RU2791749C1 - Bispecific monoclonal antibody against sars-cov-2 - Google Patents
Bispecific monoclonal antibody against sars-cov-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791749C1 RU2791749C1 RU2022116357A RU2022116357A RU2791749C1 RU 2791749 C1 RU2791749 C1 RU 2791749C1 RU 2022116357 A RU2022116357 A RU 2022116357A RU 2022116357 A RU2022116357 A RU 2022116357A RU 2791749 C1 RU2791749 C1 RU 2791749C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- sars
- protein
- cov
- spike
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims abstract 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 30
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 claims description 15
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 claims description 15
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 12
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 claims description 12
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 9
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 43
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 5
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 5
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 5
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- -1 phosphoryl groups Chemical group 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 1-[1-[2-[[5-amino-2-[[1-[5-(diaminomethylideneamino)-2-[[1-[3-(1h-indol-3-yl)-2-[(5-oxopyrrolidine-2-carbonyl)amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbon Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C1CCCN1C(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C1CCC(=O)N1 UUUHXMGGBIUAPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100030988 Angiotensin-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- UDKCHVLMFQVBAA-UHFFFAOYSA-M Choline salicylate Chemical compound C[N+](C)(C)CCO.OC1=CC=CC=C1C([O-])=O UDKCHVLMFQVBAA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 244000309467 Human Coronavirus Species 0.000 description 1
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229910021586 Nickel(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000882 Peptidyl-Dipeptidase A Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101000629313 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229940126530 T cell activator Drugs 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108070000030 Viral receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L nickel dichloride Chemical compound Cl[Ni]Cl QMMRZOWCJAIUJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 108010008595 sarcoma-associated antigen S1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- FYOWZTWVYZOZSI-UHFFFAOYSA-N thiourea dioxide Chemical compound NC(=N)S(O)=O FYOWZTWVYZOZSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к биспецифическим моноклональным антителам, которые специфически связываются с шиповидным белком коронавируса (SARS-COV-2), а также к способу получения таких антител.The present invention relates to biotechnology, in particular to bispecific monoclonal antibodies that specifically bind to the spike protein of the coronavirus (SARS-COV-2), as well as to a method for producing such antibodies.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION
В декабре 2019 г. в г. Ухань, провинция Хубэй, было выявлено заболевание, вызванное новым коронавирусом (SARS-COV-2), которое поставило перед специалистами в области здравоохранения и врачами трудные задачи, связанные с быстрой диагностикой и клиническим ведением больных. Указанный вирус быстро распространился по всему миру, вызвав беспрецедентную по своим масштабам пандемию. Только в России согласно данным Росстата, в декабре прошлого года умерли 54 630 зараженных Covid-19. При этом основной причиной смерти коронавирус стал в 49 122 случаях (в 44 390 случаях коронавирус установлен как основная причина, в 4 732 - нужно провести дополнительные исследования). В качестве сопутствующего заболевания коронавирус был диагностирован у 5 508 умерших (у 1 000 человек он способствовал появлению осложнений, ускоривших смерть, а еще в 4 508 случаях - не повлиял на наступление смерти). В настоящее время сведения об эпидемиологии, клинических особенностях, профилактике и лечении этого заболевания ограничены. Известно, что наиболее распространенным клиническим проявлением нового варианта коронавирусной инфекции является пневмония, у значительного числа пациентов зарегистрировано развитие острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС). Вирус отнесен ко II группе патогенности, как и некоторые другие представители этого семейства (вирус SARS-COV, MERS-COV). В отношении нового коронавирусного заболевания отсутствуют средства как специфической профилактики, так и этиотропного лечения. Высокий процент смертности, быстрое географическое распространение SARS-COV-2 и нечетко определенная этиология заболевания создали острую необходимость в создании эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом.In December 2019, a disease caused by a novel coronavirus (SARS-COV-2) was identified in Wuhan, Hubei Province, posing challenges for healthcare professionals and physicians in rapid diagnosis and clinical management. This virus quickly spread around the world, causing a pandemic of unprecedented proportions. In Russia alone, according to Rosstat, 54,630 people infected with Covid-19 died in December last year. At the same time, coronavirus became the main cause of death in 49,122 cases (in 44,390 cases, coronavirus was established as the main cause, in 4,732 additional studies need to be carried out). Coronavirus was diagnosed as a concomitant disease in 5,508 deaths (in 1,000 people, it contributed to the occurrence of complications that accelerated death, and in another 4,508 cases, it did not affect the onset of death). Currently, information on the epidemiology, clinical features, prevention and treatment of this disease is limited. It is known that the most common clinical manifestation of a new variant of coronavirus infection is pneumonia; a significant number of patients have developed acute respiratory distress syndrome (ARDS). The virus is assigned to pathogenicity group II, like some other representatives of this family (SARS-COV, MERS-COV virus). With regard to the new coronavirus disease, there are no means of both specific prevention and etiotropic treatment. The high mortality rate, the rapid geographic spread of SARS-COV-2 and the unclear etiology of the disease have created an urgent need for effective means of preventing diseases caused by this virus.
Направления исследований по разработке новых моноклональных антител против SARS-COV-2 зачастую ориентированы на оптимизацию последовательностей антител к домену RBD шиловидного (spike) белка вируса SARS-COV-2. Так например, в публикации WO 2021196268 А1 предложены антитело, специфически связывающееся с белком S коронавируса, мультиспецифическое антитело и композиция антител. Кроме того, предложены нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и мультиспецифическое антитело, клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту, и способ получения антитела, а также мультиспецифическое антитело. Также, дополнительно предусмотрены профилактические, лечебные и/или диагностические применения антитела или антигенсвязывающего фрагмента, мультиспецифического антитела и композиции антитела.Research directions for the development of new monoclonal antibodies against SARS-COV-2 are often focused on optimizing the sequences of antibodies to the RBD domain of the SARS-COV-2 spike protein. For example, WO 2021196268 A1 proposes an antibody that specifically binds to the S protein of a coronavirus, a multispecific antibody, and an antibody composition. In addition, a nucleic acid encoding an antibody or an antigen-binding fragment and a multispecific antibody, a host cell containing the nucleic acid, and a method for producing an antibody, as well as a multispecific antibody are provided. Also, prophylactic, therapeutic, and/or diagnostic uses of an antibody or antigen-binding fragment, a multispecific antibody, and an antibody composition are further contemplated.
Также в уровне техники описаны рекомбинантные моноклональные антитела (мАт) и их фрагменты, которые специфически связываются с шиповидным белком коронавируса (патент CN 111620946 В). В данном исследовании моноклональные антитела были рекомбинантно получены из выделенных В-клеток от людей, инфицированных коронавирусом. Такие антитела связывают различные эпитопы шиловидного белка коронавируса и нейтрализуют его. Изобретение обеспечивает способы применения антител по изобретению в профилактических и/или терапевтических способах предотвращения или лечения новой коронавирусной инфекции.The prior art also describes recombinant monoclonal antibodies (mAbs) and their fragments that specifically bind to the spike protein of the coronavirus (patent CN 111620946 B). In this study, monoclonal antibodies were recombinantly derived from isolated B cells from people infected with the coronavirus. Such antibodies bind to various epitopes of the styloid protein of the coronavirus and neutralize it. The invention provides methods for using the antibodies of the invention in prophylactic and/or therapeutic methods for preventing or treating a novel coronavirus infection.
В публикации WO 2022054068 A1 раскрыто моноклональное антитело к новому коронавирусу или его антигенсвязывающая часть, которая специфически связывается с S-белком нового коронавируса. Описанные моноклональные антитела можно с успехом применять для обнаружения присутствия новых коронавирусов. Кроме того, указанные моноклональные антитела обладают нейтрализующей активностью и, таким образом, могут применяться для приготовления лекарственного средства для профилактики или лечения новой коронавирусной инфекции.WO 2022054068 A1 discloses a monoclonal antibody to a novel coronavirus, or an antigen-binding portion thereof, which specifically binds to the S protein of the novel coronavirus. The described monoclonal antibodies can be successfully used to detect the presence of novel coronaviruses. In addition, said monoclonal antibodies have neutralizing activity and thus can be used for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of novel coronavirus infection.
В публикации WO 2022/093745 А1 предложена аминокислотная последовательность человеческого антитела, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывает антигенную детерминанту коронавируса, для применения в профилактике, лечении или выявлении коронавирусной инфекции у субъекта, нуждающегося в этом.WO 2022/093745 A1 proposes the amino acid sequence of a human antibody containing an antigen-binding domain that binds a coronavirus antigenic determinant for use in the prevention, treatment, or detection of a coronavirus infection in a subject in need thereof.
В публикации WO 2021/195385 А1 описаны полипептиды, которые специфически связываются с шиповидным белком (S) коронавируса человека, выбранные из шести библиотек фагового дисплея однодоменных антител VHH верблюда. Полипептиды, специфичные для S-белка, нарушают связывание S-белка SARS-COV-2 и/или SARS-COV с клеточным рецептором АСЕ2, что важно для нейтрализации вируса. Описано использование полипептидов, специфичных для белка S, для диагностики и лечения SARS-COV-2 и/или SARS-COV.WO 2021/195385 A1 describes polypeptides that specifically bind to the human coronavirus spike protein (S) selected from six phage display libraries of camelid VHH single domain antibodies. S protein-specific polypeptides interfere with the binding of the SARS-COV-2 and/or SARS-COV S protein to the ACE2 cell receptor, which is important for virus neutralization. Describes the use of polypeptides specific for the S protein for the diagnosis and treatment of SARS-COV-2 and/or SARS-COV.
Человеческие моноклональные антитела к тяжелому острому респираторному синдрому коронавируса 2 (SARS-COV-2) также известны из публикации WO 2022/006562 А1. Также предложен способ выявления инфекции COVID-19, вызванной SARS-COV-2, у субъекта, включающий (а) приведение в контакт образца от указанного субъекта с антителом или фрагментом антитела, имеющим клон-спаренные тяжелые и последовательности CDR легкой цепи из таблиц 3 и 4 соответственно; и (b) обнаружение SARS-COV-2 в указанном образце путем связывания указанного антитела или фрагмента антитела с антигеном SARS-COV-2 в указанном образце. Образец может представлять собой биологическую жидкость, такую как кровь, мокрота, слезы, слюна, слизь или сыворотка, сперма, цервикальный или вагинальный секрет, амниотическая жидкость, ткани плаценты, моча, экссудат, транссудат, соскобы тканей или фекалии. Обнаружение может включать ELISA, RIA, анализ в латеральном потоке или вестерн-блоттинг.Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-COV-2) are also known from WO 2022/006562 A1. Also provided is a method for detecting COVID-19 infection caused by SARS-COV-2 in a subject, comprising (a) contacting a sample from said subject with an antibody or antibody fragment having clone-paired heavy and light chain CDR sequences from Tables 3 and 4 respectively; and (b) detecting SARS-COV-2 in said sample by linking said antibody or antibody fragment to the SARS-COV-2 antigen in said sample. The sample may be a biological fluid such as blood, sputum, tears, saliva, mucus or serum, semen, cervical or vaginal secretions, amniotic fluid, placental tissue, urine, exudate, transudate, tissue scrapings, or feces. Detection may include ELISA, RIA, lateral flow analysis, or Western blotting.
