RU2775973C9 - Oligopeptide linker intermediate and method for production thereof - Google Patents
Oligopeptide linker intermediate and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2775973C9 RU2775973C9 RU2021105635A RU2021105635A RU2775973C9 RU 2775973 C9 RU2775973 C9 RU 2775973C9 RU 2021105635 A RU2021105635 A RU 2021105635A RU 2021105635 A RU2021105635 A RU 2021105635A RU 2775973 C9 RU2775973 C9 RU 2775973C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- trimethylsilyl
- amino acid
- ethoxycarbonyl
- condensation product
- condensation
- Prior art date
Links
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 57
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 28
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims abstract description 18
- ZNGINKJHQQQORD-UHFFFAOYSA-N 2-trimethylsilylethanol Chemical compound C[Si](C)(C)CCO ZNGINKJHQQQORD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- -1 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl Chemical group 0.000 claims description 48
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 40
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 41
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 38
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 32
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 32
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 31
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 30
- VEGGTWZUZGZKHY-GJZGRUSLSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-(carbamoylamino)-n-[4-(hydroxymethyl)phenyl]pentanamide Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)NC1=CC=C(CO)C=C1 VEGGTWZUZGZKHY-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 22
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 12
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 10
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 6
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N benzyl alcohol Substances OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GUVUOGQBMYCBQP-UHFFFAOYSA-N dmpu Chemical compound CN1CCCN(C)C1=O GUVUOGQBMYCBQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CANZBRDGRHNSGZ-NSHDSACASA-N (2s)-3-methyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 CANZBRDGRHNSGZ-NSHDSACASA-N 0.000 description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 2
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005906 dihydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- VYCVAPFXSOAOCL-ROUUACIJSA-N tert-butyl n-[(2s)-1-[[(2s)-5-(carbamoylamino)-1-[4-(hydroxymethyl)anilino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=O)C(=O)NC1=CC=C(CO)C=C1 VYCVAPFXSOAOCL-ROUUACIJSA-N 0.000 description 2
- FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium fluoride Chemical compound [F-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC FPGGTKZVZWFYPV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-(carbamoylamino)pentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=O AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- ZJLNQOIFTYLCHC-VXKWHMMOSA-N (2s)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoyl]amino]pentanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=O)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 ZJLNQOIFTYLCHC-VXKWHMMOSA-N 0.000 description 1
- ZZLNUAVYYRBTOZ-QWRGUYRKSA-N (2s)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoyl]amino]pentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=O ZZLNUAVYYRBTOZ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DALMAZHDNFCDRP-VMPREFPWSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[(2s)-1-[[(2s)-5-(carbamoylamino)-1-[4-(hydroxymethyl)anilino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamate Chemical compound O=C([C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C(C)C)NC1=CC=C(CO)C=C1 DALMAZHDNFCDRP-VMPREFPWSA-N 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N bis(4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000003670 easy-to-clean Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- KDLHZDBZIXYQEI-VENIDDJXSA-N palladium-100 Chemical compound [100Pd] KDLHZDBZIXYQEI-VENIDDJXSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229940126167 polatuzumab vedotin-piiq Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область изобретенияField of invention
[01] Настоящее изобретение относится к области конъюгатов антитело-лекарственное средство и, в частности, к способу получения олигопептидного линкера и его промежуточного соединения.[01] The present invention relates to the field of antibody-drug conjugates and, in particular, to a method for preparing an oligopeptide linker and its intermediate.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
[02] Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), как новый тип биологического "управляемого снаряда", обеспечивает выгодное сочетание нацеливающего эффекта моноклональных антител и цитотоксического эффекта низкомолекулярных лекарственных средств и в настоящее время является одной из самых быстроразвивающихся областей в терапии, направленно воздействующей на опухоли. Три компонента ADC (антитело, цитотоксин и линкер) составляют систему направленной доставки лекарственного средства, в которой конструкция и оптимизация линкеров являются решающими для разработки такой системы. Линкеры являются основой для эффективной доставки цитотоксических лекарственных средств посредством ADC и ключевым фактором в определении токсичности ADC продуктов, поскольку преждевременное высвобождение лекарственных средств в кровоток может приводить к системной токсичности и снижению терапевтического индекса. Путем оптимизации существующей технологии связывания, разработки стабильных линкеров и изыскания новых механизмов высвобождения токсинов можно решить такие проблемы, как ненаправленное действие токсинов и лекарственная устойчивость, которые обычно наблюдаются у ADC, и повысить, тем самым, эффективность и безопасность.[02] Antibody-drug conjugate (ADC), as a new type of biological "guided projectile", provides an advantageous combination of the targeting effect of monoclonal antibodies and the cytotoxic effect of small molecule drugs and is currently one of the fastest growing areas in therapy targeting tumors. The three components of the ADC (antibody, cytotoxin, and linker) constitute a targeted drug delivery system in which the design and optimization of linkers are critical to the development of such a system. Linkers are the basis for efficient delivery of cytotoxic drugs by ADC and a key factor in determining the toxicity of ADC products, since premature release of drugs into the bloodstream can lead to systemic toxicity and a decrease in therapeutic index. By optimizing existing coupling technology, developing stable linkers, and discovering new toxin release mechanisms, problems such as cross-targeting of toxins and drug resistance commonly seen in ADCs can be overcome, thereby improving efficacy and safety.
[03] На данном этапе в центре внимания находятся основанные на олигопептидах расщепляемые ADC, которые распадаются под действием катепсина В в лизосомах клеток-мишеней с высвобождением токсинов, которые в конечном счете уничтожают опухоли (Источник информации 1: Wang Y, Fan S, Zhong W, et al. Development and properties of valine-alanine based antibody-drug conjugates with monomethyl auristatine as the potent payload[J]. International journal of molecular sciences, 2017, 18(9): I860.). Среди них олигопептидные линкеры (такие как дипептид валин-цитруллин (Val-Cit, VC)) широко используются в различных лекарственных средствах, представляющих собой ADC. В пяти разрешенных для применения в настоящее время конъюгированных с антителом лекарственных средствах (на июль 2019 года) (Таблица 1) линкеры брентуксимаба ведотина компании Seattle & Takeda и полатузумаба ведотина-piiq компании Genentech являются олигопептидными линкерами (дипептидный линкер валин-цитруллин).[03] At this stage, the focus is on oligopeptide-based cleavable ADCs, which are degraded by cathepsin B in the lysosomes of target cells to release toxins that ultimately destroy tumors (Source 1: Wang Y, Fan S, Zhong W , et al. Development and properties of valine-alanine based antibody-drug conjugates with monomethyl auristatine as the potent payload[J]. International journal of molecular sciences, 2017, 18(9): I860.). Among them, oligopeptide linkers (such as valine-citrulline dipeptide (Val-Cit, VC)) are widely used in various ADC drugs. In the five currently approved antibody-conjugated drugs (as of July 2019) (Table 1), Seattle & Takeda's brentuximab vedotin and Genentech's polatuzumab vedotin-piiq linkers are oligopeptide linkers (valine-citrulline dipeptide linker).
[04] В настоящее время существует три основных способа синтеза олигопептидных линкеров (Источник информации 2: Mondal D, Ford J, Pinney K G. Improved Methodology for the Synthesis of a Cathepsin В Cleavable Dipeptide Linker, Widely Used in Antibody-Drug Conjugate Research [J]. Tetrahedron letters, 2018, 59 (40): 3594-3599.), причем в первом способе используется защитная группа Fmoc, во втором используется защитная группа Cbz и в третьем используется защитная группа Вос.[04] There are currently three main methods for synthesizing oligopeptide linkers (Source 2: Mondal D, Ford J, Pinney K G. Improved Methodology for the Synthesis of a Cathepsin B Cleavable Dipeptide Linker, Widely Used in Antibody-Drug Conjugate Research [ J], Tetrahedron letters, 2018, 59 (40): 3594-3599.), wherein the first method uses the Fmoc protecting group, the second uses the Cbz protecting group, and the third uses the Boc protecting group.
[05] Вышеуказанные три способа получения описаны ниже с использованием дипептидных линкеров валин-цитруллин в качестве примеров:[05] The above three preparation methods are described below using valine-citrulline dipeptide linkers as examples:
[06] (1) Использование защитной группы Fmoc
[07] В этом способе Fmoc-Val сначала подвергают реакции конденсации с Cit с получением Fmoc-Val-Cit, который затем подвергают реакции конденсации с пара-аминобензиловым спиртом с получением Fmoc-Val-Cit-PAB, и затем Fmoc удаляют с образованием Val-Cit-PAB. Однако для удаления защитной группы Fmoc в этом способе обычно используют низшие амины, поэтому легко образуются побочные продукты, которые трудно полностью удалить. Кроме того, Fmoc имеет сильное УФ поглощение, и следовые остатки оказывают большое влияние на тестирование чистоты продукта.[07] In this method, Fmoc-Val is first subjected to a condensation reaction with Cit to obtain Fmoc-Val-Cit, which is then subjected to a condensation reaction with para-aminobenzyl alcohol to obtain Fmoc-Val-Cit-PAB, and then Fmoc is removed to form Val -Cit-PAB. However, lower amines are generally used in this process to remove the Fmoc protecting group, so by-products are easily formed and are difficult to completely remove. In addition, Fmoc has strong UV absorption and trace residues have a great influence on product purity testing.
[08] (2) Использование защитной группы Cbz[08] (2) Use of the Cbz protecting group
[09] В этом способе Cbz-Val сначала подвергают реакции конденсации с Cit с получением Cbz-Val-Cit, который затем подвергают реакции конденсации с пара-аминобензиловым спиртом с получением Cbz-Val-Cit-PAB, и затем Val-Cit-PAB получают путем удаления Cbz. Однако для удаления защитной группы Cbz в этом способе в качестве катализатора требуется переходный металл, обычно Pd, который вреден для человеческого организма из-за того, что остатки тяжелого металла трудно удалять. Кроме того, требуется источник водорода, обычно газ водород, который является чрезвычайно взрывоопасным, что создает высокие риски возникновения угрозы безопасности и делает его непригодным для крупномасштабного использования. Хотя могут быть использованы другие источники водорода, газ водород также высвобождается во время использования, угрожая безопасности.[09] In this method, Cbz-Val is first subjected to a condensation reaction with Cit to obtain Cbz-Val-Cit, which is then subjected to a condensation reaction with para-aminobenzyl alcohol to obtain Cbz-Val-Cit-PAB, and then Val-Cit-PAB obtained by removing Cbz. However, to remove the Cbz protecting group in this process, a transition metal, usually Pd, is required as a catalyst, which is harmful to the human body because heavy metal residues are difficult to remove. In addition, a source of hydrogen is required, typically hydrogen gas, which is extremely explosive, creating high safety risks and making it unsuitable for large scale use. Although other sources of hydrogen may be used, hydrogen gas is also released during use, posing a safety hazard.
