RU2791324C1 - Process for obtaining collagen gel for use in medicine and cosmetology - Google Patents
Process for obtaining collagen gel for use in medicine and cosmetology Download PDFInfo
- Publication number
- RU2791324C1 RU2791324C1 RU2021139387A RU2021139387A RU2791324C1 RU 2791324 C1 RU2791324 C1 RU 2791324C1 RU 2021139387 A RU2021139387 A RU 2021139387A RU 2021139387 A RU2021139387 A RU 2021139387A RU 2791324 C1 RU2791324 C1 RU 2791324C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- solution
- tendons
- resulting
- gel
- Prior art date
Links
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 39
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 241001417092 Macrouridae Species 0.000 claims abstract description 6
- 235000009233 Stachytarpheta cayennensis Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 238000010335 hydrothermal treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 238000004380 ashing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 description 1
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- -1 masks Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- RCTGMCJBQGBLKT-PAMTUDGESA-N scarlet red Chemical compound CC1=CC=CC=C1\N=N\C(C=C1C)=CC=C1\N=N\C1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 RCTGMCJBQGBLKT-PAMTUDGESA-N 0.000 description 1
- 229960005369 scarlet red Drugs 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000036572 transepidermal water loss Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к способам получения биополимерных матриц на основе коллагена, используемых в регенеративной медицине при создании эквивалентов кожи. Также изобретение может использоваться в косметической промышленности.The invention relates to methods for producing collagen-based biopolymer matrices used in regenerative medicine when creating skin equivalents. The invention can also be used in the cosmetics industry.
Коллаген - один из наиболее распространенных природных материалов, на основе которых получают скаффолды [1].Collagen is one of the most common natural materials on the basis of which scaffolds are obtained [1].
Разработка скаффолдов и эквивалентов кожи на их основе связано, прежде всего, с необходимостью повышения эффективности лечения ожогов, хронических ран, а также реэпителизации больших площадей поврежденного кожного покрова при хирургических операциях [2]. Наиболее распространенным методом создания модели кожи invitro является использование гидрогелей, служащих каркасом для дермальных фибробластов, которые затем культивируются совместно с кератиноцитами на поверхности. Коллаген I типа часто служит в качестве гидрогелевого материала, а клетки дермальных фибробластов обычно распределяются внутри коллагенового геля для имитации дермального слоя [3, 4].The development of scaffolds and skin equivalents based on them is primarily associated with the need to improve the efficiency of treatment of burns, chronic wounds, as well as re-epithelialization of large areas of damaged skin during surgical operations [2]. The most common method for creating an in vitro skin model is to use hydrogels that serve as scaffolds for dermal fibroblasts, which are then co-cultured with keratinocytes on the surface. Type I collagen often serves as the hydrogel material, and dermal fibroblast cells are usually distributed within the collagen gel to mimic the dermal layer [3, 4].
Многие косметические коллагенсодержащие продукты были разработаны для повышения эластичности кожи, а также для укрепления ногтей и волос [5, 6]. Одно из свойств коллагена, определяющее его широкое использование в качестве сырья в косметике, постулируется его способностью, а точнее, способностью продуктов его распада, стимулировать выработку собственного коллагена кожей.Many cosmetic collagen-containing products have been developed to increase skin elasticity, as well as strengthen nails and hair [5, 6]. One of the properties of collagen, which determines its widespread use as a raw material in cosmetics, is postulated by its ability, or rather, the ability of its breakdown products, to stimulate the production of its own collagen by the skin.
Коллаген входит в состав многих кремов, гелей, масок, шампуней в качестве питательного и увлажняющего ингредиента. Эффективность вышеперечисленных косметических средств в основном обусловлена тем, что коллаген образует пленку, которая уменьшает трансэпидермальную потерю воды, тем самым увеличивая содержание влаги в роговом слое кожи [7, 8].Collagen is included in many creams, gels, masks, shampoos as a nourishing and moisturizing ingredient. The effectiveness of the above cosmetic products is mainly due to the fact that collagen forms a film that reduces transepidermal water loss, thereby increasing the moisture content in the stratum corneum [7, 8].
