RU2786591C2 - Method for determining blood plasma coagulation indicators - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin - Google Patents
Method for determining blood plasma coagulation indicators - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786591C2 RU2786591C2 RU2020132717A RU2020132717A RU2786591C2 RU 2786591 C2 RU2786591 C2 RU 2786591C2 RU 2020132717 A RU2020132717 A RU 2020132717A RU 2020132717 A RU2020132717 A RU 2020132717A RU 2786591 C2 RU2786591 C2 RU 2786591C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasma
- coagulation
- curve
- heparin
- time
- Prior art date
Links
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 title claims abstract description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 32
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 22
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims abstract description 22
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims abstract description 22
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 26
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 15
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 4
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 108090000083 Serine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003667 Serine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- -1 biogenic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940105784 coagulation factor xiii Drugs 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным способам исследования гемостаза.The invention relates to medicine, namely to laboratory methods for studying hemostasis.
Тромбин – IIa фактор свертывания крови, сериновая эндопептидаза, катализирующая ключевую реакцию гемостаза – гидролитическое расщепление фибриногена до фибрин-мономеров, которые самопроизвольно полимеризуются в фибрин — основу тромба. Кроме того, тромбин является одним из сильнейших индукторов агрегации тромбоцитов, активатором ключевого фермента фибринолиза плазминогена и системы протеина С как важнейшего физиологического антикоагулянта. Таким образом, тромбин является связующим звеном между всеми компонентами гемостаза: и сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного и физиологических антикоагулянтов. Определение его активности при различных заболеваниях может использоваться в качестве интегрального показателя гемостаза.Thrombin is a coagulation factor IIa, a serine endopeptidase that catalyzes the key reaction of hemostasis - the hydrolytic cleavage of fibrinogen to fibrin monomers, which spontaneously polymerize into fibrin - the basis of a thrombus. In addition, thrombin is one of the strongest inducers of platelet aggregation, an activator of the key enzyme of plasminogen fibrinolysis and the protein C system as the most important physiological anticoagulant. Thus, thrombin is a link between all components of hemostasis: both vascular-platelet and coagulation and physiological anticoagulants. Determination of its activity in various diseases can be used as an integral indicator of hemostasis.
В настоящее время еще одним из показателей коагуляции крови является время рекальцификации плазмы (время коагуляции), определяемое после добавления ионов кальция к цитратной плазме. В клинической лабораторной практике этот показатель сопоставляется с активированным временем рекальцификации цельной крови (АВР).Currently, one of the indicators of blood coagulation is the plasma recalcification time (coagulation time), determined after the addition of calcium ions to citrate plasma. In clinical laboratory practice, this indicator is compared with the activated whole blood recalcification time (AWR).
Кроме того, важным показателем гемостаза является толерантность плазмы к гепарину. In addition, an important indicator of hemostasis is plasma tolerance to heparin.
По величинам перечисленных показателей судят о состоянии гемостаза.According to the values of these indicators, the state of hemostasis is judged.
Определить ферментативную активность тромбина возможно двумя путями: как скорость расходования его субстрата или как скорость накопления продукта реакции. It is possible to determine the enzymatic activity of thrombin in two ways: as the rate of consumption of its substrate or as the rate of accumulation of the reaction product.
Путь определения ферментативной активности тромбина по измерению количества его субстрата за определенный промежуток времени нашел отражение в способе, основанном на добавлении к цитратной бестромбоцитратной плазме или цельной крови флуорогенного субстрата (например, пептида, меченного 7-амино-4-метилкумарином) и рекомбинантного человеческого тканевого тромбопластина для запуска коагуляционного каскада по внешнему механизму с последующим измерением интенсивности флуоресценции образующегося при гидролизе флуорофора (Hemiker H.C., Giesen P., Al Dieri R et al. Calibrated automated trombin generation measurement in clotting plasma.// Pathophysiol. Haemost. Thromb. – 2003 - № 33 – р. 4-15).The way to determine the enzymatic activity of thrombin by measuring the amount of its substrate over a certain period of time is reflected in a method based on the addition of a fluorogenic substrate (for example, a peptide labeled with 7-amino-4-methylcoumarin) and recombinant human tissue thromboplastin to citrate platelet-free plasma or whole blood. to trigger the coagulation cascade by an external mechanism with subsequent measurement of the fluorescence intensity of the fluorophore formed during hydrolysis (Hemiker H.C., Giesen P., Al Dieri R et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma.// Pathophysiol. Haemost. Thromb. - 2003 - No. 33 - p. 4-15).
Этот метод не пригоден для определения других показателей процесса коагуляции.This method is not suitable for determining other indicators of the coagulation process.