[10] (3) Использование защитной группы Вос[10] (3) Use of the Vos protecting group
[11] В этом способе Boc-Val сначала подвергают реакции конденсации с Cit с получением Boc-Val-Cit, который затем подвергают реакции конденсации с пара-аминобензиловым спиртом с получением Вос-Val-Cit-PAB, и затем Val-Cit-PAB получают путем удаления Вос. В этом способе для удаления защитной группы Вос используется сильная кислота, обычно раствор НСl и трифторуксусная кислота. При использовании НСl гидроксил спирта в положении бензила молекулы Вос-Val-Cit-PAB будет замещаться хлором с образованием соответствующего бензилхлорида, что будет сказываться на качестве продукта. При использовании трифторуксусной кислоты спирт в положении бензила будет подвергаться реакции этерификации с образованием соответствующего трифторацетата, поэтому требуется дополнительная стадия гидролиза для получения Val-Cit-PAB. Кроме того, щелочной гидролиз создает риск рацемизации хирального центра аминокислотных единиц.[11] In this method, Boc-Val is first condensed with Cit to give Boc-Val-Cit, which is then condensed with para-aminobenzyl alcohol to give Boc-Val-Cit-PAB, and then Val-Cit-PAB obtained by removing Vos. This process uses a strong acid, typically an HCl solution and trifluoroacetic acid, to remove the Boc protecting group. When using HCl, the alcohol hydroxyl in the benzyl position of the Boc-Val-Cit-PAB molecule will be replaced by chlorine to form the corresponding benzyl chloride, which will affect the quality of the product. When trifluoroacetic acid is used, the alcohol at the benzyl position will undergo an esterification reaction to form the corresponding trifluoroacetate, so an additional hydrolysis step is required to produce Val-Cit-PAB. In addition, alkaline hydrolysis creates the risk of racemization of the chiral center of amino acid units.
Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention
[12] Для решения вышеуказанных проблем согласно настоящему изобретению предложен новый способ получения олигопептидных линкеров. Способ получения Val-Cit-PAB с использованием Теос в качестве защитной группы, предусмотренный настоящим изобретением, легко осуществляется в мягких реакционных условиях, и поскольку при реакции почти отсутствуют побочные реакции, этот способ дает высокочистый продукт с меньшим количеством примесей и легко очищается, обеспечивая достижение неожиданного технического результата.[12] In order to solve the above problems, the present invention proposes a new method for the preparation of oligopeptide linkers. The method for producing Val-Cit-PAB using Teos as a protecting group of the present invention is easily carried out under mild reaction conditions, and since the reaction is almost free of side reactions, this method gives a high purity product with fewer impurities and is easily purified, achieving unexpected technical result.
[13] Конкретно, согласно настоящему изобретению предложено олигопептидное линкерное промежуточное соединение, имеющее структуру, представленную формулами (1)-(4):[13] Specifically, the present invention provides an oligopeptide linker intermediate having the structure represented by formulas (1) to (4):
илиor
илиor
илиor
где AA1, АА2, АА3 и АА4 представляют собой любую аминокислоту.where AA 1 , AA 2 , AA 3 and AA 4 are any amino acid.
[14] Далее, AA1, АА2, АА3 и АА4 независимо выбраны из группы, состоящей из следующих: -валин- (-Val-), -цитруллин -(-Cit-), -аланин- (-Ala-), -лизин- (-Lys-), -лизин(тритил)- (-Lys(Trt)-), -лизин(монометокситритил)- (-Lys(Mmt)-), -лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Lys(Fmoc)-), -аргинин- (-Arg-), -фенилаланин- (-Phe-), -глицин- (-Gly-), -лейцин- (-Leu-) и -изолейцин- (-Ile-).[14] Further, AA 1 , AA 2 , AA 3 and AA 4 are independently selected from the group consisting of the following: -valine- (-Val-), -citrulline -(-Cit-), -alanine- (-Ala- ), -lysine- (-Lys-), -lysine(trityl)- (-Lys(Trt)-), -lysine(monomethoxytrityl)- (-Lys(Mmt)-), -lysine(fluorenylmethyloxycarbonyl)- (-Lys (Fmoc)-), -arginine- (-Arg-), -phenylalanine- (-Phe-), -glycine- (-Gly-), -leucine- (-Leu-) and -isoleucine- (-Ile-) .
[15] Кроме того, -АА1-АА2- выбран из группы, состоящей из следующих: -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -в алии-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-лизин(тритил)- (-Val-Lys(Trt)-), -валин-лизин(монометокситритил)- (-Val-Lys(Mmt)-), -валин-лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Val-Lys(Fmoc)-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин- (-Phe-Cit-), -фенил про пил-лизин- (-Phe-Lys-), фенилаланин-лизин(тритил)- (-Phe-Lys(Trt)-), -фенилаланин-лизин(монометокситритил)- (-Phe-Lys(Mmt)-), -фенилаланин-лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Phe-Lys(Fmoc)-), лейцин-цитруллин- (-Leu-Cit-), изолейцин-цитруллин- (-Ile-Cit-) и -фенилаланин-аргинин- (-Phe-Arg-); -АА1-АА2-АА3- выбран из -фенилаланин-аргинин-аргинина- (-Ala-Arg-Arg-); -AA1-AA2-AA3-AA4- выбран из группы, состоящей из следующих: -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -глицин-фенилаланин-лейцин-глицин- (-Gly-Phe-Leu-Gly-) и -аланин-лейцин-аланин-лейцин (-Ala-Leu-Ala-Leu-).[15] In addition, -AA 1 -AA 2 - is selected from the group consisting of the following: -valine-citrulline- (-Val-Cit-), -aliya-alanine- (-Val-Ala-), -valine -lysine- (-Val-Lys-), -valine-lysine (trityl)- (-Val-Lys(Trt)-), -valine-lysine (monomethoxytrityl)- (-Val-Lys(Mmt)-), - valine-lysine (fluorenylmethyloxycarbonyl)- (-Val-Lys(Fmoc)-), -valine-arginine- (-Val-Arg-), -phenylalanine-citrulline- (-Phe-Cit-), -phenyl propyl-lysine - (-Phe-Lys-), phenylalanine-lysine (trityl)- (-Phe-Lys(Trt)-), -phenylalanine-lysine (monomethoxytrityl)- (-Phe-Lys(Mmt)-), -phenylalanine-lysine (fluorenylmethyloxycarbonyl)- (-Phe-Lys(Fmoc)-), leucine-citrulline- (-Leu-Cit-), isoleucine-citrulline- (-Ile-Cit-) and -phenylalanine-arginine- (-Phe-Arg- ); -AA 1 -AA 2 -AA 3 - selected from -phenylalanine-arginine-arginine- (-Ala-Arg-Arg-); -AA 1 -AA 2 -AA 3 -AA 4 is selected from the group consisting of the following: -glycine-glycine-phenylalanine-glycine- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -glycine-phenylalanine-leucine-glycine - (-Gly-Phe-Leu-Gly-) and -alanine-leucine-alanine-leucine (-Ala-Leu-Ala-Leu-).
[16] Предпочтительно, олигопептидное линкерное промежуточное соединение включает в себя следующую структуру:[16] Preferably, the oligopeptide linker intermediate includes the following structure:
[17] Согласно настоящему изобретению предложен также способ получения олигопептидного линкерного промежуточного соединения формул (1)-(3), где реакционный путь способа следующий:[17] The present invention also provides a process for preparing an oligopeptide linker intermediate of formulas (1) to (3), wherein the reaction route of the process is as follows:
1) проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1 и затем аминокислотой АА2, или аминокислотой AA1, аминокислотой АА2 и аминокислотой АА3 последовательно, или аминокислотой AA1, аминокислотой АА2, аминокислотой АА3 и аминокислотой АА4 последовательно с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил) этоксикарбонил - олигопептид;1) carrying out the condensation reaction between the carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl)ethanol and amino acid AAone and then the amino acid AA2, or amino acid AAone, amino acid AA2 and amino acid AA3 sequentially, or amino acid AAone, amino acid AA2, amino acid AA3 and amino acid AAfour sequentially to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl) ethoxycarbonyl - oligopeptide;
2) взаимодействие полученного продукта конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-олигопептида и пара-аминобензилового спирта с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил -олигопептид-пара-аминобензиловый спирт;2) interaction of the resulting condensation product of 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-oligopeptide and para-aminobenzyl alcohol to obtain a condensation product, which is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-oligopeptide-para-aminobenzyl alcohol;
где реагент карбонилирования представляет собой любое соединение, содержащее карбонильную группу.where the carbonylation reagent is any compound containing a carbonyl group.
[18] Далее, олигопептидное линкерное промежуточное соединение формулы (1) получают следующим реакционным путем:[18] Further, the oligopeptide linker intermediate of formula (1) is obtained by the following reaction route:
где способ получения включает в себя следующие стадии:where the production method includes the following steps:
1) проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислоту;1) carrying out a condensation reaction between a carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl)ethanol and amino acid AA 1 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid;
2) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислотой и аминокислотой АА2 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептид; и2) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid and amino acid AA 2 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide; and
3) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептидом и пара-аминобензиловым спиртом с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептид-пара-аминобензиловый спирт.3) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide and para-aminobenzyl alcohol to obtain a condensation product, which is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide-para-aminobenzyl alcohol.
[19] Далее, олигопептидное линкерное промежуточное соединение формулы (2) получают следующим реакционным путем:[19] Further, the oligopeptide linker intermediate of formula (2) is obtained by the following reaction route:
где способ получения включает в себя следующие стадии:where the production method includes the following steps:
1) проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил) этанолом и аминокислотой AA1 с получением продукта реакции конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислоту;1) carrying out a condensation reaction between a carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl) ethanol and amino acid AA 1 to obtain a condensation reaction product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid;
2) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил) этоксикарбонил-аминокислотой и аминокислотой АА2 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептид;2) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid and amino acid AA 2 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide;
3) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептидом и аминокислотой АА3 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептид, и3) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide and amino acid AA 3 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tripeptide, and
4) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептидом и пара-аминобензиловым спиртом с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил -трипептид-пара-аминобензиловый спирт.4) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tripeptide and para-aminobenzyl alcohol to obtain a condensation product, which is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tripeptide-para-aminobenzyl alcohol.
