RU2773750C2

RU2773750C2 - Способы лечения нарушений легких

Info

Publication number: RU2773750C2
Application number: RU2019134091A
Authority: RU
Inventors: Майкл БАЛТЕЗОР; Мэттью МАККЛОРИ; Уильям ДЖОНСТОН; Гир С. ДИЗЕРЕГА; Джеймс ВЕРКО
Original assignee: Крититек, Инк.
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2022-06-09

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, в частности к способу лечения опухоли легких с применением частиц таксана. Способ включает внутрилегочное введение субъекту с опухолью легких посредством небулайзера эффективного количества композиции в виде суспензии, содержащей частицы таксана и фармацевтически приемлемый носитель. Таксан включает паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль. Частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана, имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 3 мкм, удельную площадь поверхности (УПП) от 27 м²/г до 60 м²/г. Суспензию превращают в аэрозоль для введения. Образующиеся капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от 0,5 мкм до 6 мкм. Также предложено применение композиции, содержащей частицы таксана, для лечения опухоли легких. Изобретения приводят к значительно более продолжительному удерживанию таксана в легких, в частности продолжительный период воздействия составляет по меньшей мере 4 недели. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 54 ил., 15 табл., 4 пр.

Description

Перекрестная ссылка

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США №62/519257, поданной 14 июня 2017 года; 62/628582, поданной 9 февраля 2018 года; 62/653942, поданной 6 апреля 2018 года; и 62/678387, поданной 31 мая 2018 года, содержание каждой из которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

Уровень техники

Рак легкого является второй по распространенности и одной из самых смертельных форм рака. Традиционные способы терапии, такие как хирургическая резекция, лучевая и химиотерапия, не могут обеспечить удовлетворительный уровень долгосрочной выживаемости. Системная доставка лекарственных средств, даже в высоких дозах, приводит только к ограниченному поступлению таксановых лекарственных средств в опухоли легких. Таким образом, необходимы усовершенствованные способы лечения опухолей легких.

Краткое описание изобретения

Согласно одному из аспектов в изобретении предложены способы лечения нарушения легких, такого как опухоль легких или фиброз легких, включающие внутрилегочное введение субъекту с нарушением легких эффективного количества композиции, содержащей частицы таксана, для лечения нарушения легких, где частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана и имеют средний размер (количественный) от 0,1 мкм до 5 мкм. В одном из вариантов реализации внутрилегочное введение может включать распыление, где распыление приводит к внутрилегочной доставке субъекту частиц таксана или содержащей их суспензии в виде капель аэрозоля. В другом варианте реализации частицы таксана могут иметь средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 2 мкм. В дополнительных вариантах реализации частицы таксана могут иметь средний размер (количественный) от примерно 0,4 мкм до примерно 1,2 мкм или от примерно 0,6 мкм до примерно 1,0 мкм.

В другом варианте реализации частицы таксана могут иметь удельную площадь поверхности (УПП) по меньшей мере 10 м²/г или по меньшей мере 12 м²/г, 14 м²/г, 16 м²/г, 18 м²/г, 20 м²/г, 25 м²/г, 30 м²/г, 32 м²/г, 34 м²/г или 35 м²/г; или частицы таксана имеют УПП от примерно 10 м²/г до примерно 60 м²/г. В другом варианте реализации частицы таксана могут присутствовать в суспензии, где суспензия содержит:

(a) частицы таксана;

(b) фармацевтически приемлемый носитель; и

(c) полисорбат, где полисорбат присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1,5% (об./об.) или от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,4% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), примерно 0,1% (об./об.), примерно 0,16 (об./об.) или примерно 0,25% (об./об.). В одном из вариантов реализации фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой солевой раствор, такой как 0,9% раствор хлорида натрия. В другом варианте реализации полисорбат может представлять собой полисорбат 80. В дополнительном варианте реализации таксан может присутствовать в суспензии в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 40 мг/мл или от примерно 6 мг/мл до примерно 20 мг/мл.

В другом варианте реализации частицы таксана и содержащие их суспензии могут не содержать покрытие и липиды, полимеры, белки, такие как альбумин, полиэтоксилированное касторовое масло и/или глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиле нглико ля.

В других вариантах реализации таксан может содержать паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел или их фармацевтически приемлемые соли. В одном из вариантов реализации таксан может содержать паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль; в указанном варианте реализации частицы могут иметь одну или более из следующих характеристик:

(a) средняя объемная плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ или от примерно 0,060 г/см³ до примерно 0,11 г/см³;

(b) УПП по меньшей мере 12 м²/г, 15 м²/г, 18 м²/г, 20 м²/г, 25 м²/г, 30 м²/г, 32 м²/г, 34 м²/г или 35 м²/г;

(c) УПП от примерно 22 м²/г до примерно 40 м²/г, от 25 м²/г до примерно 40 м²/г, от 30 м²/г до примерно 40 м²/г или от примерно 35 м²/г до примерно 40 м²/г; и/или

(d) где по меньшей мере 40% (масс./масс.) паклитаксела растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 50% метанола/50% воды (об./об.) при 37°С и рН 7,0 в лопастном аппарате USP II при 75 об./мин.

В другом варианте реализации частицы таксана могут содержать доцетаксел или его фармацевтически приемлемую соль; в указанном варианте реализации частицы могут иметь одну или более из следующих характеристик:

(a) средняя объемная плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ или от примерно 0,06 г/см³ до примерно 0,1 г/см³;

(b) УПП по меньшей мере 12 м²/г, 15 м²/г, 18 м²/г, 20 м²/г, 25 м²/г, 30 м²/г, 35 м²/г, 40 м²/г или 42 м²/г;

(c) УПП от примерно 20 м²/г до примерно 50 м²/г или от примерно 35 м²/г до примерно 46 м²/г; и/или

(d) где по меньшей мере 20% (масс./масс.) доцетаксела растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 15% метанола/85% воды (об./об.) при 37°С и рН 7,0 в лопастном аппарате USP II при 75 об./мин.

В другом варианте реализации частицы таксана могут иметь кристаллическую форму. В дополнительном варианте реализации частицы таксана или содержащие их суспензии распыляют для введения, а капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от примерно 0,5 мкм до примерно 6 мкм или от примерно 1 мкм до примерно 3 мкм или от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.

В одном из вариантов реализации таксан может оставаться в поддающемся обнаружению количестве в тканях легких субъекта в течение по меньшей мере 4 дней после введения.

В некоторых вариантах реализации частицы таксана удерживаются в участке опухоли после введения композиции, обеспечивая воздействие частиц таксана на опухоль, в течение продолжительного периода времени, достаточного для стимуляции эндогенной иммунной системы субъекта, что проводит к выработке противоопухолевых клеток и инфильтрации противоопухолевых клеток в опухоль в количестве, достаточном для излечения опухоли. В некоторых вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается клеточный (опосредованный клетками) иммунный ответ. В других вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается гуморальный иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается противоопухолевая вакцина. В некоторых вариантах реализации метастазы уменьшаются или устраняются.

В одном из вариантов реализации продолжительный период времени составляет по меньшей мере 4 недели.

В некоторых вариантах реализации противоопухолевые клетки включают Т-клетки, В-клетки или естественные клетки-киллеры (ЕКК) или их комбинации.

В некоторых вариантах реализации композицию вводят за две или более отдельных операции введения.

В некоторых вариантах реализации две или более отдельных операции введения проводят раз в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

В других вариантах реализации две или более отдельных операции введения проводят два раза в неделю в течение по меньшей мере одной недели, где две или более отдельных операции введения проводят с интервалом по меньшей мере один день.

В некоторых вариантах реализации способ лечения опухоли представляет собой уничтожение опухоли.

В контексте настоящего изобретения описаны следующие варианты реализации от 1 до 25:

Вариант реализации 1 представляет собой способ лечения нарушения легких, включая, но не ограничиваясь ими, опухоль легких или фиброз легких, включающий внутрилегочное введение субъекту с нарушением легких эффективного количества композиции, содержащей частицы таксана, для лечения нарушения легких, где частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана и имеют средний размер (количественный) от примерно 0,1 мкм до 5 мкм.

Вариант реализации 2 представляет собой способ согласно варианту реализации 1, отличающийся тем, что внутрилегочное введение включает распыление, а распыление приводит к внутрилегочной доставке субъекту частиц таксана или содержащей их суспензии в виде капель аэрозоля.

Вариант реализации 3 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-2, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют средний размер (количественный) от примерно 0,4 мкм до 2 мкм.

Вариант реализации 4 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-3, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют средний размер (количественный) от примерно 0,4 мкм до примерно 1,2 мкм или от примерно 0,6 мкм до примерно 1,0 мкм.

Вариант реализации 5 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-4, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют удельную площадь поверхности (УПП) по меньшей мере 10 м²/г или по меньшей мере 12 м²/г, 14 м²/г, 16 м²/г, 18 м²/г, 20 м²/г, 25 м²/г, 30 м²/г, 32 м²/г, 34 м²/г или 35 м²/г; или частицы таксана имеют УПП от примерно 10 м²/г до примерно 60 м²/г.

Вариант реализации 6 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-5, отличающийся тем, что указанные частицы таксана присутствуют в суспензии, где суспензия содержит:

(a) частицы таксана;

(b) фармацевтически приемлемый носитель; и

(c) полисорбат, где полисорбат присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1,5% (об./об.) или от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,4% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), примерно 0,1% (об./об.), примерно 0,16% (об./об.) или примерно 0,25% (об./об.).

Вариант реализации 7 представляет собой способ согласно варианту реализации 6, отличающийся тем, что указанный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой солевой раствор, такой как 0,9% раствор хлорида натрия.

Вариант реализации 8 представляет собой способ согласно вариантам реализации 6 или 7, отличающийся тем, что указанный полисорбат представляет собой полисорбат 80.

Вариант реализации 9 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 6-8, отличающийся тем, что указанный таксан присутствует в суспензии в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 40 мг/мл или от примерно 6 мг/мл до примерно 20 мг/мл.

Вариант реализации 10 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-9, отличающийся тем, что указанные частицы и содержащие их суспензии не содержат покрытие и липиды, полимеры, белки, такие как альбумин, полиэтоксилированное касторовое масло и/или глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиленгликоля.

Вариант реализации 11 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-10, отличающийся тем, что указанный таксан содержит паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел или их фармацевтически приемлемые соли.

Вариант реализации 12 представляет собой способ согласно варианту реализации 11, отличающийся тем, что указанный таксан содержит паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль.

Вариант реализации 13 представляет собой способ согласно варианту реализации 12, отличающийся тем, что указанные частицы имеют одну или более из следующих характеристик:

Вариант реализации 14 представляет собой способ согласно варианту реализации 11, отличающийся тем, что указанный таксан содержит доцетаксел или его фармацевтически приемлемую соль.

Вариант реализации 15 представляет собой способ согласно варианту реализации 14, отличающийся тем, что указанные частицы имеют одну или более из следующих характеристик:

(d) где по меньшей мере 20% (масс./масс.) доцетаксела растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 15% метанола/85% воды (об./об.) при 37°С и рН,7,0 в лопастном аппарате USP при 75 об./мин.

Вариант реализации 16 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-15, отличающийся тем, что указанный таксан может оставаться в поддающемся обнаружению количестве в тканях легких субъекта в течение по меньшей мере 4 дней после введения.

Вариант реализации 17 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-16, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют кристаллическую форму.

Вариант реализации 18 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-17, отличающийся тем, что указанные частицы таксана или содержащие их суспензии распыляют для введения, а капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от примерно 0,5 мкм до примерно 6 мкм или от примерно 1 мкм до примерно 3 мкм или от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.

Вариант реализации 19 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-18, отличающийся тем, что указанное нарушение легких включает опухоль легких, а частицы таксана удерживаются в участке опухоли после введения композиции, обеспечивая воздействие частиц таксана на опухоль в течение продолжительного периода времени, достаточного для стимуляции эндогенной иммунной системы субъекта, в результате чего происходит выработка противоопухолевых клеток и инфильтрация противоопухолевых клеток в опухоль в количестве, достаточном для излечения опухоли.

Вариант реализации 20 представляет собой способ согласно варианту реализации 19, отличающийся тем, что указанный продолжительный период времени составляет по меньшей мере 4 недели.

Вариант реализации 21 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 19-20, отличающийся тем, что указанные противоопухолевые клетки включают Т-клетки, В-клетки или естественные клетки-киллеры (ЕКК) или их комбинации.

Вариант реализации 22 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-21, отличающийся тем, что указанную композицию вводят за две или более отдельных операции введения.

Вариант реализации 23 представляет собой способ согласно варианту реализации 22, отличающийся тем, что указанные две или более отдельных операции введения проводят раз в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

Вариант реализации 24 представляет собой способ согласно варианту реализации 22, отличающийся тем, что указанные две или более отдельных операции введения проводят два раза в неделю в течение по меньшей мере одной недели, где две или более отдельных операций введения проводят с интервалом по меньшей мере один день.

Вариант реализации 25 представляет собой способ согласно любому из вариантов реализации 1-24, отличающийся тем, что указанное нарушение легких включает опухоль легких, а способ лечения опухоли представляет собой уничтожение опухоли.

Краткое описание чертежей

На ФИГ. 1 приведен график зависимости уровня паклитаксела в тканях легких и плазме от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 2 приведен график изменения аэродинамического диаметра для 6,0 мг/мл состава частиц паклитаксела в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 3 приведен график изменения аэродинамического диаметра для 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 4 приведен график зависимости уровня паклитаксела в плазме от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 5 приведен график зависимости уровня паклитаксела в тканях легких от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 6 приведен график зависимости уровня паклитаксела в тканях легких и плазме от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 7 схематически изображен компрессионный струйный небулайзер Hospitak.

На ФИГ. 8 приведен график зависимости массы тела животного от времени в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 9 приведен график зависимости изменения массы тела животного от времени в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 10 приведен график изменения массы легких животного в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 11 приведен график отношения массы легких к массе тела животного в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 12 приведен график отношения массы легких к массе мозга животного в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 13 приведен график изменения средней площади опухоли в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 14 приведен график изменения средней площади опухоли в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 15 приведен график уменьшения опухоли в исследовании ортотопического рака легкого.

На ФИГ. 16 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки опухолевого образования в легких. (2х).

На ФИГ. 17 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006, контроль, аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки недифференцированных клеток в опухолевом образовании в легких.

На ФИГ. 18 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки недифференцированных клеток в опухолевом образовании в легких.

На ФИГ. 19 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки недифференцированных клеток в опухолевом образовании в легких, показаны образования в альвеолярном пространстве. а(20х).

На ФИГ. 20 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки зародышевых клеток в опухолевом образовании в легких. b(10х).

На ФИГ. 21 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки зародышевых клеток в опухолевом образовании в легких. b20x.

На ФИГ. 22 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки зародышевых клеток в опухолевом образовании в легких. b(40х).

На ФИГ. 23 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки зародышевых клеток в опухолевом образовании в легких. b(40х).

На ФИГ. 24 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0 в бронхиоле. Первичные признаки недифференцированных клеток в бронхиоле. с(20х).

На ФИГ. 25 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0 в железах. Первичные признаки дифференцировки клеток ацинозных желез в опухолевом образовании в легких. d(10x).

На ФИГ. 26 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0 в железах. Первичные признаки дифференцировки клеток ацинозных желез в опухолевом образовании в легких. d(20x).

На ФИГ. 27 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 2001 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-2, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки вытеснения опухолевого образования в легких под бронхиолу, отсутствие признаков внутрисосудистой инвазии. (2х).

На ФИГ. 28 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 2001 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-2, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки вытеснения опухолевого образования в легких под бронхиолу, отсутствие признаков внутрисосудистой инвазии. (4х).

На ФИГ. 29 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 2001 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-2, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки вытеснения опухолевого образования в легких под бронхиолу. (10х).

На ФИГ. 30 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (4х).

На ФИГ. 31 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (10х).

На ФИГ. 32 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (20х).

На ФИГ. 33 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. 1(40х).

На ФИГ. 34 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. 2(40х).

На ФИГ. 35 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2003 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли -1. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить наличие крупных пенистых и пигментированных макрофагов. 2, 2 х(40х).

На ФИГ. 36 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2010 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки опухолевого образования в легких. (2х).

На ФИГ. 37 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2010 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки опухолевого образования в легких. (20х).

На ФИГ. 38 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 2010 (в.в. ABRAXANE®) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. Первичные признаки опухолевого образования в легких. Следует отметить наличие незначительного количества макрофагов на границе. (40х).

На ФИГ. 39 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 4009 (инг. состав частиц паклитаксела, 1х, высокая доза) аденокарцинома-0, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки полной регрессии опухолевого образования в легких. (2х).

На ФИГ. 40 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 4009 (инг. состав частиц паклитаксела, 1х, высокая доза) аденокарцинома-0, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки полной регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить фиброз стромы. (10х).

На ФИГ. 41 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 4009 (инг. состав частиц паклитаксела, 1х, высокая доза) аденокарцинома-0, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки полной регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить фиброз стромы и наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. (40х).

На ФИГ. 42 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 5010 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, низкая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-3. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (2х).

На ФИГ. 43 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 5010 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, низкая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-3. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (10х).

На ФИГ. 44 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 5010 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, низкая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-3. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (20х).

На ФИГ. 45 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 5010 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, низкая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-3. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (40х).

На ФИГ. 46 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого - 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. (2х).

На ФИГ. 47 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить фиброз стромы и наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. (10х).

На ФИГ. 48 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Признаки регрессии опухолевого образования в легких. Следует отметить наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. (20х).

На ФИГ. 49 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Следует отметить наличие лимфоцитов и макрофагов на границе. (40х).

На ФИГ. 50 приведена микрофотография предметного стекла с тканью, пораженной ортотопическим раком легкого 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2х, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. Следует отметить наличие очага остаточных опухолевых клеток в альвеоле. 2(40х).

На ФИГ. 51 приведен график зависимости массы тела животного от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 52 приведен график зависимости изменения массы тела животного от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 53 приведен график зависимости уровня паклитаксела в плазме от времени в исследовании ингаляции.

На ФИГ. 54 приведен график зависимости уровня паклитаксела в тканях легких от времени в исследовании ингаляции.

Подробное описание изобретения

В настоящем документе формы единственного числа (соответствующие англ. «а», «an» и «the») включают ссылки на множество объектов, если по контексту явным образом не требуется иное. «И» в настоящем документе используют взаимозаменяемо с «или», если явным образом не указано иное.

В настоящем документе «примерно» обозначает +/- пять процентов (5%) от указанной величины.

Все варианты реализации любого аспекта изобретения можно применять в комбинации, если по контексту явным образом не требуется иное.

Если по контексту явным образом не требуется иное, в описании и формуле изобретения слова «содержать», «содержащий» и т.д., следует рассматривать во включительном значении, а не исключительном или исчерпывающем значении; то есть в значении «включая, но не ограничиваясь ими». Слова, используемые в формах единственного или множественного числа, включают множественное и единственное число, соответственно. Кроме того, Слова «в настоящем документе», «выше» и «ниже» и схожие по смыслу слова при использовании в настоящей заявке относятся к настоящей заявке в целом, а не к конкретным фрагментам заявки. Композиции и способы их применения могут «включать», «состоять по существу из» или «состоять из» любых ингредиентов или стадий, раскрытых в описании.