Измерение активности тромбина по накоплению продукта реакции (фибрина) затруднительно в связи с тем, что фибрин, по мере своего образования, формирует нерастворимый сгусток, в стабилизации которого принимает участие другой фермент трансглутаминаза (фактор XIII a). (Биохимия: Учебник / Под ред. Е. С. Северина. - 2 изд-е, испр. – М.: Гэотар-мед 2004. - 784 с.: ил.). The measurement of thrombin activity by the accumulation of the reaction product (fibrin) is difficult due to the fact that fibrin, as it forms, forms an insoluble clot, which is stabilized by another enzyme, transglutaminase (factor XIII a). (Biochemistry: Textbook / Edited by E. S. Severin. - 2nd ed., Rev. - M .: Geotar-med 2004. - 784 p.: ill.).
Существует способ определения активности тромбина, основанный на скорости образования фибриновых нитей оптико-механическим методом (Спиридонова В.А., Рог Е.В., Дугина Т.Н., Струкова С.М., Копылов А.М. // Биоорган. химия. 2003. T. 29, с.495-498). Сущность этого метода состоит в перемешивании магнитной мешалкой бестромбоцитарной плазмы в присутствии ионов кальция, что приводит к наматыванию на нее фибриновых нитей, которые тормозят вращение мешалки вплоть до полной остановки. Время остановки мешалки фиксируется как время коагуляции плазмы. Если время коагуляции плазмы составляет 1,5 – 3 мин, активность тромбина считают нормальной. Повышение или понижение этого показателя говорит об отклонениях в гемостазе. Стандартизация реагентов и условий реакции делает время коагуляции хорошо воспроизводимым параметром. There is a method for determining the activity of thrombin, based on the rate of formation of fibrin filaments by the optical-mechanical method (Spiridonova V.A., Rog E.V., Dugina T.N., Strukova S.M., Kopylov A.M. // Bioorgan. Chemistry, 2003, vol. 29, pp. 495-498). The essence of this method is to stir platelet-free plasma with a magnetic stirrer in the presence of calcium ions, which leads to the winding of fibrin filaments on it, which slow down the rotation of the stirrer until it stops completely. The stop time of the stirrer is recorded as the plasma coagulation time. If the plasma coagulation time is 1.5 - 3 minutes, thrombin activity is considered normal. An increase or decrease in this indicator indicates deviations in hemostasis. The standardization of reagents and reaction conditions makes the coagulation time a highly reproducible parameter.
Однако с помощью этого метода невозможно разграничить реакции образования полимер-фибрина из фибрин-мономера и полимер-фибрина, стабилизированного с участием трансглутаминазы, а также оценить время активации протромбиназного комплекса, характеризующего толерантность плазмы к гепарину. However, using this method, it is impossible to distinguish between the reactions of formation of polymer-fibrin from fibrin monomer and polymer-fibrin stabilized with the participation of transglutaminase, as well as to estimate the activation time of the prothrombinase complex, which characterizes plasma tolerance to heparin.
Известен способ определения активности тромбина [патент 2429488 RU, МПК G01N 33/86/ Способ определения активности тромбина / Головин Андрей Викторович (RU), Копылов Алексей Михайлович (RU), Завьялова Елена Геннадьевна (RU), Павлова Галина Валериевна (RU), Мудрик Николай Николаевич (RU), Бабий Владимир Евстахиевич (RU); заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью "АПТО-ФАРМ" (RU). - № 2010119575/15; заявл. 18.05.2010; опубл. 20.09.2011, Бюл. № 26], основанный на методе турбидиметрического наблюдения за образованием фибринового сгустка. Регистрацию светопропускания инкубационной среды в методе проводят с помощью ультрафиолетового диапазона излучения от 230 до 320 нм посредством УФ-спектрофотометра в качестве детектора фибрин-полимера. Для получения фибринового сгустка при температуре 27°С используется 0,1±0,005% человеческий фибриноген; буфер с pH 7,4±0,1, 1,4±0,05 М NaCl, 50±5 мМ KCl, 10±1 мМ MgCl2, 10±1 мМ CaCl2) и тромбин человеческий (0,2-50 мкМ).A known method for determining thrombin activity [patent 2429488 RU, IPC G01N 33/86/ Method for determining thrombin activity / Golovin Andrey Viktorovich (RU), Kopylov Alexei Mikhailovich (RU), Zavyalova Elena Gennadievna (RU), Pavlova Galina Valerievna (RU), Mudrik Nikolai Nikolaevich (RU), Babiy Vladimir Evstakhievich (RU); applicant and patentee Limited Liability Company "APTO-PHARM" (RU). - No. 2010119575/15; dec. 05/18/2010; publ. 20.09.2011, Bull. No. 26], based on the method of turbidimetric observation of fibrin clot formation. Registration of the light transmission of the incubation medium in the method is carried out using the ultraviolet radiation range from 230 to 320 nm using a UV spectrophotometer as a fibrin polymer detector. To obtain a fibrin clot at a temperature of 27°C, 0.1 ± 0.005% human fibrinogen is used; pH 7.4±0.1 buffer, 1.4±0.05 M NaCl, 50±5 mM KCl, 10±1 mM MgCl 2 , 10±1 mM CaCl 2 ) and human thrombin (0.2-50 µM).