[20] Далее, олигопептидное линкерное промежуточное соединение формулы (3) получают следующим реакционным путем:[20] Further, the oligopeptide linker intermediate of formula (3) is obtained by the following reaction route:
где способ получения включает в себя следующие стадии:where the production method includes the following steps:
1) проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1 с получением продукта реакции конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислоту,1) conducting a condensation reaction between a carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl)ethanol and amino acid AA 1 to obtain a condensation reaction product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid,
2) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислотой и аминокислотой АА2 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептид,2) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid and amino acid AA 2 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide,
3) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептидом и аминокислотой АА3 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептид,3) conducting a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide and amino acid AA 3 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tripeptide,
4) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептидом и аминокислотой АА4 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептид, и4) conducting a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tripeptide and amino acid AA 4 to obtain a condensation product, which is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tetrapeptide, and
5) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептидом и пара-аминобензиловым спиртом с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептид-пара-аминобензиловыйспирт.5) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tetrapeptide and para-aminobenzyl alcohol to obtain a condensation product, which is 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tetrapeptide-para-aminobenzyl alcohol.
[21] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ получения олиго пептидного линкерного промежуточного соединения формулы (4), где реакционный путь способа следующий: проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1, аминокислотой АА2, аминокислотой АА3 и аминокислотой АА4 последовательно с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептид, где реагент карбонилирования представляет собой любое соединение, содержащее карбонильную группу.[21] The present invention further provides a method for preparing an oligopeptide linker intermediate of formula (4), wherein the reaction route of the method is: carrying out a condensation reaction between a carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl)ethanol, and an amino acid AA 1 , an amino acid AA 2 , an amino acid AA 3 and AA amino acid 4 in succession to give a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tetrapeptide condensation product, where the carbonylation reagent is any compound containing a carbonyl group.
[22] Далее, олигопептидное линкерное промежуточное соединение формулы (4) получают следующим реакционным путем:[22] Further, the oligopeptide linker intermediate of formula (4) is obtained by the following reaction route:
1) проведение реакции конденсации между реагентом карбонилирования, 2-(триметилсилил) этанолом и аминокислотой AA1 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислоту;1) carrying out a condensation reaction between a carbonylation reagent, 2-(trimethylsilyl) ethanol and amino acid AA 1 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid;
2) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил) этоксикарбонил-аминокислотой и аминокислотой АА2 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептид;2) carrying out a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid and amino acid AA 2 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide;
3) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептидом и аминокислотой АА3 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептид; и3) conducting a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide and amino acid AA 3 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tripeptide; and
4) проведение реакции конденсации между продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептидом и аминокислотой АА4 с получением продукта конденсации, представляющего собой 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептид.4) conducting a condensation reaction between the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tripeptide and amino acid AA 4 to obtain a condensation product, which is a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-tetrapeptide.
[23] Далее, реагент карбонилирования имеет структуру формулы (5):[23] Further, the carbonylation reagent has the structure of formula (5):
где R1 и R2 независимо выбраны из группы, состоящей из:where R 1 and R 2 are independently selected from the group consisting of:
[24] Кроме того, реагент карбонилирования выбран из группы, состоящей из:[24] In addition, the carbonylation reagent is selected from the group consisting of:
[25] Далее, АА1, АА2, АА3 и АА4 независимо выбраны из группы, состоящей из следующих: -валин- (-Val-), -цитруллин -(-Cit-), -аланин- (-Ala-), -лизин- (-Lys-), -лизин(тритил)- (-Lys(Trt)-), -лизин(монометокситритил)- (-Lys(Mmt)-), -лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Lys(Fmoc)-), -аргинин- (-Arg-), -фенилаланин- (-Phe-), -глицин- (-Gly-), -лейцин- (-Leu-) и -изолейцин- (-Ile-).[25] Further, AA 1 , AA 2 , AA 3 and AA 4 are independently selected from the group consisting of the following: -valine- (-Val-), -citrulline -(-Cit-), -alanine- (-Ala- ), -lysine- (-Lys-), -lysine(trityl)- (-Lys(Trt)-), -lysine(monomethoxytrityl)- (-Lys(Mmt)-), -lysine(fluorenylmethyloxycarbonyl)- (-Lys (Fmoc)-), -arginine- (-Arg-), -phenylalanine- (-Phe-), -glycine- (-Gly-), -leucine- (-Leu-) and -isoleucine- (-Ile-) .
[26] Кроме того, -АА1-АА2- выбран из следующих: -валин-цитруллин- (-Val-Cit-), -валин-аланин- (-Val-Ala-), -валин-лизин- (-Val-Lys-), -валин-лизин(тритил)- (-Val-Lys(Trt)-), -валин-лизин(монометокситритил)- (-Val-Lys(Mmt)-), -валин-лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Val-Lys(Fmoc)-), -валин-аргинин- (-Val-Arg-), -фенилаланин-цитруллин- (-Phe-Cit-), -фенилпропил-лизин- (-Phe-Lys-), -фенилаланин-лизин(тритил)- (-Phe-Lys(Trt)-), -фенилаланин-лизин(монометокситритил)- (-Phe-Lys(Mmt)-), -фенилаланин-лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Phe-Lys(Fmoc)-), лейцин-цитруллин- (-Leu-Cit-), изолейцин-цитруллин- (-Ile-Cit-) и -фенилаланин-аргинин-(-Phe-Arg-); -АА1-АА2-АА3- выбран из -фенилаланин-аргинин-аргинина-(-Ala-Arg-Arg-); -АА1-АА2-АА3-АА4- выбран из группы, состоящей из следующих: -глицин-глицин-фенилаланин-глицин- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -глицин-фенилаланин-лейцин-глицин- (-Gly-Phe-Leu-Gly-) и -аланин-лейцин-аланин-лейцин (-Ala-Leu-Ala-Leu-).[26] In addition, -AA 1 -AA 2 - is selected from the following: -valine-citrulline- (-Val-Cit-), -valine-alanine- (-Val-Ala-), -valine-lysine- (- Val-Lys-), -valine-lysine (trityl)- (-Val-Lys(Trt)-), -valine-lysine (monomethoxytrityl)- (-Val-Lys(Mmt)-), -valine-lysine (fluorenylmethyloxycarbonyl )- (-Val-Lys(Fmoc)-), -valine-arginine- (-Val-Arg-), -phenylalanine-citrulline- (-Phe-Cit-), -phenylpropyl-lysine- (-Phe-Lys- ), -phenylalanine-lysine (trityl) - (-Phe-Lys (Trt) -), -phenylalanine-lysine (monomethoxytrityl) - (-Phe-Lys (Mmt) -), -phenylalanine-lysine (fluorenylmethyloxycarbonyl) - (- Phe-Lys(Fmoc)-), leucine-citrulline-(-Leu-Cit-), isoleucine-citrulline-(-Ile-Cit-) and -phenylalanine-arginine-(-Phe-Arg-); -AA 1 -AA 2 -AA 3 - selected from -phenylalanine-arginine-arginine-(-Ala-Arg-Arg-); -AA 1 -AA 2 -AA 3 -AA 4 is selected from the group consisting of the following: -glycine-glycine-phenylalanine-glycine- (-Gly-Gly-Phe-Gly-), -glycine-phenylalanine-leucine-glycine - (-Gly-Phe-Leu-Gly-) and -alanine-leucine-alanine-leucine (-Ala-Leu-Ala-Leu-).
[27] Предпочтительно, -AA1-AA2- выбран из следующих структур:[27] Preferably, -AA 1 -AA 2 - is selected from the following structures:
[28] Предпочтительно, -AA1-AA2-AA3- выбран из следующих структур:[28] Preferably, -AA 1 -AA 2 -AA 3 - is selected from the following structures:
[29] Предпочтительно, -АА1-АА2-АА3-АА4- выбран из следующих структур:[29] Preferably, -AA 1 -AA 2 -AA 3 -AA 4 - is selected from the following structures:
[30] Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение промежуточного соединения согласно одному из вышеизложенных определений в получении конъюгата антитело-лекарственное средство.[30] The present invention further provides the use of an intermediate according to one of the above definitions in the preparation of an antibody-drug conjugate.
[31] Далее, растворитель, использованный в реакции конденсации, описанной выше, представляет собой любой полярный растворитель или неполярный растворитель; предпочтительно, растворитель представляет собой один или более чем один растворитель, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, НМРА, диметилового эфира этиленгликоля, диэтилового эфира, трет-бутил-метилового эфира, трет-бутанола, воды, этилацетата, метанола, этанола, изопропанола, дихлорметана, хлороформа и четыреххлористого углерода; более предпочтительно, растворитель представляет собой один или более чем один растворитель, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, воды, метанола, дихлорметана, хлороформа, четыреххлористого углерода и этанола.[31] Further, the solvent used in the condensation reaction described above is any polar solvent or non-polar solvent; preferably, the solvent is one or more solvents selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, HMPA, ethylene glycol dimethyl ether, diethyl ether, t-butyl methyl ether, t- butanol, water, ethyl acetate, methanol, ethanol, isopropanol, dichloromethane, chloroform and carbon tetrachloride; more preferably, the solvent is one or more solvents selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, water, methanol, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride and ethanol.
[32] В некоторых конкретных воплощениях при проведении реакции конденсации между реагентом карбонилирования с 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1 реагент, использованный в реакции конденсации, предпочтительно представляет собой один или более чем один реагент, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, НМРА, диметилового эфира этиленгликоля, диэтилового эфира, трет-бутил-метилового эфира, трет-бутанола, воды и этилацетата; более предпочтительно, реагент представляет собой один или более чем один реагент, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO и воды.[32] In some specific embodiments, when carrying out the condensation reaction between the carbonylation reagent with 2-(trimethylsilyl)ethanol and amino acid AA 1 , the reagent used in the condensation reaction is preferably one or more reagents selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, HMPA, ethylene glycol dimethyl ether, diethyl ether, t-butyl methyl ether, t-butanol, water and ethyl acetate; more preferably, the reagent is one or more reagents selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO and water.