Описание вариантов реализации согласно изобретению не является исчерпывающим или не ограничивает изобретение точной описанной формой. Несмотря на то, что конкретные варианты реализации и примеры изобретения описаны в настоящем документе для иллюстрации, возможны различные эквивалентные модификации в рамках объема изобретения, которые будут понятны специалистам в соответствующей области техники.

Согласно первому аспекту в изобретении предложены способы лечения нарушения легких, включающие внутрилегочное введение субъекту с нарушением легких эффективного количества композиции, содержащей частицы таксана, для лечения опухоли легких, где частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана и имеют средний размер (количественный) от 0,1 мкм до 5 мкм.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что внутрилегочное введение частиц таксана в соответствии со способами согласно изобретению приводит к значительно более продолжительному удерживанию таксана в легких, чем это было возможно ранее при использовании любых других составов таксанов. Как показано в последующих примерах, таксан сохраняется на поддающемся обнаружению уровне в тканях легких субъекта в течение по меньшей мере 96 часов после введения. В различных дополнительных вариантах реализации таксан сохраняется на поддающемся обнаружению уровне в тканях легких субъекта в течение по меньшей мере 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312, 324 или 336 часов после введения. Таким образом, способы можно применять для лечения любого нарушения легких, для которого частицы таксана могут обеспечивать эффективное излечение, включая, но не ограничиваясь ими, опухоли легких, мезотелиому, рестриктивные заболевания легких, такие как фиброз легких, и обструктивные заболевания легких, такие как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).

Другой аспект изобретения относится к способам, которые обеспечивают воздействие частиц таксана в опухоли легких после введения композиции в течение продолжительного периода времени, достаточного для стимуляции эндогенной иммунной системы субъекта, которая приводит к выработке противоопухолевых клеток и инфильтрации противоопухолевых клеток в опухоль в количестве, достаточном для излечения опухоли. В некоторых вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается клеточный (опосредованный клетками) иммунный ответ. В других вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается гуморальный иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации при стимуляции эндогенной иммунной системы вырабатывается противоопухолевая вакцина. В некоторых вариантах реализации метастазы уменьшаются или устраняются. Противоопухолевые клетки могут содержать Т-клетки, В-клетки или естественные клетки-киллеры (ЕКК) или их комбинации. В некоторых вариантах реализации продолжительный период воздействия составляет по меньшей мере 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312, 324 или 336 часов. В различных дополнительных вариантах реализации продолжительный период воздействия составляет по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель. Композицию можно вводить внутрилегочно за одну операцию введения (цикл) одной дозы или за две или более отдельных операции введения (2 или более циклов) отдельных доз. В некоторых вариантах реализации интервал между проведением двух или более отдельных операций введения составляет или составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 14 дней. В некоторых вариантах реализации две или более отдельных операции введения проводят с интервалом от 2 до 12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8 2-7, 2-6, 2-5, 2-4, 2-3, 3-12, 3-11, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7, 3-6, 3-5, 3-4, 4-12, 4-11, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6, 4-5, 5-12, 5-11, 5-10, 5-9, 5-8, 5-7, 5-6, 6-12, 6-11, 6-10, 6-9, 6-8, 6-7, 7-12, 7-11, 7-10, 7-9, 7-8, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 9-12, 9-11, 9-10, 10-12, 10-11, 11-12, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель. В некоторых вариантах реализации композицию вводят за 2-5, 2-4, 2-3, 3-5, 3-4, 2, 3, 4, 5 или более отдельных операции введения. В некоторых вариантах реализации две или более отдельных операции введения проводят с интервалом от 2 до 12 недель. В некоторых вариантах реализации проводят от двух до пяти отдельных операций введения композиции. В некоторых вариантах реализации две или более отдельных операций введения проводят один раз в неделю в течение по меньшей мере двух недель. В других вариантах реализации две или более отдельных операций введения проводят два раза в неделю в течение по меньшей мере одной недели, где интервал между проведением двух или более отдельных операций введения составляет по меньшей мере один день. В некоторых вариантах реализации способ лечения приводит к устранению (уничтожению) опухоли. В некоторых вариантах реализации композицию вводят за 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более отдельных операции введения. В других вариантах реализации композицию вводят за 7 или более отдельных операций введения.

В настоящем документе «частицы таксана» представляют собой частицы, состоящие по существу из таксана (т.е. по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% таксана), которые имеют средний размер (количественный) от 0,1 мкм до 5 мкм. Частицы таксана для применения согласно изобретению не содержат покрытие и не погружены, не содержатся, не заключены или не инкапсулированы в твердое вспомогательное вещество. Частицы таксана согласно изобретению, тем не менее, содержат примеси и побочные продукты, как правило, образующиеся при получении таксана. Но даже с учетом этого частицы таксана содержат по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% таксана, то есть частицы таксана состоят или состоят по существу из по существу чистого таксана.

Таксаны представляют собой класс дитерпеноидов, содержащих таксадиеновое ядро, которые очень плохо растворяются в воде. Частицы таксана согласно изобретению могут представлять собой любой подходящий таксан, включая, но не ограничиваясь ими, паклитаксел, доцетаксел, кабазитаксел, таксадиен, баккатин III, таксхинин А, бревифолиол и таксуспин D, их комбинации или фармацевтически приемлемые соли. В одном из вариантов реализации таксан выбран из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела и кабазитаксела или их фармацевтически приемлемых солей.

Активные фармацевтические ингредиенты (АФИ) паклитаксел и доцетаксел коммерчески доступны в Phyton Biotech LLC, Vancouver, Canada. АФИ доцетаксел содержит не менее 95% или не менее 97,5% доцетаксела в пересчете на массу безводного вещества без растворителя. АФИ паклитаксел содержит не менее 95% или не менее 97% паклитаксела в пересчете на массу безводного вещества без растворителя. В некоторых вариантах реализации АФИ паклитаксел и АФИ доцетаксел имеют класс чистоты USP и/или ЕР. АФИ паклитаксел может быть получен полусинтетическим химическим способом или из природного источника, например, ферментацией или экстракцией из растительных клеток.

Опухоль легкого представляет собой любую опухоль, присутствующую в легких, и может представлять собой первичную или метастатическую опухоль легких. Неограничивающие примеры опухоли легких включают мелкоклеточный рак легкого (МРЛ) и немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ). В одном из вариантов реализации опухоль легких представляет собой МРЛ. В другом варианте реализации опухоль легких представляет собой НМРЛ. Субъект может представлять собой любое млекопитающее, пораженное опухолью легких, включая, но не ограничиваясь ими, человека и других приматов, собак, кошек, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, овец, коз и т.д.

«Эффективное количество» частиц таксана может быть определено лечащим врачом с учетом всех важных факторов. Введение частиц таксана может включать введение только таксана или введение совместно с другими терапевтическими средствами, которые рассматриваются лечащим врачом как уместные с учетом всех обстоятельств. В одном из вариантов реализации способы дополнительно включают лечение субъекта стандартом здравоохранения для опухоли, подвергающейся лечению, таким как внутривенная химиотерапия, лучевая терапия, хирургическая резекция и т.д.

В настоящем документе «лечить», «способ лечения» или «лечение» обозначают выполнение одного или более из следующего: (а) снижение размера опухоли или фиброза; (b) снижение скорости роста опухоли; (с) устранение опухоли или фиброза; (d) уменьшение или ограничение развития и/или распространения метастазов или устранение метастазов. В некоторых вариантах реализации способ лечения представляет собой устранение опухоли или фиброза.

В одном конкретном варианте реализации изобретения внутрилегочное введение включает ингаляцию одной дозы частиц таксана, такую как интраназальная, пероральная ингаляция или оба указанных способа. Частицы таксана можно вводить за две или более отдельных операции введения (дозы). В указанном варианте реализации частицы таксана могут быть получены в виде аэрозоля (т.е. жидких капель стабильной дисперсии или суспензии противоопухолевых частиц в газовой среде). Частицы таксана, доставляемые в виде аэрозоля, могут осаждаться в дыхательных путях в результате седиментации под действием сил притяжения, инерционного столкновения и/или диффузии. Можно применять любое подходящее устройство для получения аэрозоля, включая, но не ограничиваясь ими, дозирующие ингаляторы под давлением (pMDI), небулайзеры, ингаляторы сухого порошка (DPI) и жидкостные ингаляторы.

В одном конкретном варианте реализации способы включают ингаляцию частиц таксана, превращаемых в аэрозоль путем распыления. В небулайзерах для получения капель аэрозоля частиц таксана или содержащих их суспензий, доступных для ингаляции, как правило, используется сжатый воздух или ультразвук. В указанном варианте реализации распыление приводит к внутри легочной доставке субъекту капель аэрозоля частиц таксана или содержащей их суспензии.

В другом варианте реализации способы включают ингаляцию частиц таксана, превращаемых в аэрозоль с использованием pMDI, где частицы таксана или содержащие их суспензии суспендируют в подходящей системе вытеснителей (включая, но не ограничиваясь ими гидрофторалканы (ГФА)), содержащей по меньшей мере один сжиженный газ в контейнере под давлением, закрытом мерным клапаном. Активация клапана приводит к доставке отмеренной дозы распыляемого аэрозоля частиц таксана или содержащих их суспензий.

В других вариантах реализации частицы таксана имеют средний размер (количественный) более 0,2 мкм или 0,3 мкм. В другом варианте реализации частицы таксана имеют средний размер (количественный) по меньшей мере 0,4 мкм. В дополнительных вариантах реализации частицы таксана имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 2 мкм или от 0,5 мкм до 1,5 мкм или от 0,2 мкм до 1 мкм или от 0,2 мкм до менее чем 1 мкм.

В дополнительных вариантах реализации частицы таксана могут иметь количественный размер в диапазоне от примерно 0,4 мкм до примерно 5 мкм, от примерно 0,4 мкм до примерно 3 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 1,4 мкм, от примерно 0,4 мкм до примерно 0,8 мкм, от примерно 0,4 мкм до примерно 0,7 мкм или от примерно 0,5 мкм до примерно 0,7 мкм. В дополнительном варианте реализации частицы таксана имеют количественный размер от примерно 0,4 мкм до примерно 1,2 мкм или от примерно 0,6 мкм до примерно 1,0 мкм. В другом варианте реализации частицы таксана имеют количественный размер от 0,6 мкм до 0,861 мкм или от примерно 0,5 мкм до примерно 0,7 мкм или от примерно 0,2 мкм до примерно 1 мкм или от примерно 0,2 мкм до менее чем 1 мкм или от примерно 0,3 мкм до примерно 1 мкм или от примерно 0,3 мкм до менее чем 1 мкм или от примерно 0,4 мкм до примерно 1 мкм или от примерно 0,4 мкм до менее чем 1 мкм.

Размер частиц таксана может быть определен в анализаторе размера частиц, а измеренное значение может быть выражено как средний диаметр, вычисленный для распределения числа частиц (количественный). Подходящий анализатор размера частиц представляет собой инструмент, в котором для анализа используется техника светотени, также называемая оптическим считыванием фотозон или отдельных частиц (SPOS). Подходящим анализатором размера частиц, работающим в режиме светотени, является ACCUSIZER, такой как ACCUSIZER 780 SIS, доступный в Particle Sizing Systems, Port Richey, Florida. Другим подходящим анализатором размера частиц является инструмент, в котором используется лазерная дифракция, такой как Shimadzu SALD-7101.

В тех вариантах реализации, где частицы таксана превращают в аэрозоль для введения, массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) капель аэрозоля частиц таксана или содержащих их суспензий может представлять собой любой диаметр, подходящий для применения в изобретении. В одном из вариантов реализации капли аэрозоля имеют ММАД от примерно 0,5 мкм до примерно 6 мкм. В различных дополнительных вариантах реализации капли аэрозоля имеют ММАД от примерно 0,5 мкм до примерно 5,5 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 5 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 4,5 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 4 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 3,5 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 3 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 2,5 мкм, от примерно 0,5 мкм до примерно 2 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 5,5 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 4,5 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 4 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 3,5 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 3 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 2,5 мкм, от примерно 1 мкм до примерно 2 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 5,5 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 5 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 4,5 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 4 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 3,5 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 3 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 2,5 мкм, от примерно 1,5 мкм до примерно 2 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 5,5 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 5 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 4,5 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 4 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 3,5 мкм, от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм и от примерно 2 мкм до примерно 2,5 мкм. Подходящим инструментом для измерения массового медианного аэродинамического диаметра (ММАД) и геометрического стандартного отклонения (GSD) для капель аэрозоля является семиступенчатый пробоотборник аэрозолей, такой как каскадный импактор мерсеровского типа.

В другом варианте реализации частицы таксана могут иметь удельную площадь поверхности (УПП) по меньшей мере 10 м²/г или по меньшей мере 12 м²/г, 14 м²/г, 16 м²/г, 18 м²/г, 20 м²/г, 25 м²/г, 30 м²/г, 32 м²/г, 34 м²/г или 35 м²/г; или частицы таксана имеют УПП от примерно 10 м²/г до примерно 60 м²/г.

В различных вариантах реализации частицы таксана получают способами «осаждения со сжатыми антирастворителями» (РСА), такими как описано в патентах США US 5874029, US 5833891, US 6113795, US 7744923, US 8778181, US 9233348; опубликованных заявках на патент США US 2015/0375153, US 2016/0354336, US 2016/0374953; и международных патентных публикациях WO 2016/197091, WO 2016/197100 и WO 2016/197101; содержание всех из которых включено в настоящую заявку посредством ссылок.

В способах измельчения частиц РСА с использованием сверхкритического диоксида углерода применяют сверхкритический диоксид углерода (антирастворитель) и растворитель, например, ацетон или этанол, для получения частиц таксана без покрытия размером от 0,1 до 5 микрон с хорошо охарактеризованным распределением частиц по размерам. Диоксид углерода и растворитель удаляют во время обработки (может сохраняться вплоть до 0,5% остаточного растворителя), после чего остаются частицы таксана в виде порошка. В исследованиях стабильности показано, что частицы порошка паклитаксела стабильны как лекарственная форма при хранении в пробирках при комнатной температуре в течение периода вплоть до 59 месяцев, а в условиях ускоренного старения (40°С/75% относительная влажность) в течение периода вплоть до шести месяцев.

Частицы таксана, получаемые различными способами измельчения частиц с использованием сверхкритического диоксида углерода, могут иметь уникальные физические характеристики по сравнению с частицами таксана, полученными традиционными способами измельчения частиц с использованием механического воздействия или измельчения, например, мокрого или сухого помола, измельчения, разрушения, растирания, микроожижения или распыления. Как описано в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953, содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки, указанные уникальные характеристики включают объемную плотность (масса совокупности частиц в композиции, деленная на общий объем, который они занимают при высыпании в мерный цилиндр без уплотнения мерного цилиндра, где общий объем включает объем частиц, пустой объем между частицами и объем внутренних пор) от 0,05 г/см³ до 0,15 г/см³ и удельную площадь поверхности (УПП) по меньшей мере 18 м²/г частиц таксана (например, паклитаксела и доцетаксела), которые получают способами измельчения с использованием сверхкритического диоксида углерода, описанными в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953 и ниже. Указанный диапазон объемной плотности в общем случае ниже объемной плотности частиц таксана, получаемых традиционными способами, а УПП в целом выше УПП частиц таксана, получаемых традиционными способами. Указанные уникальные характеристики приводят к значительному повышению скорости растворения в средах на основе воды/метанола по сравнению с таксанами, получаемыми традиционными способами. В настоящем документе «удельная площадь поверхности» (УПП) представляет собой общую площадь поверхности частиц таксана на единицу массы таксана при измерении по изотерме Брунауэра-Эмметта-Теллера («БЭТ») следующим способом: измеренную массу анализируемого образца от 200 до 300 мг добавляют в 30 мл пробирку для образца. Затем размещают пробирку с образцом в SORPTOMETER^® модели ВЕТ-202А производства Porous Materials Inc. Затем проводят автоматизированное испытание с использованием пакета программного обеспечения BETWIN^®, после чего вычисляют площадь поверхности каждого образца. Специалистам в данной области техники будет понятно, что «частицы таксана» могут включать агломерированные частицы таксана и неагломерированные частицы таксана; и так как УПП определяют в пересчете на массу в граммах, то она учитывает как агломерированные, так и неагломерированные частицы таксана в композиции. Процедура испытания удельной площади поверхности по методу БЭТ представляет собой фармакопейный способ, включенный в Фармакопею США и Европейскую фармакопею. Объемную плотность можно определять путем высыпания частиц таксана в мерный цилиндр без уплотнения при комнатной температуре, измерения массы и объема и вычисления объемной плотности.

Как описано в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953, в исследованиях была показана УПП 15,0 м²/г и объемная плотность 0,31 г/см³ для частиц паклитаксела, получаемых путем измельчения паклитаксела в шаровой мельнице Deco-PBM-V-0.41 с использованием шариков размера 5 мм при 600 об./мин в течение 60 минут при комнатной температуре. Также в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953 описано, что одна партия частиц паклитаксела имела УПП 37,7 м²/г и объемную плотность 0,085 г/см³ при получении следующим способом с использованием сверхкритического диоксида углерода: получали 65 мг/мл раствор паклитаксела в ацетоне. Размещали туманообразующую форсунку BETE MicroWhirl^® (BETE Fog Nozzle, Inc.) и ультразвуковой зонд (Qsonica, номер модели Q700) в кристаллизационную камеру на расстоянии примерно 8 мм друг от друга. Проволочный фильтр из нержавеющей стали с ячейкой примерно 100 нм присоединяли к кристаллизационной камере для сбора осажденных частиц паклитаксела. Нагнетали сверхкритический диоксид углерода в кристаллизационную камеру с использованием производственного оборудования и доводили давление примерно до 1200 psi (8,3 МПа) примерно при 38°С с расходом 24 кг/час. Ультразвуковой зонд настраивали на 60% от полной выходной мощности с частотой 20 кГц. Раствор ацетона, содержащий паклитаксел, прокачивали через форсунку с расходом 4,5 мл/минута в течение примерно 36 часов. Дополнительные партии частиц паклитаксела, полученные способом с использованием сверхкритического диоксида углерода, описанным выше, имели значения УПП: 22,27 м²/г, 23,90 м²/г, 26,19 м²/г, 30,02 м²/г, 31,16 м²/г, 31,70 м²/г, 32,59 м²/г, 33,82 м²/г, 35,90 м²/г, 38,22 м²/г и 38,52 м²/г.

Как описано в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953, в исследованиях была показана УПП 15,2 м²/г и объемная плотность 0,44 г/см³ для частиц доцетаксела, полученных путем измельчения доцетаксела в шаровой мельнице Deco-PBM-V-0.41 с использованием шариков размера 5 мм при 600 об./мин в течение 60 минут при комнатной температуре. Также в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953 описано, что частицы доцетаксела имели УПП 44,2 м²/г и объемную плотность 0,079 г/см³ при получении следующим способом с использованием сверхкритического диоксида углерода: Получали 79,32 мг/мл раствор доцетаксела этаноле. Форсунку и ультразвуковой зонд размещали в стойкой к давлению камере на расстоянии примерно 9 мм друг от друга. Проволочный фильтр из нержавеющей стали с ячейкой примерно 100 нм присоединяли к стойкой к давлению камере для сбора осажденных частиц доцетаксела. Нагнетали сверхкритический диоксид углерода в кристаллизационную камеру с использованием производственного оборудования и доводили давление примерно до 1200 psi (8,3 МПа) примерно при 38°С с расходом 68 ст.л/мин. Ультразвуковой зонд настраивали на 60% от полной выходной мощности с частотой 20 кГц. Раствор этанола, содержащий доцетаксел, прокачивали через форсунку с расходом 2 мл/минута в течение примерно 95 минут. Затем собирали осажденные агломераты и частицы доцетаксела из сверхкритического диоксида углерода по мере прокачивания смеси через проволочный фильтр из нержавеющей стали. Открывали фильтр, содержащий частицы доцетаксела, и собирали полученный продукт с фильтра.