Момент добавления раствора тромбина фиксируют секундомером и проводят измерения оптической плотности образца при рабочей длине волны 200-300 нм (в работе обычно использовалось излучение 230 нм). Измерения прекращают при достижении плато кривой оптической плотности. Этот период времени является временем коагуляции. В описываемом методе активность тромбина рассчитывали как тангенс угла наклона касательной в точке перегиба полученной кривой изменения оптической плотности. Авторы патента считают, что этот параметр можно интерпретировать как максимальную скорость накопления фибрин-полимера. The moment of adding the thrombin solution is fixed with a stopwatch and the optical density of the sample is measured at a working wavelength of 200-300 nm (radiation of 230 nm was usually used in the work). Measurements are stopped when the plateau of the optical density curve is reached. This time period is the coagulation time. In the described method, thrombin activity was calculated as the tangent of the slope of the tangent at the inflection point of the obtained curve of changes in optical density. The authors of the patent believe that this parameter can be interpreted as the maximum rate of accumulation of the fibrin polymer.
Однако этот способ используется в области медицинских исследований, фармацевтической промышленности и биотехнологии с целью определения удельной активности тромбина, полученного в процессе его биохимического синтеза. Не фиксируется стадийность процесса и параметры отдельных стадий. However, this method is used in the field of medical research, pharmaceutical industry and biotechnology in order to determine the specific activity of thrombin obtained during its biochemical synthesis. The staging of the process and the parameters of individual stages are not fixed.
Известен способ определения активности тромбина плазмы крови, представленный в работе (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006, -12(3): 324-329). Для наблюдения за процессом коагуляции авторы использовали хромогенный субстрат в концентрации менее 0,4 мМоль/л, аргинин, при концентрации выше 0,8 Моль/л, и фактор II-истощенную плазму. Коагуляцию, инициировали либо тканевым фактором, либо активатором контактной фазы. Авторами были рассчитаны активности циркулирующего тромбина 0,35 мкМ/мин. A known method for determining the activity of blood plasma thrombin, presented in the work (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006, -12(3): 324-329). To monitor the coagulation process, the authors used a chromogenic substrate at a concentration of less than 0.4 mmol/l, arginine at a concentration above 0.8 mol/l, and factor II-depleted plasma. Coagulation was initiated with either tissue factor or contact phase activator. The authors calculated the activity of circulating thrombin as 0.35 µM/min.
Основным недостатком данного метода является то, что он не пригоден для определения других показателей процесса коагуляции.The main disadvantage of this method is that it is not suitable for determining other indicators of the coagulation process.
Флуоресцентная спектроскопия – один из наиболее чувствительных и информативных методов молекулярной сенсорики, которые позволяют раскрыть механизмы биологических реакций. Большое многообразие флуоресцентных сенсоров в совокупности с возможностями их тонкой спектральной настройки и регуляции механизмов оптического отклика позволяет добиться высокой селективности определения содержания молекул, ионов и параметров состояния системы в условиях нативных биологических систем. Поэтому использование различных флуоресцентных сенсоров является актуальной задачей современной медицинской диагностики (Escobedo J.O., Rusin O., Lim S., Strongin R.M. NIR dyes for bioimaging applications//Current opinion in chemical biology. 2010 - №14- р.64-70).Fluorescence spectroscopy is one of the most sensitive and informative methods of molecular sensory, which makes it possible to reveal the mechanisms of biological reactions. A wide variety of fluorescent sensors, combined with the possibilities of their fine spectral tuning and regulation of optical response mechanisms, makes it possible to achieve high selectivity in determining the content of molecules, ions, and system state parameters under conditions of native biological systems. Therefore, the use of various fluorescent sensors is an urgent task of modern medical diagnostics (Escobedo J.O., Rusin O., Lim S., Strongin R.M. NIR dyes for bioimaging applications / / Current opinion in chemical biology. 2010 - No. 14 - p. 64-70).