[33] В других конкретных воплощениях после реакции реагента карбонилирования с 2-(триметилсилил)этанолом и аминокислотой AA1 реагент, использованный в реакции конденсации продукта конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-аминокислоты и АА2 и дополнительно с АА3 и/или АА4, в других воплощениях представляет собой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, НМРА, диметилового эфира этиленгликоля, диэтилового эфира, трет-бутил-метилового эфира, трет-бутанола, воды и этилацетата; более предпочтительно, реагент представляет собой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, воды и метанола[33] In other specific embodiments, after the reaction of the carbonylation reagent with 2-(trimethylsilyl)ethanol and amino acid AA 1 , the reagent used in the condensation reaction of the condensation product of 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-amino acid and AA 2 and additionally with AA 3 and/or AA 4 , in other embodiments, is one or more selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, HMPA, ethylene glycol dimethyl ether, diethyl ether, t-butyl methyl ether, t -butanol, water and ethyl acetate; more preferably, the reactant is one or more selected from the group consisting of tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, water and methanol
[34] В других конкретных воплощениях, после вышеуказанных реакций, при проведении реакции конденсации между поли пептидным продуктом конденсации (т.е. продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-дипептидом, продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-трипептидом, продуктом конденсации 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-тетрапептидом) с пара-аминобензиловым спиртом реагент, использованный в реакции конденсации, предпочтительно представляет собой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, четыреххлористого углерода, метанола, этанола, изопропанола, тетрагидрофурана, диоксана, ацетонитрила, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, НМРА, диметилового эфира этиленгликоля, диэтилового эфира, трет-бутил-метилового эфира, трет-бутанола и этилацетата; более предпочтительно, реагент представляет собой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из дихлорметана, хлороформа, четыреххлористого углерода, метанола, этанола и DMF.[34] In other specific embodiments, after the above reactions, when carrying out the condensation reaction between the polypeptide condensation product (i.e., the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl dipeptide, the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tripeptide, the condensation product 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl tetrapeptide) with para-aminobenzyl alcohol, the reagent used in the condensation reaction is preferably one or more selected from the group consisting of dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, methanol, ethanol, isopropanol, tetrahydrofuran , dioxane, acetonitrile, DMF, DMSO, DMAc, DMPU, HMPA, ethylene glycol dimethyl ether, diethyl ether, t-butyl methyl ether, t-butanol and ethyl acetate; more preferably, the reactant is one or more selected from the group consisting of dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, methanol, ethanol and DMF.
[35] Согласно настоящему изобретению предложено также применение способа согласно любому из вышеизложенных определений в получении конъюгата антитело-лекарственное средство.[35] The present invention also provides the use of a method according to any of the above definitions in the preparation of an antibody-drug conjugate.
[36] Получение конъюгатов антитело-лекарственное средство дополнительно включает в себя удаление защитной группы Теос:[36] The preparation of antibody-drug conjugates further includes the removal of the Teos protecting group:
[37] Продукт, полученный путем удаления защитной группы Теос, как описано выше, часто используют в получении конъюгата антитело-лекарственное средство в качестве части линкера, ковалентно связанной с группировкой лекарственного средства. Для достижения ковалентного связывания с группировкой антитела указанный продукт часто связывают с линкером следующими конкретными реакционными путями:[37] The product obtained by removing the Teos protecting group as described above is often used in the preparation of an antibody-drug conjugate as the linker portion covalently linked to the drug moiety. To achieve covalent bonding to the antibody moiety, the product is often coupled to the linker in the following specific reaction pathways:
где L и L' являются линкерами и могут представлять собой любую линкерную группу.where L and L' are linkers and can be any linker group.
[38] В некоторых воплощениях линкерная группа L выбрана из:[38] In some embodiments, the linker group L is selected from:
Соответственно, линкерная группа L' выбрана из:Accordingly, the linker group L' is selected from:
[39] В конкретном воплощении олигопептидный линкер выбран из:[39] In a particular embodiment, the oligopeptide linker is selected from:
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
[40] На Фигурах с Фиг. 1-А по Фиг. 1-F представлены релевантные ЖХ-МС диаграммы Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Теос, при этом Фиг. 1-А представляет собой масс-спектр пустого контроля, Фиг. 1-В представляет собой жидкофазный спектр пустого контроля, Фиг. 1-С представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Теос, Фиг. 1-D представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 1-Е представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 1-F представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией отрицательных ионов.[40] In the Figures of FIG. 1-A in Fig. 1-F are relevant LC/MS plots of Val-Cit-PAB produced by the Teos protecting group method, wherein FIG. 1-A is a blank control mass spectrum, FIG. 1-B is the liquid phase spectrum of the blank control, FIG. 1-C is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Teos protecting group method, FIG. 1-D is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 1-E is the positive ion mass spectrum of the product, and FIG. 1-F is the negative ion mass spectrum of the product.
[41] На Фигурах с Фиг. 2-А по Фиг. 2-Н представлены релевантные ЖХ-МС диаграммы Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Cbz, при этом Фиг. 2-А представляет собой масс-спектр пустого контроля, Фиг. 2-В представляет собой жидкофазный спектр пустого контроля, Фиг. 2-С представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Cbz, Фиг. 2-D представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 2-Е представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией положительных ионов, Фиг. 2-F представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией отрицательных ионов, Фиг. 2-G представляет собой ионный масс-спектр примеси, и Фиг. 2-Н представляет собой масс-спектр примеси с регистрацией отрицательных ионов.[41] In the Figures of FIG. 2-A in Fig. 2-H shows the relevant LC/MS traces of Val-Cit-PAB produced by the Cbz protecting group method, wherein FIG. 2-A is the blank control mass spectrum, FIG. 2-B is the liquid phase spectrum of the blank control, FIG. 2-C is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Cbz protecting group method, FIG. 2-D is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 2-E is the positive ion mass spectrum of the product, FIG. 2-F is the negative ion mass spectrum of the product, FIG. 2-G is the ion mass spectrum of the impurity, and FIG. 2-H is the mass spectrum of an impurity with registration of negative ions.
[42] На Фигурах с Фиг. 3-А по Фиг. 3-D представлены релевантные ЖХ-МС диаграммы Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Вос (способ удаления защитной группы с использованием соляной кислоты), при этом Фиг. 3-А представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Вос, Фиг. 3-В представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 3-С представляет собой спектр с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 3-D представляет собой спектр с регистрацией отрицательных ионов.[42] In the Figures of FIG. 3-A in Fig. 3-D shows the relevant LC/MS diagrams of Val-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method (hydrochloric acid deprotection method), FIG. 3-A is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method, FIG. 3-B is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 3-C is a positive ion spectrum, and FIG. 3-D is a spectrum with registration of negative ions.
[43] На Фигурах с Фиг. 4-А по Фиг. 4-D представлены релевантные ЖХ-МС диаграммы Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Вос (способ удаления защитной группы с использованием трифторуксусной кислоты), при этом Фиг. 4-А представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Вос, Фиг. 4-В представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 4-С представляет собой спектр с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 4-D представляет собой спектр с регистрацией отрицательных ионов.[43] In the Figures of FIG. 4-A in Fig. 4-D shows the relevant LC/MS diagrams of Val-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method (trifluoroacetic acid deprotection method), FIG. 4-A is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method, FIG. 4-B is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 4-C is a positive ion spectrum, and FIG. 4-D is a spectrum with registration of negative ions.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
СокращенияAbbreviations
[44] Если не указано иное, все сокращения, использованные в настоящем изобретении, имеют значения, понятные специалистам в данной области. Использованные в настоящем изобретении общепринятые сокращения и их определения следующие:[44] Unless otherwise indicated, all abbreviations used in the present invention have the meanings understood by those skilled in the art. Conventional abbreviations used in the present invention and their definitions are as follows:
ОпределенияDefinitions
[45] Различные термины, относящиеся к различным аспектам описания изобретения, использованы везде в описании и формуле изобретения. Если не указано иное, такие термины даны в их обычном значении в данной области. Другие конкретно определенные термины следует понимать в соответствии с определениями, приведенными в данном описании изобретения.[45] Various terms relating to various aspects of the description of the invention are used throughout the description and claims. Unless otherwise indicated, such terms are given their usual meaning in the art. Other specifically defined terms should be understood in accordance with the definitions given in this specification.
[46] В данном описании изобретения термины в единственном числе использованы в соответствии со стандартной практикой и означают один или более, если контекст не указывает иное. Так, например, ссылка на "конъюгат антитело-лекарственное средство" включает в себя комбинацию двух или более конъюгатов антитело-лекарственное средство и т.п.[46] In this description of the invention, the terms in the singular are used in accordance with standard practice and mean one or more, unless the context indicates otherwise. For example, reference to "antibody-drug conjugate" includes a combination of two or more antibody-drug conjugates, and the like.
[47] Следует понимать, что везде, где аспект описан в настоящем документе со словом "содержащий", он также предусматривает аналогичные аспекты, описанные выражениями "состоящий из" и "по существу состоящий из".[47] It should be understood that wherever an aspect is described herein with the word "comprising", it also includes similar aspects described by the expressions "consisting of" and "essentially consisting of".
[48] Хотя числовые диапазоны и приблизительные параметры, представленные в широком объеме настоящего изобретения, числовые значения, указанные в конкретных примерах, описаны настолько точно, насколько это возможно. Тем не менее, любое числовое значение безусловно должно содержать некоторую погрешность, которая вызвана стандартным отклонением, которое имеет место при соответственных измерениях. Кроме того, понятно, что все диапазоны, раскрытые в данном документе, охватывают любой и все субдиапазоны, входящие в них. Например, указанный диапазон "от 1 до 10" следует рассматривать как охватывающий любой и все субдиапазоны между минимум 1 и максимум 10 (включительно); то есть все субдиапазоны, начинающиеся с минимум 1 или больше, такие как от 1 до 6,1, и субдиапазоны, заканчивающиеся максимум 10 или меньше, такие как от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, упомянутую как "включенную в данный документ", следует понимать как включенную во всей ее полноте.[48] Although the numerical ranges and approximate parameters are presented in the broad scope of the present invention, the numerical values indicated in specific examples are described as precisely as possible. However, any numerical value must certainly contain some error, which is caused by the standard deviation that occurs with the corresponding measurements. Furthermore, it is to be understood that all ranges disclosed herein encompass any and all subranges contained therein. For example, the specified range "from 1 to 10" should be considered as covering any and all sub-ranges between a minimum of 1 and a maximum of 10 (inclusive); that is, all subranges beginning with a minimum of 1 or greater, such as 1 to 6.1, and subranges ending at a maximum of 10 or less, such as 5.5 to 10. In addition, any reference referred to as "included in this document" shall be understood to be included in its entirety.