Как описано в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953, в исследованиях растворения была показана повышенная скорость растворения в средах на основе метанола/воды для частиц паклитаксела и доцетаксела, полученных способами с использованием сверхкритического диоксида углерода, описанными в опубликованной заявке на патент США US 2016/0374953, по сравнению с частицами паклитаксела и доцетаксела, полученными измельчением паклитаксела и доцетаксела на шаровой мельнице Deco-PBM-V-0.41 с использованием шариков размера 5 мм при 600 об./мин в течение 60 минут при комнатной температуре. Способы определения скорости растворения описаны ниже. В случае паклитаксела примерно 50 мг материала наносили в качестве покрытия примерно на 1,5 грамма 1 мм стеклянной дроби, перемешивая материал и дробь в пробирке в течение примерно 1 часа. Переносили дробь в проволочный контейнер из нержавеющей стали и помещали в ванну для растворения, содержащую среду метанол/вода 50/50 (об./об.) при 37°С, рН 7 и аппарат USP II (лопастной), работающий при 75 об./мин. Отбирали 5 мл аликвоты через 10, 20, 30, 60 и 90 минут, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и анализировали на спектрофотометре в УФ/видимой области спектра при 227 нм. Сравнивали значения поглощения образцов со значениями для стандартных растворов, полученных в среде для растворения, для определения количества растворившегося материала. В случае доцетаксела примерно 50 мг материала помещали непосредственно в ванну для растворения, содержащую среду метанол/вода 15/85 (об./об.) при 37°С, рН 7, и аппарат USP II (лопастной), работающий при 75 об./мин. Отбирали 5 мл аликвоты через 5, 15, 30, 60, 120 и 225 минут, фильтровали через 0,22 мкм фильтр и анализировали на спектрофотометре при 232 нм. Сравнивали значения поглощения образцов со значениями для стандартных растворов, полученных в среде для растворения, для определения количества растворившегося материала. В случае паклитаксела уровень растворения составлял 47% растворившегося материала за 30 минут для частиц, полученных способом с использованием сверхкритического диоксида углерода, и 32% растворившегося материала за 30 минут для частиц, полученных измельчением. В случае доцетаксела уровень растворения составлял 27% растворившегося материала за 30 минут для частиц, полученных способом с использованием сверхкритического диоксида углерода, и 9% растворившегося материала за 30 минут для частиц, полученных измельчением.

В некоторых вариантах реализации частицы таксана имеют УПП по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34 или по меньшей мере 35 м²/г. В одном из вариантов реализации противоопухолевые частицы имеют УПП от примерно 10 м²/г до примерно 50 м²/г. В некоторых вариантах реализации противоопухолевые частицы имеют объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,20 г/см³.

В дополнительных вариантах реализации противоопухолевые частицы имеют УПП:

(a) от 16 м²/г до 31 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(b) от 16 м²/г до 30 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(c) от 16 м²/г до 29 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(d) от 17 м²/г до 31 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(e) от 17 м²/г до 30 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(f) от 17 м²/г до 29 м²/г или от 32 м²/г до 40 м²/г;

(g) от 16 м²/г до 31 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(h) от 16 м²/г до 30 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(i) от 16 м²/г до 29 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(j) от 17 м²/г до 31 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(k) от 17 м²/г до 30 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(l) от 17 м²/г до 29 м²/г или от 33 м²/г до 40 м²/г;

(m) от 16 м²/г до 31 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(h) от 17 м²/г до 31 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(i) от 16 м²/г до 30 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(j) от 17 м²/г до 30 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(k) от 16 м²/г до 29 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(l) от 17 м²/г до 29 м²/г или ≥ 32 м²/г;

(m) от 16 м²/г до 31 м²/г или ≥ 33 м²/г;

(n) от 17 м²/г до 31 м²/г или ≥ 33 м²/г;

(о) от 16 м²/г до 30 м²/г или ≥ 33 м²/г;

(р) от 17 м²/г до 30 м²/г или ≥ 33 м²/г;

(q) от 16 м²/г до 29 м²/г или ≥ 33 м²/г; или

(r) от 17 м²/г до 29 м²/г или ≥ 33 м²/г.

В некоторых вариантах реализации частицы таксана представляют собой частицы паклитаксела и имеют УПП по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34 или по меньшей мере 35 м²/г. В других вариантах реализации частицы паклитаксела имеют УПП от 18 м²/г до 50 м²/г или от 20 м²/г до 50 м²/г или от 22 м²/г до 50 м²/г или от 25 м²/г до 50 м²/г или от 26 м²/г до 50 м²/г или от 30 м²/г до 50 м²/г или от 35 м²/г до 50 м²/г или от 18 м²/г до 45 м²/г или от 20 м²/г до 45 м²/г или от 22 м²/г до 45 м²/г или от 25 м²/г до 45 м²/г или от 26 м²/г до 45 м²/г или от 30 м²/г до 45 м²/г или от 35 м²/г до 45 м²/г или от 18 м²/г до 40 м²/г или от 20 м²/г до 40 м²/г или от 22 м²/г до 40 м²/г или от 25 м²/г до 40 м²/г или от 26 м²/г до 40 м²/г или от 30 м²/г до 40 м²/г или от 35 м²/г до 40 м²/г.

В некоторых вариантах реализации частицы паклитаксела имеют объемную плотность (без уплотнения) от 0,05 г/см³ до 0,15 г/см³ или от 0,05 г/см³ до 0,20 г/см³.

В некоторых вариантах реализации частицы паклитаксела имеют уровень растворения по меньшей мере 40% (масс./масс.) растворившегося материала за 30 минут или быстрее в растворе 50% метанола/50% воды (об./об.) в лопастном аппарате USP II, работающем при 75 об./мин, 37°С и рН 7.

В другом варианте реализации частицы паклитаксела имеют одну или более из следующих характеристик:

(d) где по меньшей мере 40% (масс./масс.) паклитаксела растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 50% метанола/50% воды (об./об.) при 37°С и рН 7,0 в лопастном аппарате USP II, работающем при 75 об./мин.

В одном из вариантов реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП по меньшей мере 30 м²/г. В другом варианте реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП по меньшей мере 35 м²/г. В одном из вариантов реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП от примерно 30 м²/г до примерно 40 м²/г. В другом варианте реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,060 г/см³ до примерно 0,11 г/см³ и УПП от примерно 30 м²/г до примерно 40 м²/г. В другом варианте реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,060 г/см³ до примерно 0,11 г/см³ и УПП по меньшей мере 30 м²/г. В дополнительном варианте реализации частицы паклитаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,060 г/см³ до примерно 0,11 г/см³ и УПП по меньшей мере 35 м²/г.

В другом варианте реализации по меньшей мере 40% (масс./масс.) паклитаксела из частиц паклитаксела в композиции растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 50% метанола/50% воды (об./об.) в лопастном аппарате USP II при 75 об./мин. Использовали рН 7, рН не влияет на растворимость таксанов. В другом варианте реализации исследования растворения проводят при 37°С.

В некоторых вариантах реализации частицы таксана представляют собой частицы доцетаксела и имеют УПП по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 31, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39, по меньшей мере 40, по меньшей мере 41 или по меньшей мере 42 м²/г. В других вариантах реализации частицы доцетаксела имеют УПП от 18 м²/г до 60 м²/г или от 22 м²/г до 60 м²/г или от 25 м²/г до 60 м²/г или от 30 м²/г до 60 м²/г или от 40 м²/г до 60 м²/г или от 18 м²/г до 50 м²/г или от 22 м²/г до 50 м²/г или от 25 м²/г до 50 м²/г или от 26 м²/г до 50 м²/г или от 30 м²/г до 50 м²/г или от 35 м²/г до 50 м²/г или от 40 м²/г до 50 м²/г.

В некоторых вариантах реализации частицы доцетаксела имеют объемную плотность (без уплотнения) от 0,05 г/см³ до 0,15 г/см³.

В некоторых вариантах реализации частицы доцетаксела имеют уровень растворения по меньшей мере 20% (масс./масс.) растворившегося материала за 30 минут или быстрее в растворе 15% метанола/85% воды (об./об.) в лопастном аппарате USP II, работающем при 75 об./мин, 37°С и рН 7.

В другом варианте реализации частицы доцетаксела имеют одну или более из следующих характеристик:

В одном из вариантов реализации частицы доцетаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП по меньшей мере 30 м²/г. В другом варианте реализации частицы доцетаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП по меньшей мере 35 м²/г. В дополнительном варианте реализации частицы доцетаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП по меньшей мере 40 м²/г. В одном из вариантов реализации частицы доцетаксела имеют среднюю объемную плотность (без уплотнения) от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³ и УПП от примерно 20 м²/г до примерно 50 м²/г. В другом варианте реализации средняя объемная плотность (без уплотнения) частиц доцетаксела составляет от примерно 0,06 г/см³ до примерно 0,1 г/см³, а УПП составляет от примерно 30 м²/г до примерно 50 м²/г. В другом варианте реализации средняя объемная плотность (без уплотнения) частиц доцетаксела составляет от примерно 0,06 г/см³ до примерно 0,1 г/см³, а УПП составляет от примерно 35 м²/г до примерно 50 м²/г. В другом варианте реализации средняя объемная плотность (без уплотнения) частиц доцетаксела составляет от примерно 0,06 г/см³ до примерно 0,1 г/см³, а УПП составляет от примерно 35 м²/г до примерно 45 м²/г.

В другом варианте реализации по меньшей мере 20% (масс./масс.) доцетаксела растворяется за 30 минут или быстрее в растворе 15% метанола/85% воды (об./об.) в лопастном аппарате USP II при 75 об./мин. Использовали нейтральный рН, причем рН не влияет на растворимость таксанов. В другом варианте реализации исследования растворения проводят при 37°С.

В любом из указанных различных вариантов реализации частицы таксана могут включать по меньшей мере 4,16×10^-13 грамма таксана или его фармацевтически приемлемой соли на частицу. В некоторых вариантах реализации частицы таксана представляют собой неагломерированные отдельные частицы и не являются кластерами из нескольких частиц таксана.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения частицы таксана представляют собой отдельные частицы без покрытия (чистые); частицы таксана не связаны или не образуют конъюгат с каким-либо веществом; никакое вещество не абсорбировано или не адсорбировано на поверхности частиц таксана; частицы таксана не инкапсулированы в каком-либо веществе; частицы таксана не содержат покрытие какого-либо вещества; частицы таксана не являются микроэмульсиями, наноэмульсиями, микросферами или липосомами таксана; и/или частицы таксана не связаны, не присоединены, не инкапсулированы или не содержат покрытие мономера, полимера (или биосовместимого полимера), белка, поверхностно-активного вещества или альбумина. В некоторых вариантах реализации мономер, полимер (или биосовместимый полимер), сополимер, белок, поверхностно-активное вещество или альбумин не абсорбируется или не адсорбируется на поверхности частиц таксана. В некоторых вариантах реализации в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат полимер/сополимер или биосовместимый полимер/сополимер. В некоторых вариантах реализации в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат белок. Согласно некоторым аспектам изобретения в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат альбумин. Согласно некоторым аспектам изобретения в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат гиалуроновую кислоту. Согласно некоторым аспектам изобретения в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат конъюгат гиалуроновой кислоты и таксана. Согласно некоторым аспектам изобретения в композициях отсутствует/композиции не включают или не содержат конъюгат гиалуроновой кислоты и паклитаксела. Согласно некоторым аспектам изобретения в композициях отсутствуют/композиции не включают или не содержат полоксамеры, полианионы, поликатионы, модифицированные полианионы, модифицированные поликатионы, хитозан, производные хитозана, ионы металлов, нановекторы, поли-гамма-глутаминовую кислоту (PGA), полиакриловую кислоту (РАА), альгиновую кислоту (ALG), витамин E-TPGS, диметилизосорбид (DMI), метокси-ПЭГ 350, лимонную кислоту, антитело к VEGF, этилцеллюлозу, полистирол, полиангидриды, полигидроксикислоты, полифосфазены, сложные полиортоэфиры, сложные полиэфиры, полиамиды, полисахариды, полипротеины, стирол-изобутилен-стирол (СИБС), сополимер полиангидридов, поликапролактон, полиэтиленгликоль (ПЭГ), поли(бис(Р-карбоксифенокси)пропан-себациновую кислоту, поли(d,l-молочную кислоту) (PLA), сополимер поли(d.1-молочной кислоты-гликолевой кислоты) (PLAGA) и/или сополимер поли(D,L-молочной кислоты-гликолевой кислоты) (PLGA). В некоторых вариантах реализации частицы таксана имеют кристаллическую форму. В других вариантах реализации частицы таксана имеют аморфную форму или комбинацию кристаллической и аморфной форм.

В одном из вариантов реализации частицы таксана для введения содержат лекарственную форму таксана в виде суспензии (т.е. совместно с фармацевтически приемлемым носителем и/или в виде состава в форме аэрозоля), содержащей от примерно 0,1 мг/мл до примерно 100 мг/мл таксана. В различных дополнительных вариантах реализации лекарственная форма может содержать от примерно 0,5 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 25 мг/мл до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 25 мг/мл до примерно 75 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 25 мг/мл до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 40 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 25 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 2 мг/мг до примерно 15 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 2 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 2 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 2 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 1 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 1 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 0,5 мг/мл, от примерно 0,1 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,5 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 1 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 2 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 5 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 3 мг/мл до примерно 8 мг/мл или от примерно 4 мг/мл до примерно 6 мг/мл таксана или по меньшей мере примерно 0,1, 0,5, 1, 10, 20, 25, 50, 75 или 100 мг/мл таксана.

В одном из вариантов реализации частицы таксана присутствуют в жидком носителе перед распылением. Можно применять любой подходящий носитель, такой как водный жидкий носитель. Можно применять любой подходящий водный жидкий носитель, включая, но не ограничиваясь им, 0,9% солевой раствор (физиологический раствор), такой как 0,9% хлорид натрия для инъекции USP. В другом варианте реализации частицы таксана присутствуют в суспензии перед распылением. В некоторых вариантах реализации суспензия включает водный носитель. Носитель может содержать буферный агент, осмотическую соль и/или поверхностно-активное вещество в воде и другие агенты для регулирования рН, изотоничности и вязкости. В одном из вариантов реализации, в котором применяют водный носитель, концентрация поверхностно-активного вещества составляет менее 1% в пересчете на масс./масс. или масс/об.; в других вариантах реализации менее 0,5%, менее 0,25% или примерно 0,1%. В других вариантах реализации водный носитель может включать поверхностно-активные вещества GELUCIRE® (глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиленгликоля) и/или CREMOPHOR® (полиэтоксилированное касторовое масло). В некоторых вариантах реализации композиция или суспензия не включает полимеры, белки (такие как альбумин), полиэтоксилированное касторовое масло и/или глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиленгликоля.

В некоторых вариантах реализации суспензия может содержать воду и необязательно одно или более вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из буфера, агента, регулирующего тоничность, консерванта, смягчающего средства, модификатора вязкости, осмотического агента, поверхностно-активного вещества, антиоксиданта, подщелачивающего агента, подкисляющего агента, противопенного агента и красителя. Например, суспензия может содержать частицы таксана, воду, буфер и соль. Она необязательно дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах реализации суспензия состоит по существу или состоит из воды, частиц паклитаксела, суспендированных в воде, и буфер. Суспензия может дополнительно содержать осмотическую соль.

Суспензия может содержать одно или более поверхностно-активных веществ. Подходящие поверхностно-активные вещества включают в качестве примеров без ограничений полисорбаты, лаурилсульфаты, ацетилированные моноглицериды, диацетилированные моноглицериды и полоксамеры. Полисорбаты представляют собой сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, которые являются группой неполных сложных эфиров жирных кислот сорбита и его ангидридов, сополимеризованных примерно с 20, 5 или 4 молями этиленоксида на каждый моль сорбита и его ангидридов. Неограничивающими примерами полисорбатов являются полисорбат 20, полисорбат 21, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 61, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 81, полисорбат 85 и полисорбат 120. Полисорбаты, содержащие примерно 20 молей этиленоксида, представляют собой гидрофильные неионогенные поверхностно-активные вещества. Примеры полисорбатов, содержащих примерно 20 молей этиленоксида, включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85 и полисорбат 120. Полисорбаты коммерчески доступны в Croda под торговой маркой TWEEN™. Числовое обозначение полисорбата соответствует числовому обозначению TWEEN, например, полисорбат 20 представляет собой TWEEN 20, полисорбат 40 представляет собой TWEEN 40, полисорбат 60 представляет собой TWEEN 60, полисорбат 80 представляет собой TWEEN 80, и т.д. Классы чистоты полисорбатов USP/NF включают полисорбат 20 NF, полисорбат 40 NF, полисорбат 60 NF и полисорбат 80 NF. Также доступны полисорбаты, имеющие класс чистоты PhEur (Европейская фармакопея), BP и JP. Термин «полисорбат» является непатентованным названием. Полисорбат 20 имеет химическое название полиоксиэтилен-20-сорбитана монолаурат. Полисорбат 40 имеет химическое название полиоксиэтилен-20-сорбитана монопальмитат. Полисорбат 60 имеет химическое название полиоксиэтилен-20-сорбитана моностеарат. Полисорбат 80 имеет химическое название полиоксиэтилен-20-сорбитана моноолеат. В некоторых вариантах реализации суспензия может содержать смеси полисорбатов. В некоторых вариантах реализации суспензия содержит полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85 и/или полисорбат 120. В других вариантах реализации суспензия содержит полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и/или полисорбат 80. В одном из вариантов реализации суспензия содержит полисорбат 80.

Суспензия может содержать один или более агентов, регулирующих тоничность. Подходящие агенты, регулирующие тоничность, включают в качестве примеров без ограничений одну или более неорганических солей, электролиты, хлорид натрия, хлорид калия, фосфат натрия, фосфат калия, сульфаты натрия, калия, бикарбонаты натрия и калия и соли щелочно-земельных металлов, такие как неорганические соли щелочно-земельных металлов, например, соли кальция и соли магния, маннит, декстрозу, глицерин, пропиленгликоль и их смеси.

Суспензия может содержать один или более буферных агентов. Подходящие буферные агенты включают в качестве примеров без ограничений двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, лимонную кислоту, цитрат натрия, хлороводородную кислоту, гидроксид натрия, трис(гидроксиметил)аминометан, бис(2-гидроксиэтил)имино-трис-(гидроксиметил)метан и гидрокарбонат натрия и другие агенты, известные специалистам в данной области техники. Буферы широко применяют для регулирования рН до желательного диапазона для интраперитонеального использования. Как правило, желателен рН от примерно 5 до 9, от 5 до 8, от 6 до 7,4, от 6,5 до 7,5 или от 6,9 до 7,4.