В настоящее время в научной литературе отечественными и зарубежными авторами представлен ряд методов по получению коллагена из из различного сырья. Данные методы также отличаются скоростью изготовления конечного продукта, его концентрации, а также необходимыми при этом материалами и оборудованием [9, 10, 11, 12, 13].Currently, in the scientific literature, domestic and foreign authors present a number of methods for obtaining collagen from various raw materials. These methods also differ in the speed of manufacturing the final product, its concentration, as well as the materials and equipment required for this [9, 10, 11, 12, 13].
Так, например известен способ получения коллагена (патент RU 2273489) из костной ткани, включающий очистку, обработку ферментом папаином и раствором щелочи, нейтрализацию, обезжиривание, деминерализацию и высушивание, отличающийся тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, промывают раствором 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,125-0,325% папаина при 60°С в течение 24 ч, пластины промывают 5-ю объемами воды при 60°С, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10-24 ч раствором 0,4 Н щелочи, отмывают проточной водой, обрабатывают 3%-ной перекисью водорода в течение 4 ч, затем обезжиривают в смеси этанол: хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, проводят декальцинацию в 0,5-1,0 Н соляной кислоте, отмывают водой очищенной, затем этанолом и высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.So, for example, there is a known method for obtaining collagen (patent RU 2273489) from bone tissue, including cleaning, treatment with papain enzyme and alkali solution, neutralization, degreasing, demineralization and drying, characterized in that after cleaning the bone is sawn into plates with a thickness of 0.1 to 2.0 cm, washed with a solution of 0.1 M phosphate buffer pH 5.8-6.0, digested in a solution of activated 0.125-0.325% papain at 60°C for 24 hours, the plates are washed with 5 volumes of water at 60 °C, treated at room temperature for 10-24 h with a solution of 0.4 N alkali, washed with running water, treated with 3% hydrogen peroxide for 4 h, then degreased in a mixture of ethanol: chloroform in a ratio of 1:2, changing solution for a new one at least 2 times, decalcify in 0.5-1.0 N hydrochloric acid, wash with purified water, then with ethanol and dry at room temperature, packaged and sterilized by radiation exposure.
Недостатком данного способа является использование при получении коллагена ферментов, что увеличивает стоимость методики и приводит к разрушению функциональных участков молекулы коллагена.The disadvantage of this method is the use of enzymes in the production of collagen, which increases the cost of the technique and leads to the destruction of the functional regions of the collagen molecule.
Известен способ получения коллагена из отходов кожевенного производства, включающий промывку водой, гидротермообработку, золение и нейтрализацию, отличающийся тем, что перед термообработкой проводят обессоливание 0,1-0,5%-ным раствором серной кислоты, а гидротермообработку осуществляют в течение 10-15 мин в 2-3%-ном пероксиде водорода, золение в течение 8-10 ч раствором едкого натра 2,0-2,5%-ной концентрации, с последующей промывкой в проточной воде, нейтрализацией среды ледяной уксусной кислотой до рН 7,0, измельчением, гомогенизацией и консервацией.A known method for obtaining collagen from waste leather production, including washing with water, hydrothermal treatment, ashing and neutralization, characterized in that before the heat treatment, desalting is carried out with a 0.1-0.5% solution of sulfuric acid, and the hydrothermal treatment is carried out for 10-15 minutes in 2-3% hydrogen peroxide; grinding, homogenization and preservation.
Недостаток данного способа заключается в большом количестве стадий обработки сырья, а свойства полученного коллагена не позволяют применять его в тканевой инженерии, так как молекулы коллагена при этом образуют ненативную структуру.The disadvantage of this method lies in the large number of stages of raw material processing, and the properties of the obtained collagen do not allow its use in tissue engineering, since collagen molecules form a non-native structure.