[49] В настоящем изобретении
[50] Термин "линкерная группа", использованный в настоящем изобретении, относится к бифункциональной или многофункциональной молекуле, которая может взаимодействовать соответственно с молекулой белка/антитела и дипептидным линкером, и поэтому функционирует в качестве "мостика" для связывания белка/антитела с дипептидным линкером.[50] The term "linker group" as used in the present invention refers to a bifunctional or multifunctional molecule that can interact with a protein/antibody molecule and a dipeptide linker, respectively, and therefore functions as a "bridge" for binding the protein/antibody to the dipeptide linker .
[51] Термин "олигопептидный линкер", использованный в настоящем изобретении относится, как правило, к связывающей структуре, содержащей два или более аминокислотных остатков, которая дополнительно содержит остаток пара-бензилового спирта. Две аминокислоты связываются вместе в результате реакции конденсации с дегидратацией. Аминокислоты, упомянутые в данном документе, обычно относятся к тем органическим соединениям, которые содержат как амино, так и карбоксильные группы, включая все незаменимые аминокислоты и не являющиеся незаменимыми аминокислоты. Предпочтительно, аминокислота включает, без ограничения, -валин- (-Val-), -цитруллин- (-Cit-), -аланин- (-Ala-), -лизин- (-Lys-), -лизин(тритил)- (-Lys(Trt)-), -лизин(монометокситритил)- (-Lys(Mmt)-), -лизин(флуоренилметилоксикарбонил)- (-Lys(Fmoc)-), -аргинин- (-Arg-), -фенилаланин- (-Phe-), -глицин- (-Gly-), -лейцин- (-Leu-) и -изолейцин- (-Ile-).[51] The term "oligopeptide linker" as used in the present invention refers generally to a linking structure containing two or more amino acid residues, which additionally contains a para-benzyl alcohol residue. The two amino acids bind together in a condensation-dehydration reaction. The amino acids referred to herein generally refer to those organic compounds that contain both amino and carboxyl groups, including all essential amino acids and non-essential amino acids. Preferably, the amino acid includes, without limitation, -valine- (-Val-), -citrulline- (-Cit-), -alanine- (-Ala-), -lysine- (-Lys-), -lysine (trityl)- (-Lys(Trt)-), -lysine(monomethoxytrityl)- (-Lys(Mmt)-), -lysine(fluorenylmethyloxycarbonyl)- (-Lys(Fmoc)-), -arginine- (-Arg-), -phenylalanine - (-Phe-), -glycine- (-Gly-), -leucine- (-Leu-) and -isoleucine- (-Ile-).
Конкретные примерыSpecific examples
[52] Ниже настоящее изобретение дополнительно описано в сочетании с конкретными примерами. Следует иметь в виду, что эти примеры использованы только для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения. Экспериментальные методы без конкретных условий в нижеследующих примерах осуществляют, как правило, в стандартных условиях или в условиях, рекомендованных производителем. Реагенты без конкретных источников являются стандартными реагентами, продаваемыми на рынке. Если не указано иное, все проценты, соотношения, пропорции или части являются массовыми.[52] Below, the present invention is further described in conjunction with specific examples. It should be understood that these examples are used only to illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention. Experimental methods without specific conditions in the following examples are carried out, as a rule, under standard conditions or under conditions recommended by the manufacturer. Reagents without specific sources are standard reagents sold on the market. Unless otherwise indicated, all percentages, ratios, proportions or parts are by weight.
[53] Единицы в масс-объемных процентах в настоящем изобретении известны специалистам в данной области и, например, относятся к массе растворенного вещества в 100 мл раствора.[53] The units in mass-volume percent in the present invention are known to those skilled in the art and, for example, refer to the mass of a solute in 100 ml of solution.
[54] Если не дано иного определения, все специальности и науки в данном документе использованы в том смысле, в котором они знакомы специалистам в данной области. Кроме того, любой способ или любое вещество, подобный(ое) или равный(ое) описанному, может быть использован в способе по настоящему изобретению. Предпочтительные воплощения и вещества, описанные в данном документе, приведены только в целях иллюстрации.[54] Unless otherwise defined, all specialties and sciences in this document are used in the sense in which they are familiar to specialists in this field. In addition, any method or any substance similar(s) or equal(s) described can be used in the method of the present invention. The preferred embodiments and materials described herein are for illustrative purposes only.
[55] Пример 1. Получение Val-Cit-PAB способом с использованием защитной группы Теос[55] Example 1 Preparation of Val-Cit-PAB by Teos protecting group method
[56] (1) Получение Teoc-Val-Cit[56] (1) Getting Teoc-Val-Cit
[57] 14,16 г 2-(триметилсилил)этанола (120 ммоль), 38,7 г N,N-диизопропилэтиламина (300 ммоль), 30,4 г бис(4-нитрофенил)карбоната (100 ммоль) и 400 мл ацетонитрила последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 500 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч с образованием реакционного раствора 1. 14,08 г L-валина (120 ммоль) и 25,8 г N,N-диизопропилэтиламина (200 ммоль) добавляли в одногорлую колбу вместимостью 1 л и растворяли в 400 мл воды с образованием реакционного раствора 2. Реакционный раствор 1 добавляли к реакционному раствору 2 при перемешивании, и после перемешивания при комнатной температуре в течение 16 h, завершение реакции определяли методом ЖХ-МС. После подтверждения завершения реакции реакционный раствор выпаривали на роторном испарителе для удаления растворителя. После выпаривания добавляли 500 мл воды и добавляли по каплям 1 моль/л соляной кислоты при перемешивании до установления рН1. Затем водную фазу экстрагировали дважды по 300 мл этилацетата каждый раз.[57] 14.16 g 2-(trimethylsilyl)ethanol (120 mmol), 38.7 g N,N-diisopropylethylamine (300 mmol), 30.4 g bis(4-nitrophenyl) carbonate (100 mmol) and 400 ml acetonitrile was added sequentially to a 500 ml single-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 16 hours to form
Экстракты объединяли и промывали дважды по 300 мл воды каждый раз. После промывки водой экстракт сушили путем добавления безводного сульфата магния, и растворитель выпаривали на роторном испарителе с получением 54 г бледно-желтого вязкого твердого продукта (т.е. 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валильной смеси, содержащей 4-нитрофенол (просто упоминаемый как 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валильная смесь)). ЖХ-МС (М-Н)-: 260,1. 2-(Триметилсилил)этоксикарбонил-L-валильную смесь использовали на следующей стадии без очистки.The extracts were combined and washed twice with 300 ml of water each time. After washing with water, the extract was dried by adding anhydrous magnesium sulfate and the solvent was evaporated on a rotary evaporator to give 54 g of a pale yellow viscous solid (i.e. 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valley mixture containing 4-nitrophenol (simply referred to as 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valyl mixture)). LC-MS (M-H) - : 260.1. The 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valley mixture was used in the next step without purification.
[58] 10,5 г 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валильной смеси (40 ммоль), полученной выше, 24,3 г N,N,N',N'-тетраметил-O-(N-сукцинимид)мочевины тетрафторбората (80 ммоль), 25,8 г N,N-диизопропилэтиламина (200 ммоль) и 200 мл N,N-диметилформамида последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 500 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч с образованием реакционного раствора 3. 21 г L-цитруллина (120 ммоль) добавляли в одногорлую колбу вместимостью 1 л и полностью растворяли при перемешивании с добавлением 400 мл воды с образованием реакционного раствора 4. 15,5 г N,N-диизопропилэтиламина (120 ммоль) и 200 мл N,N-диметилформамида добавляли в мерный стакан на 500 мл с образованием реакционного раствора 5. Реакционный раствор 5 добавляли к реакционному раствору 4, затем переносили в низкотемпературную баню и перемешивали при -10°С в течение 0,5 ч. Затем реакционный раствор 3 медленно добавляли по каплям в вышеуказанную реакционную систему при перемешивании при -10°С, и контролировали, чтобы добавление закончилось примерно через 2 ч. После завершения добавления смесь выдерживали при -10°С в течение 16 ч при перемешивании. Затем завершение реакции определяли методом ЖХ-МС. После подтверждения завершения реакции систему выпаривали на роторном испарителе для удаления растворителя, и после выпаривания на роторном испарителе добавляли 500 мл 0,1 моль/л соляной кислоты и хорошо перемешивали. Водную фазу экстрагировали дважды по 300 мл этилацетата каждый раз. Экстракты объединяли и промывали дважды по 300 мл 0,1 моль/л соляной кислоты каждый раз и затем промывали дважды 300 мл воды. После промывки водой экстракт сушили путем добавления безводного сульфата магния, и растворитель выпаривали на роторном испарителе, после чего добавляли 100 мл этилацетата и 1000 мл толуола при перемешивании в течение 16 ч и затем фильтровали. Осадок на фильтре растворяли в 50 мл THF и добавляли 1 л смеси метил-трет-бутиловый эфир:н-гексан = 1:1 с получением раствора. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов и затем фильтровали. Осадок на фильтре растворяли в 50 мл THF, после чего добавляли 1 л толуола. После перемешивания при комнатной температуре в течение 6 ч смесь фильтровали, и осадок на фильтре сушили с получением 11,1 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта с выходом 68%. ЖХ-МС(М+Н)+: 418,7, ЖХ-МС(М-Н)-: 416,7.[58] 10.5 g 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valyl mixture (40 mmol) prepared above, 24.3 g N,N,N',N'-tetramethyl-O-(N-succinimide)urea tetrafluoroborate (80 mmol), 25.8 g of N,N-diisopropylethylamine (200 mmol) and 200 ml of N,N-dimethylformamide were added successively to a 500 ml one-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 6 hours to form reaction solution 3. 21 g of L-citrulline (120 mmol) was added to a 1 L single-necked flask and completely dissolved with stirring with the addition of 400 ml of water to form
[59] (2) Получение Теос-Val-Cit-PAB[59] (2) Obtaining Teos-Val-Cit-PAB
[60] 7,5 г 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валил-L-цитруллина (18 ммоль), 9 г N-этоксиацил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (36 ммоль), 4,5 г пара-аминобензилового спирта (36 ммоль), 150 мл дихлорметана и 75 мл метанола последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 500 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем завершение реакции определяли методом ЖХ-МС. После подтверждения завершения реакционный раствор сушили на роторном испарителе и после выпаривания добавляли 200 мл дихлорметана и 200 мл этилацетата и перемешивали в течение 16 ч и затем фильтровали. К осадку на фильтре добавляли 100 мл дихлорметана, 100 мл этилацетата и 200 мл н-гексана при перемешивании в течение 16 ч и затем фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 7,5 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта (этим продуктом был 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валил-L-цитрулламидо-пара-бензиловый спирт, а именно Teoc-Val-Cit-PAB) с выходом 80%. ЖХ-МС(М+Н)+: 523,5, ЖХ-МС(М-Н)-: 522.[60] 7.5 g 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valyl-L-citrulline (18 mmol), 9 g N-ethoxyacyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (36 mmol), 4.5 g para-aminobenzyl alcohol (36 mmol), 150 ml of dichloromethane and 75 ml of methanol were added successively to a 500 ml single-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Then the completion of the reaction was determined by LC-MS. After confirmation of completion, the reaction solution was dried on a rotary evaporator, and after evaporation, 200 ml of dichloromethane and 200 ml of ethyl acetate were added and stirred for 16 hours and then filtered. To the filter cake were added 100 ml dichloromethane, 100 ml ethyl acetate and 200 ml n-hexane with stirring for 16 hours and then filtered. The filter cake was dried to give 7.5 g of an off-white powdery solid (this product was 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valyl-L-citrullamido-para-benzyl alcohol, namely Teoc-Val-Cit-PAB) with a yield of 80%. LC-MS(M+H) + : 523.5, LC-MS(M-H) - : 522.