Суспензия может содержать один или более смягчающих агентов. Смягчающий агент представляет собой агент, который образует успокаивающую пленку поверх слизистой мембраны, такой как мембраны, выстилающие брюшную полость или содержащиеся в ней органы. Смягчающий агент может облегчать слабую боль и воспаление, и его иногда называют мукопротекторным агентом. Подходящие смягчающие агенты включают производные целлюлозы в количестве от примерно 0,2 до примерно 2,5%, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и метил целлюлоз а; желатин в количестве примерно 0,01%; полиолы в количестве от примерно 0,05 до примерно 1%, также включают от примерно 0,05 до примерно 1% агентов, таких как глицерин, полиэтиленгликоль 300, полиэтиленгликоль 400 и пропиленгликоль; поливиниловый спирт от примерно 0,1 до примерно 4%; повидон в количестве от примерно 0,1 до примерно 2%; и декстран 70 в количестве от примерно 0,1% при использовании совместно с другим полимерным смягчающим агентом, описанным в настоящем документе.

Суспензия может содержать один или более подщелачивающих агентов для регулирования рН. В настоящем документе термин «подщелачивающий агент» обозначает соединение, используемое для обеспечения щелочной среды. Указанные соединения включают в качестве примеров без ограничений раствор аммиака, карбонат аммония, гидроксид калия, карбонат натрия, бикарбонат натрия и гидроксид натрия и другие соединения, известные специалистам в данной области техники.

Суспензия может содержать один или более подкисляющих агентов для регулирования рН. В настоящем документе термин «подкисляющий агент» обозначает соединение, используемое для обеспечения кислой среды. Указанные соединения включают в качестве примеров без ограничений уксусную кислоту, аминокислоту, лимонную кислоту, азотную кислоту, фумаровую кислоту и другие альфа-гидроксикислоты, хлороводородную кислоту, аскорбиновую кислоту и азотную кислоту и другие соединения, известные специалистам в данной области техники.

Суспензия может содержать один или более противопенных агентов. В настоящем документе «противопенный агент» обозначает соединение или соединения, которое(-ые) предотвращает(-ют) пенообразование или снижает(-ют) количество пены, образующейся на поверхности наполняемой композиции. Подходящие противопенные агенты включают в качестве примеров без ограничений диметикон, SIMETHICONE, октоксинол и другие агенты, известные специалистам в данной области техники.

Суспензия может содержать один или более модификаторов вязкости, которые повышают или снижают вязкость суспензии. Подходящие модификаторы вязкости включают метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, маннит и поливинилпирролидон.

В некоторых вариантах реализации частица таксана присутствует в суспензии, дополнительно содержащей полисорбат. В одном конкретном варианте реализации частица таксана присутствует в суспензии, дополнительно содержащей полисорбат, где полисорбат представляет собой полисорбат 80. В других вариантах реализации полисорбат или полисорбат 80 присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1,5% (об./об.). Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что указанные очень небольшие количества полисорбата 80 снижают поверхностное натяжение на границе раздела частиц таксана и водного носителя в суспензии (такого как солевой раствор). В некоторых вариантах реализации частицы могут содержать покрытие полисорбата или полисорбата 80, в других вариантах реализации частицы не содержат покрытие полисорбата или полисорбата 80. В различных других вариантах реализации полисорбат или полисорбат 80 присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,4% (об./об.), от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,05% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,5% (об./об.), от примерно 0,1% (об./об.) до примерно 0,25% (об./об.), примерно 0,1% (об./об.), примерно 0,16 (об./об.) или примерно 0,25% (об./об.). В дополнительных вариантах реализации таксан, такой как паклитаксел, присутствует в суспензии в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 40 мг/мл или от примерно 6 мг/мл до примерно 20 мг/мл. В различных дополнительных вариантах реализации таксан присутствует в суспензии в концентрации от примерно 6 мг/мл до примерно 15 мг/мл, от примерно 6 мг/мл до примерно 10 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 20 мг/мл, от примерно 10 мг/мл до примерно 15 мг/мл, примерно 6 мг/мл, примерно 10 мг/мл или примерно 15 мг/мл. В различных дополнительных вариантах реализации водный носитель в композиции может представлять собой солевой раствор, такой как примерно 0,9% хлорид натрия.

Пример 1 частицы паклитаксела (т.е. частицы паклитаксела, описанные в настоящем документе, примерно 98% паклитаксела со средним размером частиц (среднечисловым) 0,83 микрон, УПП 27,9 м²/г и объемной плотностью (без уплотнения) 0,0805 г/см³, которые использовали в примерах 1, 2, 3 и 4) в суспензии - Программа исследований безопасности и эффективности - пилотное исследование фармакокинетики у крыс линии Спраг-Доули.

Номер исследования: FY17-008A

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Задачей данного пилотного исследования являлось определение времени отбора проб в полном исследовании фармакокинетики (PK) суспензионного состава частиц паклитаксела. Благодаря тому, что состав частиц паклитаксела имел потенциал для повышения удерживания в легких, оценивали девять временных точек от 0,5 до 168 часов для определения подходящей стратегии отбора проб в полном исследовании фармакокинетики.

Шестнадцати (16) крысам линии Спраг-Доули проводили воздействие путем однократной ингаляции состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 мг/кг) только через нос. По два животных (n=2) умерщвляли в указанные моменты времени через 0,5, 6, 12, 24, 48, 72, 120 и 168 часов после воздействия состава. Собирали образцы крови (плазма) и тканей легких.

В день воздействия получали состав частиц паклитаксела (6 мг/мл) согласно инструкциям, представленным спонсором.

Общая продолжительность воздействия аэрозолем составляла 63 минуты для всех животных. Концентрацию аэрозоля отслеживали на протяжении всего 63-минутного периода воздействия аэрозолем состава частиц паклитаксела, измеряя количество состава, который накапливался на 47 мм фильтрах GF/A, размещенных в дыхательной зоне камеры воздействия путем введения только через нос. Размер частиц аэрозоля (размер капель) измеряли при помощи каскадного импактора мерсеровского типа в дыхательной зоне для животных в камере воздействия.

Суспензионный состав частиц паклитаксела распыляли при помощи двух компрессионных струйных небулайзеров Hospitak (средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле: целевая 82,65 мкг/л). Общая средняя измеренная концентрация аэрозоля на фильтрах GF/A составляла 0,24 мг/л, а средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 73,5 мкг/мл. При измерении распределения частиц по размерам ММАД составлял 2,0 мкм при GSD 2,2. Измеренная средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле 73,5 мкг/л была на ~ 11% ниже по сравнению с целевой средней концентрацией паклитаксела в аэрозоле 82,65 мкг/л (в пределах функциональных критериев точности/степени обнаружения аналитического исследования ±15%). Отслеживали уровень кислорода и температуру во время воздействия аэрозолем состава частиц паклитаксела. Измеренные диапазоны уровня кислорода и температуры составляли 19,7%-20,9% и 20,4°С- 20,8°С, соответственно.

Вычисляли дозу паклитаксела, осажденную в легких, с учетом того, что средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 73,5 мкг/л, средняя масса тела грызуна составляла 326 г, предполагаемая осаждаемая фракция составляла 10%, а продолжительность воздействия составляла 63 минуты. Было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,33 мг/кг. Средняя осажденная доза была на ~11% ниже по сравнению с целевой осажденной дозой 0,37 мг/кг, но находилась в пределах ожидаемой погрешности (±15% от целевого значения) при воздействии распылением.

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Во время вскрытия у несколько животных наблюдалось минимальное красное окрашивание легких. Другие отклонения по результатам макроскопической оценки во время вскрытия отмечены не были. Согласно результатам массы тела и легких, полученным во время вскрытия, средняя конечная масса тела животных для всех временных точек (стандартное отклонение) составляла 346,26 г (24,01); а средняя масса легких (стандартное отклонение) составляла 1,60 г (0,13).

Исследовали системный кровоток (для плазмы в пробирках K₂-ЭДТА) путем жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХМС) и исследовали легкие, как вкратце описано в разделе 4.6 (биоаналитическое исследование), для оценки зависимости количества паклитаксела от времени. В анализе тканей легких количество паклитаксела в легких поддавалось обнаружению вплоть до 168 часов. В системном кровотоке количество паклитаксела не могло быть обнаружено (менее 1 нг/мл) уже через 24 часа. На основании полученных данных для исследования РК были предложены следующие моменты отбора образцов: через 0,5 (±10 минут), 6 (±10 минут), 12 (±10 минут), 24 (±30 минут), 48 (±30 минут), 72 (±30 минут), 120 (±30 минут) 168 (±30 минут), 240 (±30 минут) и 336 (±30 минут) часов после ингаляции.

Задачи

Задачей данного пилотного исследования являлось определение времени отбора проб в полном исследовании фармакокинетики (PK) состава частиц паклитаксела. Предварительные данные для состава частиц паклитаксела, вводимого путем интраперитонеальной (и.п.) инъекции, указывают на значительную продолжительность удерживания во внутрибрюшной полости. Благодаря тому, что состав частиц паклитаксела имел потенциал для повышения удерживания в легких, оценивали временные точки вплоть до 168 часов для определения подходящей стратегии отбора проб в полном исследовании фармакокинетики.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

ИССЛЕДУЕМАЯ СИСТЕМА

Вид/линия:	Крысы Спраг-Доули
Возраст животных в начале	8-10 недель
исследования:
Диапазон массы тела в начале	308-353 г
исследования:
Число исследуемых	18 самцов (16 исследуемых животных и 2 запасных)
животных/пол:
Источник:	Charles River Laboratories (Kingston, NY)
Идентификация:	Отметка перманентным маркером на хвосте
Исследуемый и контрольный состав и введение

Суспензионный состав частиц паклитаксела (6 мг/мл) получали согласно инструкциям, предложенным спонсором. Вкратце, в пробирку, содержащую частицы паклитаксела (306 мг), добавляли 5,0 мл 1% полисорбата 80. Суспензию частиц паклитаксела интенсивно встряхивали и переворачивали для смачивания всех частиц, содержащихся в пробирке. Сразу после встряхивания в пробирку добавляли 46 мл 0,9% хлорида натрия и встряхивали пробирку в течение по меньшей мере 1 минуты для достаточного перемешивания и подходящей дисперсности суспензии. Полученный состав оставляли по меньшей мере на 5 минут для снижения уровня воздуха/пены в пробирке, после чего помещали его в небулайзер для распыления. Конечный состав выдерживали при комнатной температуре и использовали в течение 3 часов после перерастворения.

Дизайн эксперимента

Шестнадцати (16) крысам линии Спраг-Доули проводили воздействие путем однократной ингаляции суспензионного состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 мг/кг) только через нос. По два животных (n=2) умерщвляли через 0,5 (±10 минут), 6 (±10 минут), 12 (±10 минут), 24 (±30 минут), 48 (±30 минут), 72 (±30 минут), 120 (±30 минут) и 168 (±30 минут) часов после воздействия и собирали кровь (плазма) и ткани легких. Специфическое моделирование PK не проводили; напротив, на основании полученных данных планируется определить период после воздействия, в течение которого количество паклитаксела поддается обнаружению, в исследовании PK.

Условия содержания, карантин и распределение в исследование

Самцов крыс линии Спраг-Доули (возрастом 6-8 недель) получали в Charles River Laboratories (Kingston, NY) и выдерживали на карантине в течение 14 дней. После завершения карантина взвешивали животных, а затем случайным образом распределяли по массе для участия в исследовании. Животных идентифицировали при помощи маркировки хвоста и карточек на клетках. Контролировали расход воды, освещение, влажность и температуру и отслеживали стандартными способами. Крысам предоставляли доступ к стандартному корму для грызунов ad libitum во время периодов, когда воздействие не проводили.

Масса тела и ежедневные наблюдения

Определяли массу тела во время рандомизации, ежедневно во время исследования и после умерщвления. Персонал центра сравнительной медицины и животных ресурсов (Comparative Medicine Animal Resources (CMAR)) наблюдал каждое животное во время исследования два раза в день на наличие клинических признаков отклонений, агонии или смерти.

Воздействие аэрозолем путем введения только через нос

Подготовка

Подготовку животных к трубкам для воздействия путем введения только через нос проводили в течение периода вплоть до 70 минут стандартными способами. Проводили три сеанса подготовки в течение трех дней перед воздействием, первый сеанс длился 30 минут, второй 60 минут, а третий 70 минут. Животных тщательно обследовали во время периодов подготовки и воздействия, чтобы убедиться, что они не испытывали ничего серьезнее мгновенного расстройства.

Система воздействия

Система ингаляционного воздействия состояла из двух компрессионных струйных небулайзеров (Hospitak) и камеры воздействия для грызунов путем ингаляции только через нос. Во время воздействия отслеживали уровень кислорода (%). Аэрозоль суспензионного состава частиц паклитаксела получали на установке из двух компрессионных струйных небулайзеров (которые использовали вплоть до 40 (±1) минут, затем заменяли на вторую установку из двух компрессионных струйных небулайзеров на оставшийся период воздействия) с входным давлением 20 psi (140 кПа). Аэрозоль направляли через 24-дюймовую линию доставки аэрозоля из нержавеющей стали (диаметром 1,53 см) в камеру воздействия путем введения только через нос.

Отслеживание концентрации

Концентрацию аэрозоля отслеживали, собирая аэрозоль на предварительно взвешенных фильтрах GF/A 47 мм. Фильтры собирали в дыхательных зонах для грызунов в камере воздействия путем введения только через нос в период воздействия на грызунов. Расход для отбора проб аэрозоля через фильтры GF/A поддерживали на уровне 1,0±0,5 л/минута. Всего собирали шесть фильтров GF/A, по одному каждые 10 минут во время воздействия, за исключением последнего фильтра, который собирали через 13 минут после предыдущего. После сбора образцов взвешивали фильтры для определения общей концентрации аэрозоля в системе для воздействия. Экстрагировали содержимое фильтров и анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для оценки количества паклитаксела, собранного на каждом фильтре. Вычисляли общую концентрацию аэрозоля и концентрацию паклитаксела в аэрозоле для каждого фильтра путем деления общего количества аэрозоля и паклитаксела в собранном аэрозоле на общий объем воздуха, прошедшего через фильтр. Среднюю концентрацию паклитаксела в аэрозоле использовали для вычисления средней осажденной дозы паклитаксела в легких грызунов при помощи уравнения 1, показанного ниже.

Определение размера частиц

Определяли распределение частиц аэрозоля по размерам в дыхательной зоне для грызунов камеры воздействия путем введения только через нос с использованием семиступенчатого каскадного импактора мерсеровского типа (Intox Products, Inc., Albuquerque, NM). Определяли распределение частиц по размерам при помощи массового медианного аэродинамического диаметра (ММАД) и геометрического стандартного отклонения (GSD). Образцы в каскадном импакторе собирали при расходе 2,0±0,1 л/мин.

Определение дозы

Осажденную дозу вычисляли при помощи уравнения 1. Для данного вычисления использовали среднюю концентрацию аэрозоля, измеренную во время воздействия, а также среднюю массу тела в группе крыс. Таким образом вычисляли оценочное количество паклитаксела, осаженное в легких крыс, с использованием измеренной концентрации паклитаксела в аэрозоле.

где:

Осажденная доза = (ОД) мкг/кг

²Минутный объем дыхания (МОД)=0,608 х МТ^0,852

Концентрация аэрозоля во время воздействия (КА) = концентрация паклитаксела в аэрозоле (мкг/л)

Осажденная фракция (ОФ) = предполагаемая осажденная фракция в 10%

МТ = средняя масса тела (во время рандомизации; день -1) исследуемых животных (кг)

Умерщвление и вскрытие

Умерщвляли животных в соответствующие моменты времени путем и.п. инъекции раствора для умерщвления. Во время вскрытия собирали кровь (для выделения плазмы) путем сердечной пункции в пробирку K₂-ЭДТА, взвешивали легкие, собирали образцы тканей легких и мгновенно замораживали в жидком азоте для биоаналитических исследований. Кроме того, квалифицированный персонал, осуществлявший вскрытие, проводил полную макроскопическую оценку. Оценивали внешние поверхности тела, пазухи и содержимое черепной, грудной и брюшной полостей. Описывали очаги поражения и указывали при помощи словарных терминов их морфологию, количество, форму, цвет, структуру и тяжесть.

Биоаналитические исследования

Исследовали системный кровоток (плазма в пробирках K₂-ЭДТА) и ткани легких путем жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХМС) для оценки зависимости количества паклитаксела от времени. Вкратце, в исследовании используют анализ сверхэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (СВЭЖХ-МС/МС) для количественной оценки уровня паклитаксела. Экстрагировали образцы плазмы способом осаждения белка, проводили разделение путем обращенно-фазовой хроматографии. Гомогенизировали образцы легких в воде при отношении 4:1 (вода : ткани легких). Затем гомогенат обрабатывали способом, схожим со способом осаждения белка, перед анализом ЖХМС. Проводили количественную оценку с использованием калибровочных кривых, полученных для матричных растворов.

Фармакокинетическое моделирование полученных данных не проводили, тем не менее, концентрацию, при которой уровень паклитаксела падает ниже пределов чувствительности анализа (1 нг/мл), использовали для определения моментов для отбора проб в основном исследовании РК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинические отклонения и выживаемость

Все животные доживали до указанного для них момента вскрытия и набирали вес. Во время исследования клинические отклонения не были отмечены.

Воздействие частицами паклитаксела

Концентрация аэрозоля

В таблице 1 показаны общая концентрация аэрозоля и концентрация паклитаксела в аэрозоле, измеренные после отбора проб на каждом фильтре GF/A во время воздействия. Средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле во время ингаляционного воздействия в 73,5 мкг/л была на ~ 11% ниже по сравнению с целевой средней концентрацией паклитаксела в аэрозоле 82,65 мкг/л. Средняя концентрация аэрозоля во время воздействия находилась в пределах ±15% от целевой концентрации аэрозоля, что можно было ожидать при ингаляционном воздействии путем распыления.

Уровень кислорода и температура

Измеренные диапазоны уровня кислорода и температуры составляли 19,7%-20,9% и 20,4°С-20,8°С, соответственно.

Размер частиц

Распределение частиц по размерам определяли при помощи ММАД (GSD), который для аэрозоля 6,0 мг/мл состава частиц паклитаксела при использовании каскадного импактора составлял 2,0 (2,2) мкм.

Осажденная доза

С учетом того, что средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 73,5 мкг/л, средняя масса тела грызунов в день -1 (рандомизация) составляла 326 г, предполагаемая осажденная фракция составляла 10%, а продолжительность воздействия составляла 63 минуты; было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,33 мг/кг. Средняя осажденная доза была на ~11% ниже по сравнению с целевой осажденной дозой 0,37 мг/кг с учетом ожидаемой погрешности (±15% от целевого значения) средней концентрации аэрозоля во время воздействия.

Вскрытие

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Во время вскрытия у нескольких животных наблюдалось минимальное красное окрашивание легких. Другие отклонения по результатам макроскопической оценки во время вскрытия отмечены не были. Определяли отдельные и средние значения массы легких, массы тела и отношения. Средняя масса тела в конце исследования (стандартное отклонение) составляла 346,26 г (24,01). Средняя масса легких (стандартное отклонение) составляла 1,60 г (0,13). Масса легких и отношение массы легких к массе тела являются параметрами, которые широко используют для оценки возможных токсикологических ответов на ингалируемые материалы. В целом, данные согласовывались с историческими значениями и указывали на отсутствие ответа согласно любому из указанных критериев оценки.

