RU2773655C2

RU2773655C2 - Комбинация, содержащая перенаправляющие т-клетки многофункциональные антитела и модуляторы контрольных точек, и ее применения

Info

Publication number: RU2773655C2
Application number: RU2019119178A
Authority: RU
Inventors: Хорст ЛИНДХОФЕР; Петер РУФ
Original assignee: ЛИНДИС Байотек ГмбХ
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2022-06-07

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу инициации, усиления или пролонгирования противоопухолевого ответа, и может быть использовано в медицине. Способ, включающий введение модулятора иммунной контрольной точки через 12-96 часов после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, может быть использован в эффективной комбинированной терапии рака. 3 н. и 36 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к области иммунотерапии раковых заболеваний, в частности к применению перенаправляющих Т-клетку многофункциональных антител и модуляторов иммунных контрольных точек при терапевтическом/исцеляющем лечении раковых заболеваний.

Иммунотерапия приобретает все возрастающее значение в онкологии. Об этом свидетельствует выдача в последние годы разрешения на применение Yervoy® (ипилимумаб, фирма Bristol Myers Squibb), Opdivo® (ниволумаб, фирма Bristol Myers Squibb) и Keytruda® (пембролизумаб, фирма Merck). Эти моноклональные антитела (МАт) направлены либо против ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами белка 4 (CTLA-4), либо против белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1). Третьей подробно изученной раковой мишенью является лиганд белка запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-L1). Общим для всех этих мишеней является то, что они являются имеющими решающее значение негативными регуляторами Т-лимфоцитов, так называемыми ингибиторными молекулами иммунных контрольных точек. Иммунные контрольные точки представляют собой молекулы иммунной системы, в частности, находящиеся на определенных иммунных клетках, которые нуждаются в активации (стимуляторные или костимуляторные молекулы контрольных точек) или инактивации (ингибиторные молекулы контрольных точек) для инициации иммунного ответа. Многие из иммунных контрольных точек регулируются посредством взаимодействий между специфическими парами рецептор-лиганд. Часто различные виды рака защищают себя от иммунной системы, используя такие контрольные точки для того, чтобы избегать атаки иммунной системы.

Рецептор PD-1 экспрессируется на поверхности активированных Т-клеток и других иммунных клеток, таких как В-клетки. Его лиганды (PD-L1 и PD-L2) экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки или макрофаги, и других иммунных клеток. Связывание PD-L1 или PD-L2 с PD1 запускает сигнал в Т-клетке, который практически «выключает» Т-клетку или ингибирует ее. В непатологических условиях такое взаимодействие не позволяет Т-клеткам атаковать другие клетки организма. Однако раковые клетки часто используют преимущества этой системы и экспрессируют высокие уровни PD-L1 на своей поверхности. Тем самым раковые клетки способны «выключать» Т-клетки, экспрессирующие PD-1, и, следовательно, подавлять противораковый иммунный ответ. Ингибиторы PD1 и/или его лигандов, такие как ингибиторные/антагонистические моноклональные антитела, направленные против PD1 или его лигандов, могут усиливать иммунный ответ против раковых клеток и, следовательно, являются перспективными для лечения раков. Примеры ингибиторных/антагонистических моноклональных антител, направленных против PD1, разрешенных для применения в настоящее время, включают Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck). Другие ингибиторы пути PD1, которые в настоящее время находятся на фазе II и/или III клинических испытаний, включают пидилизумаб (МАт, ингибирующее PD1; фирма CureTech/Medivation), дурвалумаб (МАт, ингибирующее PD-L1; фирма MedImmune/AstraZeneca), авелумаб (МАт, ингибирующее PD-L1; фирма Merck Serono/Pfizer) и атезолимаб (МАт, ингибирующее PD-L1; фирма Roche).

Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb), другой разрешенный для применения модулятор иммунных контрольных точек, представляет собой ингибиторное/антагонистическое моноклональное антитело против ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами белка 4 (CTLA-4). CTLA4 экспрессируется также на поверхности активированных Т-клеток и его лиганды экспрессируются на поверхности профессиональных антигенпрезентирующих клеток. Предполагается, что CTLA-4 регулирует пролиферацию Т-клеток на ранней фазе иммунного ответа, прежде всего в лимфатических узлах, и воздействует на функцию регуляторных Т-клеток. Другим ингибитором CTLA-4, который в настоящее время находится на фазе II клинических испытаний, является, например, тремелимумаб (фирма MedImmune/AstraZeneca).

Связывание встречающихся в естественных условиях лигандов В7.1 и В7.2 cCTLA-4 и PD-L1/PD-L2 с PD-1 на активированных Т-клетках ингибирует позитивные сигналы, опосредуемые Т-клеточным рецептором (TCR) или костимуляторным рецептором CD28, и тем самым приводит к подавлению Т-клеточных ответов, что представляет собой естественный механизм преодоления чрезмерной иммунологической реакции. Интенсивные исследования и изучение в клинических условиях выявили, что блокирование молекул иммунных контрольных точек с помощью МАт приводит к продолжительной активации Т-клеток, которую можно использовать для борьбы с раком. Таким образом, опосредованное антителом блокирование иммунных контрольных точек представляет собой эффективный подход для усиления функций реактивных в отношении опухоли Т-клеток.

Поскольку антитела, ингибирующие (блокирующие) иммунные контрольные точки, осуществляют действие отчасти посредством неспецифической активации иммунной системы, имеются многочисленные подходы, предусматривающие их применение в комбинации с другими противораковыми режимами. Для снижения опухолевой нагрузки антитела, ингибирующие (блокирующие) иммунные контрольные точки, применяют в комбинации с химиотерапией. Недостатком такого подхода является то, что сильнодействующие химиотерапевтические агенты оказывают отрицательное воздействие на функцию иммунной системы, снижая эффективность иммунотерапевтических лекарственных средств. В альтернативном варианте антитела, ингибирующие (блокирующие) иммунные контрольные точки, применяют в комбинации с другими ингибиторами иммунных контрольных точек. Примером является комбинированная терапия с использованием Yervoy® и Opdivo®, разрешенная FDA в 2015 г. для лечения пациентов с BRAF V600 дикого типа, неоперабельной или метастатической меланомы. Кроме того, в последнее время опубликованы данные об успешных результатах фазы 1b исследования комбинации дурвалумаба и тремелимумаба в случае немелкоклеточного рака легкого (Antonia, Scott и др., Safety and antitumour activity of Durvalumab plus Trenelimumab in non-small cell lung cancer: a multicentre, phase 1b study; Lancet Oncol., 5 февраля 2016 г., pii: S1470-2045(15)00544-6. doi: 10.1016/S1470-2045(15)00544-6. [электронная публикация до выхода в печать]).

Существует, однако, недостаток, заключающийся в существенном увеличении негативных побочных действий (Tsai и Daud, Nivolumab plus Ipilimumab in the treatment of advanced melanoma. Journal of Hematology & Oncology, 8, 2015, с. 123). Кроме того, комбинация модуляторов контрольных точек только друг с другом направленно воздействует на эндогенный опухольспецифический иммунитет, в частности потому, что отсутствует таргетирование опухольспецифических антигенов.

С учетом вышеизложенного существует необходимость в улучшенной иммунотерапии, предназначенной для применения для лечения ракового заболевания. Таким образом, задача настоящего изобретения заключалась в том, чтобы преодолеть указанные выше недостатки современных иммунотерапии рака и разработать новую комбинацию, предназначенную для применения при лечении ракового заболевания, которая повышает выживаемость пациентов, страдающих раком, и которая снижает риск побочных действий.

Эта задача решается с помощью объектов, представленных ниже в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения.

Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными методологиями, протоколами и реагентами, указанными в настоящем описании, которые могут варьироваться. Должно быть очевидно также, что применяемая в настоящем описании терминология не ограничивает объем настоящего изобретения, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные понятия, применяемые в контексте настоящего описания, имеют значения, хорошо известные обычному специалисту в данной области.

Ниже описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены в конкретных вариантах осуществления изобретения, однако, как должно быть очевидно, их можно объединять любым образом и в любом количестве с получением дополнительных вариантов осуществления изобретения. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления изобретения не должны рассматриваться как свидетельствующие о том, что настоящее изобретение ограничено только описанными вариантами осуществления изобретения. Следует понимать, что настоящее описание дано в качестве основы, и оно включает варианты осуществления изобретения, в которых объединены варианты осуществления изобретения, приведенные в недвусмысленном виде, с любым количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, подразумевается, что любые перестановки и комбинации всех указанных в настоящем описании элементов подпадают под объем настоящего описания, если из контекста не следует иное.

В контексте настоящего описания и в прилагаемой формуле изобретения, если из контекста не следует иное, понятие «содержать» и его вариации, такие как «содержит» и «содержащий» следует рассматривать как включающее указанный член, целое число или стадию, но это не исключает любые другие не указанные член, целое число или стадию. Понятие «состоит из» является конкретным вариантом понятия «содержит», исключая любой другой не указанный член, целое число или стадию. В контексте настоящего изобретения понятие «содержит» включает понятие «состоит из». Так, под понятие «содержащий» подпадает понятие «включающий», а также «состоящий», например, композиция «содержащая» X, может состоять только из Х или может включать что-то дополнительно, например, Х + Y.

Упоминание понятия в единственном числе и аналогичная ссылка, применяемая в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) подразумевает его упоминание, как в единственном числе, так и во множественном числе, если из контекста не следует иное или если это не противоречит контексту. Перечисление диапазонов значений в контексте настоящего описания предназначено только в качестве сокращенного метода индивидуального упоминания каждой индивидуальной величины, находящейся в указанном диапазоне. Если не указано иное, то каждая индивидуальная величина включена в настоящее описание, так, если бы она индивидуально упомянута в нем. Ничто из изложенного в спецификации не может толковаться как указывающее на какой-либо незаявленный элемент, имеющий важное значение для воплощения на практике изобретения.

Понятие «практически» не исключает «полностью», например, композиция, которая «практически свободна» от Y может быть полностью свободна от Y. При необходимости понятие «практически» может быть опущено в определении рассматриваемого понятия в настоящем изобретении.