[61] (3) Получение Val-Cit-PAB (относительная молекулярная масса: 379,46)[61] (3) Preparation of Val-Cit-PAB (relative molecular weight: 379.46)
[62] 3,15 г 2-(триметилсилил)этоксикарбонил-L-валил-L-цитрулламидо-пара-бензилового спирта (6,2 ммоль), 2,16 г фторида калия (37,2 ммоль), 12,4 мл 1,0 моль/л раствора тетрабутиламмонийфторида в тетрагидрофуране и 100 мл N,N-диметилформамида последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 500 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч и затем завершение реакции определяли методом ЖХ-МС. После завершения реакции реакционный раствор фильтровали. После выпаривания растворителя на ротоном испарителе из фильтрата 100 мл безводного этанола добавляли до полного растворения остатка. Добавляли 18 мл 1 моль/л разбавленного раствора соляной кислоты и хорошо перемешивали, после чего смесь сушили путем добавления безводного сульфата магния и затем фильтровали. Фильтрат сушили выпариванием на роторном испарителе, и затем добавляли 30 мл этанола до полного растворения остатка. При перемешивании при комнатной температуре добавляли смешанный раствор 200 мл метил-трет-бутилового эфира и 200 мл дихлорметана и перемешивали в течение 1 ч, после чего фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 1,83 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта (этим продуктом был L-валил-L-цитрулламидо-пара-бензиловый спирт, т.е. Val-Cit-PAB) с выходом 80%.[62] 3.15 g 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-L-valyl-L-citrullamido-para-benzyl alcohol (6.2 mmol), 2.16 g potassium fluoride (37.2 mmol), 12.4 ml A 1.0 mol/L solution of tetrabutylammonium fluoride in tetrahydrofuran and 100 ml of N,N-dimethylformamide were added sequentially to a 500 ml one-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 24 hours, and then the completion of the reaction was determined by LC-MS. After completion of the reaction, the reaction solution was filtered. After evaporation of the solvent on a rotary evaporator, 100 ml of anhydrous ethanol was added from the filtrate until the residue was completely dissolved. 18 ml of a 1 mol/l dilute hydrochloric acid solution was added and stirred well, after which the mixture was dried by adding anhydrous magnesium sulfate and then filtered. The filtrate was dried by rotary evaporation and then 30 ml of ethanol was added until the residue was completely dissolved. Under stirring at room temperature, a mixed solution of 200 ml of methyl tert-butyl ether and 200 ml of dichloromethane was added and stirred for 1 hour, after which it was filtered. The filter cake was dried to give 1.83 g of an off-white powdery solid (this product was L-valyl-L-citrullamido-p-benzyl alcohol, i.e. Val-Cit-PAB) in 80% yield.
[63] При регистрации ЖХ-МС Фиг. 1-А представляет собой масс-спектр пустого контроля, Фиг. 1-В представляет собой жидкофазный спектр пустого контроля, Фиг. 1-С представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Теос (продукт в этом примере), Фиг. 1-D представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 1-Е представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 1-F представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией отрицательных ионов. Сравнивая Фиг. 1-А с Фиг. 1-С, можно видеть, что пик в точке времени 2,87 мин является ионным пиком продукта. Сравнивая Фиг. 1-В с Фиг. 1-D, можно видеть, что продукт имеет сильный ВЭЖХ сигнал, и в сочетании с Фиг. 1-А и Фиг. 1-С можно видеть, что Val-Cit-PAB, полученный способом с использованием защитной группы Теос, имеет меньше примесей. Анализируя спектр с регистрацией положительных ионов (2,849 мин) и спектр с регистрацией отрицательных ионов (2,866 мин) при 2,87 мин, можно узнать, что: ЖХ-МС(М+Н)+: 379,6, ЖХ-МС(М-Н)-: 378,0.[63] When registering LC-MS of Fig. 1-A is a blank control mass spectrum, FIG. 1-B is the liquid phase spectrum of the blank control, FIG. 1-C is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Teos protecting group method (product in this example), FIG. 1-D is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 1-E is the positive ion mass spectrum of the product, and FIG. 1-F is the negative ion mass spectrum of the product. Comparing Fig. 1-A from Fig. 1-C, it can be seen that the peak at the time point of 2.87 minutes is the ionic peak of the product. Comparing Fig. 1-B with Fig. 1-D, it can be seen that the product has a strong HPLC signal, and in combination with FIG. 1-A and Fig. 1-C, it can be seen that Val-Cit-PAB made by the Teos protecting group method has fewer impurities. By analyzing the positive ion spectrum (2.849 min) and the negative ion spectrum (2.866 min) at 2.87 min, it can be found that: LC-MS(M+H) + : 379.6, LC-MS(M -H) - : 378.0.
[64] Пример 2. Получение Val-Cit-PAB способом с использованием защитной группы Cbz[64] Example 2 Preparation of Val-Cit-PAB by Cbz protecting group method
[65] (1) Получение Cbz-Val-Cit[65] (1) Getting Cbz-Val-Cit
[66] 10 г N-бензилоксикарбонил-L-валина (т.е. Cbz-Val) (40 ммоль), 18,2 г N,N,N',N'-тетраметил-O-(N-сукцинимид)мочевины тетрафторбората (60 ммоль), 15,5 г N,N-диизопропилэтиламина (120 ммоль) и 300 мл ацетонитрила последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 1 л. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. После растворения 7,7 г L-цитруллина (44 ммоль) в 300 мл воды, смесь добавляли в вышеуказанную реакционную систему и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали. При перемешивании добавляли по каплям 0,1 моль/л соляную кислоту до достижения рН 1. После сушки выпариванием растворителя на роторном испарителе добавляли 800 мл воды, перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. После сушки осадка на фильтре в вакууме добавляли 400 мл этилацетата и 400 мл дихлорметана и перемешивали в течение 16 ч, после чего фильтровали. После сушки осадка на фильтре в вакууме добавляли 200 мл этилацетата, 200 мл дихлорметана и 400 мл н-гексана, и смесь перемешивали в течение 16 часов и затем фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 12,65 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта (т.е. N-бензилоксикарбонил-L-валил-L-цитруллина) с выходом 77%. ЖХ-МС(М+Н)+: 408,7, ЖХ-МС(М-Н)-: 406,9.[66] 10 g N-benzyloxycarbonyl-L-valine (i.e. Cbz-Val) (40 mmol), 18.2 g N,N,N',N'-tetramethyl-O-(N-succinimide)urea tetrafluoroborate (60 mmol), 15.5 g of N,N-diisopropylethylamine (120 mmol) and 300 ml of acetonitrile were added successively to a 1 L one-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 4 hours. After dissolving 7.7 g of L-citrulline (44 mmol) in 300 ml of water, the mixture was added to the above reaction system and stirred at room temperature for 16 hours. Samples were taken for registration LC-MS, and then the reaction was completed. With stirring, 0.1 mol/l hydrochloric acid was added dropwise until
[67] (2) Получение Cbz-Val-Cit-PAB[67] (2) Preparation of Cbz-Val-Cit-PAB
[68] 12,65 г N-бензилоксикарбонил-L-валил-L-цитруллина (31 ммоль), 15,74 г N-этоксиацил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (62 ммоль), 7,53 г пара-аминобензилового спирта (62 ммоль), 200 мл дихлорметана и 100 мл метанола последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 500 мл. После перемешивания при комнатной температуре в течение 16 ч отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали. После сушки реакционного раствора выпариванием на роторном испарителе добавляли 200 мл дихлорметана и 200 мл этилацетата, перемешивали в течение 16 ч и фильтровали. К осадку на фильтре добавляли 100 мл дихлорметана, 100 мл этилацетата и 200 мл н-гексана, перемешивали в течение 16 ч и фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 9,1 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта с выходом 60%. ЖХ-МС(М+Н)+: 513,6.[68] 12.65 g N-benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-citrulline (31 mmol), 15.74 g N-ethoxyacyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (62 mmol), 7.53 g steam α-aminobenzyl alcohol (62 mmol), 200 ml of dichloromethane and 100 ml of methanol were added successively to a 500 ml single-necked flask. After stirring at room temperature for 16 hours, samples were taken for LC-MS registration, and then the reaction was completed. After drying the reaction solution by rotary evaporation, 200 ml of dichloromethane and 200 ml of ethyl acetate were added, stirred for 16 hours and filtered. To the filter cake were added 100 ml of dichloromethane, 100 ml of ethyl acetate and 200 ml of n-hexane, stirred for 16 h and filtered. The filter cake was dried to give 9.1 g of an off-white powdery solid in 60% yield. LC-MS(M+H) + : 513.6.