Биоанализ

Результаты приведены ниже в таблице 2 и на фигуре 1. Средняя концентрация паклитаксела в плазме составляла 16,705 нг/мл через 0,5 часа после воздействия, а затем постепенно снижалась вплоть до точки 24 часа и была ниже нижнего предела обнаружения (1 нг/мл) для всех последующих временных точек. Средняя концентрация паклитаксела в тканях легких составляла 21940 нг/г через 0,5 часа после воздействия и постепенно снижалась до 419,6 нг/г для точки 168 часов. Это указывает на значительное удерживание частиц паклитаксела в легких при минимальном системном воздействии.

ВЫВОДЫ

Шестнадцати (16) самцам крыс линии Спраг-Доули проводили воздействие путем однократной ингаляции аэрозолей состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 мг/кг) только через нос. По два животных (n=2) умерщвляли через 0,5, 6, 12, 24, 48, 72, 120 и 168 часов после воздействия для сбора образцов крови (плазма) и тканей легких.

Средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в 73,5 мкг/л во время 63-минутного ингаляционного воздействия была на ~ 11% ниже чем целевая средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле 82,65 мкг/л. Средняя концентрация аэрозоля во время воздействия была в пределах ±15% от целевой концентрации аэрозоля, что можно было ожидать для ингаляционного воздействия путем распыления. Распределение частиц по размерам определяли при помощи ММАД (GSD), который для аэрозоля 6,0 мг/мл состава частиц паклитаксела в каскадном импакторе составлял 2,0 (2,2) мкм. Измеренные диапазоны уровня кислорода и температуры составляли 19,7%-20,9% и 20,4°С- 20,8°С, соответственно.

Осажденную дозу паклитаксела вычисляли с учетом того, что средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 73,5 мкг/л, средняя масса тела грызунов составляла 326 г, предполагаемая осажденная фракция составляла 10%, а продолжительность воздействия составляла 63 минуты. Было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,33 мг/кг. Средняя осажденная доза была на ~11% ниже по сравнению с целевой осажденной дозой 0,37 мг/кг с учетом ожидаемой погрешности (±15% от целевого значения).

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Во время вскрытия у нескольких животных наблюдалось минимальное красное окрашивание легких. Другие отклонения по результатам макроскопической оценки во время вскрытия не были отмечены. Согласно результатам массы тела и массы легких, полученным по время вскрытия, средняя масса тела в конце исследования (стандартное отклонение) составляла 346,26 г (24,01), а средняя масса легких (стандартное отклонение) составляла 1,60 г (0,13). Масса легких и отношение массы легких к массе тела являются параметрами, которые широко используют для оценки возможных токсикологических ответов на ингалируемые материалы. В целом, данные указывали на отсутствие ответа согласно любому из указанных критериев оценки.

Средняя концентрация паклитаксела в плазме составляла 16,705 нг/мл через 0,5 часа после воздействия, затем постепенно снижалась вплоть до точки 24 часа и была ниже нижнего предела обнаружения для всех временных точек после 24 часов. Средняя концентрация паклитаксела в тканях легких составляла 21940 нг/г через 0,5 часа после воздействия и постепенно снижалась до 419,6 нг/г к точке 168 часов. Это указывает на значительное удерживание частиц паклитаксела в легких при минимальном системном воздействии. Следующие моменты отбора проб были предложены для исследования РK: через 0,5 (±10 минут), 6 (±10 минут), 12 (±10 минут), 24 (±30 минут), 48 (±30 минут), 72 (±30 минут), 120 (±30 минут) 168 (±30 минут), 240 (±30 минут) и 336 (±30 минут) часов после воздействия.

Пример 2: Исследование FY17-008B - Исследование ингаляционного воздействия аэрозолем частиц паклитаксела

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Основной задачей данной работы являлось проведение воздействия для самцов крыс путем ингаляции только через 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл суспензионных составов частиц паклитаксела. Каждое ингаляционное воздействие для крыс проводили в течение 65 минут.

6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл суспензионные составы частиц паклитаксела получали согласно инструкциям, предложенным спонсором. Одновременно использовали два компрессионных струйных небулайзера Hospitak под давлением 20 psi (140 кПа) для распыления состава частиц паклитаксела в камере ингаляционного воздействия для грызунов. Во время каждого воздействия измеряли концентрацию аэрозоля в дыхательной зоне для животных путем отбора проб на 47 мм фильтрах GF/A с расходом 1,0±0,5 л/минута. Определяли размер частиц путем отбора образцов аэрозолей из дыхательной зоны для животных с использованием каскадного импактора мерсеровского типа с расходом 2,0±0,1 л/минута. Проводили гравиметрический анализ фильтров для определения общей концентрации аэрозоля частиц паклитаксела и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) для определения концентрации паклитаксела в аэрозоле для каждого воздействия. Отслеживали уровень кислорода и температуру и указывали во время ингаляционного воздействия.

Было определено, что средняя общая концентрация аэрозоля частиц паклитаксела и концентрация паклитаксела в аэрозоле составляли 0,25 мг/л при ОСО 7,43% и 85,64 мкг/л при ОСО 10,23%, соответственно, для ингаляционного воздействия 6,0 мг/мл составом частиц паклитаксела. Средний массовый медианный аэродинамический диаметр (геометрическое стандартное отклонение), измеренный при помощи каскадного импактора, составлял 1,8 (2,0) мкм для аэрозоля 6,0 мг/мл состава частиц паклитаксела. Было определено, что средняя общая концентрация аэрозоля частиц паклитаксела и концентрация паклитаксела в аэрозоле составляли 0,46 мг/л при ОСО 10,95% и 262,27 мкг/л при ОСО 11,99%, соответственно, для ингаляционного воздействия 20,0 мг/мл составом частиц паклитаксела. Средний массовый медианный аэродинамический диаметр (геометрическое стандартное отклонение), измеренный при помощи каскадного импактора, составлял 2,3 (1,9) мкм для аэрозоля 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела.

Средняя осажденная доза паклитаксела, вычисленная при помощи уравнения 1 для 65-минутного воздействия, составляла 0,38 мг/кг и 1,18 мг/кг для 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела, соответственно.

СОСТАВ И ИНГАЛЯЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

Получение состава

МАТЕРИАЛЫ

Исследуемое изделие

Исследуемое изделие, используемое для ингаляционного воздействия, показано ниже.

Частицы паклитаксела

Форма:	Частицы паклитаксела (стерильные)
Описание:	Новый сухой порошковый состав паклитаксела, доставляемый в количестве 306 мг/пробирка
Поставщик:	US Biotest
Производитель:	CritiTech
Условия хранения:	Условия окружающей среды

Носитель

Носители, используемые для получения составов частиц паклитаксела, показаны ниже.

Полисорбат 80

Форма:	Стерильный 1% полисорбат 80 в 0,9% хлориде натрия для инъекции
Описание:	Прозрачная жидкость
Поставщик:	US Biotest
Производитель:	CritiTech
Условия хранения:	Условия окружающей среды

Физиологический раствор

Форма:	Стерильный 0,9% хлорид натрия для инъекции, USP
Описание:	Прозрачная жидкость
Производитель:	Hospira, Inc, IL
Условия хранения:	Условия окружающей среды

СОСТАВ И ИНГАЛЯЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ

Получение состава

6,0 мг/мл состав частиц паклитаксела получали следующим способом: Вкратце, в пробирку, содержащую частицы паклитаксела (306 мг), добавляли 5,0 мл 1% полисорбата 80. Пробирку интенсивно встряхивали и переворачивали для смачивания всех частиц, присутствующих в пробирке. Сразу после встряхивания в пробирку добавляли 46 мл 0,9% раствора хлорида натрия и встряхивали пробирку в течение по меньшей мере 1 минуты для достаточного перемешивания и подходящей дисперсности суспензии.

Способ получения состава частиц паклитаксела, описанный выше для 6,0 мг/мл состава, использовали для получения 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела с тем исключением, что в пробирку добавляли 10,3 мл 0,9% раствора хлорида натрия, а не 46 мл, которые использовали для 6,0 мг/мл состава.

Полученные составы оставляли по меньшей мере на 5 минут для снижения уровня воздуха/пены в пробирке, после чего помещали ее в небулайзер для распыления. Конечный 6,0 мг/мл состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 2 часов после перерастворения. Конечный 20,0 мг/мл состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 30 минут после перерастворения.

Дизайн эксперимента

Тридцати (30) крысам линии Спраг-Доули проводили воздействие путем введения одной внутривенной дозы «клинического стандарта ABRAXANE^® (паклитаксел: целевая доза 5,0 мг/кг), тридцати (30) крысам линии Спраг-Доули проводили воздействие путем введения составов частиц паклитаксела, описанных в настоящем документе (целевая доза 0,37 мг/кг), а тридцати (30) крысам линии Спраг-Доули проводили воздействие путем однократной ингаляции составов частиц паклитаксела (целевая доза 1,0 мг/кг) только через нос. По три животных (n=3) умерщвляли через 0,5 (±10 минут), 6 (±10 минут), 12 (±10 минут), 24 (±30 минут), 48 (±30 минут), 72 (±30 минут), 120 (±30 минут), 168 (±30 минут), 240 (±30 минут) и 336 (±30 минут) часов после воздействия для сбора крови (плазма) и тканей легких. Проводили некомпартментный анализ плазмы и тканей легких для определения периода после воздействия, в течение которого количество паклитаксела поддавалось обнаружению, для каждой группы.

Настройка системы воздействия/Получение аэрозоля: Как в примере 1

Отслеживание концентрации аэрозоля: Как в примере 1

Распределение частиц по размерам: Как в примере 1

Вычисление осажденной дозы: Как в примере 1

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты воздействия

Концентрация аэрозоля и размер частиц

Концентрацию аэрозоля отслеживали во время каждого воздействия путем введения аэрозоля состава частиц паклитаксела с использованием 47 мм фильтров GF/A в дыхательной зоне для животных камеры для воздействия путем введения только через нос. Во время каждого воздействия отбирали образцы на семи 47 мм фильтрах GF/A. Образцы в фильтрах от FS-1 до FS-6 собирали по 10 минут, а в фильтре FS-7 в течение 5 минут для каждой из групп, в которых вводили низкую и высокую дозы. Измеряли размер частиц с использованием каскадного импактора мерсеровского типа в каждой дыхательной зоне для животных камеры для воздействия. В таблицах 3 и 4 показаны общая концентрация аэрозоля и концентрация паклитаксела в аэрозоле, измеренные после отбора образцов на фильтрах GF/A во время воздействия низкой дозой и высокой дозой, соответственно.

Распределение частиц по размерам (размер капель аэрозоля) определяли при помощи ММАД (медианное значение распределения аэродинамических диаметров массы распыленных частиц) (GSD; используют при измерении ММАД для описания изменчивости распределения частиц по размерам) для каждого аэрозоля состава частиц паклитаксела с использованием каскадного импактора. Было определено, что для аэрозолей 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл составов частиц паклитаксела ММАД (GSD) составлял 1,8 (2,0) мкм и 2,3 (1,9) мкм, соответственно. На фигурах 2 и 3 показано распределение частиц по размерам для аэрозолей 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл составов частиц паклитаксела, соответственно.

Осажденная доза

Осажденную дозу паклитаксела вычисляли по значениям средней концентрации паклитаксела в аэрозоле, средней массы тела крыс, предполагаемой осажденной фракции 10% и продолжительности воздействия 65 минут для воздействия низкой дозой и высокой дозой состава частиц паклитаксела при помощи уравнения 1. В таблице 5 показана средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле, средняя масса тела крыс, продолжительность воздействия и осажденная доза для каждого воздействия. Было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,38 мг/кг и 1,18 мг/кг для воздействия 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл составами частиц паклитаксела, соответственно.

Уровень кислорода и температура

Уровень кислорода и температуру отслеживали во время воздействия составами частиц паклитаксела в виде аэрозоля. Полученные диапазоны уровня кислорода и температуры составляли 19,8%-20,9% и 20,7°С-20,8°С, соответственно, для воздействия 6,0 мг/мл составом частиц паклитаксела. Для воздействия 20,0 мг/мл составом частиц паклитаксела уровень кислорода составлял 19,8% во время воздействия, а диапазон температур составлял 20,7°С-20,8°С.

Предварительные данные показаны на фигурах 4-6.

Пример 3. Оценка эффективности ингаляционных составов частиц паклитаксела в модели ортотопического рака легкого у бестимусных крыс - Исследование FY17-095

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Сто двадцать семь (127) бестимусных крыс NIH-rnu облучали рентгеновским излучением для подавления иммунной системы в день -1. В день 0 животным вводили опухолевые клетки Calu3 путем внутритрахеальной (в.т.) инсталляции. Животных выдерживали в течение трехнедельного периода роста. На третьей неделе животных случайным образом распределяли путем стратификации по массе тела в 5 исследуемых групп. Начиная с 4 недели, животным из группы 2 один раз в неделю внутривенно (в.в.) вводили дозу ABRAXANE^® (5 мг/кг) на 22, 29 и 36 день. Животным из групп 3 и 4 вводили путем ингаляции (инг.) один раз в неделю (по понедельникам) низкую (0,5 мг/кг) и высокую (1,0 мг/кг) целевую дозу, соответственно, составов частиц паклитаксела. Животным из групп 5 и 6 вводили путем ингаляции два раза в неделю (по понедельникам и четвергам) низкую (0,50 мг/кг) и высокую (вплоть до 1,0 мг/кг) целевую дозу, соответственно, составов частиц паклитаксела. Животным из группы 1 лечение не проводили, их использовали как контроль нормального роста опухолевых клеток. Всех животных умерщвляли на 8 неделе.

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Клинические отклонения, связанные с моделью, включали покраснение кожи и затрудненное дыхание. Во всех группах прирост массы тела во время исследования находился примерно на одном уровне.

Средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле после ингаляционного воздействия в группах, в которых вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и низкую дозу два раза в неделю, составляла 270,51 мкг/л и 263,56 мкг/л, соответственно. Средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле после ингаляционного воздействия в группах, в которых вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и высокую дозу два раза в неделю, составляла 244,82 мкг/л и 245,76 мкг/л, соответственно.

Дозы определяли с учетом средней концентрации паклитаксела в аэрозоле, самого последнего измеренного значения массы тела в группе, предполагаемой осажденной фракции 10% и продолжительности воздействия 33 (низкая доза) или 65 (высокая доза) минут. Во время четырехнедельного периода лечения средняя осажденная доза для грызунов в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 0,655 мг/кг и 0,640 мг/кг (1,28 мг/кг/неделя), соответственно. Средняя осажденная доза паклитаксела для грызунов в группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и в группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 1,166 мг/кг и 1,176 мг/кг (2,352 мг/кг/неделя), соответственно. В группе, в которой вводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, средняя доза, вводимая на 22, 29 и 36 день, составляла 4,94, 4,64 и 4,46 мг/кг, соответственно.

Во время запланированного вскрытия у большинства животных из каждой группы имелись бледно-коричневые узелки в легких и/или красные или бледно-коричневые пятна в легких. Другие единичные отклонения включали брюшную грыжу у одного животного и узелки в перикарде у другого животного. Другие отклонения по результатам макроскопической оценки во время вскрытия отмечены не были.

У животных, которым вводили ABRAXANE^®, масса легких, отношение массы легких к МТ и отношение массы легких к массе мозга были значительно ниже по сравнению с контролем без лечения. В группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, значения массы были схожими с группой ABRAXANE^®, а масса легких и отношение массы легких к массе мозга были значительно ниже по сравнению с контролем без лечения.

По результатам гистологической оценки в легких большинства животных во всех группах наблюдались признаки опухолевых образований. Опухолевые образования характеризовались наличием небольших образований различного размера, способных к росту, случайным образом рассеянных по паренхиме легких и более крупных разросшихся и сросшихся образований, которые занимали вплоть до 75% паренхимы легких, малых дыхательных путей и кровеносных сосудов. Более крупные образования были распределены, главным образом, в прикорневых участках или рядом с центральной осью дыхательных путей, а мелкие образования, в целом, были расположены на периферии.

Первичные морфологические клеточные характеристики опухолевых образований в легких варьировались от недифференцированной до относительно хорошо дифференцированной формы аденокарциномы легких. Для основного типа опухолевых клеток была показана морфология недифференцированной аденокарциномы; клетки были плеоморфными, крупными, анапластическими, давали бледное амфофильное окрашивание и имели внутрицитоплазматические вакуоли, напоминавшие слизистые везикулы, отмечался умеренный или выраженный анизокариоз, наблюдался рост клеток по отдельности или слоями, отсутствовали четко очерченные признаки дифференцировки в клетки аденокарциномы. Тем не менее, по своим морфологическим характеристикам клетки, которые наблюдались в других образованиях или росли в описанных выше недифференцированных образованиях, были более организованными и могли быть отнесены к высокодифференцированной аденокарциноме легкого благодаря выраженной дифференцировке в клетки ацинозных желез. Эти дающие амфофильное окрашивание опухолевые клетки были распределены, главным образом, в виде гнездных скоплений или в железах, которые согласно наблюдениям были соединены альвеолярными перегородками. В популяции указанных опухолевых клеток митотические фигуры наблюдались редко. Еще реже в указанных образованиях наблюдались очаги относительно небольших зародышевых опухолевых клеток с примитивной структурой и небольшое или умеренное бледное базофильное окрашивание цитоплазмы, овальные и различные пузырьковидные ядра и умеренный анизокариоз. Согласно наблюдениям указанные зародышевые опухолевые клети росли случайным образом и слоями. Повышенное число митотических фигур и апоптотических телец чаще всего отмечали в этой базофильной популяции зародышевых опухолевых клеток. Часто наблюдали воспаление, характеризующееся инфильтрацией различных воспалительных клеток (главным образом, эозинофилов, лимфоцитов, пенистых макрофагов и иногда гигантских клеток), сопровождающейся интерстициальным фиброзом. Значительный некроз паренхимы отсутствовал в редких случаях.

Патолог рассматривал наличие неровностей на границах отдельных опухолевых образований, характеризующееся постепенным исчезновением опухолевых клеток вплоть до полного исчезновения всех опухолевых клеток, и остаточный фиброз выступающей в качестве каркаса соединительной ткани паренхимы легких совместно с инвазией пенистых макрофагов как показатель регрессии опухоли.

По сравнению с положительным контролем, группа 1, и группой 2, в которой проводили сравнительное лечение ABRAXANE^®, в группах, в которых вводили состав частиц паклитаксела (группы 3-6), наблюдалось снижение общей опухолевой нагрузки в легких, характеризующееся снижением тяжести опухолевых образований аденокарциномы и уменьшением популяции зародышевых опухолевых клеток, а также признаки регрессии опухоли. Другие связанные с лечением поражения или признаки не наблюдались. Наблюдали активную инфильтрацию мононуклеарных клеток в легкие животных, которым вводили состав частиц паклитаксела путем ингаляции. Так как в используемой модели Т-клетки отсутствуют, клетки вероятно представляли собой В-клетки или ЕК-клетки. Было сделано предположение о том, что локализованное воздействие частицами паклитаксела в более высокой концентрации на опухоль приводило к изменению среды и инфильтрации мононукле арных клеток в легкие.

ЗАДАЧИ

Задачей данного исследования была оценка эффективности ингаляционного состава частиц паклитаксела по сравнению с внутривенным введением дозы клинического стандарта ABRAXANE^® в отношении снижения опухолевой нагрузки в ортотопической модели рака легкого.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Исследуемая система
Вид/линия:	бестимусные крысы NIH-rnu
Возраст животных в начале	3-5 недель
исследования:
Диапазон массы тела в начале	Примерно 150- 200 г
исследования:
Количество исследуемых	127 самцов (120 исследуемых животных и 7 запасных)
животных/пол:
Источник:	Envigo
Идентификация:	Отметка перманентным маркером на хвосте

Состав ABRAXANE^®

В качестве клинического стандарта в.в. состава использовали лекарственный продукт ABRAXANE^®. Лекарственный продукт перерастворяли до концентрации 5,0 мг/мл в солевом растворе в день введения и хранили согласно инструкциям производителя.