В настоящее время описано множество флуоресцентных сенсоров. Отдельный класс органических флуорофоров представляют соединения бордипирринового ряда, так называемые BODIPY–флуорофоры. Структурные модификации BODIPY позволяют реализовать разные механизмы спектрально-флуоресцентного отклика молекул на присутствие/концентрацию в системе различных соединений, в том числе биогенных молекул. Изменения флуоресцентных характеристик BODIPY в присутствии биомолекул были интерпретированы с использованием теории динамического/статического тушения Штерна-Фольмера и свидетельствуют о возможности использования данных соединений для анализа полярности, гидрофобности/гидрофильности отдельных сайтов белковых молекул для наблюдения за процессом коагуляции плазмы крови. Many fluorescent sensors have been described to date. A separate class of organic fluorophores are compounds of the borondipyrrine series, the so-called BODIPY-fluorophores. Structural modifications of BODIPY make it possible to realize different mechanisms of the spectral fluorescence response of molecules to the presence/concentration of various compounds, including biogenic molecules, in the system. Changes in the fluorescent characteristics of BODIPY in the presence of biomolecules were interpreted using the Stern-Volmer dynamic/static quenching theory and indicate the possibility of using these compounds to analyze the polarity, hydrophobicity/hydrophilicity of individual sites of protein molecules to monitor the process of blood plasma coagulation.
Наибольший интерес среди существующих BODIPY–флуорофоров представляют соединения с объемными ароматическими заместителями в мезо-положении дипирринового фрагмента. Обладающие достаточной селективностью к белкам плазмы крови при молекулярном комплексообразовании и других межмолекулярных взаимодействий они повышают свои флуоресцентные свойства за счет резонансного переноса энергии (Мarfin Yu S., Aleksakhina E.L., Merkushev D.A., Rumyantsev E.V., Tomilova I.K., Interaction of BODIPY Dyes with the Blood Plasma Proteins// Journal of Fluorescence – 2016 - №1 – p. 255-261).Of greatest interest among the existing BODIPY fluorophores are compounds with bulky aromatic substituents in the meso position of the dipyrrine fragment. Possessing sufficient selectivity for blood plasma proteins during molecular complexation and other intermolecular interactions, they increase their fluorescent properties due to resonant energy transfer (Marfin Yu S., Aleksakhina E.L., Merkushev D.A., Rumyantsev E.V., Tomilova I.K., Interaction of BODIPY Dyes with the Blood Plasma Proteins // Journal of Fluorescence - 2016 - No. 1 - p. 255-261).
Эти свойства BODIPY–флуорофоров позволяют использовать их в качестве сенсоров, отражающих изменение концентрации фибриногена, регистрировать ступенчатый процесс его преобразования в фибрин, определять активность тромбина.These properties of BODIPY-fluorophores make it possible to use them as sensors that reflect changes in the concentration of fibrinogen, to register the stepwise process of its transformation into fibrin, and to determine the activity of thrombin.
Ни один из известных в литературе способов определения показателей коагуляции плазмы крови не предполагает использование флуоресцентных молекул соединений бордипирринового ряда в качестве сенсоров преобразований молекулярного состояния биомолекул плазмы крови. None of the methods known in the literature for determining blood plasma coagulation parameters involves the use of fluorescent molecules of borondipyrrine compounds as sensors for the transformation of the molecular state of blood plasma biomolecules.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение технических возможностей за счет одновременного определения трех показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину, и повышение чувствительности и точности процесса их определения.The technical result of the claimed invention is the expansion of technical capabilities by simultaneously determining three indicators of blood plasma coagulation - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin, and increasing the sensitivity and accuracy of the process of their determination.
Указанный результат достигается тем, что способ одновременного определения показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина (фактор коагуляции IIa), времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину, характеризуется, согласно изобретению, тем, что используют флуоресцентный метод в видимом диапазоне излучения 420 – 600 нм с участием соединений бордипиринового ряда (BODIPY), флуоресцентные характеристики которых зависят от присутствия биомолекул (в частности, фибриногена), наблюдают за образованием фибринового сгустка, получают и анализируют кривую коагуляции при регистрации изменения интенсивности флуоресценции на спектрофлуориметре за промежуток времени от стадии формирования полимерного фибрина до стадии стабилизации кровяного сгустка.This result is achieved by the fact that the method of simultaneous determination of blood plasma coagulation parameters - thrombin activity (coagulation factor IIa), plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin, is characterized, according to the invention, by using a fluorescent method in the visible radiation range of 420 - 600 nm with the participation of compounds of the borondipyrine series (BODIPY), the fluorescence characteristics of which depend on the presence of biomolecules (in particular, fibrinogen), the formation of a fibrin clot is observed, the coagulation curve is obtained and analyzed by registering changes in the fluorescence intensity on a spectrofluorimeter over a period of time from the stage of formation of polymeric fibrin to stages of stabilization of the blood clot.