Также опубликованы исследования по разработке биспецифических моноклональных антител (мАт) к SARS-COV-2.Studies on the development of bispecific monoclonal antibodies (mAbs) against SARS-COV-2 have also been published.
Основной гипотезой в разработке биспецифических мАт к SARS-COV-2 является гипотеза о эффективности нейтрализующих антител, нацеленных на рецептор-связывающий домен (RBD) шиловидного белка SARS-COV-2, в борьбе с COVID-19. Так, например, в работе De Gasparo et al. была разработана биспецифическая IgG1-подобная молекула (COV-X2) на основе С121 и С135, двух антител, полученных от доноров, выздоровевших от COVID-19. В работе показано, что COV-X2 одновременно связывает два независимых сайта на RBD и, в отличие от его родительских антител, предотвращает обнаруживаемое пиковое связывание с клеточным рецептором вируса, ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АСЕ2). Кроме того, COV-X2 нейтрализует SARS-COV-2 дикого типа и его варианты, вызывающие озабоченность, а также ускользающие мутанты, генерируемые родительскими моноклональными антителами. В исследовании также обнаружили, что в мышиной модели инфекции SARS-COV-2 с воспалением легких COV-X2 защищает мышей от болезни и подавляет утечку вируса. Таким образом, одновременное нацеливание на неперекрывающиеся эпитопы RBD с помощью IgG-подобных биспецифических антител возможно и эффективно и сочетает в себе преимущества коктейлей антител с преимуществами одномолекулярных подходов [De Gasparo, R., Pedotti, M., Simonelli, L. et al. Bispecific IgG neutralizes SARS-COV-2 variants and prevents escape in mice. Nature 593, 424-428 (2021)].The main hypothesis in the development of bispecific mAbs to SARS-COV-2 is the hypothesis of the effectiveness of neutralizing antibodies targeting the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-COV-2 styloid protein in the fight against COVID-19. For example, in the work of De Gasparo et al. A bispecific IgG1-like molecule (COV-X2) was developed based on C121 and C135, two antibodies obtained from donors who had recovered from COVID-19. We have shown that COV-X2 simultaneously binds two independent sites on the RBD and, unlike its parent antibodies, prevents detectable peak binding to the virus's cellular receptor, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2). In addition, COV-X2 neutralizes wild-type SARS-COV-2 and its variants of concern, as well as escape mutants generated by parental monoclonal antibodies. The study also found that in a mouse model of SARS-COV-2 infection with lung inflammation, COV-X2 protected mice from disease and suppressed viral shedding. Thus, simultaneous targeting of non-overlapping RBD epitopes with IgG-like bispecific antibodies is possible and efficient and combines the advantages of antibody cocktails with the advantages of single molecule approaches [De Gasparo, R., Pedotti, M., Simonelli, L. et al. Bispecific IgG neutralizes SARS-COV-2 variants and prevents escape in mice. Nature 593, 424-428 (2021)].
Также описана неконкурирующая пара человеческих нейтрализующих антител (В38 и Н4), блокирующих связывание SARS-COV-2 с его рецептором АСЕ2. Yanwu et al. разработали биспецифическое моноклональное антитело (bsAb15) на основе В38 и Н4. bsAb15 обладает большей нейтрализующей эффективностью, чем эти исходные антитела, приводит к меньшему селективному давлению и сохраняет нейтрализующую способность в отношении большинства вызывающих озабоченность вариантов SARS-COV-2 (с более сильной нейтрализующей активностью в отношении дельта-варианта). Также в исследовании отобрали в качестве ускользающих мутантов двух родительских мАт смесь мАт и bsAb15, демонстрируя, что bsAb15 может эффективно нейтрализовать все ускользающие мутанты с одним мАт. Кроме того, профилактическое и терапевтическое применение bsAb15 снижало титр вируса у инфицированных приматов, не являющихся человеком, и мышей, трансгенных по АСЕ2 человека. Таким образом, согласно исследованию, bsAb является осуществимой и эффективной стратегией лечения и профилактики тяжелой формы COVID-19 [Li, Z., Li, S., Zhang, G. et al. An engineered bispecific human monoclonal antibody against SARS-COV-2. Nat Immunol 23, 423-430 (2022)].Also described is a non-competing pair of human neutralizing antibodies (B38 and H4) that block the binding of SARS-COV-2 to its ACE2 receptor. Yanwu et al. developed a bispecific monoclonal antibody (bsAb15) based on B38 and H4. bsAb15 has greater neutralizing potency than these parent antibodies, results in less selective pressure, and retains neutralizing ability against most of the SARS-COV-2 variants of concern (with stronger neutralizing activity against the delta variant). The study also selected a mixture of mAb and bsAb15 as escape mutants of two parental mAbs, demonstrating that bsAb15 can effectively neutralize all single mAb escape mutants. In addition, prophylactic and therapeutic use of bsAb15 reduced viral titer in infected non-human primates and mice transgenic for human ACE2. Thus, according to the study, bsAb is a feasible and effective strategy for the treatment and prevention of severe COVID-19 [Li, Z., Li, S., Zhang, G. et al. An engineered bispecific human monoclonal antibody against SARS-COV-2. Nat Immunol 23, 423-430 (2022)].
В исследовании Dogan et al. сконструировали первичные Т-клетки CD8 для экспрессии CAR, специфичных для белка SARS-COV-2 Spike, с использованием внеклеточной области АСЕ2, и продемонстрировали их высокоспецифичную и мощную цитотоксичность по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим шиловидный белок. В качестве потенциального терапевтического средства, исследователями был разработан биспецифический активатор Т-клеток, сочетающий АСЕ2 с анти-CD3 scFv (ACE2-Bite) для нацеливания на инфицированные клетки и вирус. Подобно подходу CAR-Т-клеток, ACE2-Bite обеспечивал способность цитотоксических клеток избирательно убивать мишени, экспрессирующие шиловидный белок. Кроме того, ACE2-Bite нейтрализовал псевдовирусы SARS-COV, SARS-COV-2 дикого типа и варианты, включая Delta и Omicron, в качестве белка-приманки. Примечательно, что молекула ACE2-Bite продемонстрировала более высокую аффинность к связыванию и нейтрализации вариантов Delta и Omicron по сравнению с шиловидными белками дикого типа SARS-COV-2, что указывает на потенциал этого подхода в качестве защищенной от вариантов терапевтической стратегии для будущего SARS-COV-2 варианты, использующие как гуморальное, так и клеточное звено адаптивного иммунного ответа [Dogan, Mikail; Kozhaya, Lina; Placek, Lindsey; Karabacak, Fatih; Yigit, Mesut; Unutmaz, Derya, Targeting SARS-COV-2 Infection Through CAR-T Like Bispecific T Cell Engagers Incorporating АСЕ2].In a study by Dogan et al. constructed primary CD8 T cells to express CARs specific for the SARS-COV-2 Spike protein using the extracellular region of ACE2 and demonstrated their highly specific and potent cytotoxicity against target cells expressing the styloid protein. As a potential therapeutic agent, researchers have developed a bispecific T cell activator combining ACE2 with an anti-CD3 scFv (ACE2-Bite) to target infected cells and virus. Similar to the CAR-T cell approach, ACE2-Bite conferred the ability of cytotoxic cells to selectively kill targets expressing the styloid protein. In addition, ACE2-Bite neutralized SARS-COV, wild-type SARS-COV-2 pseudoviruses, and variants including Delta and Omicron as a bait protein. Notably, the ACE2-Bite molecule showed higher binding and neutralization affinity for Delta and Omicron variants compared to SARS-COV-2 wild-type styloid proteins, indicating the potential of this approach as a variant-protected therapeutic strategy for the future of SARS-COV. -2 variants using both humoral and cellular components of the adaptive immune response [Dogan, Mikail; Kozhaya, Lina; Placek, Lindsey; Karabacak, Fatih; Yigit, Mesut; Unutmaz, Derya, Targeting SARS-COV-2 Infection Through CAR-T Like Bispecific T Cell Engagers Incorporating ACE2].
Моноклональные антитела (мАт) стали важным компонентом лечения коронавирусной инфекции 2019 (COVID-19). Большинство мАт вводятся в виде коктейля из нескольких антител, которые нацелены на различные области вириона коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-COV-2). Так, например, было продемонстрировано, что усовершенствование этой стратегии путем выявления мАт, которые в сочетании с биспецифическими антителами нейтрализуют SARS-COV-2 лучше, чем смеси исходных мАт. Такие биспецифические антитела связывались с отдельными областями шиповидного белка SARS-COV-2, нейтрализовали вызывающие озабоченность варианты, включая вариант Delta, и обеспечивали защиту при введении хомякам до заражения SARS-COV-2. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что биспецифические антитела обладают большим потенциалом в качестве терапевтических средств против SARS-COV-2, устойчивых к вариантам [Hyeseon Cho, et al. Bispecific antibodies targeting distinct regions of the spike protein potently neutralize SARS-CoV-2 variants of concern//Sci Transl Med. 2021 Oct 20;13(616)].Monoclonal antibodies (mAbs) have become an important component in the treatment of coronavirus infection 2019 (COVID-19). Most mAbs are administered as a cocktail of multiple antibodies that target different regions of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-COV-2) virion. For example, it has been demonstrated that improving this strategy by identifying mAbs that, when combined with bispecific antibodies, neutralize SARS-COV-2 is better than mixtures of parent mAbs. These bispecific antibodies bind to specific regions of the SARS-COV-2 spike protein, neutralize variants of concern, including the Delta variant, and confer protection when administered to hamsters prior to SARS-COV-2 infection. Taken together, these data suggest that bispecific antibodies have great potential as variant-resistant therapeutics against SARS-COV-2 [Hyeseon Cho, et al. Bispecific targeting antibodies distinct regions of the spike protein potently neutralize SARS-CoV-2 variants of concern//Sci Transl Med. 2021 Oct 20;13(616)].
Однако, несмотря на успехи в лечении антителами и разработке вакцин, заболевание COVID-19, вызванное инфекцией SARS-COV-2, остается серьезной проблемой для здоровья, приводящей к чрезмерной заболеваемости и смертности, а появление новых вариантов снижает эффективность существующих вакцин. Таким образом, все еще существует потребность в разработке дополнительных антител против SARS-COV-2.However, despite advances in antibody treatment and vaccine development, COVID-19 disease caused by SARS-COV-2 infection remains a major health problem, leading to excessive morbidity and mortality, and the emergence of new variants reduces the effectiveness of existing vaccines. Thus, there is still a need to develop additional antibodies against SARS-COV-2.