Состав частиц паклитаксела

20,0 мг/мл составы частиц паклитаксела для воздействия получали согласно рекомендациям спонсора. В частности, частицы паклитаксела перерастворяли в 1% полисорбате 80. Встряхивали пробирку вручную для смачивания всех частиц. Добавляли дополнительное количество 0,9% хлорида натрия для инъекции (до целевой концентрации) и встряхивали пробирку вручную еще минуту. Продолжали встряхивать до исчезновения крупных комков и подходящей дисперсности суспензии.

Полученные составы оставляли по меньшей мере на 5 минут для снижения уровня воздуха/пены в пробирке, после чего помещали ее в небулайзер для распыления. Конечный состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 2 часов после перерастворения. Конечный 20,0 мг/мл состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 30 (+5) минут после перерастворения.

Дизайн эксперимента

В исследовании использовали сто двадцать семь (127) животных. Перед облучением рентгеновским излучением и введением опухолевых клеток 7 животных определяли в запас (запасных животных не облучали и не проводили инсталляцию клеточной линии). В день -1 всех исследуемых животных облучали рентгеновским излучением для подавления иммунной системы. В день 0 животным вводили опухолевые клетки Calu3 путем внутритрахеальной (в.т.) инсталляции. Животных выдерживали в течение трехнедельного периода роста. На третьей неделе животных случайным образом распределяли путем стратификации по массе тела в группы, описанные ниже в таблице 6. Начиная с 4 недели, животным из группы 2 один раз в неделю внутривенно (в.в.) вводили дозу ABRAXANE^® (5 мг/кг). Животным из групп 3 и 4 вводили путем ингаляции (инг.) один раз в неделю (по понедельникам) низкую (0,5 мг/кг) и высокую (1,0 мг/кг) целевую дозу, соответственно, составов частиц паклитаксела. Животным из групп 5 и 6 вводили путем ингаляции два раза в неделю (по понедельникам и четвергам) низкую (0,50 мг/кг) и высокую (1,0 мг/кг) целевую дозу, соответственно, составов частиц паклитаксела. Животным из группы 1 лечение не проводили, их использовали как контроль нормального роста опухолевых клеток. Всех животных умерщвляли на 8 неделе.

После карантина взвешивали всех животных и случайным образом распределяли по группам, за исключением 7 запасных животных, с учетом массы тела. В период от 1 недели до 3 недели идентифицировали животных при помощи карточек на клетках (номера LC) и отметок на хвостах.

На 3 неделе перед началом лечения взвешивали животных и случайным образом распределяли по группам, перечисленным выше, используя стратификацию по массе тела, и присваивали № в исследовании. Начиная с этого момента, животных идентифицировали по карточкам на клетках и ярким отметкам на хвостах.

Подавление иммунной системы и облучение

В день -1 проводили полное рентгеновское облучение животных ~500 рад (рентгеновский аппарат Phillips RT 250 X-ray Therapy Unit, Phillips Medical Systems, Shelton, CT, рабочие характеристики 250 кВп, 15 мА и расстояние от источника до объекта 100 см). Животных помещали в камеру в форме пирога («cutie pie») по 2-3 животных на каждый «кусочек пирога». Процесс облучения занимал ~10-15 минут.

Имплантация опухолевых клеток

В день 0 животным в.т. вводили опухолевые клетки (Calu3). Вкратце, после анестезирования 3-5% изофлураном в индукционной камере животное размещали таким образом, чтобы верхние резцы зацеплялись за наклонную подвешенную платформу для инсталляции. Осторожно фиксировали язык животного и в это время вводили стилет в участок трахеи сразу за гортанью. Суспензию клеток в ЭДТА (объем целевой дозы: 500 мкл; концентрация: примерно 20×10⁶ на 0,5 мл) доставляли в легкие путем внутритрахеальной инсталляции. После инсталляции осторожно отслеживали дыхание и передвижение животных. После имплантации опухолевых клеток животных выдерживали в течение периода роста примерно 3 недели перед началом лечения для приживления опухолевых клеток и развития рака легкого.

Выращивание и получение препарата Calu3

Клетки Calu3 выращивали при 37°С, 5% СО₂, в колбах для клеточных культур. Их выращивали в среде Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), до 80% конфлюэнтности. Выдерживали клетки вплоть до дня инсталляции. Перед инсталляцией собирали их путем промывки ФБР, затем добавляли трипсин для удаления клеток из колбы. Нейтрализовали клетки в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭБС. Затем их центрифугировали при 100xg в течение 5 минут, удаляли среду и повторно суспендировали клетки до концентрации 20 миллионов клеток в 450 мкл бессывороточной RPMI. Перед инсталляцией в клеточную суспензию добавляли 50 мкл 70 мкМ ЭДТА для получения общего объема в.т. дозы 500 мкл для каждой крысы.

Масса тела и ежедневные наблюдения

Значения массы тела определяли во время рандомизации, раз в неделю вплоть до 3 недели, два раза в неделю, начиная с 4 недели и до конца исследования и во время вскрытия.

Каждое животное наблюдали во время исследования два раза в день на наличие любых клинических признаков отклонений, заболевания или гибели. Технический персонал наблюдал животных во время введения и измерения массы тела.

В.в. введение ABRAXANE^® -инъекции в хвостовую вену

ABRAXANE^® (5 мг/мл, максимальный объем дозы 250 мкл) вводили животным из группы 2 путем в.в. инъекции в хвостовую вену на 22, 29 и 36 день.

Введение состава частиц паклитаксела - Воздействие аэрозолем путем введения только через нос

Подготовка

Система воздействия

Аэрозоли получали при помощи двух компрессионных струйных небулайзеров Hospitak, как показано на ФИГ. 7, под давлением в небулайзере 20 psi (140 кПа). 20,0 мг/мл суспензионный состав частиц паклитаксела использовали для воздействия низкой дозой и высокой дозой. Аэрозоли вводили через линию доставки в камеру для воздействия с 32 отверстиями. Ингаляционное воздействие для грызунов проводили в течение 33 или 65 минут. Аэрозоль суспензии частиц паклитаксела получали на установке из двух компрессионных струйных небулайзеров Hospitak (которые использовали до 40 (±1) минут), которую затем заменяли на вторую установку из двух небулайзеров Hospitak на оставшийся период воздействия. Отслеживали и измеряли уровень кислорода и температуру во время каждого ингаляционного воздействия.

Отслеживание концентрации

Концентрацию аэрозоля отслеживали, собирая аэрозоли на предварительно взвешенных 47 мм фильтрах GF/A. Собирали фильтры из дыхательных зон для животных камеры для воздействия путем введения только через нос во время каждого ингаляционного воздействия. Расход при отборе проб аэрозоля на фильтрах GF/A поддерживали на уровне 1,0±0,5 л/минута. Собирали фильтры во время каждого воздействия каждые 10 минут за исключением последнего фильтра. При воздействии низкой дозой (группы 3 и 5) продолжительностью 33 минуты последний фильтр собирали через 13 минут после предыдущего, а при воздействии высокой дозой (группы 4 и 6) продолжительностью 65 минут последний фильтр собирали через 15 минут. После сбора образцов взвешивали фильтры для определения общей концентрации аэрозоля в системе воздействия.

После взвешивания каждый фильтр помещали в 7 мл стеклянную пробирку. Проводили экстракцию содержимого фильтров в стеклянных пробирках и анализ высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для оценки количества паклитаксела, собранного на фильтрах. Вычисляли общую концентрацию аэрозоля и концентрацию паклитаксела в аэрозоле для каждого фильтра путем деления общего количества аэрозоля и паклитаксела в аэрозоле на общий объем воздуха, прошедший через фильтр. Среднюю концентрацию паклитаксела в аэрозоле использовали для вычисления средней осажденной дозы паклитаксела в легких грызунов при помощи уравнения 1, как показано ниже в разделе «определение дозы».

Определение дозы

Осажденную дозу вычисляли при помощи уравнения 1. В этом вычислении использовали среднюю концентрацию аэрозоля, измеренную во время воздействия, и среднюю массу телу крыс в группе. Таким способом оценочное количество паклитаксела, осажденного в легких крыс, вычисляли по измеренной концентрации паклитаксела в аэрозоле.

где:

Осажденная доза = (ОД) мкг/кг

²Минутный объем дыхания (МОД) = 0,608 х МТ^0,852

Осажденная фракция (ОФ) = предполагаемая осажденная фракция 10%

Умерщвление и вскрытие

В запланированный период вскрытия умерщвляли животных путем интраперитонеальной инъекции избыточной дозы седативного средства на основе барбитурата.

Сбор образцов крови и тканей

Во время вскрытия определяли конечную массу тела и массу мозга. Во время запланированного умерщвления собирали кровь (плазма) после сердечной пункции в пробирки K₂-ЭДТА. Удаляли и взвешивали легкие. Срез опухолевой ткани, содержащий опухоль, трахеобронхиальный лимфатический узел, замораживали в жидком азоте для возможного будущего анализа. Оставшийся фрагмент легких фиксировали для возможного проведения гистопатологии.

Гистопатология

Зафиксированные доли левого легкого нарезали как «буханку хлеба» и по очереди помещали срезы в 2 кассеты для получения 2 препаратов каждого среза для 3 типовых срезов левого легкого. Ткани обрабатывали обычным способом, погружали в парафин, нарезали на срезы ~4 мкм, закрепляли и окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для микроскопического исследования. Проводили субъективную полуколичественную оценку результатов.

Срезы легких (1-4/животное), полученные у 60 из 120 исследуемых бестимусных крыс, нарезали по длине и обрабатывали для получения окрашенных Н&Е предметных стекол для оценки путем световой микроскопии.

Во время этого анализа записывали результаты микроскопического исследования и отправляли в электронную систему учета патологий (PDS-Ascentos-1.2.0, версия 1.2), которая обобщала показатели частоты и тяжести для данных нагрузки в легких, сводила результаты и получала данные для отдельных животных. Проводили гистологическую оценку легких 60 бестимусных крыс: группа 1 [1001-1010], группа 2 [2001-2010], группа 3 [3001-3010], группа 4 [4001-4010], группа 5 [5001-5010] и группа 6 [6001-6010]. Для оценки уровня опухолевой нагрузки в указанных образцах легких изучали легкие и классифицировали во время гистопатологического исследования. Для диагностики совокупных характеристик нагрузки в легких: 1) аденокарцинома (недифференцированная и дифференцированная), 2) зародышевые опухолевые клетки (слабодифференцированные плеоморфные клетки) и 3) регрессия опухоли, проводили полуколичественную классификацию легких по следующей 4-балльной классификационной шкале, которая указывала на уровень распространения в процентах по ткани легкого в целом: 0 = отсутствие, 1 = минимальный (распространение на ~ 1 - 25% от общей площади срезов легкого), 2 = низкий (распространение на ~ 25 - 50% от общей площади срезов легкого), 3 = умеренный (распространение на ~ 50 - 75% от общей площади срезов легкого) и 4 = выраженный (распространение на ~ 75 - 100% от общей площади срезов легкого).

Гистоморфометрия

Гистоморфометрический анализ проводили с использованием зафиксированных долей левого легкого, взятых у первых 10 животных из каждой группы. Срезы ткани получали с использованием ножа для морфометрии (нарезка «ломтиков хлеба»). Вкратце, срезы начинали получать на случайном участке на расстоянии от 2 до 4 мм от краниального края легкого. Толщина каждого среза легкого составляла примерно 4 мм. Нечетные срезы помещали каудальной частью вниз в кассету 1, а четные срезы помещали в кассету 2. Затем обрабатывали срезы тканей, погружали в парафин и нарезали на фрагменты толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (НЕ) для изучения. Оба препарата (нечетные и четные срезы) использовали для определения среднего уровня опухоли у каждого животного.

Морфометрический анализ проводили для тканей легкого, окрашенных гематоксилином и эозином (НЕ), взятых у обозначенных животных в Lovelace Biomedical. Цельные препараты (2 для каждого животного, которые содержали поперечные срезы левого легкого в целом) сканировали на Hamamatsu Nanozoomer. Анализировали сканы при помощи программного обеспечения Visiopharm Integrator System (VIS, версия 2017.2.5.3857). Статистический анализ состава участка опухоли проводили при помощи GraphPad Prism 5 (версия 5.04).

Компьютерный количественный анализ изображений, разработанный для оценки площади опухоли в каждом срезе, проводили для тканей левого легкого в целом с использованием сканов цельных препаратов. Приложение Visiopharm для количественной оценки площади метастазов в легких использовали для проведения различий между опухолевыми клетками и нормальной тканью легкого на основании плотности клеток, интенсивности окрашивания и размера и интенсивности окрашивания. Следует отметить, что указанная количественная оценка, основанная на простом окрашивании Н&Е, не идеальна (т.е. она не позволяет в полной мере проводить различия между типами опухолевых тканей, умершими и жизнеспособными опухолевыми тканями, а некоторые нормальные структуры могут быть отнесены к опухолевым). Ценность использования этого способа для срезов Н&Е заключается в том, что он обеспечивает объективную количественную оценку опухоли. Определяют площадь легкого в целом, а затем указывают площадь, занятую структурами, отнесенными к метастазам, в процентах от общей площади. Вручную можно вносить незначительные поправки анализируемой площади для того, чтобы исключить структуры, не относящиеся к легким, и включить в анализ легкое в целом. Другие изменения не вносят в неавтоматическом режиме, чтобы обеспечить постоянство условий для всех групп и устранить возможность появления субъективности. При наличии возможности разработка специфических иммуногистохимических красителей для идентификации только опухолевой ткани могла бы повысить специфичность данного анализа.

Сбор и обработка проб крови

Кровь, собранную во время вскрытия, обрабатывали для получения плазмы путем центрифугирования при скорости как минимум 1300g при 4°С в течение 10 минут. Образцы плазмы хранили при температуре от -70 до -90°С до проведения анализа или отправки спонсору.

Результаты

Клинические отклонения, выживаемость и масса тела.

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Клинические отклонения, связанные с моделью, включали кожную сыпь и затрудненное дыхание. Согласно наблюдениям одно животное имело грыжу в верхнем отделе желудка. В соответствии с рекомендацией ветеринара животное переводили в группу 1 (контроль без лечения), в которой ингаляционное воздействие не проводили, таким образом, необходимость использования ограничителей трубок для воздействия отсутствовала.

На ФИГ. 8 показана средняя масса тела на протяжении исследования. На ФИГ. 9 показано изменение в процентах средней массы тела относительно дня 0. Во всех группах прирост массы тела происходил примерно с одной скоростью по ходу исследования.

В.в. инъекции ABRAXANE^® в хвостовую вену

В группе, в которой вводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, средняя доза на 22, 29 и 36 день, составляла 4,94, 4,64 и 4,46 мг/кг, соответственно.

Воздействие частицами паклитаксела

Концентрация аэрозоля и осажденная доза

Общую концентрацию аэрозоля и концентрацию паклитаксела в аэрозоле измеряли путем отбора проб на фильтрах GF/A во время каждого воздействия. Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 270,51 мкг/л и 263,56 мкг/л, соответственно. Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 244,82 мкг/л и 245,76 мкг/л, соответственно. Уровень кислорода и температуру отслеживали во время каждого воздействия.

Дозы вычисляли с учетом средней концентрации паклитаксела в аэрозоле, самого последнего измеренного среднего значения массы тела в группе, предполагаемой осажденной фракции 10% и продолжительности воздействия 33 или 65 минут. Во время четырехнедельного периода лечения средняя осажденная доза в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 0,655 мг/кг и 0,640 мг/кг (1,28 мг/кг/неделя), соответственно.

Средняя осажденная доза в группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и в группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 1,166 мг/кг и 1,176 мг/кг (2,352 мг/кг/неделя), соответственно.

Размер частиц (ММАД и GSD)

Распределение частиц по размерам определяли по массовому медианному аэродинамическому диаметру (ММАД) и геометрическому стандартному отклонению (GSD) для каждого аэрозоля состава частиц паклитаксела с использованием каскадного импактора. Было определено, что для аэрозоля 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела средний ММАД составлял 2,01 мкм, a GSD 1,87.

Наблюдения во время вскрытия и масса органов

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Во время вскрытия у животных из каждой группы имелись бледно-коричневые узелки в легких и/или красные или бледно-коричневые пятна в легких. Другие единичные отклонения включали брюшную грыжу у одного животного и узелки в перикарде у другого животного. Другие отклонения согласно макроскопической оценке во время вскрытия отмечены не были. У одного животного отсутствовали видимые опухоли (узелки) во время вскрытия.

Данные о массе органов отдельных животных графически показаны на ФИГ. 10, ФИГ. 11 и ФИГ. 12. У животных, которым вводили ABRAXANE^®, масса легких, отношение массы легких к МТ и отношение массы легких к массе мозга были значительно ниже по сравнению с контролем без лечения. В группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, измеренная масса была схожей с группой ABRAXANE^®, а масса легких и отношение массы легких к массе мозга были значительно ниже по сравнению с контролем без лечения. Группы, в которых вводили низкую дозу один раз в неделю, низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю и высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, в целом, имели схожие значения средней массы легкого и отношения.

Морфометрия

Во всех группах, в которых проводили лечение, наблюдалось снижение среднего уровня опухоли в легких по сравнению с контрольной группой; тем не менее, статистически значимые различия между группами отсутствовали. Также отсутствовали статистически значимые различия между в.в. введением ABRAXANE^® и любым режимом введения состава частиц паклитаксела в отношении площади опухоли при изучении поперечных срезов легкого. У животных во всех группах наблюдалась высокая изменчивость площади опухоли, что характерно для данной модели. Эти данные следует рассматривать в комбинации с другими показателями опухолевой нагрузки в легких в рамках данной модели, включая отношение массы легких к массе мозга, и результатами гистопатологии для получения конечной оценки. Важно отметить, что морфометрический анализ и гистопатологическую оценку проводили для фиксированных тканей легкого, полученных в левой доле, при этом другие анализы тканей легких можно проводить для замороженных тканей из долей правого легкого. Средняя площадь опухоли показана на ФИГ. 13 и ФИГ. 14.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПАТОЛОГИИ

По результатам изучения препаратов выявленных популяций неопластических клеток патолог определил, что: (1) общая опухолевая нагрузка аденокарциномы (недифференцированной и дифференцированной) в легких незначительно снижалась во всех группах, в которых проводили лечение (группа 2 (1,7), группа 3 (1,8), группа 4 (1,7), группа 5 (1,6) и группа 6 (1,6)), по сравнению с контрольной группой 1 без лечения (2,1). (2) популяция зародышевых опухолевых клеток уменьшалась, о чем свидетельствовало снижение тяжести в группе 3 (0,3), группе 4 (0,3), группе 5 (0,2) и группе 6 (0,2) по сравнению с соответствующей контрольной группой 1 (0,9) и группой 2 (1,0), и (3) происходила регрессия опухоли в группе 3 (0,6), группе 4 (1,0), группе 5 (0,8) и группе 6 (1,0) по сравнению с соответствующей контрольной группой 1 (0,0) и группой 2 (0,1). Частота и тяжесть признаков опухолевой нагрузки приведены в таблице 7 и на ФИГ. 15. Микрофотографии препаратов показаны на ФИГ. 16-50.