Доказательство достижения технического результата: расширение технических возможностей происходит за счет одновременного определения трех показателей коагуляции плазмы крови - активности тромбина, времени рекальцификации плазмы и толерантности плазмы к гепарину по кривой коагуляции, а повышение чувствительности и точности процесса определения показателей коагуляции плазмы в настоящем способе обусловлена высокой чувствительностью бордипириновых флуорофоров к изменению полярности, гидрофобности/гидрофильности отдельных сайтов фибриногена (субстрата тромбина) и продукта его полимеризации – фибрина. Именно высокая чувствительность BODYPI позволяет регистрировать и наблюдать многоступенчатый процесс коагуляции плазмы, разграничить действие двух различных ферментов, рассчитать активность тромбина, используя для этого кривую коагуляции. Evidence of the achievement of the technical result: the expansion of technical capabilities occurs due to the simultaneous determination of three indicators of blood plasma coagulation - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin along the coagulation curve, and the increase in the sensitivity and accuracy of the process of determining plasma coagulation indicators in the present method is due to high sensitivity borondipyrine fluorophores to change the polarity, hydrophobicity/hydrophilicity of individual sites of fibrinogen (thrombin substrate) and its polymerization product, fibrin. It is the high sensitivity of BODYPI that makes it possible to record and observe the multistage process of plasma coagulation, to distinguish between the action of two different enzymes, and to calculate thrombin activity using the coagulation curve for this.
Изобретение поясняется чертежом, на котором приводится кривая коагуляции бестромбоцитарной плазмы»: 1 – в отсутствии гепарина; 2 – в присутствии гепарина.The invention is illustrated by a drawing, which shows the coagulation curve of platelet-free plasma: 1 - in the absence of heparin; 2 - in the presence of heparin.
Пример осуществления способа.An example of the implementation of the method.
Для исследования использовалась свежая цитратная бестромбоцитарная плазма крови, взятая из локтевой вены. Концентрацию фибриногена в образцах определяли модифицированным методом Клаусса. Плазма, разведенная дистиллированной водой (к 0,4 мл плазмы прибавляли 2,45 мл воды) и 0,15 мл раствора BODIPY–флуорофора в ДМСО (с = 1⋅10-5 моль/л) смешивались в термостатируемой (37°С) спектрофотометрической кювете. Fresh citrate platelet-free blood plasma taken from the cubital vein was used for the study. The concentration of fibrinogen in the samples was determined by the modified Clauss method. Plasma diluted with distilled water (2.45 ml of water was added to 0.4 ml of plasma) and 0.15 ml of a solution of BODIPY-fluorophore in DMSO (c = 1⋅10 -5 mol/l) were mixed in a thermostated (37°C) spectrophotometric cuvette.
Запуск коагуляции осуществляли добавлением в кювету 0,04 мл 1% хлорида кальция. С момента добавления через равные промежутки времени автоматически с помощью спектрофлуориметра производили измерение интенсивности флуоресценции образца в интервале длин волн 420–600 нм, при этом были использованы такие соединения бордипирринового ряда, как: 4,4-дифторо-8-фенил-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен; 4,4-дифторо-8-(пара-диметиламинофенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен; 4,4-дифторо-8-(ди-ортометилфенил)-1,3,5,7-тетраметил-2,6-диэтил-4-бор-3a,4a-диаза-s-индацен, имеющие общую структурную формулу: Coagulation was started by adding 0.04 ml of 1% calcium chloride to the cuvette. From the moment of addition at regular intervals, the fluorescence intensity of the sample was automatically measured using a spectrofluorimeter in the wavelength range of 420–600 nm, while using such compounds of the borondipyrrine series as: 4,4-difluoro-8-phenyl-1,3, 5,7-tetramethyl-2,6-diethyl-4-boron-3a,4a-diaza-s-indacene; 4,4-difluoro-8-(para-dimethylaminophenyl)-1,3,5,7-tetramethyl-2,6-diethyl-4-boron-3a,4a-diaza-s-indacene; 4,4-difluoro-8-(di-orthomethylphenyl)-1,3,5,7-tetramethyl-2,6-diethyl-4-boron-3a,4a-diaza-s-indacene having the general structural formula:
Таким образом, регистрировали зависимость интенсивности флуоресценции на максимуме испускания BODIPY–флуорофора от времени – кривую коагуляции образца плазмы. Исследование прекращали при достижении устойчивого плато на кривой изменения флуоресценции. Далее проводили анализ кривой коагуляции (чертеж).Thus, we recorded the dependence of the fluorescence intensity at the emission maximum of the BODIPY fluorophore on time, i.e., the coagulation curve of the plasma sample. The study was terminated when a stable plateau was reached on the fluorescence change curve. Next, the coagulation curve was analyzed (drawing).
На стандартной кривой коагуляции (чертеж - кривые 1 и 2) можно наблюдать три участка: верхнее плато, ниспадающий участок и нижнее плато. On the standard curve of coagulation (drawing - curves 1 and 2) you can see three sections: the upper plateau, falling area and lower plateau.