Коллаген I типа также получают из сухожилий крысиных хвостов кислотной экстракцией. Так, например, Timpson Р. с соавторами в работе «Organotypic collagen I assay: a malleable platform to assess cell behaviour in a 3-dimensional context* в ходе экстракции предлагает использовать сверхцентрифугу с величиной центробежного ускорения до 30000 g. Однако при этом образуется конечный продукт ввиде плотного геля беловатого цвета с неподходящими физическими свойствами для создания кожных эквивалентов.Type I collagen is also obtained from rat tail tendons by acid extraction. So, for example, Timpson R. et al. in the work “Organotypic collagen I assay: a malleable platform to assess cell behavior in a 3-dimensional context*” suggests using a supercentrifuge with a centrifugal acceleration of up to 30,000 g during extraction. However, this produces an end product in the form of a thick, off-white gel with unsuitable physical properties for making skin equivalents.
Другой автор Сафонова Л.А., с соавторами в работе «Пленки на основе фиброина шелка для заживления полнослойной раны кожи у крыс» предлагает проводить экстракцию сухожилий в уксусной кислоте на протяжении 3-х месяцев, в результате чего концентрация конечного продукта будет составлять 9 мг/мл. Однако установлено, что для создания кожных эквивалентов на основе дермальных фибробластов оптимальная концентрация коллагена должна составлять 1,5-2 мг/мл. При этом коллаген должен быть в состоянии геля.Another author Safonova L.A., with co-authors in the work "Films based on silk fibroin for healing a full-thickness wound of the skin in rats" proposes to carry out the extraction of tendons in acetic acid for 3 months, as a result of which the concentration of the final product will be 9 mg /ml However, it has been found that in order to create skin equivalents based on dermal fibroblasts, the optimal concentration of collagen should be 1.5-2 mg/ml. In this case, the collagen must be in a gel state.
Целью настоящего изобретения является упрощения методики получения коллагена из сухожилий крысиных хвостов. Указанная цель достигается путем сокращения времени экстракции сухожилий в уксусной кислоте до 30 дней. Также вместо диализа полученный раствор коллагена сначала полимеризуется, а потом уже вымачивали 3 раза по 30 минут в воде. Промывание полученного геля вместо диализа дает сокращение времени получения конечного продукта и упрощения методики.The aim of the present invention is to simplify the procedure for obtaining collagen from the tendons of rat tails. This goal is achieved by reducing the time of extraction of tendons in acetic acid to 30 days. Also, instead of dialysis, the resulting collagen solution is first polymerized, and then soaked 3 times for 30 minutes in water. Washing the resulting gel instead of dialysis results in a reduction in the time to obtain the final product and simplification of the procedure.
Коллаген первого типа выделяли из сухожилий крысиных хвостов, для этого их предварительно очищали от загрязнений при помощи хозяйственного мыла и погружали в 70% этанол на 30 минут. После этого делали срез поперек хвоста в его основании, для более удобного очищения, производили надрез с помощью скальпеля вдоль хвоста по всей длине, и удаляли кожу хвоста. С помощью скальпеля и пинцета, аккуратно придерживая основание хвоста, извлекали сухожилия. После чего сухожилия экстрагировали в уксусной кислоте, на 1 г сухожилий брали 250 мл уксусной кислоты. Время экстракции сухожилий в 0,5 М уксусной кислоте нами было сокращено до 30 дней при температурном режиме 4°С и ежедневном помешивании раствора в течение 5 минут с помощью стеклянной палочки. По окончании времени экстракции полученный раствор центрифугировали в течении 10 минут при 5000 g и отделяли от не растворившихся сухожилий. Концентрацию раствора рассчитывали, выпарив в суховоздушном термостате водную фракцию и взвесив образовавшийся осадок. Раствор коллагена можно считать приемлемым, при концентрации коллагена не ниже 1 мг/мл (обычно получается 1,5-3,0 мг/мл).Collagen of the first type was isolated from the tendons of rat tails; for this, they were previously cleaned of contaminants with laundry soap and immersed in 70% ethanol for 30 minutes. After that, a cut was made across the tail at its base, for more convenient cleaning, an incision was made with a scalpel along the tail along the entire length, and the skin of the tail was removed. Using a scalpel and tweezers, gently holding the base of the tail, the tendons were removed. After that, the tendons were extracted in acetic acid, 250 ml of acetic acid was taken per 1 g of tendons. The time of tendon extraction in 0.5 M acetic acid was reduced by us to 30 days at a temperature of 4°C and daily stirring of the solution for 5 minutes with a glass rod. At the end of the extraction time, the resulting solution was centrifuged for 10 minutes at 5000 g and separated from the undissolved tendons. The concentration of the solution was calculated by evaporating the aqueous fraction in a dry-air thermostat and weighing the resulting precipitate. A collagen solution can be considered acceptable if the concentration of collagen is not lower than 1 mg/ml (usually 1.5-3.0 mg/ml is obtained).