Понятие «примерно» касательно численной величины x означает x ± 10%.

Комбинация, предназначенная для применения для терапевтического лечения ракового заболевания

Первым объектом настоящего изобретения является комбинация

(I) модулятора иммунных контрольных точек и

(II) перенаправляющего (выделенную) Т-клетку многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего:

(а) специфичность в отношении поверхностного Т-клеточного антигена,

(б) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена, и

(в) сайт связывания с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII с более высокой аффинностью, чем с человеческим FcγRIIb,

предназначенная для терапевтического лечения ракового заболевания.

Комбинация перенаправляющих Т-клетки многофункциональных антител (trAт) и модуляторов иммунных контрольных точек представляет собой новый подход к лечению рака, который объединяет несколько уникальных и комплементарных иммунотерапии:

Во-первых, снижаются негативные побочные действия. Блокада молекул ингибиторных контрольных точек приводит к сильной и неспецифической активации Т-клеток, которая может вызывать серьезные аутоиммунные нарушения, такие как колит, диарея, пневмония, гепатит и т.д. Комбинация с перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами позволяет «уводить» активированные Т-клетки от здоровой ткани и «приводить» их к сайту опухоли. Тем самым можно ингибировать или снижать аутоиммунные реакции.

Кроме того, сайт связывания Fc-рецептора перенаправляющих Т-клетки многофункциональных антител осуществляет рекрутинг и стимулирование вспомогательных клеток, таких как дендритные клетки (DC) или макрофаги, в результате активации Fc-рецепторов. Эти клетки создают дополнительные стимулы для Т-клеток, поглощают дебрис опухолевых клеток и презентируют происходящие из опухоли пептиды иммунной системе. Таким образом, перенаправляющие Т-клетки многофункциональные антитела не только обеспечивают зависящую от Т-клеток деструкцию опухоли, но индуцируют также долговременную опухольспецифическую иммунологическую память.

Кроме того, в результате продолжительной активации Т-клеток повышается терапевтическая эффективность. При создании настоящего изобретения было установлено, что активация Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами сопровождается повышением экспрессии молекул иммунных контрольных точек, которые - в свою очередь - осуществляют понижающую регуляцию активированных Т-клеток. Таким образом, использование в комбинации антител, блокирующих ингибиторные контрольные точки, приводит к устойчивой и пролонгированной активации Т-клеток, которая является благоприятной с точки зрения прямого противоопухолевого действия многофункциональных перенаправляющих Т-клетки антител.

Таким образом, как было установлено при создании настоящего изобретения, комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, обеспечивает, в частности, устойчивую активацию Т-клеток по сравнению с активацией Т-клеток, индуцированной (I) только модулятором иммунных контрольных точек и/или (II) только перенаправляющим Т-клетки многофункциональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

В целом, комбинация перенаправляющих Т-клетки многофункциональных антител с модуляторами иммунных контрольных точек существенно повышает терапевтическую противоопухолевую эффективность индивидуальных лекарственных средств (фиг. 1). Кроме того, она даже может снижать имеющие важное значение негативные побочные действия, обусловленные модуляторами иммунных контрольных точек.

Ниже подробно описаны компоненты комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, а именно, модулятор иммунных контрольных точек и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, содержащее специфичность против антигена Т-клеточной поверхности, специфичность против ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, и их предпочтительные варианты осуществления. Кроме того, ниже подробно описано применение для терапевтического лечения ракового заболевания и его предпочтительные варианты осуществления. Следует понимать, что (I) предпочтительный вариант комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, включает предпочтительный вариант модулятора иммунных контрольных точек, (II) предпочтительный вариант комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, включает предпочтительный вариант перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, содержащего специфичность против антигена Т-клеточной поверхности, специфичность против ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII; и (III) предпочтительный вариант комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, включает предпочтительный вариант применения для терапевтического лечения ракового заболевания. Более предпочтительный вариант комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, включает (I) предпочтительный вариант модулятора иммунных контрольных точек и предпочтительный вариант перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, содержащего специфичность против антигена Т-клеточной поверхности, специфичность против ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII; (II) предпочтительный вариант перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, содержащего специфичность против антигена Т-клеточной поверхности, специфичность против ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, и предпочтительный вариант применения для терапевтического лечения ракового заболевания; или (III) предпочтительный вариант модулятора иммунных контрольных точек и предпочтительный вариант применения для терапевтического лечения ракового заболевания. Наиболее предпочтительный вариант комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, включает (I) предпочтительный вариант модулятора иммунных контрольных точек; (II) предпочтительный вариант перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, содержащего специфичность против антигена Т-клеточной поверхности, специфичность против ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, и (III) предпочтительный вариант применения для терапевтического лечения ракового заболевания.

Следует понимать, что, как правило, предпочтительно, чтобы в комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, модулятор иммунных контрольных точек и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) были направлены против различных мишеней. Иными словами, предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) не содержит никакой специфичности или никакого связывающего сайта, таргетирующей/таргетирующего ту же самую молекулу иммунной контрольной точки (или ее лиганд), что и модулятор иммунных контрольных точек, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению. И также, иными словами, модулятор иммунных контрольных точек предпочтительно не модулирует молекулу иммунной контрольной точки (или ее лиганд), который таргетируется перенаправляющим Т-клетки многофункциональным антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), входящим в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению.

Перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело

В контексте настоящего описания (т.е. в настоящей заявке) под понятие «антитело» подпадают различные формы антител, предпочтительно моноклональные антитела, включая (но, не ограничиваясь только ими) полные антитела, фрагменты антител, человеческие антитела, химерные антитела, рекомбинантные антитела, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химически модифицированные антитела и генетически сконструированные антитела (вариантные или мутантные антитела), если они сохраняют характерные свойства, предлагаемые в изобретении. Предпочтительные примеры антител включают моноклональные антитела, биспецифические антитела, миниантитела, доменные антитела, синтетические антитела, миметики антител, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые антитела, конъюгаты антител, одноцепочечные антитела, производные антител, аналоги антител и их фрагменты соответственно. Более предпочтительными являются рекомбинантные антитела, прежде всего рекомбинантные моноклональные антитела. Кроме того, предпочтительно также, чтобы антитело представляло собой многоцепочечное антитело, т.е. антитело, которое содержит более одной цепи, что отличает его от одноцепочечного антитела. Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть полностью или частично происходить из человеческого организма или быть гуманизированным. Гуманизация антител известна в данной области (см., например, Shalaby и др., J. Exp. Med. 175, 1992, с. 217; Mocikat и др., Transplantation 57, 1994, с. 405). Предпочтительно, по меньшей мере (шесть) CDR (определяющие комплементарность участки) и/или каркасные области, более предпочтительно вариабельные области, происходят из организма человека и/или являются гуманизированными. Если не указано иное, то понятие «антитело» включает помимо антител, содержащих две полноразмерные тяжелые цепи и две полноразмерные легкие цепи, также их производные, варианты и фрагменты. В некоторых случаях «антитело» может включать меньшее количество цепей.

Предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В контексте настоящего описания под «моноклональным» антителом (МАт или МоАт) следует понимать антитело, продуцируемое идентичными иммунными клетками, которые являются клонами одной родительской клетки, в отличие от поликлональных антител, которые продуцируются несколькими различными иммунными клетками. Как правило, можно получать моноклональное антитело, которое специфически связывается с конкретной субстанцией.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «человеческое антитело» включает антитела, которые имеют вариабельные и константные области, имеющие происхождение из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М. А. и van de Winkel J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, сс. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных животных (например, мышах), которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител или выбранные антитела в отсутствии производства эндогенных иммуноглобулинов. Перенос массива генов иммуноглобулинов зародышей линии человека в указанных мышей с мутантной зародышевой линией должно приводить к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (см., например, Jakobovits А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature 362, 1993, сс. 255-258; Bruggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, с. 3340). Человеческие антитела можно получать также с использованием фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom Н. R. и Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, сс. 381-388; Marks J. D. и др., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597). Кроме того, для получения человеческих моноклональных антител можно применять методики, описанные у Cole с соавторами и Boerner с соавторами (Cole и др., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, изд-во Alan R. Liss, 1985, с. 77; и Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, сс. 86-95). В контексте настоящего описания понятие «человеческое антитело» включает также антитела, которые модифицированы, например, в вариабельной области или в Fc-области, для создания свойств, требуемых согласно изобретению.

В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие «рекомбинантное антитело» включает все антитела, которые не встречаются в природе, в частности, антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой, например, как СНО-клетка, или из клетки животного (например, мыши), или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектировали клетку-хозяина. Указанные рекомбинантные антитела имеют вариабельные и константные области в преобразованной форме по сравнению с встречающимися в естественных условиях антителами.

В контексте настоящего описания понятия «антигенсвязывающий фрагмент», «фрагмент» и «фрагмент антитела» применяют взаимозаменяемо для обозначения любого фрагмента антитела, предлагаемого в изобретении, который сохраняет специфическую связывающую активность антитела, предназначенного для применения согласно изобретению, в частности специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхностности и специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и имеет сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. Примеры фрагментов антител включают (но, не ограничиваясь только ими) sc (одноцепочечное) антитело, scFv-Fc, scFv-СН3, scDiabody-СН3, Diabody-СН3, минибоди, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, scDiabody-Fc, Diabody-Fc и тандем scFv-Fc (описанные, например, в Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J., Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106). Фрагменты антител, предлагаемые в изобретении, можно получать из антител с помощью методов, которые включают расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или путем расщепления дисульфидных связей с помощью химической реакции. Альтернативно этому, фрагменты антител можно получать путем клонирования и экспрессии части последовательностей тяжелых и/или легких цепей. Под объем изобретения подпадают также одноцепочечные Fv-фрагменты (scFv), включающие СН3-область, полученную из тяжелых и легких цепей антитела, предлагаемого в изобретении. Например, изобретение включает scFv-СН3 или scFv-Fc, содержащий CDR из антитела, предлагаемого в изобретении. Они включают также мономеры и димеры тяжелых и легких цепей, антитела с единичным доменом тяжелой цепи, антитела с единичным доменом легкой цепи, а также одноцепочечные антитела, например, одноцепочечный Fv, в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей соединены с помощью пептидного линкера. Фрагменты антител, предлагаемые в изобретении, как правило, являются многовалентными и могут содержаться в различных описанных выше структурах. Например, молекулы scFv можно синтезировать с получением трехвалентного «триабоди» или четырехвалентного «тетрабоди». Молекулы scFv предпочтительно включают домен Fc-области. Хотя в описании изобретения, включая формулу изобретения, в некоторых местах может недвусмысленно упоминаться антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы), фрагмент(ы) антитела, вариант(ы) и/или производное(ые) антител, следует понимать, что понятие «антитело» или «антитело, предлагаемое в изобретении» включает все категории антител, а именно антигенсвязывающий(ие) фрагмент(ы), фрагмент(ы) антитела, вариант(ы) и/или производное(ые) антител.