Длина верхнего плато (tlag) соответствует периоду времени активации протромбиназного комплекса и очень чувствительна к наличию или отсутствию антикоагулянтов в плазме. Присутствие гепарина в крови человека (Яковлев А.Н. Медицинский совет, 2010, №5-6, 64 – 67), из которой получена плазма, значительно удлиняет этот период (кривая 2 на чертеже). Промежуток времени tlag является лимитирующим показателем, определяющим толерантность плазмы к гепарину, т.к. является характеристикой, отражающей время начала формирования сгустка фибрина после добавления в исследуемый материал гепарина (табл.1). Ранее доказано, что толерантность плазмы к гепарину в норме составляет 7-15 минут. Если же этот показатель составляет менее 7 мин, то диагностируется заболевание сердечно-сосудистой системы (Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. Учебно-практическое издание. ГЭОТАР-Медиа, 2009 - 800 с. Общая врачебная практика: диагностическое значение лабораторных исследований: учебн.пособ./под ред. Вялова С.С., Чорбинской С.А., 4-е изд. , М.: МЕДпресс-информ, 2010).The length of the upper plateau (t lag ) corresponds to the time period of activation of the prothrombinase complex and is very sensitive to the presence or absence of anticoagulants in the plasma. The presence of heparin in human blood (Yakovlev A.N. Medical Council, 2010, No. 5-6, 64 - 67), from which plasma is obtained, significantly lengthens this period (curve 2 in the drawing). The time interval t lag is a limiting indicator that determines the tolerance of plasma to heparin, because. is a characteristic reflecting the time of the beginning of the formation of a fibrin clot after adding heparin to the test material (Table 1). It has been previously proven that plasma tolerance to heparin is normally 7-15 minutes. If this indicator is less than 7 minutes, then a disease of the cardiovascular system is diagnosed (Kishkun A.A. Manual of laboratory diagnostic methods. Educational and practical edition. GEOTAR-Media, 2009 - 800 p. General medical practice: diagnostic value of laboratory tests : textbook / edited by Vyalov S.S., Chorbinskaya S.A., 4th ed., M.: MEDpress-inform, 2010).
Ниспадающий участок кривой коагуляции соответствует ключевой реакции плазменного гемостаза – гидролитическому расщеплению фибриногена при каталитическом действии имеющегося в плазме тромбина до фибрин-мономеров, которые самопроизвольно полимеризуются в фибрин — основу тромба. Касательная, проведенная к ниспадающему участку кривой коагуляции, образует угол наклона φ к оси ординат: tg φ пропорционален скорости образования полимерного фибрина из фибриногена, т.е. активности тромбина. Активность тромбина прямо пропорциональна произведению tg φ и концентрации фибриногена в плазме (мкМоль/л) с учетом разведения в спектрофотометрической кювете (табл.2). Как показывают данные этой таблицы, усредненная активность тромбина крови у группы пожилых людей (45-65 лет), определенная по предлагаемому методу, соответствует литературным данным (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12(3): 324-329).The descending section of the coagulation curve corresponds to the key reaction of plasma hemostasis - the hydrolytic cleavage of fibrinogen during the catalytic action of thrombin present in the plasma to fibrin monomers, which spontaneously polymerize into fibrin - the basis of a thrombus. The tangent drawn to the descending section of the coagulation curve forms the angle of inclination φ to the y-axis: tg φ is proportional to the rate of formation of polymeric fibrin from fibrinogen, i.e. thrombin activity. Thrombin activity is directly proportional to the product of tg φ and plasma fibrinogen concentration (μmol/l), taking into account dilution in a spectrophotometric cuvette (Table 2). As the data of this table show, the average activity of blood thrombin in a group of elderly people (45-65 years old), determined by the proposed method, corresponds to the literature data (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12 (3): 324-329).
При выходе на нижнее плато кривой коагуляции над процессом латеральной полимеризации фибрин-полимеров в фибриновом сгустке начинают преобладать процессы их стабилизации под действием другого фермента – трансглютаминазы. Это наглядно видно на участке ав кривой коагуляции 1: тангенс угла наклона касательной к этому участку кривой коагуляции изменяется. Время выхода на нижнее плато, полученное экстраполяцией касательной, тангенс угла наклона которой характеризует активность тромбина, следует считать временем окончания коагуляции (в клинической практике - время рекальцификации плазмы, референсные значения 100-180 мин) (табл.3).Upon reaching the lower plateau of the coagulation curve, the process of lateral polymerization of fibrin polymers in the fibrin clot begins to be dominated by the processes of their stabilization under the action of another enzyme, transglutaminase. This is clearly seen in section а of the coagulation curve 1: the tangent of the slope of the tangent to this section of the coagulation curve changes. The time to reach the lower plateau, obtained by extrapolation of the tangent, the tangent of the slope of which characterizes the activity of thrombin, should be considered the time of the end of coagulation (in clinical practice, the time of plasma recalcification, reference values 100-180 min) (Table 3).