Для приготовления геля брали полученный ранее раствор коллагена. К 3 мл коллагена добавляли 10-кратную среду М 199 в объеме 0,8 мл и добавляли концентрированный раствор аммиака (о.ч. гост 2414780) до доведения рН до 7,0-7,2. Кислотность раствора можно легко определить по среде М 199, содержащей краситель феноловый красный, цвет которого меняется в зависимости от рН. Необходимый цвет раствора - алый красный. Коллаген полимеризовался в течении 5 минут.To prepare the gel, the previously obtained collagen solution was taken. To 3 ml of collagen was added a 10-fold medium M 199 in a volume of 0.8 ml and a concentrated solution of ammonia was added (special purity standard GOST 2414780) to bring the pH to 7.0-7.2. The acidity of the solution can be easily determined by the M 199 medium containing phenol red dye, the color of which changes depending on pH. The required color of the solution is scarlet red. Collagen polymerized within 5 minutes.
Далее полученный гель промывали в стерильной дистиллированной воде: вымачивали 3 раза по 30 минут. Полученный коллагеновый гель не обладал уксусным запахом, не растворялся в спирте и воде. Хорошо держал заданную форму и имеет прозрачную однородную структуру (Фиг. 1-2).Next, the resulting gel was washed in sterile distilled water: soaked 3 times for 30 minutes. The resulting collagen gel did not have an acetic odor and was insoluble in alcohol and water. Well kept a given shape and has a transparent homogeneous structure (Fig. 1-2).
Пример. Для оценки стерильности полученного образца коллагена использовали агар Мюллера-Хилтона. Образец засевали методом сплошного посева (метод «газона») по три повторности, в заранее подготовленные чашки Петри с уже застывшей питательной средой. Так же в эксперименте присутствовали контрольные чашки Петри. Чашки инкубировали при температурном режиме 37°С в течении 72 часов. По истечении времени проводили оценку общей бактериальной обсемененности образца коллагена путем визуального осмотра чашек Петри на наличие роста колоний на питательной среде. При оценке общей бактериальной обсемененности раствора коллагена было выявлено отсутствие роста микроорганизмов на питательной среде.Example. Muller-Hilton agar was used to evaluate the sterility of the obtained collagen sample. The sample was inoculated by the method of continuous seeding ("lawn" method) in three repetitions, in pre-prepared Petri dishes with already solidified nutrient medium. Control Petri dishes were also present in the experiment. The plates were incubated at 37°C for 72 hours. After the expiration of time, the total bacterial contamination of the collagen sample was assessed by visual inspection of Petri dishes for the presence of colony growth on a nutrient medium. When assessing the total bacterial contamination of the collagen solution, it was found that there was no growth of microorganisms on a nutrient medium.