Антитело или его фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его фрагмент.

В контексте настоящего описания «перенаправляющее Т-клетки» антитело или его фрагмент представляет собой антитело или его фрагмент, которое содержит как специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхностности, так и специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена. Это позволяет антителу или его фрагменту перенаправлять Т-клетки на раковые клетки. При этом понятие «специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхностности» означает, в частности, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который распознает эпитоп антигена Т-клеточной поверхностности. Иными словами, выражение «специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхностности» означает, в частности, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания антигена Т-клеточной поверхностности. Соответственно выражение «специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена» означает, в частности, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который распознает эпитоп ассоциированного с раком и/или опухолью антигена. Иными словами, выражение «специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена» означает, в частности, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания ассоциированного с раком и/или опухолью антигена.

Важно отметить, что, в отличие от канонических («обычных») антител, обладающих только одной специфичностью, перенаправляющие Т-клетку антитела обладают способностью связываться по меньшей мере с двумя различными эпитопами, а именно, с одним эпитопом на раковой/опухолевой клетке и одним эпитопом на Т-клетке, «перенаправляя» тем самым Т-клетку на раковую/опухолевую клетку, что приводит к опосредованному Т-клеткой уничтожению клетки. Таким образом, перенаправляющие Т-клетку антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, обладают способностью перенаправлять Т-клетку, т.е. антитело, как правило, обладает способностью реактивировать опухольспецифические Т-клетки, находящиеся в анергическом состоянии, и/или направлять Т-клетки на требуемый антиген (что обеспечивается специфичностью антитела в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена).

В контексте настоящего описания «многофункциональное» антитело или его фрагмент, представляет собой антитело или его фрагмент, который/которое обладает способностью взаимодействовать одновременно с несколькими различными сайтами связывания. Поскольку антитело или его фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит (по меньшей мере) (а) специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхностности, (б) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и (в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, то «многофункциональное» антитело или его фрагмент представляет собой по меньшей мере «трехфункциональное» антитело или его фрагмент. Понятие «трехфункциональный» означает, что антитело или его фрагмент обладают способностью взаимодействовать одновременно с тремя различными сайтами связывания.

Как указано выше, перенаправляющие Т-клетки многофункциональные антитела содержат специфическое в отношении ассоциированного с опухолью антигена (ТАА) плечо, второе связывающееся плечо, специфическое в отношении антигена Т-клеточной поверхностности, такого как CD3, экспрессируемый на Т-клетках, и сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, который наиболее предпочтительно связывается с активирующими Fcγ-рецепторами, такими как FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, присутствующими на вспомогательных клетках, таких как макрофаги, дендритные клетки (DC), или на естественных клетках-киллерах (NK). Не вдаваясь в какую-либо теорию, при создании настоящего изобретения было выдвинуто предположение о том, что механизм действия перенаправляющих Т-клетки многофункциональных антител при осуществлении противоопухолевой терапии (Lindhofer H., Hess J., Ruf P., Trifunctional Triomab^® antibodies for cancer therapy, в: Bispecific antibodies, под ред. Kontermann R.E., изд-во Springer, Berlin, 2011, cc. 289-312) состоит в следующем: предполагается, что первая имеющая решающее значения стадия при таком механизме действия заключается в перенаправлении Т-клеток на опухоль посредством опосредованного биспецифическим антителом перекрестного сшивания ТАА с антигеном Т-клеточной поверхностности, таким как CD3. Опосредованный антителом контакт с антигеном Т-клеточной поверхностности, таким как CD3, в качестве компонента комплекса Т-клеточного рецептора, является первым мощным стимулом для активации Т-клеток независимым от главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) образом, которая сопровождается секрецией TNF-α и IFN-γ. Однако для физиологической активации Т-клеток требуется второй сигнал. Посредством FcγRI-, FcγRIIa- и/или FcγRIII-связывающего сайта перенаправляющих Т-клетки многофункциональных антител происходит дополнительное вовлечение привлекаемых опсонированными Т-клетками и опухолевыми клетками, а также провоспалительными цитокинами, FcγRI-, FcγRIIa- и/или FcγRIII-позитивных иммунных клеток. На опухолевой клетки формируется кластер иммунных клеток различного типа.

Предполагается, что формирование указанного трехклеточного комплекса, состоящего из опухолевых клеток, Т-клеток и FcγRI-, FcγRIIa- и/или FcγRIII-позитивных вспомогательных иммунных клеток, приводит к нескольким важным последствиям: во-первых, происходит взаимная стимуляция вспомогательных иммунных клеток и Т-клеток. Инициируемое перенаправляющим Т-клетки многофункциональным антителом взаимодействие Т-клеток и CD14-позитивных моноцитов приводит к повышающей регуляции CD83, CD86 и CD40 (Riechelmann H., Wiesneth M., Schauwecker P., Reinhardt P., Gronau S., Schmitt A., Schroen C., Atz J., Schmitt M., Adoptive therapy of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immune cells: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother 56, 2007, cc. 1397-1406; Stanglmaier M., Faltin M., Ruf P., Bodenhausen A., Schroder P., Lindhofer H., Bi20 (FBTA05), a novel trifunctional bispecific antibody (anti-CD20_anti-CD3), mediates efficient killing of B-cell lymphoma cells even with very low CD20 expression levels. Int J Cancer 123, 2008, сс. 1181-1189; Zeidler R., Mysliwietz J., Csanady M., Walz A., Ziegler I., Schmitt В., Wollenberg В., Lindhofer H., The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates activation of accessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumour cells. Br J Cancer 83, 2000, сс. 261-266). Таким образом, Т-клетки получают второй костимуляторный сигнал в форме взаимодействия CD40/CD40L или CD80-CD86/CD28. В результате этого они выраженно и физиологически значимо активируются, что характеризуется высоким уровнем экспрессии IL-2 и сильной пролиферацией, выявляемой путем обнаружения маркера пролиферации Ki-67. Кроме того, имеет место повышающая регуляция маркеров Т-клеточной активации CD25 и CD69 (Riechelmann H., Wiesneth M., Schauwecker P., Reinhardt P., Gronau S., Schmitt A., Schroen C., Atz J., Schmitt M., Adoptive therapy of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immune cells: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother 56, 2007, сс. 1397-1406). И наоборот, вспомогательные иммунные клетки стимулируются путем взаимодействия с Т-клетками и поперечного сшивания с FcgR. Указанная стимуляция проявляется в высоких измеренных уровнях провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и IL-12, которые в основном секретируются вспомогательными клетками. Кроме того, о перекрестном взаимодействии между вспомогательными клетками и Т-клетками свидетельствует повышенное высвобождение характерных для Th1-клеточного ответа цитокинов, прежде всего IL-2 и IFN-γ. В итоге таргетированные опухолевые клетки эффективно разрушаются в результате концентрированной атаки иммунных эффекторных клеток различных типов, что продемонстрировано в аллогенных условиях, а также в аутологичных человеческих системах ex vivo (Gronau S.S., Schmitt M., Thess В., Reinhardt P., Wiesneth M., Schmitt A., Riechelmann H., Trifunctional bispecific antibody-induced tumor cell lysis of squamous cell carcinomas of the upper aerodigestive tract. Head Neck 27, 2005, сс. 376-382). Некротизированные и апоптозные опухолевые клетки и частицы подвергаются фагоцитозу (Riesenberg R., Buchner A., Pohla H., Lindhofer H., Lysis of prostate carcinoma cells by trifunctional bispecific antibodies (alpha EpCAM_alpha CD3). J Histochem Cytochem 49, 2001, сс. 911-917; Zeidler R., Mysliwietz J., Csanady M., Walz A., Ziegler I., Schmitt В., Wollenberg В., Lindhofer H., The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates activation of accessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumour cells. Br J Cancer 83, 2000. сс. 261-266) и могут процессироваться и перезентироваться профессиональными антигенпрезентирующими клетками в условиях стимуляции, что является идеальной предпосылкой для противоопухолевой иммунизации.

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), представленное в настоящем описании, индуцирует повышенную экспрессию молекул иммунных контрольных точек, таких как CTLA-4 (ср. пример 2, фиг. 2). Таким образом, предпочтительно, чтобы входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) индуцировало повышенную экспрессию молекул иммунных контрольных точек, таких как CTLA-4.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой трехфункциональное антитело или его трехфункциональный антигенсвязывающий фрагмент, прежде всего биспецифическое трехфункциональное антитело или его биспецифический трехфункциональный антигенсвязывающий фрагмент.