[69] (3) Получение Val-Cit-PAB (относительная молекулярная масса: 379,46)[69] (3) Preparation of Val-Cit-PAB (relative molecular weight: 379.46)
[70] 1,12 г N-бензилоксикарбонил-L-валил-L-цитрулламидо-пара-бензилового спирта (2 ммоль), 0,3 г палладия на углероде и 100 мл метанол последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 250 мл и перемешивали при 10°С. Реакционную систему подключали к баллону, заполненному газом водородом, и смесь перемешивали при 10°С в течение 16 ч. Отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали. Реакционный раствор фильтровали, и фильтрат сушили выпариванием на роторном испарителе. Добавляли 400 мл н-гексана, перемешивали в течение 16 ч и затем фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 0,69 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта с выходом 91%.[70] 1.12 g of N-benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-citrullamido-p-benzyl alcohol (2 mmol), 0.3 g of palladium on carbon, and 100 ml of methanol were successively added to a 250 ml one-necked flask and stirred at 10°C. The reaction system was connected to a balloon filled with hydrogen gas, and the mixture was stirred at 10° C. for 16 hours. Samples were taken for LC-MS registration, and then the reaction was completed. The reaction solution was filtered, and the filtrate was dried by rotary evaporation. 400 ml n-hexane was added, stirred for 16 h and then filtered. The filter cake was dried to give 0.69 g of an off-white powdery solid in 91% yield.
[71] При регистрации ЖХ-МС Фиг 2-А представляет собой масс-спектр пустого контроля, Фиг. 2-В представляет собой жидкофазный спектр пустого контроля, Фиг 2-С представляет собой масс-спектр Val-Cit-PAB, полученного способом с использованием защитной группы Cbz (продукт в этом примере), Фиг 2-D представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 2-Е представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией положительных ионов, Фиг 2-F представляет собой масс-спектр продукта с регистрацией отрицательных ионов, Фиг 2-G представляет собой ионный масс-спектр примеси, и Фиг. 2-Н представляет собой масс-спектр примеси с регистрацией отрицательных ионов. Сравнивая Фиг 2-А с Фиг 2-С, можно видеть, что имеется два более сильных ионных пика: при 4,33 мин и при 6,54 мин. Сравнивая Фиг 2-В и 2-D, можно видеть, что имеется два пика с сильными ВЭЖХ сигналами при 4,12 мин и при 5,39 мин, и в сочетании с Фиг 2-А и Фиг 2-С, можно сделать вывод, что один из двух пиков является пиком продукта, и один из двух пиков является пиком примесей, и содержание примесей выше. Анализируя масс-спектр с регистрацией положительных ионов и масс-спектр с регистрацией отрицательных ионов при 4,33 мин и при 5,54 мин, можно обнаружить, что пик при 4,33 мин является пиком продукта (ЖХ-МС(М+Н)+: 379,6, ЖХ-МС(М-Н)-: 378,0), а пик при 5,54 мин является пиком примеси (ЖХ-МС(М+Н)+: 363,6), которая предположительно является побочным продуктом дегидроксилирования Val-Cit-PAB (с разницей в молекулярной массе лишь 16), и его содержание выше. Поскольку химические свойства побочного продукта очень схожи со свойствами продукта, этот побочный продукт очень трудно удалить, и это сильно сказывается на последующих реакциях и качестве продукта. Кроме того, в процессе удаления защитной группы используется газ водород, что создает риск для возникновения угрозы безопасности.[71] When registered by LC-MS, FIG. 2-A is a blank control mass spectrum, FIG. 2-B is the liquid phase spectrum of the blank control, FIG. 2-C is the mass spectrum of Val-Cit-PAB prepared by the Cbz protecting group method (the product in this example), FIG. 2-D is the liquid phase spectrum of the product, FIG. . 2-E is the mass spectrum of the product with positive ion detection, FIG. 2-F is the mass spectrum of the product with negative ion detection, FIG. 2-G is the ion mass spectrum of the impurity, and FIG. 2-H is the mass spectrum of an impurity with registration of negative ions. Comparing Figure 2-A with Figure 2-C, it can be seen that there are two stronger ion peaks, at 4.33 minutes and at 6.54 minutes. Comparing Figs 2-B and 2-D, it can be seen that there are two peaks with strong HPLC signals at 4.12 min and 5.39 min, and in combination with Figs 2-A and Fig 2-C, it can be concluded that one of the two peaks is a product peak and one of the two peaks is an impurity peak, and the impurity content is higher. By analyzing the positive ion mass spectrum and the negative ion mass spectrum at 4.33 min and at 5.54 min, it can be found that the peak at 4.33 min is the product peak (LC-MS(M+H) + : 379.6, LC-MS(M-H) - : 378.0), and the peak at 5.54 min is the peak of the impurity (LC-MS(M+H) + : 363.6), which is assumed to be a by-product of the dehydroxylation of Val-Cit-PAB (with a difference in molecular weight of only 16), and its content is higher. Since the chemical properties of the by-product are very similar to those of the product, this by-product is very difficult to remove and this greatly affects subsequent reactions and product quality. In addition, hydrogen gas is used in the deprotection process, which poses a safety risk.
[72] Пример 3. Получение Phe-Cit-PAB способом с использованием защитной группы Вос[72] Example 3 Preparation of Phe-Cit-PAB by the Boc protecting group method
[73] (1) Получение Boc-Phe-Cit[73] (1) Obtaining Boc-Phe-Cit
[74] 2,65 г N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланина (10 ммоль) (т.е. Boc-Phe), 3,61 г N,N,N',N'-тетраметил-O-(N-сукцинимид)мочевины тетрафторбората (12 ммоль), 3,87 г N,N-диизопропилэтиламина (30 ммоль) и 50 мл N,N-диметилформамида последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 250 мл и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч.[74] 2.65 g N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanine (10 mmol) (i.e. Boc-Phe), 3.61 g N,N,N',N'-tetramethyl-O- (N-succinimide)urea tetrafluoroborate (12 mmol), 3.87 g of N,N-diisopropylethylamine (30 mmol) and 50 ml of N,N-dimethylformamide were sequentially added to a 250 ml single neck flask and stirred at room temperature for 4 h .
[75] 1,75 г L-цитруллина (10 ммоль) растворяли в 50 мл воды, и этот раствор добавляли в вышеуказанную реакционную систему и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали. При перемешивании раствор 0,1 моль/л соляной кислоты добавляли по каплям до достижения рН 1. После сушки системы выпариванием на роторном испарителе добавляли 200 мл воды, перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч и фильтровали. После сушки осадка на фильтре добавляли 100 мл этилацетата и 100 мл дихлорметана, перемешивали в течение 16 ч и фильтровали. Осадок на фильтре сушили с получением 3 г желтого порошкообразного твердого продукта (то есть N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-цитруллина, Boc-Phe-Cit) с выходом 71%. ЖХ-МС(М-Н)-: 421,4.[75] 1.75 g of L-citrulline (10 mmol) was dissolved in 50 ml of water, and this solution was added to the above reaction system and stirred at room temperature for 16 hours. Samples were taken for LC-MS registration, and then the reaction was completed . With stirring, a solution of 0.1 mol/l hydrochloric acid was added dropwise until
[76] (2) Получение Boc-Phe-Cit-PAB[76] (2) Preparation of Boc-Phe-Cit-PAB
[77] 3 г N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-цитруллина (7,1 ммоль) (т.е. Boc-Phe-Cit), 3,5 г N-этоксиацил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина (14,2 ммоль), 1,75 г пара-аминобензилового спирта (14,2 ммоль), 60 мл дихлорметана и 30 мл метанола последовательно добавляли в одногорлую колбу вместимостью 250 мл и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Затем отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали. После сушки реакционного раствора выпариванием на роторном испарителе добавляли 100 мл дихлорметана и 100 мл этилацетата, перемешивали в течение 16 ч и центрифугировали. 100 мл н-гексана добавляли к белому твердому веществе в нижнем слое, перемешивали в течение 2 ч и центрифугировали. Белое твердое вещество в нижнем слое сушили с получением 2,3 г не совсем белого порошкообразного твердого продукта (то есть N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-цитрулламидо-пара-бензилового спирта, Boc-Phe-Cit-PAB) с выходом 62%. ЖХ-МС(М-Н)-: 526,2.[77] 3 g N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-citrulline (7.1 mmol) (i.e. Boc-Phe-Cit), 3.5 g N-ethoxyacyl-2-ethoxy- 1,2-dihydroquinoline (14.2 mmol), 1.75 g of para-aminobenzyl alcohol (14.2 mmol), 60 ml of dichloromethane and 30 ml of methanol were successively added to a 250 ml single neck flask and stirred at room temperature for 16 h. Then samples were taken for registration by LC-MS, and then the reaction was completed. After drying the reaction solution by rotary evaporation, 100 ml of dichloromethane and 100 ml of ethyl acetate were added, stirred for 16 hours and centrifuged. 100 ml of n-hexane was added to the white solid in the bottom layer, stirred for 2 h and centrifuged. The white solid in the bottom layer was dried to give 2.3 g of an off-white powdery solid (i.e. N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-citrullamido-p-benzyl alcohol, Boc-Phe-Cit-PAB ) with a yield of 62%. LC-MS(M-H) - : 526.2.
[78] (3) Получение Phe-Cit-PAB (относительная молекулярная масса: 427,51)[78] (3) Preparation of Phe-Cit-PAB (relative molecular weight: 427.51)
[79] Защитную группу Вос удаляли способом с использованием соляной кислоты и способом с использованием трифторуксусной кислоты, соответственно, как показано далее.[79] The Boc protecting group was removed by the hydrochloric acid method and the trifluoroacetic acid method, respectively, as shown below.