Пример 2. Цитотоксичность полученного коллагенового геля оценивали двумя способами. Первый способ заключался в том, что фибробласты высаживались на коллагеновый гель и культивировались несколько дней. Далее подвергались окрашиванию трипановым синим и подсчитывалось количество мертвых клеток. Данное исследование показало, что полученный коллагеновый гель не обладает токсичностью (Фиг. 3).Example 2 The cytotoxicity of the obtained collagen gel was evaluated in two ways. The first method consisted in the fact that fibroblasts were planted on a collagen gel and cultivated for several days. Then they were stained with trypan blue and the number of dead cells was counted. This study showed that the resulting collagen gel was not toxic (FIG. 3).
Также проводили ХТТ тест на токсичность. При проведении ХТТ-теста было выявлено преобладание показателей в контрольной группе (р<0,01), что можно объяснить условиями эксперимента и способностью клеток легко прикрепляться к пластику. Но в исследованной группе клетки оставались жизнеспособными на протяжении 9 дней. Проводили ХТТ тест на 3, 6 и 9 день. За 9 дней оптическая плотность в лунках с коллагеновым гелем оставалась постоянной, что указывает на нетоксичность полученного геля (Фиг. 4).An XTT toxicity test was also performed. During the XTT test, the predominance of indicators in the control group (p<0.01) was revealed, which can be explained by the experimental conditions and the ability of cells to easily attach to plastic. But in the studied group, the cells remained viable for 9 days. An XTT test was performed on days 3, 6 and 9. For 9 days, the optical density in the wells with collagen gel remained constant, indicating the non-toxicity of the resulting gel (Fig. 4).
Список литературы:Bibliography:
[1] Glowacki J., Mizuno S. Collagen scaffolds for tissue engineering // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 2008. - T. 89. - №. 5. - C. 338-344.[1] Glowacki J., Mizuno S. Collagen scaffolds for tissue engineering // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 2008. - T. 89. - No. 5. - C. 338-344.
[2] Добровольская И.П. и др. 2016 Полимерные матрицы для тканевой инженерии. Полимеры. 12(2) 74-84.[2] Dobrovolskaya I.P. et al. 2016 Polymer matrices for tissue engineering. Polymers. 12(2) 74-84.
[3] Reis R.L. et al. 2008 Natural-based polymers for biomedical applications. Elsevier. 8(1) 127-32.[3] Reis R.L. et al. 2008 Natural-based polymers for biomedical applications. Elsevier. 8(1) 127-32.
[4] Avila Rodriguez M.I. et al 2018 Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications. Journal of Cosmetic Dermatology. 17(1) 20-26.[4] Avila Rodriguez M.I. et al 2018 Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications. Journal of Cosmetic Dermatology. 17(1) 20-26.
[5] Avila Rodriguez M.I., Rodriguez Barroso L.G., Sanchez M.L. Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications // Journal of Cosmetic Dermatology. - 2018. - Т. 17. - №. 1. - C. 20-26.[5] Avila Rodriguez M.I., Rodriguez Barroso L.G., Sanchez M.L. Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications // Journal of Cosmetic Dermatology. - 2018. - V. 17. - No. 1. - C. 20-26.
[6] Udhayakumar S. et al. Novel fibrous collagen-based cream accelerates fibroblast growth for wound healing applications: in vitro and in vivo evaluation // Biomaterials science. - 2017. - T. 5. - №. 9. - C. 1868-1883.[6] Udhayakumar S. et al. Novel fibrous collagen-based cream accelerates fibroblast growth for wound healing applications: in vitro and in vivo evaluation // Biomaterials science. - 2017. - T. 5. - no. 9. - C. 1868-1883.
[7] Antipova L.V. et al. Obtaining, identification and comparative analysis of fish collagen with analogues of animal origin // Fundamental research. - 2015. - T. 8. - №. 1. - C. 9-13.[7] Antipova L.V. et al. Obtaining, identification and comparative analysis of fish collagen with analogues of animal origin // Fundamental research. - 2015. - T. 8. - no. 1. - C. 9-13.