В контексте настоящего описания под «трехфункциональными» антителами (trAт) понимают, прежде всего, специфический класс биспецифических антител, которые осуществляют одновременно рекрутинг и активацию Т-клеток и, прежде всего, вспомогательных иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, естественных клеток-киллеров (NK), и/или других экспрессирующих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII клеток, в таргетируемом раке/таргетируемой опухоли посредством их сайта связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. Так, трехфункциональные биспецифические антитела имеют два антигенсвязывающих сайта (т.е. два паратопа). Как правило, эти два антигенсвязывающих сайта (т.е. два паратопа) дают возможность антителам связываться с раковыми/опухолевыми клетками (антигенами поверхности раковых/опухолевых клеток) и с Т-клетками (антигены Т-клеточной поверхности). Одновременно, например, посредством их Fc-фрагмента, прежде всего, их сайта связывания Fcγ-рецептора, осуществляется рекрутинг позитивных вспомогательных клеток, например, моноцитов/макрофагов, естественных клеток-киллеров, дендритных клеток или других экспрессирующих Fcγ-рецептор клеток. Одновременная активация указанных различных классов эффекторных клеток приводит к эффективному уничтожению опухолевых клеток посредством различных механизмов, таких как фагоцитоз и опосредуемая перфорином цитотоксичность. Как правило, чистый эффект трехфункционального антитела заключается в связывании Т-клеток и, прежде всего, позитивных по Fcγ-рецептору вспомогательных клеток с опухолевыми клетками, что приводит к деструкции опухолевых клеток.

Трехфункциональные антитела вызывают удаление опухолевых клеток, в частности, посредством (I) антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности, (II) опосредованного Т-клетками цитолиза и (III) индукции противоопухолевого иммунитета. В отличие от этого, канонические (моноклональные и моноспецифические) антитела осуществляют свое действие фактически только посредством первого механизма действия. Кроме того, в отличие от канонических антител трехфункциональные антитела обладают более высоким цитотоксическим потенциалом и могут связываться даже с антигенами, которые характеризуются относительно слабой экспрессией. Таким образом, трехфункциональные антитела при их применении в эквивалентной дозе являются более эффективными (более чем в 1000 раз) в отношении элиминации опухолевых клеток по сравнению с каноническими антителами.

В целом, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, предназначенное для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой мультиспецифическое антитело. В контексте настоящего описания понятие «мультиспецифический» относится к способности связываться по меньшей мере с двумя различными эпитопами, например, на различных антигенах, таких как антиген Т-клеточной поверхности и раковый/опухолевый антиген. Таким образом, понятия типа «биспецифический», «триспецифический», «тетраспецифический» и т.д. относятся к количеству различных эпитопов, с которыми может связываться антитело. Например, канонические моноспецифические антитела IgG-типа имеют два идентичных эпитопсвязывающих сайта (паратопа) и поэтому могут связываться только с идентичными эпитопами (но не с различными эпитопами). В противоположность этому, мультиспецифическое антитело имеет по меньшей мере два различных типа паратопов и поэтому может связываться по меньшей мере с двумя различными эпитопами. В контексте настоящего описания понятие «паратоп» относится к эпитопсвязывающему сайту антитела. Кроме того, индивидуальная «специфичность» может относиться к одному, двум, трем или большему количеству идентичных паратопов в одном антителе (фактическое количество паратопов в индивидуальной молекуле антитела обозначают как «валентность»). Например, индивидуальное нативное антитело IgG-типа является моноспецифическим и двухвалентным, поскольку оно имеет два идентичных паратопа. Таким образом, мультиспецифическое антитело содержит по меньшей мере два (различных) паратопа. Так, понятие «мультиспецифические антитела» относится к антителам, которые имеют более одного паратопа и обладают способностью связываться с двумя или большим количеством различных эпитопов. Понятие «мультиспецифические антитела» включает, в частности, биспецифические антитела, указанные выше, но, как правило, включает также белок, например, антитело, каркасы, которые связываются, в частности, с тремя или большим количеством различных эпитопов, например, антитела с тремя или большим количеством паратопов.

В частности, мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать два или большее количество паратопов, при этом некоторые паратопы могут быть идентичными, но в результате все паратопы антитела принадлежат по меньшей мере к двум различным типам паратопов, и поэтому антитело имеет по меньшей мере две специфичности. Например, мультиспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать четыре паратопа, из которых каждые два паратопа являются идентичными (т.е. имеют одинаковую специфичность), и таким образом, антитело или его фрагмент является биспецифическим и четырехвалентным (два идентичных паратопа для каждой из двух специфичностей). Таким образом, понятие «одна специфичность» относится, в частности, одному или нескольким паратопам, характеризующимся одинаковой специфичностью (это, как правило, означает, что указанный(ые) один или несколько паратопов являются идентичными), и таким образом, «две специфичности» могут быть реализованы двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или большим количеством паратопов, если они относятся только к двум специфичностям. Наиболее предпочтительно мультиспецифическое антитело содержит один единственный паратоп для каждой (из по меньшей мере двух) специфичности, т.е. мультиспецифическое антитело содержит в целом по меньшей мере два паратопа. Например, биспецифическое антитело содержит один единственный паратоп для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело содержит в целом два паратопа. Предпочтительно также антитело содержит два (идентичных) паратопа для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело содержит в целом четыре паратопа. Предпочтительно антитело содержит три (идентичных) паратопа для каждой из двух специфичностей, т.е. антитело содержит в целом шесть паратопов.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой биспецифическое антитело или его биспецифический антигенсвязывающий фрагмент.

В контексте настоящего изобретения биспецифические антитела (БиАт) содержат (строго) две специфичности. Они являются наиболее предпочтительным типом мультиспецифических антител и их антигенсвязывающих фрагментов. В контексте настоящего изобретения биспецифическое антитело может представлять собой биспецифическое антитело любого формата, содержащее сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, например, антитело, описанное у Spiess С., Zhai Q. и Carter Р.J., Molecular Immunology 67, 2-15, сс. 95-106. Например, БиАт могут представлять собой полные антитела, такие как полные IgG-подобные молекулы, или их фрагменты, которые не представляют собой полные антитела, но сохраняют свойства антител. Они могут представлять собой малые рекомбинантные антитела, например, в формате тандемных одноцепочечных молекул вариабельных фрагментов (taFv), димерных антител (диабоди) (Db), одноцепочечных димерных антител (scDb) и различных других их производных (см., например, у Byrne Н. и др., Trends Biotech, 31 (11), 2013, сс. 621-632, где на фиг. 2 продемонстрированы различные форматы биспецифических антител). Несколько форматов БиАт обладают способностью перенаправлять эффекторные клетки к клеткам-мишеням, которые играют ключевую роль в развитии заболеваний. Например, несколько форматов БиАт могут перенаправлять эффекторные клетки к опухолевым клеткам, и были созданы различные конструкции БиАт для перенаправления клеток иммунной системы, например, путем связывания с Fc-рецепторами на поверхности эффекторных клеток и их запуска или путем связывания с комплексами Т-клеточного рецептора (TCR).

Предпочтительно мультиспецифическое, в частности, биспецифическое, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является по меньшей мере двухвалентным, т.е. имеет по меньшей мере два паратопа. Более предпочтительно мультиспецифическое, в частности, биспецифическое, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является двухвалентным, трехвалентным, четырехвалентным или шестивалентным. Еще более предпочтительно мультиспецифическое, в частности, биспецифическое, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является двухвалентным или четырехвалентным. Наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой биспецифическое двухвалентное антитело, т.е. антитело, которое имеет два паратопа: один, распознающий антиген на поверхности Т-клетки, и другой, распознающий ассоциированный с раком и/или опухолью антиген.

В отличие от понятия «мультиспецифический», например, биспецифический, триспецифический, тетраспецифический и т.п., понятие «многофункциональный», например, трехфункциональный и т.п., относится к количеству различных сайтов связывания в более общем смысле, а именно, оно включает любые сайты связывания (не только те, которые связываются с эпитопами). Таким образом, например, сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII «причисляют» к категории «многофункциональных», например, трехфункциональных и т.п., но не к категории «мультиспецифических», например, биспецифических, триспецифических, тетраспецифических и т.п. Например, трехфункциональное антитело может быть моно-, би- или триспецифическим - но в контексте настоящего изобретения (когда антитело имеет две специфичности и сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII), трехфункциональное антитело, как правило, является биспецифическим.

В контексте настоящего описания понятие «антиген» относится к субстанции любой структуры, которая служит мишенью для рецепторов адаптивного иммунного ответа, в частности, мишенью для антител, Т-клеточных рецепторов и/или В-клеточных рецепторов. Понятие «эпитоп», известное также как «антигенная детерминанта», является частью (или фрагментом) антигена, который распознается иммунной системой, в частности, антителами, Т-клеточными рецепторами и/или В-клеточными рецепторами. Так, один антиген имеет по меньшей мере один эпитоп, т.е. индивидуальный антиген имеет один или несколько эпитопов. Антиген может представлять собой (I) пептид, полипептид или белок, (II) полисахарид, (III) липид, (IV) липопротеин или липопептид, (V) гликолипид, (VI) нуклеиновую кислоту или (VII) низкомолекулярное лекарственное средство или токсин. Таким образом, антиген может представлять собой пептид, белок, полисахарид, липид, их комбинацию, включая липопротеины и гликолипиды, нуклеиновую кислоту (например, ДНК, siPHК, shPHК, антисмысловые олигонуклеотиды, ДНК-ловушку, плазмиду) или низкомолекулярное лекарственное средство (например, циклоспорин А, паклитаксел, доксорубицин, метотрексат, 5-аминолевулиновую кислоту), или любую их комбинацию. Предпочтительно антиген выбирают из (I) пептид а, полипептида или белка, (II) полисахарида, (III) липида, (IV) липопротеина или липопептида и (V) гликолипида, более предпочтительно антиген представляет собой пептид, полипептид или белок.

Антиген Т-клеточной поверхности

В контексте настоящего описания понятие «антиген Т-клеточной поверхности (его эпитоп)» относится к ассоциированному с поверхностью Т-клетки антигену (его эпитопу) или специфическому для поверхности Т-клетки антигену (которые обозначают также как «маркеры Т-клеточной поверхности»). Они представляют собой, в частности, молекулы «CD» (кластер дифференцировки), специфические для Т-клеток. Молекулы CD являются маркерами клеточной поверхности, которые можно применять для идентификации и характеризации лейкоцитов. Номенклатура CD была разработана и продолжает разрабатываться с 1982 г на основе изучения HLDA (дифференцировочные антигены лейкоцитов человека). Сведения о том, присутствует или нет определенная молекула CD на Т-клетках (и, следовательно, представляет ли она собой антиген Т-клеточной поверхностности в контексте настоящего изобретения) можно почерпнуть, например, из различных источников, известных специалисту в данной области, например, http://www.ebioscience.com/resources/human-cd-chart.htm, BD Bioscience's "Human and Mouse CD Marker Handbook" (можно получать из https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf) или из www.hcdm.org. Таким образом, примеры антигенов Т-клеточной поверхности включают, например, те (человеческие) CD-маркеры, которые указаны как присутствующие (позитивные) на Т-клетках в BD Bioscience's «Human and Mouse CD Marker Handbook» (можно получать из https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf) или других источников «CD marker charts».