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ ОБЗОР МИКРОФОТОГРАФИЙ НА ФИГ. 16-50

Общие наблюдения:

Контроль: Большое количество жизнеспособных опухолей с пролиферирующими клетками и отсутствие инфильтрации иммунных клеток.

ABRAXANE^® в.в.: Много жизнеспособных опухолевых образований, незначительный лимфоцитарный ответ и небольшая регрессия опухоли.

Состав частиц паклитаксела, 1 раз в неделю, высокая доза: Исчезновение опухоли в легких, незначительное число оставшихся жизнеспособных опухолевых клеток. Оставшиеся образования вероятно включают инфильтрат иммунных клеток и фиброз.

Состав частиц паклитаксела, 2 раза в неделю, низкая доза: Небольшое количество опухолевых узелков, окруженных инфильтратом иммунных клеток, включающим макрофаги и мононуклеарные клетки.

Состав частиц паклитаксела, 2 раза в неделю, высокая доза: Несколько опухолевых узелков с инфильтратами иммунных клеток, фиброз стромы на месте опухоли.

Высокоактивную инфильтрацию мононуклеарных противоопухолевых клеток наблюдали в легких животных, которым вводили состав частиц паклитаксела путем ингаляции. Так как в используемой модели отсутствуют Т-клетки, то клетки вероятно представляют собой В-клетки или ЕК-клетки или оба указанных типа клеток. В-клетки отвечают за выработку антител и могут участвовать в уничтожении опухолевых клеток благодаря антителозависимой клеточной цитотоксичности (антитела связываются с клетками, экспрессирующими рецепторы Fc, и усиливают киллерную активность этих клеток). ЕК-клетки представляют собой врожденные лимфоидные клетки, которые важны для уничтожения опухолевых клеток. У пациентов с опухолями активность ЕК-клеток снижается, в результате чего становится возможен рост опухоли. Наряду с Т-клетками, ЕК-клетки являются мишенями для некоторых ингибиторов контрольных точек, которые могут повышать их активность.

Благодаря использованию разнообразных поверхностных рецепторов, которые могут доставлять активирующие или ингибирующие сигналы, ЕК-клетки могут отслеживать клетки в соответствующей микросреде и определять, является ли клетка болезненной (опухолевой или инфицированной вирусом) и следует ли ее уничтожать, используя механизм цитотоксичности.

Цитотоксичность и хемотаксис ЕК-клеток могут быть модифицированы в результате множества патологических процессов, включающих опухолевые клетки и продукты обмена веществ в этих клетках. В ответ на определенные сигналы их функции увеличиваются или усиливаются. В ответ на некоторые патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП) благодаря использованию различных толл-подобных рецепторов (TLR); ЕК-клетки могут повышать выработку цитокинов и/или цитолитическую активность. Цитокины, включая IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 и IFN α/β, также могут модифицировать активность ЕК-клеток. ЕК-клетки являются не простыми клетками, которые действуют только как цитолитические эффекторы и могут уничтожать различные опухолевые клетки-мишени; напротив они представляют собой разнородную популяцию, которая может тонко подстраивать свою активность в различных окружающих условиях.

Как видно, опухолевая нагрузка значительно снижается в легких животных после лечения составом частиц паклитаксела и является более низкой по сравнению с нагрузкой после в.в. введения ABRAXANE^®. Таким образом, локализованное введение паклитаксела в виде состава частиц паклитаксела обеспечивает дополнительную активность. Вероятно, это связано с увеличенной продолжительностью воздействия химиотерапевтического средства и интенсивной инфильтрацией клеток в участок опухоли. Этот указанный последним вид ответа вероятно зависит от плотности дозы (фактическая доза и частота введения).

Наблюдения на конкретных микрофотографиях

ФИГ. 16: Субъект 1006 (контроль) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. При слабом увеличении (2х) показано обычное распределение недифференцированных плеоморфных крупных анапластических опухолевых клеток, расположенных внутри альвеолярного пространства или выстилающих альвеолярных перегородки. Основная часть клеток не имеет признаков аденокарциномы и присутствует в слоях, прилегающими к опухоли. Многие клетки имеют базофильно окрашенную цитоплазму, но при этом другие являются крупными анапластичными и имеют бледное амфофильное окрашивание. Следует отметить наличие существовавшей до этого резидентной популяции макрофагов и отсутствие регрессии опухоли.

ФИГ. 30: Субъект 2003 (в.в. ABRAXANE^®) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-1, регрессия-1. При слабом увеличении (4х) показано обычное распределение опухолевых образований, главным образом, по периферии, а также несколько более мелких растущих опухолевых образований, заполняющих альвеолярное пространство. Опухолевые клетки являются плеоморфными, крупными, анапластичными и имеют бледное амфофильное окрашивание, различные образования, соответствующие как недифференцированной, так и дифференцированной формам аденокарциномы. Признаки регрессии опухоли наблюдаются по периферии образования и характеризуются, главным образом, инфильтрацией макрофагов.

ФИГ. 36: Субъект 2010 (в.в. ABRAXANE^®) аденокарцинома-3, зародышевые клетки-1, регрессия опухоли-0. При слабом увеличении (2х) показано обычное распределение крупного растущего опухолевого образования, заполняющего большинство альвеолярных пространств, а также неопластические клетки на периферии. Большинство опухолевых клеток, главным образом, являются недифференцированными, плеоморфными, крупными, анапластичными и имеют бледное амфофильное окрашивание. Зародышевые клетки имеют более мелкую овальную форму и цитоплазму с более интенсивным базофильным окрашиванием, а также различные пузырьковидные ядра и умеренный или выраженный анизокариоз. Инфильтрирующие воспалительные клетки представляют собой, главным образом, нейтрофилы и макрофаги. На данном изображении отсутствуют признаки регрессии опухоли.

ФИГ. 39: Субъект 4009 (инг. состав частиц паклитаксела, 1 раз/неделя, высокая доза) аденокарцинома-0, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. При слабом увеличении (2х) показано обычное распределение ранее заселенных опухолевых образований, наличие нескольких небольших участков фиброзной соединительной ткани, центральная коллагеновая строма и фиброциты присутствуют в периферических альвеолярных пространствах, а уплотненные альвеолярные перегородки подтверждают регрессию опухоли. Кроме того, большинство альвеолярных пространств заполнено инфильтратом макрофагов и лимфоцитов, что является еще одним подтверждением регрессии опухоли.

ФИГ. 42: Субъект 5010 (инг. состав частиц паклитаксела, 2 раза/неделя, низкая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-3. При слабом увеличении (2х) показано обычное распределение ранее заселенных опухолевых образований. Регрессирующие образования имеют разный, но мелкий размер, и распределены случайным образом. Согласно наблюдениям фиброзная соединительная ткань заполняет/заменяет альвеолярные пространства, что позволяет предположить наличие очагов регрессии аденокарциномы. Острый некроз, фиброзный остов соединительной ткани, смешанная инфильтрация макрофагами, гигантскими клетками и лимфоцитами в эпителии, а также вокруг стромы являются признаками регрессии опухоли.

ФИГ. 46: Субъект 6005 (инг. состав частиц паклитаксела, 2 раза/неделя, высокая доза) аденокарцинома-1, зародышевые клетки-0, регрессия опухоли-4. При слабом увеличении (2х) показано обычное распределение ранее заселенных опухолевых образований в нескольких небольших участках фиброзной соединительной ткани, которая заполняла/заменяла альвеолярные пространства, что позволяет предположить наличие очагов ранних инфильтратов в клетках аденокарциномы. Регрессия опухоли подтверждается фиброзом ранее заселенных опухолевых образований, наличием центрального коллагенового ядра стромы и фиброзной соединительной ткани на периферии, заполняющей/заменяющей альвеолярные пространства, уплотнением перегородок, а также наличием фиброцитов, заполняющих альвеолярное пространство, инфильтрованное лимфоцитами и макрофагами.

ВЫВОДЫ

Сто двадцать семь (127) бестимусных крыс NIH-rnu облучали рентгеновским излучением для подавления иммунной системы в день -1. В день 0 животным вводили опухолевые клетки Calu3 путем внутритрахеальной (в.т.) инсталляции. Животных выдерживали в течение трехнедельного периода роста. На третьей неделе животных случайным образом путем стратификации по массе тела распределяли по группам. Начиная с 4 недели, животным из группы 2 внутривенно (в.в.) вводили один раз в неделю дозу ABRAXANE^® (5 мг/кг) на 22, 29 и 36 день. Животным из групп 3 и 4 вводили один раз в неделю (по понедельникам) путем ингаляции (инг.) низкую (0,5 мг/кг) и высокую (1,0 мг/кг) целевую дозу состава частиц паклитаксела, соответственно. Животным из групп 5 и 6 вводили два раза в неделю (по понедельникам и четвергам) путем ингаляции низкую (0,50 мг/кг) и высокую (1,0 мг/кг) целевую дозу состава частиц паклитаксела, соответственно. Животных из группы 1 оставляли без лечения в качестве контроля нормального роста опухолевых клеток. Всех животных умерщвляли на 8 неделе.

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Клинические отклонения, связанные с моделью, включали кожную сыпь, затрудненное дыхание. Во всех группах прирост массы тела происходил примерно с одной скоростью во время исследования.

Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 270,51 мкг/л и 263,56 мкг/л, соответственно. Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю и высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 244,82 мкг/л и 245,76 мкг/л, соответственно.

Дозы вычисляли с учетом средней концентрации паклитаксела в аэрозоле, самого последнего измеренного среднего значения массы тела в группе, предполагаемой осажденной фракции 10% и продолжительности воздействия 33 или 65 минут. Во время четырехнедельного периода лечения средняя осажденная доза для грызунов из группы, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и группы, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 0,655 мг/кг и 0,640 мг/кг (1,28 мг/кг/неделя), соответственно. Средняя осажденная доза для грызунов из группы, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, и группы, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела два раза в неделю, составляла 1,166 мг/кг и 1,176 мг/кг (2,352 мг/кг/неделя), соответственно. В группе, в которой проводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, средняя доза на 22, 29 и 36 день, составляла 4,94, 4,64 и 4,46 мг/кг, соответственно.

Во время запланированного вскрытия у большинства животных из каждой группы имелись бледно-коричневые узелки в легких и/или красные или бледно-коричневые пятна в легких. Другие единичные отклонения включали брюшную грыжу у одного животного и узелки в перикарде у другого животного. Другие отклонения согласно макроскопической оценке во время вскрытия отмечены не были.

У животных, которым вводили ABRAXANE^®, масса легких, отношение массы легких к МТ и отношение массы легких к массе мозга были значительно ниже по сравнению с контролем без лечения. В группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела один раз в неделю, значения массы были схожими с группой ABRAXANE^® и были значительно более низкими по сравнению с массой легких и отношением массы легких к массе мозга для контроля без лечения.

По сравнению с группой положительного контроля 1 и группой сравнения 2, в которой вводили ABRAXANE^®, наблюдался терапевтический эффект, определяемый понижением отношения масса легкого/масса мозга и понижением общей опухолевой нагрузки в легких и отсутствием явных нежелательных явлений. В гистологическом анализе опухолевой нагрузки в легких после лечения ингаляционным составом частиц паклитаксела было показано уменьшение опухолевого образования, уменьшение популяции зародышевых опухолевых клеток и повышение регрессии опухоли. Активная инфильтрация мононуклеарных клеток наблюдалась в легких животных, которым вводили состав частиц паклитаксела путем ингаляции. Так как в используемой модели отсутствуют Т-клетки, то клетки вероятно представляют собой В-клетки или ЕК-клетки. Было сделано предположение о том, что локализованное воздействие частицами паклитаксела в предположительно более высокой концентрации влияло на опухоли и приводило к изменению среды и инфильтрации мононуклеарных клеток в легкие.

Пример 4: Исследование FY 17-008В - Исследование фармакокинетики частиц паклитаксела

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

Девяноста (90) самцам крыс линии Спраг-Доули проводили воздействие дозой «клинического стандарта» паклитаксела, ABRAXANE^® (частицы паклитаксела, связанные с белком, для суспензии для инъекции, или наб-паклитаксел), путем внутривенной (в.в.) инъекции болюса или состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 или 1,0 мг/кг) путем однократной ингаляции только через нос. По три животных (n=3) умерщвляли в десять (10) временных точек от 0,5 до 336 часов после воздействия и собирали кровь (плазма) и ткани легких. Проводили некомпартментный анализ (NCA) плазмы и тканей легких для определения периода времени после воздействия, в течение которого количество паклитаксела поддается обнаружению, в каждой группе. У животных, на которых исследовали временную точку 336 часов, из всех групп собирали правые легкие для анализа жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХМС), в то же время проводили перфузию левых легких в 10% нейтральном забуференном формалине (NBF) и хранили для возможного проведения гистопатологии. Для проведения сравнительной гистопатологии трех запасных животных (контрольные животные, которых ранее не использовали в опытах) умерщвляли через 336 часов и собирали легкие таким же способом. Легкие, собранные у животных, на которых изучали все другие временные точки, замораживали по отдельности для анализа ЖХМС.

Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили низкую дозу и высокую дозу состава частиц паклитаксела, составляла 85,64 мкг/л и 262,27 мкг/л, соответственно. Средняя концентрация аэрозоля во время воздействия находилась в пределах ±15% от целевой концентрации аэрозоля, что было ожидаемым для ингаляционного воздействия путем распыления. Распределение частиц по размерам определяли по ММАД (GSD) для каждого аэрозоля состава частиц паклитаксела с использованием каскадного импактора. Было определено, что для аэрозолей 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл состава частиц паклитаксела ММАД (GSD) составлял 1,8 (2,0) мкм и 2,3 (1,9) мкм, соответственно.

Осажденную дозу паклитаксела при использовании низкой дозы вычисляли с учетом средней концентрации паклитаксела в аэрозоле 85,64 мкг/л, средней массы тела в группе в день 0 420,4 г, предполагаемой осажденной фракции 10% и продолжительности воздействия 65 минут; было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,38 мг/кг в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела. В группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела, средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 262,27 мкг/л, средняя масса тела по группе в день 0 составляла 420,5 г, предполагаемая осажденная фракция составляла 10% и продолжительность воздействия составляла 65 минут; было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 1,18 мг/кг. Измеренные диапазоны уровня кислорода и температуры составляла 19,8%-20,9% и 20,7°С-20,8°С, соответственно, для воздействия 6,0 мг/мл составом частиц паклитаксела. В случае воздействия 20,0 мг/мл составом частиц паклитаксела измеренное значение уровня кислорода составляло 19,8% во время воздействия, а температура находилась в диапазоне 20,7°С-20,8°С.

В группе, в которой вводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, значения массы тела в 1 день находились в диапазоне от 386,1 до 472,8 г, что давало дозы ABRAXANE^® 2,6-3,2 мг/кг, а средняя доза в группе составляла 2,9 мг/кг.

Во всех группах во время исследования наблюдался прирост массы тела. Клинические отклонения во время исследования отмечены не были. Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Всех животных умерщвляли в пределах временного диапазона, предполагаемого для каждой временной точки.

Во время вскрытия примерно у половины животных из каждой группы имелись минимальные или небольшие бледно-коричневые участки в легких. Эти отклонения часто связывают с ингаляционным воздействием. Другие встречавшиеся у отдельных животных отклонения включали укрупнение сердца (животное №2016) и укрупнение трахеобронхиальных лимфатических узлов. Другие отклонения согласно макроскопической оценке во время вскрытия отмечены не были. В гистопатологии было показано, что легкие и трахея, собранные у крыс, которым вводили исследуемое изделие и стандарт, имели нормальное состояние и в рамках данного исследования были неотличимы от соответствующих органов крыс, которых ранее не использовали в исследованиях. При умерщвлении через 336 часов после введения дозы на срезах легких животных, которым проводили лечение в указанном исследовании, накопление макрофагов, которое часто наблюдается в исследованиях ингаляции в качестве нормального физиологического ответа на осаждение экзогенных веществ в легких, не происходило.

Был разработан NCA для количественной оценки воздействия (площадь под кривой зависимости концентрации от времени [AUC]), времени достижения максимальной концентрации (T_max), максимальной концентрации (C_max) и, если это было возможно, кажущегося конечного периода полувыведения (Т_1/2).

Было сделано предположение о том, что новый состав частиц паклитаксела позволит повысить удерживание паклитаксела в тканях легких и понизить системное воздействие. Период полувыведения в плазме в системном кровотоке оставался неизменным для исследуемых составов/доз, а период полувыведения в тканях легких увеличивался в случае состава частиц паклитаксела, доставляемого путем ингаляции. Уровень в тканях легких (AUC, нормированная по дозе) увеличивался при доставке состава частиц паклитаксела путем ингаляции.

В совокупности данные указывают на значительное удерживание частиц паклитаксела в тканях легких при доставке путем ингаляции по сравнению с в.в. «клиническим стандартом».

ЗАДАЧИ

Задачей данного исследования являлось определение фармакокинетики состава частиц паклитаксела по сравнению с дозой клинического стандарта паклитаксела. Данные пилотного исследования FY 17-008А фармакокинетики (РК), полученные в Lovelace Biomedical (пример 1 выше) при использовании состава частиц паклитаксела, вводимого путем ингаляции, указывали на то, что время удерживания в тканях легких превышало 168 часов. В данном исследовании животным вводили одну низкую или высокую дозу состава частиц паклитаксела путем ингаляции только через нос или одну дозу клинического стандарта паклитаксела путем внутривенной (в.в.) инъекции в хвост и оценивали уровень в плазме и тканях легких для временных точек от 0,5 до 336 часов.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Исследуемая система

Вид/линия: крысы Спраг-Доули

Возраст животных в начале исследования: 8-10 недель

Диапазон массы тела в начале исследования: 345-447 г

Число исследуемых животных/пол: 95 самцов (90 исследуемых животных и 5 запасных)

Источник: Charles River Laboratories (Kingston, NY)

Идентификация: Отметка перманентным маркером на хвосте

Состав ABRAXANE^®

В качестве клинического стандарта использовали в.в. состав лекарственного продукта ABRAXANE^® (производитель: Celgene Corporation, Summit, NJ; №партии: 6111880). Лекарственный продукт перерастворяли до 5,0 мг/мл в солевом растворе (производитель: Baxter Healthcare, Deerfield, 11..; №партии: Р357889) в день введения и хранили согласно инструкциям производителя.

Состав частиц паклитаксела

6,0 мг/мл состав частиц паклитаксела для групп, в которых проводили воздействие низкой дозой, и 20,0 мг/мл состав частиц паклитаксела для групп, в которых проводили воздействие высокой дозой, получали согласно рекомендациям спонсора. В частности, частицы паклитаксела перерастворяли в 1% полисорбате 80. Встряхивали пробирку вручную для смачивания всех частиц. Добавляли дополнительное количество 0,9% хлорида натрия для инъекции (до целевой концентрации) и встряхивали пробирку вручную еще минуту.

Продолжали встряхивать до исчезновения крупных комков и подходящей дисперсности суспензии. Полученные составы оставляли по меньшей мере на 5 минут для снижения уровня воздуха/пены в пробирке, после чего помещали ее в небулайзер для распыления. Конечный 6,0 мг/мл состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 2 часов после перерастворения. Конечный 20,0 мг/мл состав выдерживали при комнатной температуре и распыляли в течение 30 минут после перерастворения.