[8] Baumann L., Kaufman J., Saghari S. Collagen fillers // Dermatologic therapy. - 2006. - Т. 19. - №. 3. - C. 134-140.[8] Baumann L., Kaufman J., Saghari S. Collagen fillers // Dermatologic therapy. - 2006. - T. 19. - No. 3. - C. 134-140.
[9] Сироткина M.Ю., Дарвиш Д.M., Нащекина Ю.А. Выделение коллагенов разных типов и формирование композитных матриц на их основе // Неделя науки-2019. - 2019. - С. 245-245.[9] Sirotkina M.Yu., Darvish D.M., Nashchekina Yu.A. Isolation of collagens of different types and the formation of composite matrices based on them // Week of Science-2019. - 2019. - S. 245-245.
[10] Сироткина М.Ю., Дарвиш Д.М, Нащекина Ю.А. Культивирование клеток роговицы на модифицированных коллагеновых пленках // Гены и Клетки. - 2020. - Т. 15. - №. S3. - С. 113-114.[10] Sirotkina M.Yu., Darvish D.M., Nashchekina Yu.A. Cultivation of corneal cells on modified collagen films // Genes and Cells. - 2020. - Vol. 15. - No. S3. - S. 113-114.
[11] Швед Ю.А. Культивирование клеток кожи, предназначенных для заместительной терапии, на полимерных пленках:дис. - Институт цитологии Российской академии наук, 2008.[11] Shved Yu.A. Cultivation of skin cells intended for replacement therapy on polymer films: dis. - Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences, 2008.
[12] Timpson P., Mcghee E.J., Erami Z., et al. 2011 Organotypic collagen I assay: a malleable platform to assess cell behaviour in a 3-dimensional context. Journalofvisualizedexperiments. 56(2) 78-83.[12] Timpson P., Mcghee E.J., Erami Z., et al. 2011 Organotypic collagen I assay: a malleable platform to assess cell behavior in a 3-dimensional context. Journalofvisualizedexperiments. 56(2) 78-83.
[13] 2 Сафонова Л.A. 2016 Пленки на основе фиброина шелка для заживления полнослойной раны кожи у крыс. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 18(3) 80-83.[13] 2 Safonova L.A. 2016 Films based on silk fibroin for the healing of a full-thickness skin wound in rats. Bulletin of transplantology and artificial organs. 18(3) 80-83.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2791324C1 true RU2791324C1 (en) | 2023-03-07 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836308C1 (en) * | 2024-03-07 | 2025-03-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Collagen-containing hydrogel from human bone tissue and method for its preparation |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007926C1 (en) * | 1988-06-01 | 1994-02-28 | Нэтчурал Рисорсиз (Мануфакчуринг) Лимитед | Method for processing collagen-containing animal tissues into collagen fiber |
| RU2059383C1 (en) * | 1992-11-26 | 1996-05-10 | Ефим Семенович Вайнерман | Method for production of multifunctional collagen preparation |
| CN102586372A (en) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 广东省医学实验动物中心 | Preparation method of rat tail collagen protein |
| CN103966294A (en) * | 2013-02-02 | 2014-08-06 | 深圳兰度生物材料有限公司 | Extraction method for bioactive collagen |
| CN109810187A (en) * | 2017-11-20 | 2019-05-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | A kind of extraction method and application of animal hoof tendon collagen |
| RU2736480C2 (en) * | 2018-05-15 | 2020-11-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Бурятский государственный университет имени Доржи Банзарова" | Method for production of collagen-laminin matrix for healing of ulcers, burns and wounds of human skin |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2007926C1 (en) * | 1988-06-01 | 1994-02-28 | Нэтчурал Рисорсиз (Мануфакчуринг) Лимитед | Method for processing collagen-containing animal tissues into collagen fiber |
| RU2059383C1 (en) * | 1992-11-26 | 1996-05-10 | Ефим Семенович Вайнерман | Method for production of multifunctional collagen preparation |
| CN102586372A (en) * | 2012-01-11 | 2012-07-18 | 广东省医学实验动物中心 | Preparation method of rat tail collagen protein |