Предпочтительно, антиген Т-клеточной поверхности выбирают из группы, состоящей из CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L и CD44. Это означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает (обладает способностью связываться с) эпитоп поверхностного антигена Т-клетки, выбранного из группы, которая состоит из CD3, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L и/или CD44. Указанная специфичность предпочтительно облегчает рекрутмент Т-клеток. В данном контексте CD является сокращенным обозначением «кластера дифференцировки» (кластер номенклатуры или классификации детерминант), описанного выше. В целом, он известен в качестве протокола, применяемого для идентификации и изучения молекул клеточной поверхности, которые представляют собой мишени для иммунофенотипирования клеток. С физиологической точки зрения молекулы CD действуют в качестве многочисленных путей, часто действующих через рецепторы или лиганды (молекула, которая активирует рецептор), важные для клетки. Как правило, инициируется каскад сигналов, изменяющий поведение клетки (см. раздел, посвященный передаче сигналов в клетке). Некоторые белки CD не играют роли в передаче сигналов в клетке, но обладают другими функциями, такими как клеточная адгезия. В настоящее время человеческие CD обозначены номерами вплоть до 364. Настоящее изобретение относится к ассоциированным с Т-клетками молекулам CD.

Предпочтительно, антиген Т-клеточной поверхности, специфичность в отношении которого содержит перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, не представляет собой CD28. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит никакой специфичности в отношении CD28/сайта связывания CD28.

Более предпочтительно антиген Т-клеточной поверхности представляет собой CD2 или CD3, наиболее предпочтительно антиген Т-клеточной поверхности представляет собой CD3. Это означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который более предпочтительно распознает эпитоп CD2 или CD3, наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который распознает эпитоп CD3. CD3 (кластер дифференцировки 3) представляет собой Т-клеточный корецептор, который способствует активации цитотоксических Т-клеток. CD3, как правило, представляет собой белковый комплекс и состоит из четырех различных цепей. У млекопитающих комплекс содержит CD3γ-цепь, CD3δ-цепь и две CD3ε-цепи. Эти цепи вступают в ассоциацию с молекулой, известной как Т-клеточный рецептор (TCR) и ζ-цепью (дзета-цепь), в результате чего генерируется сигнал активации в Т-лимфоцитах. Молекулы TCR, ζ-цепи и CD3 вместе образуют содержащий TCR комплекс.

Ассоциированный с раком и/или опухолью антиген

В контексте настоящего описания понятие «ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (его эпитоп)» относится к ассоциированному с раком антигену, специфическому для рака антигену, ассоциированному с опухолью антигену и/или опухольспецифическому антигену (его эпитопу). Указанные эпитопы/антигены, как правило, являются специфическими для определенного типа рака/опухоли или ассоциированы с ними. Сведения о приемлемых раковых/опухолевых эпитопах и антигенах можно почерпнуть, например, из баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, из базы данных, описанной у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde В., Peptide database: Т cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которой человеческие опухолевые антигены классифицированы в виде четырех основных групп на основе их схемы экспрессии, или базы данных «Tantigen» (TANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., которая разработана Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Конкретные примеры связанных с раком, в частности, связанных с опухолью или тканеспецифических антигенов, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают (но, не ограничиваясь только ими) следующие антигены: Epha2, Epha4, PCDGF, НААН, мезотелин; ЕРСАМ; NY-ESO-1, гликопротеин муцинов MUC1 и NIUC10 р5 (прежде всего мутантные версии), EGFR; раковый антиген 125 (СА 125), эпителиальный гликопротеин 40 (EGP40) (Kievit и др., Int. 1 Cancer 71, 1997, сс. 237-245), антиген плоскоклеточной карциномы (SCC) (Lozza и др., Anticancer Res. 17, 1997, сс. 525-529), катепсин Е (Mota и др., Am. J Pathol. 150, 1997, сс. 1223-1229), CDC27 (включая мутантную форму белка), антигены триозофосфатизомеразы, 707-АР, микобактериальный антиген А60 (Macs и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 1996, сс. 296-300), AFP, альфа(v)бета(3)-интегрин, ART-4, ASC, BAGE, β-катенин/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, СА 19-9 (Tolliver и O'Brien, South Med. J. 90, 1997, сс. 89-90; Tsuruta и др., Urol. Int. 58, 1997, сс. 20-24), СА125, CALLA, CAMEL, угольная ангидраза, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD44v3, CD44v6, CD47, CD52, CEA (Huang и др., ExperRev. Vaccines 1, 2002, сс. 49-63), c-erb-2, CT9, CT10, Сур-В, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek и др., Cell Growth Differ. 10, 1999, сс. 629-638; Carles-Kinch и др., Cancer Res. 62, 2002, сс. 2840-2847), EphA4 (Cheng и др., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 2002, сс. 75-85), ассоциированный с опухолью антиген Томсена-Фриденрейха (Dahlenborg и др., Int. J Cancer 70, 1997, сс. 63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GnT-V, GM1, GM2, GM3, gp100 (Zajac и др., Int. J Cancer 71, 1997, сс. 491-496), GT1b, GT3, GQ1, HAGE, HER2/neu, HLA, HLA-DR, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP-27, HSP-70, HSP70-2M, HSP-72, HSP-90, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, ингибиторы апоптоза, такие как сурвивин, антиген аденокарциномы KH-1 (Deshpande и Danishefsky, Nature 387, 1997, сс. 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, антиген Y Льюиса, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-1/Melan-A (Kawakami и Rosenberg, Int. Rev. Immunol. 14, 1997, cc. 173-192), MC1R, MCSP, MDM-2, MHCII, mTOR, миозин/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, нео-полиА-полимераза, NA88-A, NFX2, NY-ESO-1, NY-ESO-1a (CAG-3), PAGE-4, PAP, протеиназа 3 (Molldrem и др., Blood 88, 1996, cc. 2450-2457; Molldrem и др., Blood 90, 1997, cc. 2529-2534), Р15, p53, p97, p190, PD-L1, Pgp, PIK3CA, Pm1/RARα, PRAME, протеогликан, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, SSX2, SSX4 TEL/AML1, TPI/m, тирозиназа, TARP, теломераза, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT-1, антиген Wue, мишени на клеточной поверхности GC182, GT468 или GT512 и альтернативно транслируемые белки NY-ESO-ORF2 и CAMEL, полученные из генов NY-ESO-1 и LAGE-1.

Более предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER2/neu, СЕА, MAGE, протеогликана, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, альфа(v)бета(3)-интегрина, HLA, HLA-DR, ASC, угольной ангидразы, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30 CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gp100, тирозиназы, MUC-1, теломеразы, сурвивина, p53, CA125, антигена Wue, антигена Y Льюиса, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 и мишеней на клеточной поверхности GC182, GT468 или GT512. Это означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает (обладает способностью связываться с) эпитоп ассоциированного с раком и/или опухолью антигена, выбранного из группы, которая состоит из ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, MAGE, протеогликана, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, альфа(v)бета(3)-интегрина, HLA, HLA-DR, ASC, угольной ангидразы, GD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30 CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gp100, тирозиназы, MUC-1, теломеразы, сурвивина, р53, СА125, антигена Wue, антигена Y Льюиса, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 и мишеней на клеточной поверхности GC182, GT468 или GT512.

Особенно предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38, более предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38, еще более предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ЕрСАМ, HER2/neu, GD2 и CD20, и наиболее предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген представляет собой ЕрСАМ. Это означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает эпитоп ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38; более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает эпитоп ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 или CD33; еще более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает эпитоп ЕрСАМ, HER2/neu, GD2 или CD20; и наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит паратоп, который предпочтительно распознает эпитоп ЕрСАМ или GD2.

Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген, в отношении которого перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит специфичность, не представляет собой PD-L1. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит никакой специфичности в отношении PD-L1/сайта связывания PD-L1. В более общем смысле еще более предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген, в отношении которого перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит специфичность, не представляет собой молекулу иммунной контрольной точки и/или ее лиганд. Наиболее предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит никакой специфичности в отношении молекулы иммунной контрольной точки и/или ее лиганда /сайта связывания молекулы иммунной контрольной точки и/или ее лиганда.

Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой ЕрСАМ. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой GD2. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой Her2/neu. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой GD3. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой CD20. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой CD19. Предпочтительно ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой CD30. В альтернативном варианте ассоциированный с раком и/или опухолью антиген (или его эпитоп соответственно), который должен распознаваться антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предназначенным для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой СЕА, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA или RAS.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, связывается (I) с помощью его первой специфичности, например, с помощью его первого паратопа, с эпитопом антигена Т-клеточной поверхности, выбранного из группы, которая состоит из CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L и CD44, предпочтительно CD2 или CD3, более предпочтительно CD3, и (II) с помощью его второй специфичности, например, с помощью его второго паратопа, с ассоциированным с раком и/или опухолью антигеном, выбранным из группы, которая состоит из опухолевых антигенов ЕрСАМ, HER2/neu, СЕА, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PD-L1, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38.

Более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, связывается (I) с помощью его первой специфичности, например, с помощью его первого паратопа, с эпитопом антигена Т-клеточной поверхности, выбранного из группы, которая состоит из CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD28, CD40L и CD44, предпочтительно CD2 или CD3, более предпочтительно CD3, и (II) с помощью его второй специфичности, например, с помощью его второго паратопа, с ассоциированным с раком и/или опухолью антигеном, выбранным из группы, которая состоит из опухолевых антигенов ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно связывается с помощью его первой специфичности, например, с помощью первого паратопа, с эпитопом антигена Т-клеточной поверхности, предпочтительно CD3, и с помощью его второй специфичности, например, с помощью его второго паратопа, с ассоциированным с раком и/или опухолью антигеном, предпочтительно выбранным из группы, которая состоит из опухолевых антигенов ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, MAGE, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, GD2, CD19, CD20, CD30, CD33 и CD38, или с ганглиозидами GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD3, GT1b, GT3 или GQ1.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит первую специфичность в отношении CD3 и вторую специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена, выбранного из группы, которая состоит из ЕрСАМ, HER2/neu, CEA, GD2, CD19, CD20 и CD33.