Авторы настоящего изобретения разработали биспецифические антитела, нейтрализующие SARS-COV-2. Описанные здесь антитела можно использовать для лечения инфекций SARS-COV-2 и их симптомов.The authors of the present invention have developed bispecific antibodies that neutralize SARS-COV-2. The antibodies described herein can be used to treat SARS-COV-2 infections and their symptoms.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯDISCLOSURE OF THE INVENTION
В одном аспекте настоящего изобретения предложено биспецифическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфически связывающееся по меньшей мере с одним эпитопом в рецептор-связывающем домене (RBD) шиповидного белка (S) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-COV-2).In one aspect, the present invention provides a bispecific antibody, or an antigen-binding fragment thereof, that specifically binds to at least one epitope in the receptor-binding domain (RBD) of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-COV-2) spike protein (S).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный эпитоп является нелинейным.According to one implementation variant of the present invention, the specified epitope is non-linear.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанный эпитоп содержит область в пределах аминокислот 319-541 шиповидного белка, предпочтительно, указанный эпитоп содержит область в пределах аминокислот 319-490 шиповидного белка.According to a further embodiment of the present invention, said epitope comprises a region within amino acids 319-541 of the spike protein, preferably said epitope comprises a region within amino acids 319-490 of the spike protein.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело ингибирует слияние вирусной и клеточной мембраны.According to an additional implementation variant of the present invention, the specified antibody inhibits the fusion of the viral and cell membranes.
Согласно еще одному дополнительному варианту реализации настоящего изобретения антитело блокирует связывание шиповидного белка SARS-COV2 с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2) на клеточной поверхности.According to another additional embodiment of the present invention, the antibody blocks the binding of the SARS-COV2 spike protein to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor on the cell surface.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-7.According to another implementation variant of the present invention, the antibody contains an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-7.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid the sequence shown in SEQ ID NO: 5. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.According to a preferred embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело представляет собой полностью человеческое антитело.According to an additional embodiment of the present invention, said antibody is a fully human antibody.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения антитела, включающий следующие этапы: а) конструирование рекомбинантной экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей антитело по любому из пп. 1-9, б) трансфекцию полученной ДНК клеток СНО, в) культивирование полученной линии клеток, и г) выделение указанного антитела.In another aspect of the present invention, a method for producing an antibody is provided, comprising the following steps: a) constructing a recombinant expression plasmid DNA encoding an antibody according to any one of paragraphs. 1-9 b) transfecting the resulting CHO cell DNA, c) culturing the resulting cell line, and d) isolating said antibody.
Согласно одному из вариантов реализации изобретения конструирование рекомбинантной экспрессионной плазмидной ДНК осуществляется способами, широко известными специалисту в области техники.According to one embodiment of the invention, the construction of recombinant expression plasmid DNA is carried out by methods widely known to a person skilled in the art.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения после трансфекции клетки культивировали на среде BalanCD с добавлением 500000 ЕД пенициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина и 4 мМ L-глютамина при температуре 37°С, содержании CO2-5%, влажности не более 75% в течении 7 дней до точки снижения жизнеспособности ниже 80%.According to an additional embodiment of the present invention, after transfection, cells were cultured on BalanCD medium supplemented with 500,000 IU of penicillin, 100 µg/cm3 of streptomycin, and 4 mM L-glutamine at a temperature of 37°C, CO2 content of 5%, and humidity not exceeding 75% for 7 days to the point of viability drop below 80%.
Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и условиями экспериментов, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена лишь для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предполагает ограничительный характер, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться лишь прилагаемой формулой изобретения. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны только предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.It is to be understood that the present invention is not limited to the specific experimental methods and conditions described, as such methods and conditions may vary. It is also to be understood that the terminology used in this application is for the purpose of describing specific embodiments only and is not meant to be limiting, as the scope of the present invention will only be limited by the appended claims. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning, which is usually understood by a person skilled in the field to which the present invention belongs. While any methods and materials similar to or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, only the preferred methods and materials are described herein. All publications cited in this document are incorporated herein by reference in their entirety.
Используемые в настоящей заявке термины «биспецифическое моноклональное антитело», «биспецифическое антитело» «бАт», «мАт», «антитело» являются взаимозаменяемыми. Указанный термин предназначен для обозначения молекул иммуноглобулинов, состоящих из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, соединенных между собой дисульфидными связями (т.е. «молекулы полного антитела»), а также их мультимеров или их антигенсвязывающих фрагментов. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи («HCVR» или «VH») и константного участка тяжелой цепи (состоящего из доменов СН1, СН2 и СН3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи («LCVR» или «VL») и константного участка легкой цепи (CL). Участки VH и VL могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино- до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения FR антитела (или его антигенсвязывающий фрагмент) могут быть идентичными последовательностям зародышевой линии человека или могут быть естественно или искусственно изменены. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена на основании анализа «бок о бок» двух или более CDR.Used in this application, the terms "bispecific monoclonal antibody", "bispecific antibody", "bAb", "mAb", "antibody" are used interchangeably. This term is intended to refer to immunoglobulin molecules consisting of four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains connected by disulfide bonds (i.e. "complete antibody molecules"), as well as their multimers or their antigen-binding fragments. Each heavy chain is composed of a heavy chain variable region ("HCVR" or "VH") and a heavy chain constant region (consisting of the CH1, CH2, and CH3 domains). Each light chain is composed of a light chain variable region ("LCVR" or "VL") and a light chain constant region (CL). The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. In certain embodiments, the FR antibody (or antigen-binding fragment thereof) may be identical to human germline sequences, or may be naturally or artificially altered. The amino acid consensus sequence can be determined based on a side-by-side analysis of two or more CDRs.
Используемый в настоящем изобретении термин «SARS-COV-2» относится к вирусу, который является возбудителем коронавирусной инфекции COVID-19 и представляет собой оболочечный одноцепочный РНК-вирус, относящийся к семейству Coronaviridae и роду Betacoronavirus. Геном коронавирусов кодирует 4 главных структурных белка: шиловидный (S), оболочечный (Е), мембранный (М) и нуклеокапсидный (N). S-белок (шиловидный белок) представляет собой очень крупный трансмембранный белок, который собирается в тримеры и образует характерные «шипы» на поверхности коронавирусов. Каждый S-мономер состоит из N-концевой субъединицы S1 и мембранно-проксимальной субъединицы S2. Вирус проникает в клетку-хозяина путем связывания S-белка с ангиотензин-превращающим ферментом 2-го типа (АСЕ2), который находится на поверхности клеток разных типов. АСЕ2 работает как рецептор вируса и взаимодействует с рецептор-связывающим доменом (RBD) субъединицы S1.As used in the present invention, the term "SARS-COV-2" refers to a virus that is the causative agent of the coronavirus infection COVID-19 and is an enveloped single-stranded RNA virus belonging to the Coronaviridae family and the Betacoronavirus genus. The genome of coronaviruses encodes 4 main structural proteins: styloid (S), envelope (E), membrane (M), and nucleocapsid (N). The S protein (styloid protein) is a very large transmembrane protein that assembles into trimers and forms characteristic "spikes" on the surface of coronaviruses. Each S monomer consists of an N-terminal S1 subunit and a membrane-proximal S2 subunit. The virus enters the host cell by binding the S protein to angiotensin-converting enzyme type 2 (ACE2), which is found on the surface of various cell types. ACE2 acts as a viral receptor and interacts with the receptor-binding domain (RBD) of the S1 subunit.
Используемый в настоящем изобретении термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельном участке молекулы антитела, известным как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, различные антитела могут связываться с различными областями на антигене и могут иметь различные биологические эффекты. Термин «эпитоп» также относится к сайту на антигене, с которым вступают в реакцию В- и/или Т-клетки. Он также относится к участку антигена, с которым связывается антителом. Эпитопы можно определить как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы в общем представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат те остатки, которые непосредственно обусловливают свойство аффинности взаимодействия. Также эпитопы могут быть конформационными, т.е. состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерных структур и/или специфические характеристики заряда.As used in the present invention, the term "epitope" refers to an antigenic determinant that interacts with a specific antigen-binding site in the variable region of an antibody molecule known as a paratope. One antigen may have more than one epitope. Thus, different antibodies may bind to different regions on an antigen and may have different biological effects. The term "epitope" also refers to a site on an antigen with which B and/or T cells react. It also refers to the site of an antigen to which an antibody binds. Epitopes can be defined as structural or functional. Functional epitopes are generally a subgroup of structural epitopes and contain those residues that directly confer the affinity property of the interaction. Epitopes can also be conformational, i.e. consist of non-linear amino acids. In certain embodiments, epitopes may include determinants that are reactive surface groups of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups, or sulfonyl groups, and in certain embodiments, may have specific three-dimensional structure characteristics and/or specific charge characteristics.
Используемый в настоящем изобретении термин «человеческое антитело» предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и константные участки, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека.As used herein, the term "human antibody" is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences.
Используемый в настоящем изобретении термин «специфически связывает», или «специфически связывается с», или подобный означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент образуют комплекс с антигеном, который является относительно устойчивым в физиологических условиях. Специфическое связывание можно характеризовать при помощи равновесной константы диссоциации, составляющей по меньшей мере приблизительно 1×10-8 М или менее (например, значение меньше KD означает более сильное связывание). Способы определения наличия специфического связывания двух молекул хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс и им подобные.As used herein, the term "specifically binds" or "specifically binds to" or the like means that an antibody or antigen-binding fragment thereof forms a complex with an antigen that is relatively stable under physiological conditions. Specific binding can be characterized by an equilibrium dissociation constant of at least about 1×10-8 M or less (eg, a value less than KD means stronger binding). Methods for determining the presence of specific binding of two molecules are well known in the art and include, for example, equilibrium dialysis, surface plasmon resonance, and the like.
Используемый в настоящем изобретении термин «выделенное антитело», предназначен для обозначения антитела, которое, по сути, не содержит антител, специфичных в отношении другого антигена.As used in the present invention, the term "isolated antibody" is intended to refer to an antibody that essentially does not contain antibodies specific for another antigen.
В одном аспекте настоящего изобретения предложено биспецифическое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, специфически связывающееся по меньшей мере с одним эпитопом в рецептор-связывающем домене (RBD) шиповидного белка (S) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-COV-2).In one aspect, the present invention provides a bispecific antibody, or an antigen-binding fragment thereof, that specifically binds to at least one epitope in the receptor-binding domain (RBD) of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-COV-2) spike protein (S).