[80] (а) Способ удаления защитной группы с использованием соляной кислоты[80] (a) Hydrochloric acid deprotection method
[81] 0,5 г N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-цитрулламидо-пара-бензилового спирта (1 ммоль) (т.е. Boc-Phe-Cit-PAB), 3 мл 4 моль/л раствора хлористого водорода в диоксане и 3 мл диоксана последовательно добавляли в одногорлую колбу на 10 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Отбирали образцы для регистрации ЖХ-МС, и затем реакцию завершали.[81] 0.5 g N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-citrullamido-para-benzyl alcohol (1 mmol) (i.e. Boc-Phe-Cit-PAB), 3
[82] При регистрации ЖХ-МС Фиг. 3-А представляет собой масс-спектр Phe-Cit-РАВ, полученного способом с использованием защитной группы Вос (продукт в этом примере), Фиг. 3-В представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 3-С представляет собой спектр с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 3-D представляет собой спектр с регистрацией отрицательных ионов. Из Фиг. 3-А можно видеть, что имеется сильный ионный пик при 5,39 мин. Анализируя масс-спектр с регистрацией положительных ионов (5,390 мин) и масс-спектр с регистрацией отрицательных ионов (5,403 мин) в этом положении было получено значение ЖХ-МС (М+Н)+: 446,2, ЖХ-МС (М-Н)-: 444,1. Можно сделать предположение, что большинство продуктов, полученных этим способом, являются побочными продуктами, в которых гидроксильная группа в положении бензила замещена хлором.[82] When registering LC-MS FIG. 3-A is the mass spectrum of Phe-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method (the product in this example), FIG. 3-B is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 3-C is a positive ion spectrum, and FIG. 3-D is a spectrum with registration of negative ions. From FIG. 3-A it can be seen that there is a strong ion peak at 5.39 min. Analyzing the mass spectrum with the registration of positive ions (5.390 min) and the mass spectrum with the registration of negative ions (5.403 min) in this position, the value of LC-MS (M+H) + was obtained: 446.2, LC-MS (M- H) - : 444.1. It can be assumed that most of the products obtained by this process are by-products in which the hydroxyl group at the benzyl position is replaced by chlorine.
[83] (б) Способ удаления защитной группы с использованием трифторуксусной кислоты[83] (b) Deprotection method using trifluoroacetic acid
[84] 0,5 г N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-цитрулламидо-пара-бензилового спирта (1 ммоль) и 3 мл трифторуксусной кислоты последовательно добавляли в одногорлую колбу на 10 мл. После добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, и завершение реакции определяли методом ЖХ-МС.[84] 0.5 g of N-(tert-butoxycarbonyl)-L-phenylalanyl-L-citrullamido-p-benzyl alcohol (1 mmol) and 3 ml of trifluoroacetic acid were added sequentially to a 10 ml single-necked flask. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 2 hours, and the completion of the reaction was determined by LC-MS.
[85] При регистрации ЖХ-МС Фиг. 4-А представляет собой масс-спектр Phe-Cit-РАВ, полученного способом с использованием защитной группы Вос (продукт в этом примере), Фиг. 4-В представляет собой жидкофазный спектр продукта, Фиг. 4-С представляет собой спектр с регистрацией положительных ионов, и Фиг. 4-D представляет собой спектр с регистрацией отрицательных ионов. Можно видеть из Фиг. 4-А, что имеется сильный ионный пик при 5,77 мин. Анализируя масс-спектр с регистрацией положительных ионов (5,768 мин) и масс-спектр с регистрацией отрицательных ионов (5,781 мин) в этой позиции, было получено значение ЖХ-МС (М+Н)+: 524,4, ЖХ-МС (М-Н)-: 522,1. Предполагается, что большинство продуктов, полученных этим способом, являются побочными продуктами, в которых гидроксильная группа в положении бензила образует трифторацетат.[85] When registering LC-MS FIG. 4-A is the mass spectrum of Phe-Cit-PAB prepared by the Boc protecting group method (the product in this example), FIG. 4-B is the liquid phase spectrum of the product, FIG. 4-C is a positive ion spectrum, and FIG. 4-D is a spectrum with registration of negative ions. It can be seen from Fig. 4-A that there is a strong ion peak at 5.77 min. By analyzing the positive ion mass spectrum (5.768 min) and the negative ion mass spectrum (5.781 min) at this position, an LC-MS (M+H) + value was obtained: 524.4, LC-MS (M -H) - : 522.1. It is believed that most of the products obtained by this process are by-products in which the hydroxyl group at the benzyl position forms trifluoroacetate.
[86] В итоге, способ получения Val-Cit-PAB с использованием Теос в качестве защитной группы, предложенный согласно настоящему изобретению, легко осуществляется в мягких реакционных условиях, и поскольку почти не происходит побочных реакций в этой реакции, этот способ дает высокочистый продукт, который имеет меньше примесей и легко очищается. Способ получения Val-Cit-PAB с использованием Cbz в качестве защитной группы дает большое количество побочных продуктов дегидроксилирования. Поскольку химические свойства этих побочных продуктов очень схожи со свойствами продуктов, их трудно удалять, что сильно сказывается на последующих реакциях и качестве продукта. Кроме того, в процессе удаления защитной группы используют газ водород в качестве реагента, что создает риск возникновения угрозы безопасности. Способ получения Val-Cit-PAB с использованием Вос в качестве защитной группы имеет проблемы в том, что гидроксильная группа в положении бензила замещена хлором и образует трифторацетат с высокой степенью конверсии. Следовательно, по сравнению с другими двумя способами способ с использованием Теос, предложенный согласно настоящему изобретению, легче осуществляется и дает немного примесей, что обеспечивает достижение неожиданного технического результата.[86] In summary, the method for producing Val-Cit-PAB using Teos as a protecting group proposed by the present invention is easily carried out under mild reaction conditions, and since almost no side reactions occur in this reaction, this method gives a highly pure product, which has less impurities and is easy to clean. The process for preparing Val-Cit-PAB using Cbz as a protecting group produces a large amount of dehydroxylation by-products. Since the chemical properties of these by-products are very similar to those of the products, they are difficult to remove, which greatly affects subsequent reactions and product quality. In addition, the deprotection process uses hydrogen gas as a reactant, which poses a safety risk. The method for preparing Val-Cit-PAB using Boc as a protecting group has problems in that the hydroxyl group at the benzyl position is replaced by chlorine and forms trifluoroacetate with a high degree of conversion. Therefore, compared with the other two methods, the Teos method of the present invention is easier to carry out and produces few impurities, which achieves an unexpected technical result.
[87] Изобретение было проиллюстрировано различными конкретными воплощениями. Однако специалисты в данной области могут понять, что настоящее изобретение не ограничено этими конкретными воплощениями. Специалисты в данной области могут делать различные изменения или модификации в рамках объема настоящего изобретения, и различные технические признаки, упомянутые в разных местах в данном описании изобретения, можно сочетать друг с другом, не отклоняясь от замысла и объема настоящего изобретения. Такие модификации и варианты также входят в объем настоящего изобретения.[87] The invention has been illustrated by various specific embodiments. However, those skilled in the art will appreciate that the present invention is not limited to these particular embodiments. Various changes or modifications may be made by those skilled in the art within the scope of the present invention, and various technical features mentioned at various places in this specification may be combined with each other without deviating from the spirit and scope of the present invention. Such modifications and variations are also within the scope of the present invention.
Claims (53)
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2775973C1 RU2775973C1 (en) | 2022-07-12 |
| RU2775973C9 true RU2775973C9 (en) | 2022-09-13 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2018102153A (en) * | 2015-06-22 | 2019-07-25 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | ANTIBODY AND MEDICINAL COMPOUNDS (ADC) AND ANTIBODY AND MEDICINAL COMPOUNDS (APDC) CONTAINING AN ENZYMATLY DIVISIBLE GROUP |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2018102153A (en) * | 2015-06-22 | 2019-07-25 | Байер Фарма Акциенгезельшафт | ANTIBODY AND MEDICINAL COMPOUNDS (ADC) AND ANTIBODY AND MEDICINAL COMPOUNDS (APDC) CONTAINING AN ENZYMATLY DIVISIBLE GROUP |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| D. MONDAL ET AL. Improved Methodology for the Synthesis of a Cathepsin B Cleavable Dipeptide Linker, Widely Used in Antibody-Drug Conjugate Research, TETRAHEDRON LETTERS, 2018, Vol. 59, pp. 3594-3599. A. DAL CORSO ET AL. Protease-Cleavable Linkers Modulate the Anticancer Activity of Non-Internalizing Antibody-Drug Conjugates, BIOCONJUGATE CHEMISTRY, 2017, 28(7), pp. 1826-1833. R. SHUTE ET AL. Synthesis and Evaluation of Novel Activated Mixed Carbonate Reagents for the Introduction of the 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl(Teoc)-Protecting Group, SYNTHESIS, 1987, (4), pp. 346-349; DOI: 10.1055/s-1987-27939. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019268215B2 (en) | Process for preparing intermediate of antibody drug conjugate | |
| JP7625531B2 (en) | Method for producing peptide compounds containing amino acids with high steric hindrance | |
| US20230128167A1 (en) | Oligopeptide linker intermediate and preparation method thereof | |
| AU2019433421B2 (en) | Preparation method for and intermediate of drug-linker for antibody drug conjugate MC-MMAF | |
| US12018097B2 (en) | Non-chromatographic purification of macrocyclic peptides by a resin catch and release | |
| CN109125736B (en) | Non-natural amatoxin antibody conjugate | |
| CN117343125B (en) | A method for synthesizing antibody-drug conjugate linker | |
| RU2775973C9 (en) | Oligopeptide linker intermediate and method for production thereof | |
| RU2775973C1 (en) | Oligopeptide linker intermediate and method for production thereof | |
| TWI816708B (en) | Method for the synthesis of cyclic depsipeptides | |
| CN109232712B (en) | Preparation method of intermediate for antibody drug conjugate | |
| AU2023386710A1 (en) | Synthesis of a cyclic peptide | |
| JP2020529472A (en) | Cross-references to related applications for cyclization and release of peptide compounds | |
| AU2022383308A1 (en) | Antibody-drug conjugate intermediate comprising sn38 and preparation method therefor | |
| CN119409760A (en) | A method for conjugating p-aminobenzenesulfonic acid with polypeptide | |
| RU2304583C1 (en) | Method for synthesis di- and triaminochlorines | |
| WO2025229966A1 (en) | Method for removing fmoc group, method for producing peptide, and method for producing compound | |
| EP3151828A1 (en) | Short chain pegylation of amino acid monomers glutamine and lysine and peptides formed thereby | |
| US20050187138A1 (en) | Peptide beta-strand mimics based on pyridinones, pyrazinones, pyridazinones, and triazinones | |
| US20050043538A1 (en) | Peptide beta-strand mimics based on 1,2-dihydro-3(6H)-pyridinone | |
| JPWO1998055492A1 (en) | Method for producing antifungal agent V-28-3M | |
| HK40035181A (en) | Amanitin antibody conjugate | |
| Wi | Hydantoin and Diketopiperazine Products from Z Protected Dipeptides | |
| NZ741734B2 (en) | Novel cryptophycin compounds and conjugates, their preparation and their therapeutic use |