Предпочтительно также ассоциированный с раком и/или опухолью антиген, в отношении которого перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат специфичность, не представляет собой CD19. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит ни какой-либо специфичности в отношении CD19/ни какой-либо сайт связывания CD19.

Предпочтительно также ассоциированный с раком и/или опухолью антиген, в отношении которого перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат специфичность, не представляет собой CD20. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит ни какой-либо специфичности в отношении CD20/ни какой-либо сайт связывания CD20.

Предпочтительно также ассоциированный с раком и/или опухолью антиген, в отношении которого перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат специфичность, не представляет собой СЕА. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не содержит ни какой-либо специфичности в отношении СЕА/ни какой-либо сайт связывания СЕА.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении ЕрСАМ (анти-CD3 × анти-ЕрСАМ). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении GD2 (анти-CD3 × анти-GD2). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении Her2/neu (анти-CD3 × анти-Her2/neu). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении GD3 (анти-CD3 × анти-GD3). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD20 (анти-CD3 × анти-CD20). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD19 (анти-CD3 × анти-CD19). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении СЕА (анти-CD3 × анти-СЕА). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении MAGE (анти-CD3 × анти-MAGE). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении VEGF (анти-CD3 × анти-VEGF). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении EGFR (анти-CD3 × анти-EGFR). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении mTOR (анти-CD3 × анти-mTOR). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении PIK3CA (анти-CD3 × анти-PIK3CA). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении RAS (анти-CD3 × анти-RAS).

Альтернативно этому, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD30 (анти-CD3 × анти-CD30). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD33 (анти-CD3 × анти-CD33). Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, может содержать одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении CD3 и одну специфичность, предпочтительно один паратоп, в отношении эпитопа белка Е арбовируса (анти-CD3 × анти-белок Е арбовируса).

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит две специфичности, выбранные из анти-ЕрСАМ × анти-CD3, анти-CD20 × анти-CD3, анти-HER2/neu × анти-CD3, анти-GD2 × анти-CD3 и анти-CD19 × анти-CD3. Более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит две специфичности, выбранные из анти-ЕрСАМ × анти-CD3, анти-GD2 × анти-CD3 и анти-HER2/neu × анти-CD3. Еще более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит две специфичности, выбранные из анти-ЕрСАМ × анти-CD3 и анти-GD2 × анти-CD3.

Сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. Более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRIIa. Сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, например, Fc-область, позволяет многофункциональному антителу осуществлять дополнительно рекрутмент клеток, экспрессирующих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, таких как FcγRI-, FcγRIIa- и/или FcγRIII-позитивные вспомогательные клетки, например, макрофаги, дендритные клетки, естественные клетки-киллеры (NK), и другие экспрессирующие FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII клетки. Поскольку многофункциональные антитела являются по меньшей мере биспецифическими (или мультиспецифическими) антителами, то они предпочтительно обладают способностью осуществлять одновременно рекрутмент (I) Т-клеток и (II) экспрессирующих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII клеток, таких как вспомогательные иммунные клетки, например, моноциты/макрофаги, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки или другие экспрессирующие FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII клетки, к (III) таргетируемым раковым/опухолевым клеткам и активацию указанных клеток. Одновременная активация указанных различных классов эффекторных клеток приводит к эффективному цитолизу опухолевых клеток посредством различных механизмов, таких, например, как фагоцитоз и опосредованная перфорином цитотоксичность. Как правило, чистым результатом воздействия предпочтительного многофункционального антитела, которое содержит сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, является связывание Т-клеток и позитивных по Fc-рецептору клеток с клетками-мишенями, например, опухолевыми клетками, что приводит к деструкции опухолевых клеток. Многофункциональные антитела инициируют элиминацию опухолевых клеток посредством (I) антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности, (II) опосредованного Т-клетками цитолиза клеток и (III) индукции противоопухолевого иммунитета.

В целом, Fc-гамма рецепторы (FcγR) представляют собой семейство Fc-рецепторов для IgG. Все Fcγ-рецепторы (FcγR) соответствуют суперсемейству иммуноглобулинов и представляют собой наиболее важные Fc-рецепторы с точки зрения индукции фагоцитоза опсонированных (помеченных) микроорганизмов. Это семейство включает несколько членов: FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32a), FcγRIIb (CD32b), FcγRIIIa (CD16a) и FcγRIIIb (CD16b) у человека и FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII и FcγRIV у мышей. Сложность семейства FcγR отражается в наличии четырех различных подклассов IgG у человека (IgG1-IgG4) и мышей (IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3), которые связываются с различной аффинностью и специфичностью с различными Fcγ-рецепторами (см. обзор Nimmerjahn F. и Ravetch J.V., Fcγ receptors as regulators of immune responses, Nat Rev Immunol 8, 2008, сс. 34-47). Традиционно FcγR-семейства классифицируют по уровню аффинности рецептора в отношении конкретных подклассов IgG и типу пути передачи сигнала, который они запускают, т.е. является он ингибирующим или активирующим. FcγRIIb является консервативным у мышей и человека, и он представляет собой единственный известный ингибирующий FcγR, он передает ингибирующие сигналы посредством ингибирующего мотива на основе тирозина иммунорецептора (ITIM), присутствующего в его цитоплазматической области. Все другие FcγR, за исключением человеческого GPI-заякоренного FcγRIIIb, активируют сигнальные пути посредством мотивов ITAM, присутствующих в их цитоплазматических областях. FcγRIa является единственным известным высокоаффинным FcγR у мышей и человека. Все другие FcγR обладают более низкой в 100-1000 раз аффинностью в диапазоне от низких до средних микромолярных концентраций и характеризуются специфичностью в отношении более широкого спектра подклассов IgG. Ингибирующий FcγRIIb представляет собой наиболее широко распространенный экспрессируемый FcγR, он присутствует практически на всех лейкоцитах за исключением NK-клеток и Т-клеток. И, наконец, было продемонстрировано, что активность IgG1 негативно регулируется ингибирующим FcγRIIb. Таким образом, предполагается, что ингибирующий FcγRIIb обладает «регуляторной» функцией в отношении IgG-ответов.

Человеческий FcγRIIa (Fc-рецептор IIa иммуноглобулина G (IgG); CD32a) представляет собой низкоаффинный рецептор для IgG, и он экспрессируется на макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах, тромбоцитах и дендритных клетках. FcγRIIa передает активирующий сигнал после связывания с лигандом и приводит к инициации воспалительных ответов, включая цитолиз, фагоцитоз, дегрануляцию и производство цитокинов. Известны два генетически детерминированных структурно различных аллотипа человеческого FcγRIIa: продукты FcγRIIa-R131 и аллели FcγRIIa-H131. Ответы FcγRIIa могут модулироваться сигналами совместно экспрессируемых ингибирующих рецепторов, таких как FcγRIIb (CD32b), при этом сила сигнала зависит от соотношения между уровнями экспрессии активирующих и ингибирующие рецепторов.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. Это означает, что если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается только с одним из FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII (т.е. (I) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRI, но не с FcγRIIa или FcγRIII; (II) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRIIa, но не с FcγRI или FcγRIII; или (III) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRIII, но не с FcγRI или FcγRIIa), то антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с указанным одним из человеческих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. Однако, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается более чем с одним из FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII (т.е. (I) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRI и FcγRIIa, но не с FcγRIII; (II) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRIIa и FcγRIII, но не с FcγRI; (III) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRI и FcγRIII, но не с FcγRIIa; или (IV) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с FcγRI, FcγRIIa и FcγRIII), то достаточно, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с одним из человеческих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. Однако, более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с двумя из человеческих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. Наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью со всеми тремя человеческими FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. В частности, (I) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент наиболее предпочтительно связывается с более высокой аффинностью с каждым из человеческих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb - и/или (II) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент наиболее предпочтительно связывается с более высокой аффинностью с каждым из указанных человеческих FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, для которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит сайт связывания, чем с человеческим FcγRIIb.

В целом, человеческие FcγRI, FcγRIIa и FcγRIII являются активирующими Fc-рецепторами, в то время как человеческий FcγRIIb представляет собой ингибирующий Fc-рецептор. Следовательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb, как указано выше, связывается скорее с активирующим Fc-рецептором, чем с ингибирующим Fc-рецептором, в результате чего происходит сдвиг соотношения активирование/ингибирование в сторону активирования и снижение регуляторного влияния ингибирующего FcγRIIb. Следовательно, усиливается фагоцитоз и непосредственный цитолиз.

В контексте настоящего описания «более высокая аффинность к человеческому FcγRIIa, чем к человеческому FcγRIIb» означает, в частности, что величина ЕС₅₀ (эффективная концентрация, при которой уровень сигналов связывания составляет половину от максимального) конкретного антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRIIa, меньше, чем величина ЕС₅₀ того же самого антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRIIb. Иными словами, требуется более низкая концентрация антитела (или его фрагмента) для обеспечения уровня связывания с FcγRIIa, составляющего половину от максимального, чем для достижения уровня связывания с FcγRIIb, составляющего половину от максимального. Например, по соотношению EC₅₀(FcγRIIb)/EC₅₀(FcγRIIa) можно определять соотношение FcγRIIa/FcγRIIb (которое >1, если антитело связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb). Величины ЕС₅₀ можно определять, например, с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Альтернативно этому, аффинности связывания антитела или его фрагмента можно определять также путем измерения методом поверхностного плазменного резонанса, например, как описано у Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527). В целом, аффинности связывания антитела или его фрагмента с FcγRIIa и FcγRIIb можно определять с помощью различных методов, известных специалисту в данной области. Однако, аффинности связывания конкретного антитела или его фрагмента с FcγRIIa и FcγRIIb определяют, прежде всего с помощью того же самого метода, которым определяют аффинности связывания FcγRIIa и FcγRIIb.