Разработанная молекула биспецифического моноклонального антитела Bite anti-Spike/CD3 представляет собой рекомбинантное моноклональное химерное антитело сконструированное генно-инженерным способом, селективно связывающееся с поверхностным шиповидным (Spike) белком капсида вируса SARS-COV-2, и Т-клеточным ко-рецептором (CD3) в составе протеинового комплекса, экспрессируемым на поверхности Т-клеток. Антитело способно связываться с рецептор связывающим доменом шиповидного белка вируса SARS-COV-2, тем самым обладая нейтрализующим потенциалом в отношении вируса SARS-COV-2. Антитело Bite anti-Spike/CD3 активирует эндогенные Т-клетки, соединяя CD3 в комплексе Т-клеточного рецептора (ТКР) с Spike SARS-COV-2 на поверхности зараженных клетках. Биологическая активность антитела Bite anti-Spike/CD3 проявляется через опосредованное образование цитолитического синапса между Т-клеткой и зараженной клеткой, что приводит к гибели клетки-мишени. Доказано, что антитело Bite anti-Spike/CD3 способно связываться с CD3-рецептором на поверхности CD4-/ CD8-положительных клеток. За счет биспецифической активности антитело Bite anti-Spike/CD3 может иметь терапевтический потенциал для лечения COVID-19 и профилактическое применение для предупреждения инфекционных заболеваний вызванных вариантами SARS-COV-2.The developed molecule of the bispecific monoclonal antibody Bite anti-Spike/CD3 is a genetically engineered recombinant monoclonal chimeric antibody that selectively binds to the surface spike protein (Spike) of the capsid of the SARS-COV-2 virus and the T-cell co-receptor (CD3) as part of a protein complex expressed on the surface of T-cells. The antibody is capable of binding to the receptor binding domain of the spike protein of the SARS-COV-2 virus, thereby having a neutralizing potential against the SARS-COV-2 virus. The Bite anti-Spike/CD3 antibody activates endogenous T cells by binding CD3 in the T cell receptor (TCR) complex to the SARS-COV-2 Spike on the surface of infected cells. The biological activity of the Bite anti-Spike/CD3 antibody is manifested through the mediated formation of a cytolytic synapse between the T cell and the infected cell, which leads to the death of the target cell. The Bite anti-Spike/CD3 antibody has been shown to be able to bind to the CD3 receptor on the surface of CD4-/CD8-positive cells. Due to its bispecific activity, the Bite anti-Spike/CD3 antibody may have therapeutic potential for the treatment of COVID-19 and prophylactic use in the prevention of infectious diseases caused by SARS-COV-2 variants.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный эпитоп является нелинейным.According to one implementation variant of the present invention, the specified epitope is non-linear.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанный эпитоп содержит область в пределах аминокислот 319-541 шиповидного белка.According to a further embodiment of the present invention, said epitope comprises a region within amino acids 319-541 of the spike protein.
Согласно предпочтителному варианту реализации настоящего изобретения, указанный эпитоп содержит область в пределах аминокислот 319-490 шиповидного белка.According to a preferred embodiment of the present invention, said epitope comprises a region within amino acids 319-490 of the spike protein.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело ингибирует слияние вирусной и клеточной мембраны.According to an additional implementation variant of the present invention, the specified antibody inhibits the fusion of the viral and cell membranes.
Согласно еще одному дополнительному варианту реализации настоящего изобретения антитело блокирует связывание шиповидного белка SARS-COV-2 с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2) на клеточной поверхности.According to another additional embodiment of the present invention, the antibody blocks the binding of the SARS-COV-2 spike protein to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor on the cell surface.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения антитело содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-7.According to another implementation variant of the present invention, the antibody contains an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-7.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7.According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid the sequence shown in SEQ ID NO: 3. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. According to a further embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. According to an additional implementation variant of the present invention, the specified antibody contains the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 6. According to additional var In order to carry out the present invention, said antibody contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.According to a preferred embodiment of the present invention, said antibody comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения указанное антитело представляет собой полностью человеческое антитело.According to an additional embodiment of the present invention, said antibody is a fully human antibody.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения антитела, включающий следующие этапы: а) конструирование рекомбинантной экспрессионной плазмидной ДНК, кодирующей антитело по любому из пл. 1-9, б) трансфекцию полученной ДНК клеток СНО, в) культивирование полученной линии клеток, и г) выделение указанного антитела.In another aspect of the present invention, a method for producing an antibody is provided, comprising the following steps: a) constructing a recombinant expression plasmid DNA encoding an antibody according to any of pl. 1-9 b) transfecting the resulting CHO cell DNA, c) culturing the resulting cell line, and d) isolating said antibody.
Согласно одному из вариантов реализации изобретения конструирование рекомбинантной экспрессионной плазмидной ДНК осуществляется способами, широко известными специалисту в области техники.According to one embodiment of the invention, the construction of recombinant expression plasmid DNA is carried out by methods widely known to a person skilled in the art.
Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения после трансфекции клетки культивировали на среде BalanCD с добавлением 500000 ЕД пенициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина и 4 мМ L-глютамина при температуре 37°С, содержании CO2-5%, влажности не более 75% в течении 7 дней до точки снижения жизнеспособности ниже 80%.According to an additional embodiment of the present invention, after transfection, cells were cultured on BalanCD medium supplemented with 500,000 IU of penicillin, 100 µg/cm3 of streptomycin, and 4 mM L-glutamine at a temperature of 37°C, CO2 content of 5%, and humidity not exceeding 75% for 7 days to the point of viability drop below 80%.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛАBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHICS
На Фиг. 1 показана доменная организация моноклонального биспецифического антитела (Bite) anti-Spike/CD3.On FIG. 1 shows the domain organization of a monoclonal bispecific antibody (Bite) anti-Spike/CD3.
На Фиг. 2 показаны результаты Western Blot анализа антитела Bite anti-Spike/CD3 в культуральной жидкости транзиента.On FIG. 2 shows the results of Western Blot analysis of the Bite anti-Spike/CD3 antibody in transient culture fluid.
На Фиг. 3 показаны результаты хроматографической очистки и выделения антитела Bite anti-Spike/CD3 из культуральной жидкости на Hi Trap IMAC HP 5 мл (GE)On FIG. 3 shows the results of chromatographic purification and isolation of the Bite anti-Spike/CD3 antibody from the culture liquid on Hi
На Фиг. 4 показана электрофореграмма аналитического SDS Page на наличие антитела Bite anti-Spike/CD3 после стадии Hi Trap IMAC HP 5 мл (GE)On FIG. 4 shows the electrophoregram of the analytical SDS Page for the presence of Bite anti-Spike/CD3 antibody after the Hi
На Фиг. 5 показана кривая взаимодействия белка SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 (Sino Biological, кат. №40589-V08B1) с антителом Bite anti-Spike/CD3 в дозозависимом диапазоне.On FIG. 5 shows the interaction curve of the SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 protein (Sino Biological, cat. #40589-V08B1) with the Bite anti-Spike/CD3 antibody in a dose-dependent range.
На Фиг. 6А показано определение полумаксимальной эффективной дозы (ЕС50) мАт для популяций CD4-положительных клеток.On FIG. 6A shows the determination of the half maximum effective dose (EC50) of mAb for populations of CD4 positive cells.
На Фиг. 6Б показано определение полумаксимальной эффективной дозы (ЕС50) мАт для популяций CD4-положительных клеток.On FIG. 6B shows the determination of the half maximum effective dose (EC50) of mAb for populations of CD4 positive cells.
Следующие примеры предлагаются с тем, чтобы обеспечить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и применять изобретение, но они не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают в качестве своего изобретения.The following examples are provided to provide those skilled in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the invention, but are not intended to limit the scope of what the inventors consider their invention to be.
ПРИМЕРЫEXAMPLES
Пример 1. Способ получения антитела Bite anti-Spike/CD3Example 1 Method for producing Bite anti-Spike/CD3 antibody
1.1 Дизайн антитела Bite anti-Spike/CD3.1.1 Design of the Bite anti-Spike/CD3 antibody.
Для сборки Bite формата антитела использовали вариабельные области двух антител: антитело формата IgG1, связывающий шиловидный домен вируса SARS-COV-2-CR3022; антитело против CD3 Т-клеток - блинатумомаб. Аминокислотные последовательности антител CR3022 и anti-CD3 взяты из научных публикаций и открытых источников информации. Сигнальный пептид белковой молекулы описан в уровне техники [Correnti, С.Е., Laszlo, G.S., de van der Schueren, W.J. et al. Simultaneous multiple interaction T-cell engaging (SMITE) bispecific antibodies overcome bispecific T-cell engager (BiTE) resistance via CD28 co-stimulation. Leukemia 32, 1239-1243 (2018)].To assemble the Bite format of the antibody, the variable regions of two antibodies were used: an IgG1 format antibody that binds the styloid domain of the SARS-COV-2-CR3022 virus; antibody against CD3 T cells - blinatumomab. Amino acid sequences of CR3022 and anti-CD3 antibodies are taken from scientific publications and open sources of information. The signal peptide of the protein molecule is described in the prior art [Correnti, C.E., Laszlo, G.S., de van der Schueren, W.J. et al. Simultaneous multiple interaction T-cell engaging (SMITE) bispecific antibodies overcome bispecific T-cell engager (BiTE) resistance via CD28 co-stimulation. Leukemia 32, 1239-1243 (2018)].
Между вариабельной областью легкой цепи CR3022 и вариабельной областью тяжелой цепи anti-CD3 (блинатумомаб) использовали длинный линкер GGGGGGGGGGGGS; между вариабельной областью тяжелой цепи anti-CD3 (блинатумомаб) и вариабельной областью тяжелой цепи CR3022 использовали короткий линкер GGGGS; между вариабельной областью тяжелой цепи CR3022 и вариабельной области легкой цепи anti-CD3 (блинатумомаб) использовали длинный линкер -GGSGGSGGSGGSGG. С- концевой конец молекулы тагировали 6 аминокислотами гистидина - 6xHis-tag (см. SEQ ID NO: 1). Доменная организация полученного антитела Bite anti-Spike/CD3 представлена на Фиг. 1.A long linker GGGGGGGGGGGGS was used between the CR3022 light chain variable region and the anti-CD3 heavy chain variable region (blinatumomab); a short GGGGS linker was used between the anti-CD3 heavy chain variable region (blinatumomab) and the CR3022 heavy chain variable region; between the heavy chain variable region of CR3022 and the light chain variable region of anti-CD3 (blinatumomab), a long linker -GGSGGSGGSGGSGG was used. The C-terminal end of the molecule was tagged with 6 histidine amino acids - 6xHis-tag (see SEQ ID NO: 1). The domain organization of the resulting Bite anti-Spike/CD3 antibody is shown in FIG. 1.