Время задержки (tlag) формирования фибринового сгустка (время активации протромбиназного комплекса) показаны в таблице 1.The delay time (t lag ) for fibrin clot formation (prothrombinase complex activation time) is shown in Table 1.
Таблица 1.Table 1.
(добровольцы в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания)Citrated plasma without heparin
(volunteers aged 45-65 years without an established diagnosis of cardiovascular disease)
(пациенты в возрасте 45-65 лет с диагнозом острый коронарный синдром)Citrated plasma with heparin
(patients aged 45-65 with a diagnosis of acute coronary syndrome)
Данные таблицы 1 иллюстрируют, что анализ кривой коагуляции, полученной по предлагаемому способу, позволяет оценить время активации (tlag) протромбиназного комплекса, являющееся лимитирующим фактором процесса коагуляции и обуславливающим толерантность плазмы к гепарину, тем самым оценить вклад tlag в величину показателя толерантности и во временя рекальцификации плазмы, повышая чувствительность и точность процесса определения показателей коагуляции плазмы крови. The data in Table 1 illustrate that the analysis of the coagulation curve obtained by the proposed method makes it possible to estimate the activation time (t lag ) of the prothrombinase complex, which is the limiting factor in the coagulation process and determines plasma tolerance to heparin, thereby assessing the contribution of t lag to the value of the tolerance index and to time of plasma recalcification, increasing the sensitivity and accuracy of the process of determining the parameters of coagulation of blood plasma.
Активность тромбина крови у группы добровольцев в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания показана в таблице 2.Blood thrombin activity in a group of volunteers aged 45-65 years without an established diagnosis of cardiovascular disease is shown in Table 2.
Таблица 2table 2
Данные таблицы 2 показывают, что усредненная активность тромбина крови у группы пожилых людей (45-65 лет) соответствует литературным данным (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12(3): 324-329) и получена при одновременном определении других заявленных показателей, которые также соответствуют референсным значениям.Table 2 data show that the average activity of blood thrombin in the group of elderly people (45-65 years old) corresponds to the literature data (Stief T.W. Specific determination of plasmatic thrombin activity Clinical and Applied Thrombosis/Haemostasis, -2006. -12(3): 324- 329) and obtained by simultaneously determining other declared indicators, which also correspond to the reference values.
Время рекальцификации плазмы у группы добровольцев в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания показано в таблице 3. The time of plasma recalcification in a group of volunteers aged 45-65 years without an established diagnosis of cardiovascular disease is shown in Table 3.
Таблица 3.Table 3
Данные таблицы 3, отражающие время рекальцификации плазмы, получены путем экстраполяции касательной к ниспадающему участку кривой коагуляции на ось абсцисс (время), отсекая стадию стабилизации фибринового сгустка. Такой подход позволяет повысить точность и чувствительность анализа, т.к. учитывает действие только тромбина и не учитывает стабилизирующее действие другого фермента - трансглютаминазы (фактор коагуляции XIII). The data in Table 3, reflecting the time of plasma recalcification, were obtained by extrapolating the tangent to the descending section of the coagulation curve to the x-axis (time), cutting off the stage of stabilization of the fibrin clot. This approach improves the accuracy and sensitivity of the analysis, because takes into account the action of thrombin only and does not take into account the stabilizing effect of another enzyme - transglutaminase (coagulation factor XIII).
Основные контролируемые показатели коагуляции плазмы крови, полученные на разных соединениях бордипирринового ряда, представлены в таблице №4.The main controlled indicators of blood plasma coagulation, obtained on different compounds of the borondipyrrine series, are presented in table No. 4.
