| CN110157669A (en) | A kind of cultivating system and method for hematopoietic stem cell population | |
| Felgueres et al. | Selective expansion of anti-tumor innate lymphocytes in long-term cultures after a single BCG pulse | |
| CN113150981A (en) | Method for simulating influence of cytokine release on indirect target cell phenotype in vitro | |
| TWI669399B (en) | A method for in-vitro expansion of nature killer cells (nk cells) and nature killer t cells (nkt cell) and the pharmaceutical composition thereof. | |
| CN113416696B (en) | Immunoregulatory gamma delta T cell and in-vitro amplification method thereof | |
| TWI669400B (en) | A serum-free cell culture medium for in-vitro expansion of nature killer cells and nature killer t cells | |
| Mohamad et al. | ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RETICULOCYTES DIFFERENTIATED FROM HUMAN PERIPHERAL BLOOD-DERIVED CD34+ HEMATOPOIETIC STEM CELLS AND THE POTENTIAL OF RETICULOCYTE INVASION BY PLASMODIUM FALCIPARUM |