1.2. Создание конструкции pCMV_anti-Spike/CD3.1.2. Creation of the pCMV_anti-Spike/CD3 construct.
Нуклеотидную последовательность антитела Bite anti-Spike/CD3 синтезировали с оптимизацией кодонового состава под экспрессию в клетках млекопитающих: клетки HEK293 и СНО. Ген Bite anti-Spike/CD3 и вектор pCMV3-untagged (Sino Biological) подвергали рестрикционной обработке двумя эндонуклеазами HindIII и XbaI для получения липких концов и затем очищали от эндонуклеаз и продуктов рестрикционного расщепления с помощью набора («Qiagene», Германия). Полученные фрагменты лигировали по липким концам, формирующимся в результате рестрикционного расщепления. Реакцию лигирования вектора и вставки осуществляли с помощью ДНК-лигазы фага Т4 («Neb», США), в эквимолярном соотношении (вектор/вставка - 1/3). Отобранные единичные колонии пересевали в жидкую среду 2YT с содержанием селективного антибиотика ампициллина 100 мкг/см3 и культивировали на шейкере при 37°С в течение 16 часов при 220 об/мин. Затем из полученной ночной культуры с помощью набора «Plasmide MiniPrep» («Qiagene», Германия) выделяли плазмидную ДНК, которую далее использовали в аналитической рестрикции. Полученные клоны на этапе скрининга анализировали на наличие специфической вставки с помощью аналитической рестрикции по фланкирующим эндонуклеазам (HindIII и XbaI).The nucleotide sequence of the Bite anti-Spike/CD3 antibody was synthesized with optimization of the codon composition for expression in mammalian cells: HEK293 and CHO cells. The Bite anti-Spike/CD3 gene and the pCMV3-untagged vector (Sino Biological) were subjected to restriction digestion with two endonucleases HindIII and XbaI to obtain sticky ends and then purified from endonucleases and restriction cleavage products using a kit (Qiagene, Germany). The resulting fragments were ligated at sticky ends formed as a result of restriction cleavage. The ligation reaction of the vector and insert was carried out using T4 phage DNA ligase (Neb, USA) in an equimolar ratio (vector/insert - 1/3). Selected single colonies were inoculated into a 2YT liquid medium containing the selective
1.3. Транзиторная экспрессия антитела Bite anti-Spike/CD3 в клетках СНО.1.3. Transient expression of the Bite anti-Spike/CD3 antibody in CHO cells.
Для получения рекомбинантных белков была выбрана эукариотическая система экспрессии с использованием клеточной линии яичников китайского хомячка (Chinese hamster ovary - СНО) «FreeStyle CHO-S» (ThermoFisher, США).To obtain recombinant proteins, a eukaryotic expression system was chosen using the FreeStyle CHO-S (ThermoFisher, USA) cell line of Chinese hamster ovary (Chinese hamster ovary - CHO).
Трансфекцию клеток СНО, находящиеся в фазе логарифмического роста, осуществляли с помощью электропорации приборе Gene Pulse Xcell («Bio-Rad», США). После трансфекции клетки культивировали на среде BalanCD с добавлением 500000 ЕД пенициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина и 4 мМ L-глютамина при температуре 37°С, содержании CO2-5%, влажности не более 75% в течении 7 дней до точки снижения жизнеспособности ниже 80%. Образцы культуральной жидкости отбирали для оценки экспрессии антитела. Оценку наличия антитела Bite anti-Spike/CD3 в культуральной жидкости проводили с помощью анализа Western Blot.CHO cells in the logarithmic growth phase were transfected using electroporation on a Gene Pulse Xcell device (Bio-Rad, USA). After transfection, cells were cultured in BalanCD medium supplemented with 500,000 IU penicillin, 100 μg/cm3 streptomycin, and 4 mM L-glutamine at 37°C, CO2-5%, humidity no more than 75% for 7 days until the viability decline point was below 80%. Culture fluid samples were taken to evaluate antibody expression. The presence of Bite anti-Spike/CD3 antibody in the culture fluid was assessed using Western Blot analysis.
1. 4. Анализ Western Blot антитела Bite anti-Spike/CD3 в культуральной жидкости транзиента.1. 4. Western Blot analysis of Bite anti-Spike/CD3 antibody in transient culture fluid.
В качестве образцов для анализа использовали образцы культуральной жидкости транзиента. Для проведения анализа WB на 12,5% полиакриламидный гель наносили по 10 мкл образца, подготовленных для белкового фореза. Перенос белковых образцов проводили полусухим способом с использованием PVDF мембраны. Перенос проводили при силе тока в 150 мА, в течение 50 мин. Неспецифическое блокирование мембраны PVDF после переноса проводили буфером PBST с добавлением сухого молока в концентрации 2%.Samples of the culture liquid of the transient were used as samples for analysis. For WB analysis, 10 μl of the sample prepared for protein phoresis was applied to a 12.5% polyacrylamide gel. The transfer of protein samples was carried out in a semi-dry manner using a PVDF membrane. The transfer was carried out at a current of 150 mA for 50 min. Nonspecific blocking of the PVDF membrane after transfer was performed with PBST buffer with the addition of powdered milk at a concentration of 2%.
Мембрану инкубировали в растворе антител Rb pAb to 6х His tag HRP-conjugate (разведение раствора 1:5000), по окончании инкубации мембрану промывали однократным буфером PBST, затем на мембрану наносили раствор для появления хемилюминесценции. Результат реакции фиксировался системой документирования гелей.The membrane was incubated in a solution of antibodies Rb pAb to 6x His tag HRP-conjugate (dilution of the solution 1:5000), after incubation, the membrane was washed with a single PBST buffer, then the solution was applied to the membrane for the appearance of chemiluminescence. The result of the reaction was recorded by the gel documentation system.
Для сопоставления анализа уровня экспрессии также наносили тот же образец культуральной жидкости транзиента на 2,5% полиакриламидный гель (SDS Page) с дальнейшим окрашиванием раствора Кумасси (см. Фиг. 2).To compare the expression level analysis, the same transient culture fluid sample was also applied to a 2.5% polyacrylamide gel (SDS Page) followed by Coomassie staining (see Fig. 2).
Анализ Western Blot образца в культуральной жидкости транзиента показал наличие специфичной полосы молекулярным весом от 55 до 70 кДа. Наличие единственной полосы в данном области указывает на характерную электрофоретическую подвижность антитела Bite anti-Spike/CD3 имеющую схожую теоретическую молекулярную массу, рассчитанной по аминокислотной последовательности. При анализе 12,5% SDS Page четкой полосы невозможно определить из-за большой нагрузки по белку на лунку.Western Blot analysis of the sample in the culture fluid of the transient showed the presence of a specific band with a molecular weight of 55 to 70 kDa. The presence of a single band in this region indicates the characteristic electrophoretic mobility of the Bite anti-Spike/CD3 antibody having a similar theoretical molecular weight calculated from the amino acid sequence. In the analysis of 12.5% SDS Page, a clear band cannot be determined due to the high protein load per well.
1.5. Хроматографическая очистка и выделение антитела Bite anti-Spike/CD3 из культуральной жидкости.1.5. Chromatographic purification and isolation of the Bite anti-Spike/CD3 antibody from the culture fluid.
Выделение рекомбинантного антитела Bite anti-Spike/CD3 проводили с помощью металл-хелатной хроматографии с применением IMAC Sepharose FF. Н первом этапе очистки использовали колонку Hi Trap IMAC HP 5 мл (GE). Хроматографию проводили при 4°С с использованием системы
Анализ наличия антитела Bite anti-Spike/CD3 с помощью SDS Page (см. Фиг. 4) показал, что в основной фракции элюата был обнаружен целевой белок с мажорной полосой в диапазоне молекулярного веса от 55 до 70 кДа. Молекулярный вес целевого белка совпадает с молекулярным весом идентифицированного белка при анализе культуральнйо жидкости транзиента на этапе анализа наличия в культуральной жидкости транзиента антитела Bite anti-Spike/CD3 с помощью анализа Western Blot (Фиг. 2). Таким образом, можно отметить, что авторами настоящего изобретения была выделена целевая фракция, характерная для антитела Bite anti-Spike/CD3. После подтверждения подлинности антитела Bite anti-Spike/CD3 основную фракцию элюата диализовали в буфер готовой формы - PBS.Analysis of the presence of Bite anti-Spike/CD3 antibody using SDS Page (see Fig. 4) showed that the target protein with a major band in the molecular weight range from 55 to 70 kDa was found in the main fraction of the eluate. The molecular weight of the target protein matches the molecular weight of the identified protein when analyzing the culture fluid of the transient at the stage of analyzing the presence of the Bite anti-Spike/CD3 antibody transient in the culture fluid using Western Blot analysis (Fig. 2). Thus, it can be noted that the authors of the present invention have isolated the target fraction characteristic of the Bite anti-Spike/CD3 antibody. After confirming the identity of the Bite anti-Spike/CD3 antibody, the main fraction of the eluate was dialyzed into the buffer of the finished form - PBS.
1.6. Измерение концентрации антитела Bite anti-Spike/CD3.1.6. Bite anti-Spike/CD3 antibody concentration measurement.
Определение концентрации проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см по сравнению с буфером готовой формы (БГФ) - PBS. Рассчитанный коэффициент экстинкции для антитела Bite anti-Spike/CD3 в программе PROTEIN CALCULATOR v3.4 (http://protcalc.sourceforge.net/) составил - ε'X=280nm=2.1483 (мг/мл)-1 см-1. Концентрацию выражали в мг/мл и рассчитывали по формуле:The determination of the concentration was carried out by spectrophotometric method at a wavelength of 280 nm in cuvettes with an optical path length of 1 cm compared with the buffer of the finished form (BGF) - PBS. The calculated extinction coefficient for the Bite anti-Spike/CD3 antibody in the PROTEIN CALCULATOR v3.4 program (http://protcalc.sourceforge.net/) was - ε'X=280nm=2.1483 (mg/mL)-1 cm-1. The concentration was expressed in mg/ml and calculated by the formula:
ODcp - среднее значение оптической плотности,OD cp - average value of optical density,
R - значение разведения,R - dilution value,
Кэ (Коэффициент экстинкции) = 2,1483Ke (Extinction Coefficient) = 2.1483
Полученные результаты:Results:
Пример 2. Подтверждение активности антитела Bite anti-Spike/CD3. Связывание Spike белком SARS-COV-2.Example 2 Confirmation of the activity of the Bite anti-Spike/CD3 antibody. Spike binding by the SARS-COV-2 protein.