Таблица 4Table 4
Atr, mkM/ минThrombin activity
A tr , mkM/min
(добровольцы в возрасте 45-65 лет без установленного диагноза сердечно-сосудистого заболевания)Citrated plasma without heparin
(volunteers aged 45-65 years without an established diagnosis of cardiovascular disease)
(пациенты в возрасте 45-65 лет с диагнозом острый коронарный синдром)Citrated plasma with heparin
(patients aged 45-65 with a diagnosis of acute coronary syndrome)
Таким образом, данный способ позволяет, используя сенсорные возможности BODIPY–флуорофоров, регистрировать, выделять и одновременно численно характеризовать стадии процесса коагуляции плазмы, т.е. повысить точность и чувствительность определения показателей коагуляции, таких, как активность тромбина, время рекальцификации плазмы и толерантность плазмы к гепарину.Thus, this method allows, using the sensory capabilities of BODIPY-fluorophores, to register, isolate and simultaneously numerically characterize the stages of the plasma coagulation process, i.e. improve the accuracy and sensitivity of coagulation parameters such as thrombin activity, plasma recalcification time, and plasma heparin tolerance.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132717A RU2786591C2 (en) | 2020-10-05 | Method for determining blood plasma coagulation indicators - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132717A RU2786591C2 (en) | 2020-10-05 | Method for determining blood plasma coagulation indicators - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020132717A3 RU2020132717A3 (en) | 2022-04-06 |
| RU2020132717A RU2020132717A (en) | 2022-04-06 |
| RU2786591C2 true RU2786591C2 (en) | 2022-12-22 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2429488C1 (en) * | 2010-05-18 | 2011-09-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" | Method for measuring thrombin activity |
| RU2669796C1 (en) * | 2017-10-30 | 2018-10-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for determination of functional fibrinogen |
| RU2699798C1 (en) * | 2019-05-22 | 2019-09-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for detecting blood clotting factor deficiency by thromboelastometry |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2429488C1 (en) * | 2010-05-18 | 2011-09-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Апто-Фарм" | Method for measuring thrombin activity |
| RU2669796C1 (en) * | 2017-10-30 | 2018-10-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for determination of functional fibrinogen |
| RU2699798C1 (en) * | 2019-05-22 | 2019-09-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Method for detecting blood clotting factor deficiency by thromboelastometry |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель // Биофизика. 1994. Т. 39, JSfe l. с. 97-106. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-1996 гг.. Е.Л. Алексахина и др. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА СВЁРТЫВАНИЯ КРОВИ В ПРИСУТСТВИИ БОРДИПИРРИНОВЫХ ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ. Казанский медицинский журнал, 2015 г., том 96, N5, с. 792-798. Н.А. Подоплелова и др. Свертывание крови в XXI веке: новые знания, методы и перспективы для терапии. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2020, Том 19, N 1, с. 139-157. Renáta Hudák et al. Laboratory characterization of leukemic cell procoagulants. Clin Chem Lab Med, 2017 Jul 26; 55(8): 1215-1223. PMID: 28593927. Hemker Н.С., Giesen P., Al Dieri R., Regnault V., de Smedt E., Wagenvoord R., Lecompte Т., Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma //Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2003. V.33. P. 4-15. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2032561C (en) | Method of determining levels of extrinsic and intrinsic clotting factors and protein c | |
| JP6300793B2 (en) | Simultaneous measurement of thrombin production and clot strength in plasma and whole blood | |
| ES2725426T3 (en) | Means and procedures for universal calibration of anti-factor Xa tests | |
| US4234682A (en) | Method and reagent for determining biologically active heparin in plasma | |
| US20090087870A1 (en) | Hematological assay and kit | |
| US6902904B2 (en) | Coagulation assay reagents containing lanthanides | |
| WO2011057143A1 (en) | Compositions, methods and uses for simultaneous assay of thrombin and plasmin generation | |
| Mijovski | Advances in monitoring anticoagulant therapy | |
| JP3248621B2 (en) | Testing for thrombosis risk | |
| AU6369700A (en) | Method for measuring coagulant factor activity in whole blood | |
| KR20090085666A (en) | How to measure proteolytic activity in complex biomaterials including cells | |
| Hoffmann et al. | Automated nephelometry of fibrinogen: analytical performance and observations during thrombolytic therapy. | |
| Kitchen et al. | Laboratory tests of hemostasis | |
| Chantarangkul et al. | Evaluation of a fully automated centrifugal analyzer for performance of hemostasis tests. | |
| RU2786591C2 (en) | Method for determining blood plasma coagulation indicators - thrombin activity, plasma recalcification time and plasma tolerance to heparin | |
| Luo et al. | Drop-of-blood acoustic tweezing technique for integrative turbidimetric and elastometric measurement of blood coagulation | |
| de Freitas Saito et al. | Anticoagulant activity of nucleic acid nanoparticles (NANPs) assessed by thrombin generation dynamics on a fully automated system | |
| JP3713901B2 (en) | Method for measuring osteoclast-derived acid phosphatase | |
| EP3649253A1 (en) | Improved detection of anticoagulants in body fluids | |
| Harris et al. | Point of care (POC) blood coagulation monitoring technologies | |
| RU2660706C1 (en) | Screening-test of determining coagulation contact way (stokpk) | |
| CN110133304B (en) | Composition, reagent containing the composition and application thereof | |
| RU2835822C1 (en) | Method for determining anticoagulant potential of blood plasma for diagnosing prethrombotic conditions | |
| RU2772195C1 (en) | Method for determining the functional activity of antithrombin iii in blood plasma | |
| RU2429488C1 (en) | Method for measuring thrombin activity |