| CN103966294A (en) * | 2013-02-02 | 2014-08-06 | 深圳兰度生物材料有限公司 | Extraction method for bioactive collagen |
| CN109810187A (en) * | 2017-11-20 | 2019-05-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | A kind of extraction method and application of animal hoof tendon collagen |
| RU2736480C2 (en) * | 2018-05-15 | 2020-11-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Бурятский государственный университет имени Доржи Банзарова" | Method for production of collagen-laminin matrix for healing of ulcers, burns and wounds of human skin |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2836308C1 (en) * | 2024-03-07 | 2025-03-12 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Collagen-containing hydrogel from human bone tissue and method for its preparation |
| RU2836935C1 (en) * | 2024-03-07 | 2025-03-24 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Collagen-containing hydrogel from supporting and connective tissues of person and method for production thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Avila Rodríguez et al. | Collagen: A review on its sources and potential cosmetic applications | |
| Sapru et al. | Nonmulberry silk protein sericin blend hydrogels for skin tissue regeneration-in vitro and in vivo | |
| AU2005202652B2 (en) | Chemically modified polyaminosaccharide by a hydrocarbyl sultone compound | |
| CN111393521A (en) | Extraction method of jellyfish collagen | |
| Gulevsky et al. | Collagen: structure, metabolism, production and industrial application | |
| Veiga et al. | Expanding the boundaries of silk sericin biomaterials in biomedical applications | |
| KR20180028229A (en) | The Method of High-yield and High-purity Manufacturing of Allo-collagen Composition Extracted From Human origin | |
| Adikwu et al. | Evaluation of snail mucin dispersed in Brachystegia gum gel as a wound healing agent | |
| Singh | Keratin-based materials in Biomedical engineering | |
| RU2353397C2 (en) | Bioabsorbable collagen matrix, method of production and application | |
| Zhang et al. | A hydrogel derived from skin secretion of Andrias davidianus to facilitate bone regeneration | |
| RU2791324C1 (en) | Process for obtaining collagen gel for use in medicine and cosmetology | |
| Iosageanu et al. | The effect of fish bone bioactive peptides on the wound healing process: an in vitro study on keratinocytes | |
| Chirita | Mechanical properties of collagen biomimetic films formed in the presence of calcium, silica and chitosan | |
| Varma et al. | Pharmaceutical & cosmetical application of keratin protein obtaining from biowaste–a review | |
| DE112019002479B4 (en) | METHOD OF MANUFACTURING A COLLAGEN-LAMININE MATRIX FOR THE HEALING OF SKIN ULASTERS, BURNS AND WOUNDS IN HUMANS | |
| US20200282107A1 (en) | Sterile clear concentrated solution of biocompatible collagen, process for the preparation and use thereof | |
| Maistrenko et al. | Collagen matrices from leather industry wastes for biomedical application | |
| Shetty et al. | Bioengineered nanocomposite bacitracin zinc-loaded chitosan microspheres containing keratin/gelatine films for wound healing | |
| RU2737358C1 (en) | Super-thin ultrathin collagen membrane and method of production thereof | |
| RU2836935C1 (en) | Collagen-containing hydrogel from supporting and connective tissues of person and method for production thereof | |
| RU2836308C1 (en) | Collagen-containing hydrogel from human bone tissue and method for its preparation | |
| RU2849846C1 (en) | Method for producing a wound dressing from type i collagen for healing ulcers, burns, wounds and defects in human skin | |
| RU2809459C1 (en) | Deamidated collagen biomatrix and method of its preparation | |
| KR20050053904A (en) | Moisturizing chitosan-ha complex compound and composition of their aqueous solution |