Метод определения основан на твердофазном иммуноферментном анализе - ИФА с применением рекомбинантных антигена S1 коронавируса SARS-COV-2 и моноклонального Bite anti-Spike/CD3. Метод основан на взаимодействии S-белка с одной вариабельной областей (CR3022) антитела Bite anti-Spike/CD3. Образующийся комплекс после инкубации и отмывки обнаруживали с помощью мышиных антител к 6xHis-tag (Ab1187, Abeam), конъюгированных с пероксидазой хрена.The determination method is based on enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA using recombinant SARS-COV-2 coronavirus S1 antigen and monoclonal Bite anti-Spike/CD3. The method is based on the interaction of the S protein with one variable region (CR3022) of the Bite anti-Spike/CD3 antibody. The resulting complex after incubation and washing was detected using mouse antibodies to 6xHis-tag (Ab1187, Abeam) conjugated with horseradish peroxidase.
Белок SARS-COV-2 (2019-nCoV) Spike S1+S2 (Sino Biological, кат. №40589-V08B1) с концентрацией 100 мкг/мл наносили на планшеты по 100 мкл в лунку от концентрации 2000 нг на лунку 0 до нг на лунку разведенные в фосфатно-солевом буферном растворе для иммуноферментного анализа рН 7,2-7,6 (PBSt). Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 60±10 минут при температуре (37±2)°С при 250 об/мин. После инкубации лунки планшетов промывали 4 раза раствором PBSt по 800 мкл/лунку.SARS-COV-2 (2019-nCoV) Spike S1+S2 protein (Sino Biological, cat. no. 40589-V08B1) at a concentration of 100 μg/ml was applied to the plates at 100 μl per well from a concentration of 2000 ng per
Антитело Bite anti-Spike/CD3 разводили в PBSta в 1000 раз и наносили по 100 мкл/лунку раствора антител. Планшеты заклеивали пленкой и инкубировали в течение 60±10 минут при температуре (37±2)°С при 250 об/мин. После инкубации лунки планшетов промывали 4 раза по 800 мкл/лунку раствором PBSt. Далее вносили мышиные антитела к 6xHis-tag (Ab1187, Abeam), конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в 2500 раз, также в PBSt. И инкубировали в течение 60±10 минут при температуре (37±2)°С при 250 об/мин. После инкубации лунки планшетов промывали 4 раза раствором PBSt по 800 мкл/лунку.The Bite anti-Spike/CD3 antibody was diluted 1000-fold in PBSta and applied at 100 µl/well of the antibody solution. The plates were taped and incubated for 60±10 minutes at (37±2)°C at 250 rpm. After incubation, the wells of the plates were washed 4 times with 800 μl/well of PBSt solution. Next, mouse antibodies to 6xHis-tag (Ab1187, Abeam) conjugated with horseradish peroxidase, diluted 2500 times, also in PBSt, were added. And incubated for 60±10 minutes at a temperature of (37±2)°C at 250 rpm. After incubation, the wells of the plates were washed 4 times with a solution of PBSt at 800 μl/well.
После промывки в лунки планшетов вносили по 100 мкл раствора субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина («БиоТест Системы», кат. №01016-1). Инкубировали планшеты при комнатной температуре, до появления интенсивного синего окрашивания (в течение 5 мин). Реакцию останавливали внесением 100 мкл/лунку стоп-раствора (0,5 М раствор серной кислоты). Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 450 нм.After washing, 100 μl of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine substrate solution (BioTest Systems, cat. No. 01016-1) was added to the wells of the plates. The plates were incubated at room temperature until an intense blue color appeared (for 5 min). The reaction was stopped by adding 100 μl/well of stop solution (0.5 M sulfuric acid solution). The optical density was measured on a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.
В результате было показано специфиячное образование комплекса антиген-антитело. Белок SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 (Sino Biological, кат. №40589-V08B1) связывался с антителом Bite anti-Spike/CD3 в дозозависимом диапазоне. На Фиг. 5 показана кривая взаимодействия белка SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 (Sino Biological, кат. №40589-V08B1) с антителом Bite anti-Spike/CD3 в дозозависимом диапазоне.As a result, specific formation of the antigen-antibody complex was shown. The SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 protein (Sino Biological cat. no. 40589-V08B1) bound to the Bite anti-Spike/CD3 antibody in a dose-dependent manner. On FIG. 5 shows the interaction curve of the SARS-COV-2 (2019-nCOV) Spike S1+S2 protein (Sino Biological, cat. #40589-V08B1) with the Bite anti-Spike/CD3 antibody in a dose-dependent range.
Пример 3. Связывание антитела Bite anti-Spike/CD3 с CD3, экспрессированными на поверхности Т- клетокExample 3 Bite anti-Spike/CD3 antibody binding to CD3 expressed on the surface of T cells
Подготовка клеток и инкубация с исследуемым мАт. Ампулу с мононуклеарными клетками периферической крови (далее - МКПК) размораживали на водяной бане при температуре (37±2)°С в течение 2-3 мин. Содержимое ампулы переносили в центрифужную пробирку вместимостью 15 мл, содержащую 14,0 мл теплой питательной среды DMEM/F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки. Центрифугировали в течение 5 мин при скорости 400g в условиях комнатной температуры (22±2)°С. Надосадочную жидкость удаляли, осадок клеток ресуспендировали в 1,0 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора, доводили объем до 15,0 мл ФСБ и центрифугировали в течение 5 мин при скорости 450g при температуре (22±2)°С. Ресуспендировали в 1 мл FACS и считали концентрацию клеток. В эксперименте использовали клетки с жизнеспособностью не менее 95%. Готовили суспензию клеток с концентрацией 1 млн/мл в нагретом до 20 (±5°С) FACS буфере.Cell preparation and incubation with test mAb. An ampoule with peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as PBMCs) was thawed in a water bath at a temperature of (37±2)°C for 2–3 min. The contents of the ampoule were transferred to a 15 ml centrifuge tube containing 14.0 ml of warm DMEM/F12 nutrient medium with 10% fetal bovine serum. Centrifuged for 5 min at a speed of 400g at room temperature (22±2)°C. The supernatant was removed, the cell sediment was resuspended in 1.0 ml of sterile phosphate-buffered saline, the volume was adjusted to 15.0 ml of PBS, and centrifuged for 5 min at a speed of 450 g at a temperature of (22 ± 2)°C. Resuspended in 1 ml FACS and counted the cell concentration. Cells with a viability of at least 95% were used in the experiment. A cell suspension was prepared at a concentration of 1 million/ml in FACS buffer heated to 20 (±5°C).
Переносили суспензию клеток в лунки V-образного планшета в объеме 100 мкл. В лунки планшета вносили 100 мкл разведений исследуемого мАт и осторожно пипетировали. Инкубировали в течение (30±5) мин при 5 (±3°С). По окончанию инкубации дважды отмывали клетки охлажденным до 5 (±3°С) FACS буфером, осаждая при 450 g 5 минут при 5 (±3°С).The cell suspension was transferred into the wells of a V-shaped plate in a volume of 100 μl. 100 μl dilutions of the test mAb were added to the wells of the plate and carefully pipetted. Incubated for (30±5) min at 5 (±3°C). At the end of the incubation, the cells were washed twice with FACS buffer cooled to 5 (±3°С), sedimenting at 450 g for 5 minutes at 5 (±3°С).
Цитофенотипирование клеток. Готовили раствор для блокирования неспецифического связывания с Fc-рецепторами клеток (человеческий Fc-блок) в разведении 1:200 в охлажденном FACS буфере. В растворе Fc-блока готовили смесь красок: anti-Human CD4-PerCP Су5.5 (PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD4 Clone L200 cat. №552838, 1:150), Anti-Human CD8-BB515 (BB515 Mouse Anti-Human CD8, Clone RPA-T8, cat. №1:200), Streptavidin BV421 (BV421 Streptavidin6 cat. №563259, разведение 1:200).Cytophenotyping of cells. A solution was prepared to block non-specific binding to cell Fc receptors (human Fc block) at a 1:200 dilution in chilled FACS buffer. A mixture of dyes was prepared in the Fc block solution: anti-Human CD4-PerCP Cy5.5 (PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD4 Clone L200 cat. No. 552838, 1:150), Anti-Human CD8-BB515 (BB515 Mouse Anti-Human CD8, Clone RPA-T8, cat. no. 1:200), Streptavidin BV421 (BV421 Streptavidin6 cat. no. 563259, dilution 1:200).
Инкубировали в течение 20 (±5) мин во льду. По окончанию инкубации, клетки однократно отмывали 2,0 мл охлажденного FACS-буфера и осаждали центрифугированием 5 минут при 500g при температуре (5±3)°С. Фиксировали клетки в 100 мкл FIX буфера.Incubated for 20 (±5) min on ice. At the end of the incubation, the cells were washed once with 2.0 ml of cooled FACS buffer and sedimented by centrifugation for 5 minutes at 500g at a temperature of (5±3)°C. Cells were fixed in 100 µl of FIX buffer.
Гейтирование целевых популяций. Интенсивность флуоресценции клеток измеряли на проточном цитофлуориметре BD LSR Fortessa. В координатах прямого и бокового светорассеяния выделяли гейт синглетных событий. В гейте синглетных событий выделяли клеточный гейт. Из клеточного гейта выделяли CD4- и CD8-положительные клетки. Для определения процента клеток, связанных с исследуемым мАт в популяциях CD4- и CD8-положительных клеток выделяли популяцию клеток, положтельную по BV421. Клетки, положительные по BV421 определяли как клетки, связанные с исследуемым мАт. Определения значений ЕС50 проводили по медиане флуоресцентного сигнала по BV421 (далее - MFI).Gating of target populations. Cell fluorescence intensity was measured on a BD LSR Fortessa flow cytometer. In the coordinates of forward and side light scattering, the gate of singlet events was identified. A cell gate was isolated in the gate of singlet events. CD4- and CD8-positive cells were isolated from the cell gate. To determine the percentage of cells associated with the test mAb in populations of CD4- and CD8-positive cells, a population of cells positive for BV421 was isolated. Cells positive for BV421 were defined as cells associated with the test mAb. EC50 values were determined by the median of the fluorescent signal for BV421 (hereinafter referred to as MFI).
Обработка результатов. Обработку результатов проводили в программе FlowJo версии 7.6.5. Средние значения, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (CV) рассчитывали для каждой экспериментальной точки в программе Microsoft Excel. Расчет критерия приемлемости R2 (коэффициент достоверности аппроксимации) и обработку результатов проводили в программе GraphPadPrism 8.0, аппроксимируя зависимость MFI по BV421 от десятичного логарифма разведения мАт 4-х параметрической логистической функцией «доза-ответ». Определяли полумаксимальную эффективную дозу (ЕС50) мАт для популяций CD4- и CD8-положительных клеток (Фиг. 6А и 6Б).Processing of results. The results were processed using the FlowJo software version 7.6.5. Mean values, standard deviation (SD), and coefficient of variation (CV) were calculated for each experimental point in Microsoft Excel. The acceptance criterion R2 (approximation confidence factor) was calculated and the results were processed using the GraphPadPrism 8.0 program, approximating the dependence of MFI for BV421 on the decimal logarithm of mAb dilution with a 4-parameter dose-response logistic function. The half-maximal effective dose (EC50) of the mAb was determined for the CD4- and CD8-positive cell populations (FIGS. 6A and 6B).