Вышеизложенное применимо также к выражению «более высокая аффинность к человеческому FcγRI, чем к человеческому FcγRIIb», которое означает, в частности, что величина ЕС₅₀ (эффективная концентрация, при которой уровень сигналов связывания составляет половину от максимального) конкретного антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRI, меньше, чем величина ЕС₅₀ того же самого антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRIIb. Иными словами, требуется более низкая концентрация антитела (или его фрагмента) для обеспечения уровня связывания с FcγRI, составляющего половину от максимального, чем для достижения уровня связывания с FcγRIIb, составляющего половину от максимального. Например, по соотношению EC₅₀(FcγRIIb)/EC₅₀(FcγRI) можно определять соотношение FcγRI/FcγRIIb (которое >1, если антитело связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, чем с человеческим FcγRIIb). Величины ЕС₅₀ можно определять, например, с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Альтернативно этому, аффинности связывания антитела или его фрагмента можно определять также путем измерения поверхностного плазменного резонанса, например, как описано у Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527). В целом, аффинности связывания антитела или его фрагмента с FcγRI и FcγRIIb можно определять с помощью различных методов, известных специалисту в данной области. Однако, аффинности связывания конкретного антитела или его фрагмента с FcγRI и FcγRIIb определяют, прежде всего с помощью того же самого метода, которым определяют аффинности связывания FcγRI и FcγRIIb.

Вышеизложенное применимо также к выражению «более высокая аффинность к человеческому FcγRIII, чем к человеческому FcγRIIb», которое означает, в частности, что величина ЕС₅₀ (эффективная концентрация, при которой уровень сигналов связывания составляет половину от максимального) конкретного антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRIII, меньше, чем величина ЕС₅₀ того же самого антитела или его фрагмента, характеризующая связывание с FcγRIIb. Иными словами, требуется более низкая концентрация антитела (или его фрагмента) для обеспечения уровня связывания с FcγRIII, составляющего половину от максимального, чем для достижения уровня связывания с FcγRIIb, составляющего половину от максимального. Например, по соотношению EC₅₀(FcγRIIb)/EC₅₀(FcγRIII) можно определять соотношение FcγRIII/FcγRIIb (которое >1, если антитело связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb). Величины ЕС₅₀ можно определять, например, с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Альтернативно этому, аффинности связывания антитела или его фрагмента можно определять также путем измерения поверхностного плазменного резонанса, например, как описано у Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527). В целом, аффинности связывания антитела или его фрагмента с FcγRIII и FcγRIIb можно определять с помощью различных методов, известных специалисту в данной области. Однако, аффинности связывания конкретного антитела или его фрагмента с FcγRIII и FcγRIIb определяют, прежде всего с помощью того же самого метода, которым определяют аффинности связывания FcγRIII и FcγRIIb.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRI, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, чем с человеческим FcγRIIb. Предпочтительно также антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRIII, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb. Наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит сайт связывания человеческого FcγRIIa, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb.

В частности, более высокое соотношение уровней связывания FcγRIIa/FcγRIIb значительно повышает антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (ADCP; Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527) и способствует активации и созреванию DC, оказывая позитивное воздействие на индукцию противоопухолевого иммунитета (Boruchov A.M., Heller G., Veri M.C., Bonvini E., Ravetch J.V., Young J.W., Activating and inhibitory IgG Fc receptors on human DCs mediate opposing functions. J Clin Invest 115, 2005, сс. 2914-2923; Kalergis A.M., Ravetch J.V., Inducing tumor immunity through the selective engagement of activating Fcgamma receptors on dendritic cells. J Exp Med 195, 2002, сс. 1653-1659). В частности, у Richards и др., 2008 продемонстрировано, что антитела, связывающиеся с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb, опосредуют более сильный фагоцитоз макрофагами клеток-мишеней, несущих на своей поверхности антитело (Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527). Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, которое/который связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb, инициирует более сильный фагоцитоз макрофагами опухолевых клеток. Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, связывается более высокой аффинностью с формой R131 человеческого FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb.

Примеры антител, обладающих более высокой аффинностью к человеческому FcγRIIa, чем к человеческому FcγRIIb, известны в данной области. Например, у Richards и др., 2008, описан вариант IgG1, который содержит замену G236A, приводящую к значительному увеличению соотношения FcγRIIa/FcγRIIb (Richards J.O., Karki S., Lazar G.A., Chen H., Dang W., Desjarlais J.R., Optimization of antibody binding to FcgammaRIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther 7, 2008, сс. 2517-2527). Кроме того, у Lindhofer и др., 2011 описаны антитела Triomab®, содержащие Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b, которые также характеризуются высокими соотношениями FcγRIIa/FcγRIIb (Lindhofer H., Hess J., Ruf P., Trifunctional Triomab^® antibodies for cancer therapy. в: Bispecific antibodies, под ред. Kontermann R.E., изд-во Springer, Berlin, 2011, cc. 289-312), и, таким образом, усиливают фагоцитоз макрофагами клеток-мишеней, несущих на своей поверхности антитело, и усиливают непосредственный цитолиз опухолевых клеток.

Хотя достаточно только сайта связывания FcγRI, FcγRIIa или FcγRIII, предпочтительно, чтобы антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержало/содержал Fc-фрагмент, в частности Fc-область.

В контексте настоящего описания понятие «Fc-фрагмент» относится к последовательности из участка тяжелой цепи иммуноглобулина, который начинается с шарнирной области, расположенной в обратном направлении относительно сайта расщепления папаином, и заканчивается на С-конце тяжелой цепи иммуноглобулина. В частности, «Fc-фрагмент» содержит сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. Предпочтительно, «Fc-фрагмент» содержит сайт связывания FcγRIIa. Однако, предпочтительно также, чтобы Fc-фрагмент мог обладать функциональностью, отличной от связывания с Fc-рецептором, например, связыванием с белком системы комплемента. В этом случае сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII может присутствовать в антителе отдельно от Fc-фрагмента. Следовательно, «Fc-фрагмент» может представлять собой полную Fc-область или ее часть (например, домен). Предпочтительно «Fc-фрагмент» обладает полной функциональностью полной Fc-области, например, включая связывание с Fc-рецептором и необязательно связывание с белком системы комплемента. Таким образом, антитело, предлагаемое для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержит полную Fc-область, где полная Fc-область содержит по меньшей мере шарнирный домен, СН2-домен и СН3-домен. Fc-фрагмент может содержать также одну или несколько аминокислотных инсерций, делеций или замен относительно встречающейся в естественных условиях Fc-области. Например, по меньшей мере один шарнирный домен, СН2-домен или СН3-домен (или их часть) может быть удален в результате делеций. Например, Fc-фрагмент может содержать или состоять из: (I) шарнирного домена (или его части), слитого с СН2-доменом (или его частью), (II) шарнирного домена (или его части), слитого с СН3-доменом (или его частью), (III) СН2-домена (или его части), слитого с СН3-доменом (или его частью), (IV) шарнирного домена (или его части), (V) СН2-домена (или его части), или (VI) СН3-домена или его части. Предпочтительно Fc-фрагмент содержит замену G236A.

Предпочтительно Fc-фрагмент/Fc-область антитела или его фрагмента связывается с позитивными по Fc-рецептору клетками, которые предпочтительно экспрессируют по меньшей мере FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, более предпочтительно по меньшей мере FcγRIIa.

Предпочтительно сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII (прежде всего Fc-фрагмент) в антителе (или его фрагменте), предназначенном для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой мышиный IgG2a/крысиный IgG2b. Это означает, что те участки антитела (или его фрагмента), которые участвуют в связывании с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, представляют собой последовательности мышиного IgG2a и/или крысиного IgG2b. В частности, антитело (или его фрагмент) содержит сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII (прежде всего Fc-фрагмент) мышиного IgG2a и/или крысиного IgG2b. Специалисту в данной области хорошо известно, что мышиный IgG2a и крысиный IgG2b содержат сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII (прежде всего Fc-фрагмент), поскольку хорошо известные антитела, разрешенные для применения для человека, такие как катумаксомаб, содержат Fc-фрагмент мышиного IgG2a/крысиного IgG2b. Следовательно, предпочтительной является комбинация как ((I) сайта связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего Fc-фрагмента, мышиного IgG2a и (II) сайта связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего Fc-фрагмента, крысиного IgG2b), например, присутствующая в гетерологичных антителах, представленных в настоящем описании. Наиболее предпочтительно антитело или его фрагмент содержит Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b. Это означает, в частности, что Fc-область антитела состоит из (I) Fc-области цепи мышиного IgG2a и (II) Fc-области цепи крысиного IgG2b. В частности, одна (тяжелая) цепь антитела содержит Fc-область тяжелой цепи мышиного IgG2a, а другая (тяжелая) цепь антитела содержит Fc-область тяжелой цепи крысиного IgG2b, и обе вместе образуют Fc-область антитела, представленную в настоящем описании (обозначена как «Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b»). Такие антитела характеризуются избирательно повышенным связыванием с активирующим FcγRIIa, но не с его ингибирующим партнером FcγRIIb (Lindhofer Н., Hess J., Ruf P., Trifunctional Triomab^® antibodies for cancer therapy, в: Bispecific antibodies, под ред. Kontermann R.E., изд-во Springer, Berlin, 2011, cc. 289-312).

Формат антитела

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению могут иметь любой формат, если только он включает по меньшей мере две описанные выше специфичности и описанный выше сайт связывания FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. В частности, понятие «многофункциональные антитела» предпочтительно включает «полные» антитела, такие как полные IgG-молекулы или IgG-подобные молекулы, при этом понятие «антигенсвязывающие фрагменты» предпочтительно относится к форматам небольших рекомбинантных молекул, таких как молекулы в виде тандемов одноцепочечных вариабельных фрагментов (taFv), диабоди (Db), одноцепочечные диабоди (scDb) и различные другие производные указанных молекул (например, описанные у Byrne Н. и др., Trends Biotech, 31 (11), 2013, сс. 621-632, где на фиг. 2 представлены различные форматы биспецифических антител, Weidle U.H. и др., Cancer Genomics and Proteomics 10, 2013, сс. 1-18, см., прежде всего, фиг. 1; и у Chan A.C. и Carter P.J., Nat Rev Immu 10, 2010, сс. 301-316, см., прежде всего, фиг. 3). Предпочтительные примеры включают (но, не ограничиваясь только ими) Triomab и квадромные антитела.