Дизайн эксперимента

Животным из группы 1, как показано в таблице 8, вводили одну дозу «клинического стандарта» (концентрация состава: 5 мг/мл, целевая доза: 5,0 мг/кг массы тела; целевой объем дозы: не более 250 мкл) ABRAXANE^® (частицы паклитаксела, связанные с белком, для суспензии для инъекции) путем в.в. инъекции в хвостовую вену. Животным из групп 2 и 3, как показано в таблице 9, проводили воздействие аэрозолями состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 или 1,0 мг/кг) путем однократной ингаляции только через нос (инг.) согласно дизайну исследования, описанному ниже. По три животных (n=3) умерщвляли через 0,5 (±10 минут), 6 (±10 минут), 12 (±10 минут), 24 (±30 минут), 48 (±30 минут), 72 (±30 минут), 120 (±30 минут), 168 (±30 минут) 240 (±30 минут) и 336 (±30 минут) часов после воздействия для сбора крови (плазма) и тканей легких. Проводили некомпартментный анализ плазмы и тканей легких для определения периода времени после воздействия, в течение которого количество паклитаксела поддается обнаружению, для каждой группы, в которой вводили дозу. У животных, на которых исследовали временную точку 336 часов, во всех группах собирали правые легкие и замораживали по отдельности для анализа ЖХМС, при этом проводили перфузию левых легких в 10% нейтральном забуференном формалине (NBF) и хранили до возможного проведения гистопатологии. Для проведения сравнительной гистопатологии трех запасных животных (контрольные, животные, которых ранее не использовали в опытах) также умерщвляли в момент, соответствующий временной точке 336 часов, и собирали легкие таким же способом.

Самцов крыс линии Спраг-Доули (возраст 6-8 недель) получали в Charles River Laboratories (Kingston, NY) и выдерживали на карантине в течение 14 дней. По завершении карантина взвешивали животных, а затем проводили рандомизацию по массе и распределяли в исследование. Животных идентифицировали по отметкам на хвостах и карточкам на клетках. Контролировали расход воды, освещение, влажность и температуру и отслеживали согласно соответствующим СОП. Крысам предоставляли доступ к стандартному корму для грызунов ad libitum в периоды, когда воздействие не проводили.

Масса тела и ежедневные наблюдения

Массу тела определяли во время рандомизации, ежедневно во время исследования и после умерщвления. Персонал центра сравнительной медицины и животных ресурсов (CMAR) два раза в день наблюдали животных на предмет наличия клинических признаков отклонений, агонии или гибели.

В.в. введение ABRAXANE^® - Инъекции в хвостовую вену

ABRAXANE^® (концентрация: 5 мг/мл, целевая доза: 5,0 мг/кг массы тела; объем дозы: не более 250 мкл) вводили животным из группы 1 путем однократной в.в. инъекции в хвостовую вену.

Введение частиц паклитаксела - Воздействие аэрозолем путем введения только через нос

Подготовка

Подготовку животных к трубкам для воздействия путем введения только через нос проводили в течение периода вплоть до 70 минут. Проводили три сеанса подготовки в течение трех дней перед воздействием, первый сеанс длился 30 минут, второй 60 минут, а третий 70 минут. Животных тщательно обследовали во время периодов подготовки и воздействия, чтобы убедиться, что они не испытывали ничего серьезнее мгновенного расстройства.

Система воздействия

Аэрозоли получали с использованием двух компрессионных струйных небулайзеров Hospitak, как показано на ФИГ. 7 (см. пример 3), под давлением в небулайзере 20 psi (140 кПа). 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл суспензионные составы частиц паклитаксела использовали для воздействия низкой дозой и высокой дозой, соответственно. Оба состава распыляли по отдельности и вводили через линию доставки в камеру для воздействия с 32 отверстиями. Ингаляционное воздействие для грызунов проводили по 65 минут. Аэрозоль суспензии частиц паклитаксела получали на установке из двух компрессионных струйных небулайзеров Hospitak (использовали до 40 (±1) минут), которую затем заменяли на вторую установку из двух небулайзеров Hospitak на оставшийся период воздействия. Отслеживали уровень кислорода и температуру во время каждого ингаляционного воздействия.

Отслеживание концентрации

Так же, как в примере 1

Определение размера частиц

Так же, как в примере 1

Определение дозы

Так же, как в примере 1

Умерщвление и вскрытие

Животных умерщвляли в моменты времени, указанные выше в дизайне исследования, путем интраперитонеальной (и.п.) инъекции раствора для умерщвления.

Временная точка 336 часов (и запасные животные, n=3): Во время вскрытия собирали кровь (плазма) путем сердечной пункции в пробирки K₂-ЭДТА. Определяли массу легких в целом, отделяли левое легкое и заполняли нейтральным забуференным формалином и хранили для возможного проведения гистопатологии. Доли правого легкого взвешивали по отдельности и мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре от -70 до -90°С для биоаналитических исследований. Кроме того, квалифицированный персонал, осуществлявший вскрытие, проводил полную макроскопическую оценку. Оценивали внешние поверхности тела, пазухи и содержимое черепной, грудной и брюшной полостей. Описывали очаги поражения и указывали при помощи словарных терминов их морфологию, количество, форму, цвет, структуру и тяжесть.

Все другие временные точки: Во время вскрытия собирали кровь (плазма) путем сердечной пункции в пробирку K₂-ЭДТА. Определяли массу легких в целом, взвешивали доли легких по отдельности и мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре от -70 до -90°С для биоаналитических исследований. Кроме того, квалифицированный персонал, осуществлявший вскрытие, проводил полную макроскопическую оценку. Оценивали внешние поверхности тела, пазухи и содержимое черепной, грудной и брюшной полостей. Описывали очаги поражения и указывали при помощи словарных терминов их морфологию, количество, форму, цвет, структуру и тяжесть.

Гистопатология

Нарезали доступные зафиксированные ткани. Зафиксированные доли левого легкого нарезали для получения типичных срезов для определения токсикологической патологии, включавших дыхательные пути. Ткани обрабатывали обычным способом, погружали в парафин, нарезали на фрагменты ~4 мкм, закрепляли и окрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е) для микроскопического исследования. Один патолог, специализирующийся на токсикологической патологии, проводил субъективную полуколичественную классификацию результатов по шкале 1-5 (1 = минимальный, 2 = низкий, 3 = умеренный, 4 = выраженный, 5 = тяжелый). Компьютерное программное обеспечение/базу данных Provantis™ (Instem LSS Ltd., Staffordshire, England) использовали для получения, описания и анализа данных гистопатологии.

Сбор и обработка проб крови

Кровь, собранную во время вскрытия, обрабатывали для получения плазмы путем центрифугирования со скоростью как минимум 1300g при 4°С в течение 10 минут. Образцы плазмы хранили при температуре от -70 до -90°С до проведения анализа.

Биоаналитические исследования

Кровь из системного кровотока (в виде плазмы в пробирках K₂-ЭДТА) и ткани легких исследовали в анализе жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХМС) для оценки зависимости количества паклитаксела от времени. Вкратце, в исследовании используют анализ сверхэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии (СВЭЖХ-МС/МС) для количественной оценки уровня паклитаксела.

Экстрагировали образцы способом осаждения белка и разделяли путем обращенно-фазовой хроматографии. Количественную оценку проводили по калибровочной кривой, полученной для матричных растворов.

Проводили некомпартментный анализ данных для концентрации в плазме и тканях легких. Определяли как минимум C_max, T_max, AUC и кажущийся терминальный период полувыведения. На основании полученных данных можно определять и другие параметры.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Клинические отклонения, выживаемость и масса тела

Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Всех животных умерщвляли в пределах временного диапазона, предполагаемого для каждой временной точки.

Во время исследования клинические отклонения отмечены не были.

На ФИГ. 51 и ФИГ. 52 показаны средние значения массы тела на протяжении исследования и среднее изменение в процентах относительно 1 дня. Во всех группах во время исследования прирост массы происходил примерно с одной скоростью.

В.в. инъекции ABRAXANE^® в хвостовую вену

В группе, в которой вводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, масса тела в 1 день находилась в диапазоне от 386,1 до 472,8 г, соответственно дозы ABRAXANE^® составляли 2,6-3,2 мг/кг. Средняя доза (стандартное отклонение) составляла 2,9 (0,16) мг/кг. Отдельные дозы ABRAXANE^® показаны в таблице 9.

Воздействие частицами паклитаксела

Концентрация аэрозоля и размер частиц

См.: Результаты - Концентрация аэрозоля и размер частиц в примере 2.

Уровень кислорода и температура

См: Результаты - Уровень кислорода и температура в примере 2.

Осажденная доза

См: Результаты - Осажденная доза в примере 2.

Вскрытие

Все животные доживали до указанных для них моментов вскрытия. Во время вскрытия у животных из каждой группы имелись минимальные или небольшие бледно-коричневые участки в легких (таблица 10). Указанные отклонения часто связаны с ингаляционным воздействием. Другие единичные отклонения включали укрупнение сердца (животное №2016) и укрупнение трахеобронхиальных лимфатических узлов. Другие отклонения согласно макроскопической оценке во время вскрытия отмечены не были.

Гистопатология

Значительные отклонения в трахее и левом легком у животных, умерщвленных через 336 часов (~14 дней) после введения, которых изучали в данном исследовании, отсутствовали. По результатам микроскопической оценки ткани были неотличимы от «запасных» животных, которых использовали в качестве контроля.

Накопление макрофагов не наблюдалось в участках легких у животных, которым проводили введение, которых изучали в данном исследовании. Некоторое повышение уровня макрофагов в альвеолах часто встречается в исследованиях ингаляции как нормальный физиологический ответ на осаждение экзогенных веществ в легких (низкий уровень также может относительно часто наблюдаться у животных, которым не проводили лечение). Фактическое их отсутствие у животных, которым вводили дозу путем ингаляции, в данном исследовании может быть отчасти связано с относительно поздней временной точкой (336 часов или ~14 дней) после введения дозы, после которой проводили гистологию.

Биоанализ и моделирование PK

Результаты сведены ниже в таблицах 11, 12 и 13 и на ФИГ. 53 и ФИГ. 54. Моделировали данные зависимости средней концентрации паклитаксела в плазме от времени и средней концентрации паклитаксела в тканях легких от времени, как показано выше, результаты показаны в таблицах 14 и 15, соответственно.

Моделирование проводили при помощи WinNonlin для средней концентрации в плазме или тканях легких в каждый момент времени. Был разработан NCA для количественной оценки воздействия (площадь под кривой зависимости концентрации от времени [AUC]), времени достижения максимальной концентрации (T_max), максимальной концентрации (C_max) и, по мере возможности, кажущегося терминального периода полувыведения (Т_1/2).

Период полувыведения в плазме в системном кровотоке оставался неизменным для исследуемых составов/доз, а период полувыведения в тканях легких повышался при доставке состава частиц паклитаксела путем ингаляции. Уровень в тканях легких повышался (AUC, нормированная по дозе) при доставке состава частиц паклитаксела путем ингаляции.

В совокупности полученные данные указывают на значительное удерживание частиц паклитаксела в тканях легких при доставке путем ингаляции.

ВЫВОДЫ

Девяноста (90) самцам крыс линии Спраг-Доули проводили воздействие дозой «клинического стандарта» паклитаксела, ABRAXANE^® (частицы паклитаксела, связанные с белком, для суспензии для инъекции), путем внутривенной (в.в.) инъекции болюса или состава частиц паклитаксела (целевая доза 0,37 или 1,0 мг/кг) путем однократной ингаляции только через нос. По три животных (n=3) умерщвляли в десять (10) временных точек от 0,5 до 336 часов после воздействия и собирали кровь (плазма) и ткани легких. Проводили некомпартментный анализ плазмы и тканей легких для определения периода времени после воздействия, в течение которого количество паклитаксела поддавалось обнаружению, в каждой группе, в которой вводили дозу. У животных, на которых изучали временную точку 336 часов, во всех группах собирали правые легкие для анализа жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХМС), при этом проводили перфузию левых легких в 10% нейтральном забуференном формалине (NBF) и хранили для возможного проведения гистопатологии. Для проведения сравнительной гистопатологии также умерщвляли трех запасных животных (контрольные животные, которых ранее не использовали в опытах) через 336 часов и собирали легкие таким же способом. Животных, на которых изучали все другие временные точки, собирали легкие и замораживали по отдельности для анализа ЖХМС.

Во время ингаляционного воздействия средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле в группах, в которых вводили низкую дозу и высокую дозу состава частиц паклитаксела, составляла 85,64 мкг/л и 262,27 мкг/л, соответственно. Средняя концентрация аэрозоля во время воздействия находилась в пределах ±15% от целевой концентрации аэрозоля, что можно было ожидать для ингаляционного воздействия путем распыления. Распределение частиц по размерам определяли при помощи ММАД (GSD) для каждого аэрозоля состава частиц паклитаксела с использованием каскадного импактора. Было определено, что для аэрозолей 6,0 мг/мл и 20,0 мг/мл составов частиц паклитаксела ММАД (GSD) составлял 1,8 (2,0) мкм и 2,3 (1,9) мкм, соответственно.

Осажденную дозу паклитаксела вычисляли с учетом того, что средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 85,64 мкг/л, средняя масса тела в группе в день 0 составляла 420,4 г, предполагаемая осажденная фракция составляла 10%, а продолжительность воздействия составляла 65 минут; было определено, что средняя осажденная доза для грызунов составляла 0,38 мг/кг в группе, в которой вводили низкую дозу состава частиц паклитаксела. Было определено, что в группе, в которой вводили высокую дозу состава частиц паклитаксела, в которой средняя концентрация паклитаксела в аэрозоле составляла 262,27 мкг/л, средняя масса тела в группе в день 0 составляла 420,5 г, предполагаемая осажденная фракция составляла 10%, а продолжительность воздействия составляла 65 минут; средняя осажденная доза для грызунов составляла 1,18 мг/кг. Измеренные диапазоны уровня кислорода и температуры составляли 19,8%-20,9% и 20,7°С- 20,8°С, соответственно, для воздействия 6,0 мг/мл составом частиц паклитаксела. Для воздействия 20,0 мг/мл составом частиц паклитаксела измеренное значение уровня кислорода составляло 19,8% во время воздействия, а температура находилась в диапазоне 20,7°С- 20,8°С.

В группе, в которой вводили в.в. инъекции ABRAXANE^®, масса тела на 1 день находилась в диапазоне от 386,1 до 472,8 г, что давало дозу ABRAXANE^® 2,6-3,2 мг/кг, а средняя доза в группе составляла 2,9 мг/кг.

Во всех группах наблюдался прирост массы тела во время исследования. Клинические отклонения во время исследования отмечены не были. Все животные доживали до указанного для них времени вскрытия. Всех животных умерщвляли в пределах временного диапазона, предполагаемого для каждой временной точки.

Во время вскрытия примерно у половины животных из каждой группы наблюдалось минимальное или небольшое бледно-коричневое окрашивание в легких. Такие отклонения часто связаны с ингаляционным воздействием. Другие единичные отклонения включали укрупнение сердца (животное №2016) и укрупнение трахеобронхиальных лимфатических узлов. Другие отклонения согласно макроскопической оценке во время вскрытия отмечены не были. По результатам гистопатологии было показано, что легкие и трахея у крыс, которым вводили исследуемое изделие и стандарт, находились в пределах нормы и были неотличимы от органов крыс, которых ранее не использовали в опытах, в условиях данного исследования.

Был разработан NCA для количественной оценки воздействия (площадь под кривой зависимости концентрации от времени [AUC]), времени достижения максимальной концентрации (T_max), максимальной концентрации (C_max) и, по мере возможности, кажущегося терминального периода полувыведения (Т_1/2).

Claims

1. Способ лечения опухоли легких, включающий внутрилегочное введение субъекту с опухолью легких эффективного количества композиции, содержащей частицы таксана, для лечения опухоли легких, где таксан включает паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль, где частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана и имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 3 мкм, где частицы таксана имеют удельную площадь поверхности (УПП) от 27 м²/г до 60 м²/г, где частицы таксана присутствуют в суспензии, содержащей частицы таксана и фармацевтически приемлемый носитель, где суспензию превращают в аэрозоль для введения, и образующиеся капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от примерно 0,5 мкм до примерно 6 мкм, где указанное внутрилегочное введение включает распыление посредством небулайзера, и указанное распыление приводит к внутрилегочной доставке субъекту капель аэрозоля суспензии частиц таксана.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 2 мкм.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 1,2 мкм.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что образующиеся капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от примерно 1 мкм до примерно 3 мкм.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что суспензия дополнительно содержит полисорбат, где полисорбат присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1,5% (об./об.).

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный фармацевтически приемлемый носитель представляет собой солевой раствор.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный полисорбат представляет собой полисорбат 80.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный таксан присутствует в суспензии в концентрации от примерно 1 мг/мл до примерно 40 мг/мл.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные частицы и их суспензии не содержат покрытия и липиды, полимеры, белки, полиэтоксилированное касторовое масло и глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиленгликоля.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что суспензия дополнительно содержит полисорбат, где полисорбат присутствует в суспензии в концентрации от примерно 0,01% (об./об.) до примерно 1,5% (об./об.).

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный фармацевтически приемлемый носитель содержит солевой раствор.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют среднюю объемную плотность от примерно 0,050 г/см³ до примерно 0,12 г/см³.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные частицы таксана имеют кристаллическую форму.

14. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанные частицы таксана или их суспензии не содержат покрытия и липиды, полимеры, белки, полиэтоксилированное касторовое масло и глицериды полиэтиленгликоля, состоящие из моно-, ди- и триглицеридов и сложных моно- и диэфиров полиэтиленгликоля.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что частицы таксана сохраняются в участке опухоли легких после введения композиции и обеспечивают воздействие частиц таксана на опухоль в течение продолжительного периода времени, достаточного для стимуляции эндогенной иммунной системы субъекта, что приводит к выработке противоопухолевых клеток и инфильтрации противоопухолевых клеток в опухоль легких в количестве, достаточном для излечения опухоли.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный продолжительный период времени составляет по меньшей мере 4 недели.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанные противоопухолевые клетки содержат T-клетки, B-клетки или естественные клетки-киллеры (ЕКК) или их комбинации.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную композицию вводят за две или более отдельные операции введения.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанную композицию вводят один раз в неделю в течение по меньшей мере двух недель.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что указанную композицию вводят два раза в неделю в течение по меньшей мере одной недели, где две или более отдельные операции введения проводят с интервалом по меньшей мере один день.

21. Применение композиции, содержащей частицы таксана, для лечения опухоли легких, где таксан включает паклитаксел или его фармацевтически приемлемую соль, где частицы таксана содержат по меньшей мере 95% таксана и имеют средний размер (количественный) от 0,4 мкм до 3 мкм, где частицы таксана имеют удельную площадь поверхности (УПП) от 27 м²/г до 60 м²/г, где частицы таксана присутствуют в суспензии, содержащей частицы таксана и фармацевтически приемлемый носитель, где суспензии превращают в аэрозоль для введения, и образующиеся капли аэрозоля имеют массовый медианный аэродинамический диаметр (ММАД) от примерно 0,5 мкм до примерно 6 мкм, где указанное внутрилегочное введение включает распыление посредством небулайзера, и указанное распыление приводит к внутрилегочной доставке субъекту капель аэрозоля суспензии частиц таксана.