1. При инкубации МКПК условно здорового донора с 500 нМ исследуемого мАт, 97,8% CD4-положительных и 61,05% CD8-положительных клеток были связаны с исследуемым мАт.1. Upon incubation of PBMCs from an apparently healthy donor with 500 nM of the test mAb, 97.8% of CD4-positive and 61.05% of CD8-positive cells were bound to the test mAb.
2. Значение ЕС50 связывания исследуемого мАт с CD3-рецептором на поверхности CD4- положительных клеток условно-здоровых доноров составило 2,699 и 3,309 нМ для доноров 1 и 2 соответственно.2. The EC50 value of the binding of the studied mAb to the CD3 receptor on the surface of CD4-positive cells of conditionally healthy donors was 2.699 and 3.309 nM for
3. Значение . ЕС50 связывания исследуемого мАт с CD3-рецептором на поверхности CD8- положительных клеток условно здоровых доноров составило 2,706 и 3,026 нМ для доноров 1 и 2 соответственно.3. Meaning. The EC50 of the binding of the studied mAb to the CD3 receptor on the surface of CD8-positive cells of apparently healthy donors was 2.706 and 3.026 nM for
Таким образом, исследуемое мАт способно связываться с CD3-рецептором на поверхности CD4-/CD8-положительных клеток. Значения полумаксимальной эффективной концентрации связывания с CD3-рецептором на поверхности CD4-/ CD8-положительных клеток различается для разных доноров.Thus, the studied mAb is able to bind to the CD3 receptor on the surface of CD4-/CD8-positive cells. The values of the half-maximal effective concentration of binding to the CD3 receptor on the surface of CD4-/CD8-positive cells differ for different donors.
Следует понимать, что объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации настоящего изобретения, помимо описанных в настоящей заявке, будут очевидны специалистам в данной области техники исходя из изложенного выше описания и прилагаемых фигур. Такие модификации находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения.It should be understood that the scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention, in addition to those described in this application, will be obvious to experts in the art based on the above description and the accompanying figures. Such modifications are within the scope of the appended claims.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> <110>
<120> БИСПЕЦИФИЧЕСКОЕ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ SARS-CoV-2<120> BI-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST SARS-CoV-2
<160> 6 <160> 6
<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 504<211> 504
<212> Антитело<212> Antibody
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 1<400> 1
EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR
ATGIP DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGGATGIP DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG
GSGGG GSGGG GS2QV QLQQS GAELV RPGSS VKISC KASGY AFSSY WMNWV KQRPGGSGGG GSGGG GS2QV QLQQS GAELV RPGSS VKISC KASGY AFSSY WMNWV KQRPG
QGLEW IGQIW PGDGD TNYNG KFKGK ATLTA DESSS TAYMQ LSSLA SEDSA VYFCAQGLEW IGQIW PGDGD TNYNG KFKGK ATLTA DESSS TAYMQ LSSLA SEDSA VYFCA
RRETT TVGRY YYAMD YWGQG TTVTV SSGGG GS3EV QLLES GGGLV QPGGS LRLSC AASGF RRETT TVGRY YYAMD YWGQG TTVTV SSGGG GS3EV QLLES GGGLV QPGGS LRLSC AASGF
TFSWY AMSWV RQAPG KGLEW VSYIR HQAGS TEYAD SVKGR FTISR DNSKN TLYLQ MNSLR TFSWY AMSWV RQAPG KGLEW VSYIR HQAGS TEYAD SVKGR FTISR DNSKN TLYLQ MNSLR
AEDTA VYYCA RGDYK RRAYS AIDYW GQGTL VTVSS GGSGG SGGSG GSGG4 VDDIQ LTQSP AEDTA VYYCA RGDYK RRAYS AIDYW GQGTL VTVSS GGSGG SGGSG GSGG4 VDDIQ LTQSP
AIMSA SPGEK VTMTC RASSS VSYMN WYQQK SGTSP KRWIY DTSKV ASGVP YRFSG SGSGT AIMSA SPGEK VTMTC RASSS VSYMN WYQQK SGTSP KRWIY DTSKV ASGVP YRFSG SGSGT
SYSLT ISSME AEDAA TYYCQ QWSSN PLTFG AGTKL ELKHH HHHH SYSLT ISSME AEDAA TYYCQ QWSSN PLTFG AGTKL ELKHH HHHH
<210> 2<210> 2
<211> 504<211> 504
<212> Антитело<212> Antibody
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 2<400> 2
EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSREIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR
ATGIP DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG ATGIP DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG
GSGGG GSGGG GSDIQ LTQTP ASLAV SLGQR ATISC KASQS VDYDG DSYLN WYQQI GSGGG GSGGG GSDIQ LTQTP ASLAV SLGQR ATISC KASQS VDYDG DSYLN WYQQI
PGQPP KLLIY DASNL VSGIP PRFSG SGSGT DFTLN IHPVE KVDAA TYHCQ QSTED PGQPP KLLIY DASNL VSGIP PRFSG SGSGT DFTLN IHPVE KVDAA TYHCQ QSTED
PWTFG GGTKL EIKGG GGSEV QLLES GGGLV QPGGS LRLSC AASGF TFSWY AMSWV PWTFG GGTKL EIKGG GGSEV QLLES GGGLV QPGGS LRLSC AASGF TFSWY AMSWV
RQAPG KGLEW VSYIR HQAGS TEYAD SVKGR FTISR DNSKN TLYLQ MNSLR AEDTA RQAPG KGLEW VSYIR HQAGS TEYAD SVKGR FTISR DNSKN TLYLQ MNSLR AEDTA
VYYCA RGDYK RRAYS AIDYW GQGTL VTVSS GGSGG SGGSG GSGGQ VQLQQ SGAEL VYYCA RGDYK RRAYS AIDYW GQGTL VTVSS GGSGG SGGSG GSGGQ VQLQQ SGAEL
VRPGS SVKIS CKASG YAFSS YWMNW VKQRP GQGLE WIGQI WPGDG DTNYN GKFKG VRPGS SVKIS CKASG YAFSS YWMNW VKQRP GQGLE WIGQI WPGDG DTNYN GKFKG
KATLT ADESS STAYM QLSSL ASEDS AVYFC ARRET TTVGR YYYAM DYWGQ GTSVT KATLT ADESS STAYM QLSSL ASEDS AVYFC ARRET TTVGR YYYAM DYWGQ GTSVT
VSSHH HHHH VSSHH HHHH
<210> 3<210> 3
<211> 497<211> 497
<212> Антитело<212> Antibody
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 3<400> 3
EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR ATGIP EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR ATGIP
DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG GSGGG GSGGG DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG GSGGG GSGGG
GSDVV MTQSH RFMST SVGDR VSITC RASQD VNTAV SWYQQ KPGQS PKLLI FSASY RYTGV GSDVV MTQSH RFMST SVGDR VSITC RASQD VNTAV SWYQQ KPGQS PKLLI FSASY RYTGV
PDRFT GSGSG ADFTL TISSV QAEDL AVYYC QQHYS TPWTF GGGTK LDIKG GGGSE VQLLE PDRFT GSGSG ADFTL TISSV QAEDL AVYYC QQHYS TPWTF GGGTK LDIKG GGGSE VQLLE
SGGGL VQPGG SLRLS CAASG FTFSW YAMSW VRQAP GKGLE WVSYI RHQAG STEYA DSVKG SGGGL VQPGG SLRLS CAASG FTFSW YAMSW VRQAP GKGLE WVSYI RHQAG STEYA DSVKG
RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC ARGDY KRRAY SAIDY WGQGT LVTVS SGGSG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC ARGDY KRRAY SAIDY WGQGT LVTVS SGGSG
GSGGS GGSGG QIQLV QSGPD LKKPG ETVKL SCKAS GYTFT NFGMN WVKQA PGKGF KWMAW GSGGS GGSGG QIQLV QSGPD LKKPG ETVKL SCKAS GYTFT NFGMN WVKQA PGKGF KWMAW
INTYT GESYF ADDFK GRFAF SVETS ATTAY LQINN LKTED TATYF CARGE IYYGY DGGFA INTYT GESYF ADDFK GRFAF SVETS ATTAY LQINN LKTED TATYF CARGE IYYGY DGGFA
YWGQG TLVTV SHHHH HH YWGQG TLVTV SHHHH HH
<210> 4<210> 4
<211> 497<211> 497
<212> Антитело<212> Antibody
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 4<400> 4
EIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR ATGIPEIVLT QSPGT LSLSP GERAT LSCRA SQSVS SSYLA WYQQK PGQAP RLLIY GASSR ATGIP
DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG GSGGG GSGGG DRFSG SGSGT DFTLA ISRLE PEDFA VYYCQ QYGSS PTFGQ GTKVE IKGGG GSGGG GSGGG
GSAIQ MTQSP SSLSA SVGDR VTITC RASED IYNGL AWYQQ KPGKA PKLLI YGASS LQDGV GSAIQ MTQSP SSLSA SVGDR VTITC RASED IYNGL AWYQQ KPGKA PKLLI YGASS LQDGV
PSRFS GSGSG TEFTL TISSL QPEDE ATYYC AGPHK YPLTF GGGTK VEIKG GGGSE VQLLE PSRFS GSGSG TEFTL TISSL QPEDE ATYYC AGPHK YPLTF GGGTK VEIKG GGGSE VQLLE
SGGGL VQPGG SLRLS CAASG FTFSW YAMSW VRQAP GKGLE WVSYI RHQAG STEYA DSVKG SGGGL VQPGG SLRLS CAASG FTFSW YAMSW VRQAP GKGLE WVSYI RHQAG STEYA DSVKG
RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC ARGDY KRRAY SAIDY WGQGT LVTVS SGGSG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC ARGDY KRRAY SAIDY WGQGT LVTVS SGGSG
GSGGS GGSGG EVQLL ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GFTFS NYDMA WVRQA PGKGL EWVSS GSGGS GGSGG EVQLL ESGGG LVQPG GSLRL SCAAS GFTFS NYDMA WVRQA PGKGL EWVSS
ISTRG DITSY RDSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CARQD YYTDY MGFAY ISTRG DITSY RDSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CARQD YYTDY MGFAY
WGQGT LVTVS SHHHH HHWGQGT LVTVS SHHHH HH
<210> 5<210> 5
<211> 502<211> 502
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 5<400> 5
DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP
DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSQV DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSQV
QLQQS GAELV RPGSS VKISC KASGY AFSSY WMNWV KQRPG QGLEW IGQIW PGDGD TNYNG KFKGK QLQQS GAELV RPGSS VKISC KASGY AFSSY WMNWV KQRPG QGLEW IGQIW PGDGD TNYNG KFKGK
ATLTA DESSS TAYMQ LSSLA SEDSA VYFCA RRETT TVGRY YYAMD YWGQG TTVTV SSGGG GSQMQ ATLTA DESSS TAYMQ LSSLA SEDSA VYFCA RRETT TVGRY YYAMD YWGQG TTVTV SSGGG GSQMQ
LVQSG TEVKK PGESL KISCK GSGYG FITYW IGWVR QMPGK GLEWM GIIYP GDSET RYSPS FQGQV LVQSG TEVKK PGESL KISCK GSGYG FITYW IGWVR QMPGK GLEWM GIIYP GDSET RYSPS FQGQV
TISAD KSINT AYLQW SSLKA SDTAI YYCAG GSGIS TPMDV WGQGT TVTVG GSGGS GGSGG SGGVD TISAD KSINT AYLQW SSLKA SDTAI YYCAG GSGIS TPMDV WGQGT TVTVG GSGGS GGSGG SGGVD
DIQLT QSPAI MSASP GEKVT MTCRA SSSVS YMNWY QQKSG TSPKR WIYDT SKVAS GVPYR FSGSG DIQLT QSPAI MSASP GEKVT MTCRA SSSVS YMNWY QQKSG TSPKR WIYDT SKVAS GVPYR FSGSG
SGTSY SLTIS SMEAE DAATY YCQQW SSNPL TFGAG TKLEL KHHHH HH SGTSY SLTIS SMEAE DAATY YCQQW SSNPL TFGAG TKLEL KHHHH HH
<210> 6<210> 6
<211> 463<211> 463
<212> Антитело<212> Antibody
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 6<400> 6
DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP
DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSAI DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSAI
QMTQS PSSLS ASVGD RVTIT CRASE DIYNG LAWYQ QKPGK APKLL IYGAS SLQDG VPSRF SGSGS QMTQS PSSLS ASVGD RVTIT CRASE DIYNG LAWYQ QKPGK APKLL IYGAS SLQDG VPSRF SGSGS
GTEFT LTISS LQPED EATYY CAGPH KYPLT FGGGT KVEIK GGGGS QMQLV QSGTE VKKPG ESLKI GTEFT LTISS LQPED EATYY CAGPH KYPLT FGGGT KVEIK GGGGS QMQLV QSGTE VKKPG ESLKI
SCKGS GYGFI TYWIG WVRQM PGKGL EWMGI IYPGD SETRY SPSFQ GQVTI SADKS INTAY LQWSS SCKGS GYGFI TYWIG WVRQM PGKGL EWMGI IYPGD SETRY SPSFQ GQVTI SADKS INTAY LQWSS
LKASD TAIYY CAGGS GISTP MDVWG QGTTV TVGGS GGSGG SGGSG GEVQL LESGG GLVQP GGSLR LKASD TAIYY CAGGS GISTP MDVWG QGTTV TVGGS GGSGG SGGSG GEVQL LESGG GLVQP GGSLR
LSCAA SGFTF SNYDM AWVRQ APGKG LEWVS SISTR GDITS YRDSV KGRFT ISRDN SKNTL YLQMN LSCAA SGFTF SNYDM AWVRQ APGKG LEWVS SISTR GDITS YRDSV KGRFT ISRDN SKNTL YLQMN
SLRAE DTAVY YCARQ DYYTD YMGFA YWGQG TLVTV SSHHH HHH SLRAE DTAVY YCARQ DYYTD YMGFA YWGQG TLVTV SSHHH HHH
<210> 7<210> 7
<211> 498<211> 498
<212> Белок<212> Protein
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 7<400> 7
DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP DIQLT QSPDS LAVSL GERAT INCKS SQSVL YSSIN KNYLA WYQQK PGQPP KLLIY WASTR ESGVP
DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSDV DRFSG SGSGT DFTLT ISSLQ AEDVA VYYCQ QYYST PYTFG QGTKV EIKGG GGSGG GGSGG GGSDV
VMTQS HRFMS TSVGD RVSIT CRASQ DVNTA VSWYQ QKPGQ SPKLL IFSAS YRYTG VPDRF TGSGS VMTQS HRFMS TSVGD RVSIT CRASQ DVNTA VSWYQ QKPGQ SPKLL IFSAS YRYTG VPDRF TGSGS
GADFT LTISS VQAED LAVYY CQQHY STPWT FGGGT KLDIK GGGGS QMQLV QSGTE VKKPG ESLKI GADFT LTISS VQAED LAVYY CQQHY STPWT FGGGT KLDIK GGGGS QMQLV QSGTE VKKPG ESLKI
SCKGS GYGFI TYWIG WVRQM PGKGL EWMGI IYPGD SETRY SPSFQ GQVTI SADKS INTAY LQWSS SCKGS GYGFI TYWIG WVRQM PGKGL EWMGI IYPGD SETRY SPSFQ GQVTI SADKS INTAY LQWSS
LKASD TAIYY CAGGS GISTP MDVWG QGTTV TVGGS GGSGG SGGSG GEVQL LESGG GLVQP GGSLR LKASD TAIYY CAGGS GISTP MDVWG QGTTV TVGGS GGSGG SGGSG GEVQL LESGG GLVQP GGSLR
LSCAA SGFTF SNYDM AWVRQ APGKG LEWVS SISTR GDITS YRDSV KGRFT ISRDN SKNTL YLQMN LSCAA SGFTF SNYDM AWVRQ APGKG LEWVS SISTR GDITS YRDSV KGRFT ISRDN SKNTL YLQMN
SLRAE DTAVY YCARQ DYYTD YMGFA YWGQG TLVTV SSHHH HHHSLRAE DTAVY YCARQ DYYTD YMGFA YWGQG TLVTV SSHHH HHH
Claims (12)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2791749C1 true RU2791749C1 (en) | 2023-03-13 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2577226C2 (en) * | 2014-04-10 | 2016-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью, "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Methods for making bispecific antibodies against cd3*cd19 in flexybody format in mammalian cells |
| RU2744274C1 (en) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Monoclonal antibody to rdb fragment in composition of sars-cov-2 s protein |
| RU2020138338A (en) * | 2020-10-16 | 2022-05-23 | Хайтест Лтд | ANTIBODY NEUTRALIZING SARS-COV-2 CORONAVIRUS (VERSIONS), METHOD, KIT AND DEVICE |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2577226C2 (en) * | 2014-04-10 | 2016-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью, "Международный биотехнологический центр "Генериум" ("МБЦ "Генериум") | Methods for making bispecific antibodies against cd3*cd19 in flexybody format in mammalian cells |
| RU2020141137A (en) * | 2020-03-09 | 2022-06-17 | Абселлера Байолоджикс Инк. | ANTIBODIES TO CORONAVIRUS AND METHODS OF APPLICATION |
| RU2020138338A (en) * | 2020-10-16 | 2022-05-23 | Хайтест Лтд | ANTIBODY NEUTRALIZING SARS-COV-2 CORONAVIRUS (VERSIONS), METHOD, KIT AND DEVICE |
| RU2744274C1 (en) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Monoclonal antibody to rdb fragment in composition of sars-cov-2 s protein |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| О.Н. Солопова, В.А. Мисюрин, Биспецифические антитела в клинике и клинических исследованиях (обзор литературы), Клиническая онкогематология. 2019, 12(2), стр. 125-144. М.Ю. Щелканов и др. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ И СОВРЕМЕННАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ КОРОНАВИРУСОВ (NIDOVIRALES: CORONAVIRIDAE), Инфекция и иммунитет, 2020, т. 10 2, с. 221-246. Zhaohui Li et al. An engineered bispecific human monoclonal antibody against SARS-CoV-2, Nature Immunology, 2022 (28.02.2022), vol. 23, p. 423-430. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220356250A1 (en) | Cd47 antigen-binding molecules | |
| TWI701259B (en) | 4-1BB antibody and its preparation method and application | |
| CN112794899B (en) | A fully human monoclonal neutralizing antibody against novel coronavirus and its application | |
| EP2580241B1 (en) | Annexin 1 antibody | |
| TW202330595A (en) | Antigen binding polypeptides, antigen binding polypeptide complexes and methods of use thereof | |
| WO2022096716A2 (en) | Multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity | |
| US20250145705A1 (en) | Gprc5d antibody and application thereof | |
| KR20240016991A (en) | Anti-NKG2A antibodies and compositions | |
| TW202144435A (en) | Antibody directed against CD19 antibody, and preparation therefor and application thereof | |
| CN114656556B (en) | Fully human monoclonal antibody for resisting novel coronavirus and application thereof | |
| RU2791749C1 (en) | Bispecific monoclonal antibody against sars-cov-2 | |
| WO2022143815A1 (en) | Neutralizing antibody against epitopes of receptor binding domain of novel coronavirus and use thereof | |
| TWI603979B (en) | Anti-human miga antibodies capable of lysing miga-b lymphocytes and decreasing iga production | |
| CN114409766A (en) | Neutralizing antibody of EB virus and application thereof | |
| AU2021374036A1 (en) | Polypeptide constructs selectively binding to cldn6 and cd3 | |
| CN119638838B (en) | A nano antibody against programmed death molecule 1 and its application | |
| CN117106077B (en) | Fully human monoclonal antibodies that specifically bind to staphylococcus aureus Hla toxin | |
| WO2024012513A1 (en) | Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof | |
| RU2794141C2 (en) | SINGLE-DOMAIN NANO-ANTIBODIES AGAINST SPIKE PROTEIN OF SARS-CoV-2 VIRUS | |
| CN1982338B (en) | A neutralizing monoclonal antibody 4C13 against ricin, its preparation method and application | |
| WO2023131262A1 (en) | Antigen-binding protein specifically bound to sars-cov-2 | |
| CA3221929A1 (en) | Anti-idiotypic antibodies against anti-cd79b antibodies | |
| WO2025054328A1 (en) | Bispecific binding construct capable of binding to ackr4, compositions comprising a bispecific binding construct capable of binding to ackr4, and methods of using bispecific binding construct capable of binding to ackr4 | |
| CA3189562A1 (en) | Anti-idiotypic antibodies against anti-gprc5d antibodies | |
| WO2023246790A1 (en) | Formulation comprising anti-cd47 antibody or antigen-binding fragment thereof, preparation method therefor, and use thereof |