Так, антитело или структуру каркаса, или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению можно выбирать из группы, включающей Triomab, гибридную гибридому (квадрому), мультиспецифическую платформу на основе антикалина (фирма Pieris); диабоди; одноцепочечные диабоди; тандемные одноцепочечные Fv-фрагменты, тандемные антитела (TandAb), триспецифические Ат (фирма Affimed) (105-110 кДа); Darts (переориентирующие антитела с двойной аффинностью, фирма Macrogenics); производные многофункционального рекомбинантного антитела (110 кДа), молекулы на основе платформы «Dock and lock» (стыковка и замыкание), молекулы на основе платформы «Knob into hole» («выступ-во впадину», (KIH)), гуманизированное биспецифическое антитело в виде IgG (REGN1979) (фирма Regeneron); биспецифические антитела формата Mab² (фирма F-Star); DVD-Ig = молекула иммуноглобулина с двойными вариабельными доменами (фирма Abbvie), антитела в виде каппа-лямбда-цепей, TBTI = четырехвалентное биспецифическое тандемное антитело в виде Ig, и CrossMab.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, можно выбирать из биспецифических IgG-подобных антител (BsIgG), включающих CrossMab; DAF (два- в одном); DAF (четыре- в одном); DutaMab; DT-IgG; молекул на основе платформу «Knobs-in-holes» с общей LC-цепью; молекул, полученных сборкой по типу «knobs-in-holes», молекул с заряженной парой, молекул с обменом Fab-плечей; SEEDbody; Triomab; LUZ-Y; Fcab; κλ-антитела; и молекулы на основе ортогонального Fab-фрагмента (Orthogonal Fab). Указанные форматы биспецифических антител представлены и описаны, например, у Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J. Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106, см., прежде всего, фиг. 1 и соответствующее описание, например, на сс. 95-101.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, можно выбирать из дополненных антител в виде IgG с дополнительным антигенсвязывающим фрагментом, включая DVD-IgG, IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L,H)-Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; Zybody; и DVI-IgG (четыре- в одном). Указанные форматы биспецифических антител представлены и описаны, например, у Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J., Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106, см., прежде всего, фиг. 1 и соответствующее описание, например, на сс. 95-101.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, можно выбирать из фрагментов биспецифического антитела, включая sc-диабоди-СН3; диабоди-СН3; минибоди; TriBi-минибоди; scFv-СН3 KIH; scFv-KIH; Fab-scFv-Fc; четырехвалентное HCAb; scDiabody-Fc; диабоди-Fc; тандем scFv-Fc; и интрабоди. Указанные форматы биспецифических антител представлены и описаны, например, у Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J., Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106, см., прежде всего, фиг. 1 и соответствующее описание, например, на сс. 95-101.

В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, можно выбирать из конъюгатов биспецифического антитела, включая IgG-IgG и Cov-X-Body. Указанные форматы биспецифических антител представлены и описаны, например, у Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J., Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106, см., прежде всего, фиг. 1 и соответствующее описание, например, на сс. 95-101.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой биспецифическое трехфункциональное антитело.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, имеет IgG-подобный формат (антитело на основе IgG, обозначаемое также как антитело «IgG-типа»), где антитело, имеющее IgG-подобный формат, как правило, содержит две тяжелые цепи и две легкие цепи. В большинстве случаев в качестве типа антитела рассматривают иммуноглобулин G (IgG). В контексте настоящего описания под этим подразумевают белковый комплекс, состоящий из четырех пептидных цепей-двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, расположенных в виде Y-образной конструкции, типичной для мономеров антитела. Каждый IgG, как правило, имеет два антигенсвязывающих сайта (центра), которые могут быть различными или идентичными. IgG, на долю которого приходится примерно 75% антител в сыворотке человека, является наиболее распространенным типом антитела, присутствующим в кровотоке. Физиологически, молекулы IgG продуцируются и высвобождаются в плазму В-клетками.

Примеры антитела, имеющего IgG-подобный формат, включают квадрому и различные форматы IgG-scFv (см.: Byrne H. и др., Trends Biotech, 31 (11), 2013, сс. 621-632, фиг. 2А-Д), при этом предпочтительной является квадрома, которую предпочтительно создают путем слияния двух различных гибридом. В IgG-классе антитела предпочтительно могут представлять собой антитела на основе IgG1-, IgG2-, IgG3- или IgG4-подкласса, при этом предпочтительным является антитело на основе IgG1 (называемое также «IgG1-тип») или IgG2 (называемое также как «IgG2-тип»). Альтернативно этому основой многофункциональных антител или антигенсвязывающих фрагментов, предназначенных для применения согласно настоящему изобретению, может быть любой класс (например, IgA, IgG, IgM и т.д.) и подкласс иммуноглобулина (например, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т.д.).

Предпочтительные форматы биспецифических IgG-подобных антител включают, например, гибридную гибридому (квадрому), конструкции, созданные по технологии «knobs-into-holes» с общей легкой цепью, различные IgG-scFv-форматы, различные scFv-IgG-форматы, формат IgG «два- в одном», IgG с двойным V-доменом, IgG-V и V-IgG, которые представлены, например, на фиг. 3 в публикации Chan A.C. и Carter P.J., Nat Rev Immu 10, 2010, сс. 301-316 и описаны в указанной статье. Другие предпочтительные форматы биспецифического IgG-подобного антитела включают, например, DAF, CrossMab, IgG-dsscFv, DVD, IgG-dsFV, IgG-scFab, scFab-dsscFv и Fv2-Fc, которые представлены на фиг. 1А в публикации Weidle U.H. и др., Cancer Genomics and Proteomics 10, 2013, сс. 1-18 и описаны в указанной статье. Другие предпочтительные форматы биспецифического IgG-подобного антитела включают DAF («два- в одном»), DAF («четыре- в одном»), DutaMab; DT-IgG; формат, созданный сборкой по типу «knobs-in-holes»; формат на основе заряженной пары; формат на основе обмена Fab-плечей; SEEDbody; Triomab; LUZ-Y; Fcab; формат κλ-антитела; и формат на основе ортогонального Fab-фрагмента; DVD-IgG; IgG(H)-scFv; scFv-(H)IgG; IgG(L)-scFv; scFV-(L)IgG; IgG(L,H)-Fv; IgG(H)-V; V(H)-IgG; IgG(L)-V; V(L)-IgG; KIH IgG-scFab; 2scFv-IgG; IgG-2scFv; scFv4-Ig; scFv4-Ig; зибоди; и DVI-IgG («четыре- в одном»), которые представлены и описаны, например, у Spiess С., Zhai Q. и Carter P.J., Molecular Immunology 67, 2015, сс. 95-106, прежде всего на фиг. 1 и в соответствующем разделе описания, например, на cc. 95-101.

В целом, методы получения антител известны в данной области. Моноклональные антитела, происходящие из млекопитающих, например, человека, крыс, мышей, кроликов, коз или овец, можно получать с помощью общепринятых методов, например, описанных у

и Milstein (Nature 256, 1975, с. 495), у Harlow и Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, изд-во Cold Spring Harbor, 1988) или у Galfie (Meth. Enzymol. 73, 1981, с. 3) или в DE 19531346. В частности, многофункциональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью трех основных методов: (I) путем химической конъюгации, в которой применяют химическое перекрестное сшивание; (II) путем слияния двух различных линий клеток гибридомы (например, согласно методу, описанному у Milstein и др., Nature 305, 1983, с. 537); или (III) на основе генетических подходов с применением технологии рекомбинантной ДНК (например, согласно методу, описанному у Kurucz и др., J. Immunol. 154, 1995, с. 4576; Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sc. USA 90, 1993, с. 6444).

Предпочтительно антитела можно получать путем слияния двух различных линий клеток гибридомы (например, согласно методу, описанному у Milstein и др., Nature 305, 1983, с. 537). При этом сливают различные линии клеток гибридомы, каждая из которых продуцирует антитела с одной из требуемых специфичностей, и среди клонов клеток («квадром»), продуцирующих гетерогенную популяцию таких антител - квадром (или «гибридных гибридом»), можно идентифицировать и выделять те, которые секретируют требуемые многофункциональные антитела.

Альтернативные подходы включают осуществления химической конъюгации двух различных МАт и/или более мелких фрагментов антител. Было установлено, что стратегии окислительной реассоциации для связывания двух различных антител или фрагментов антител являются неэффективными вследствие наличия побочных реакций в процессе реокисления нескольких нативных дисульфидных связей. Современные методы химической конъюгации сфокусированы на применении гомо- или гетеро-бифункциональных перекрестносшивающих реагентов.

Технология рекомбинантной ДНК позволила получить наиболее широкий спектр многофункциональных антител посредством искусственной манипуляции с генами, и она представляет собой наиболее универсальный подход к созданию антител (см. Byrne Н. и др., Trends Biotech, 31 (11), 2013, сс. 621-632). Соответственно, многофункциональные антитела, получают, прежде всего, методами рекомбинантной ДНК или с помощью технологий (гибридной) гибридомы.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой гетерологичное антитело или гетерологичный фрагмент антитела. В контексте настоящего описания понятие «гетерологичный» означает, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержит тяжелые цепи из иммуноглобулинов различных подклассов (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 у человека; например, IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 у мышей и крыс) и/или различного происхождения (вида).

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь, происходящую из крысы и/или мыши. «Происходящий» из крысы и/или мыши означает, в частности, что аминокислотная последовательность СН3-участка тяжелой цепи антитела, предпочтительно аминокислотная последовательность Fc-области тяжелой цепи антитела, идентична по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% последовательности СН3-участка или Fc-области соответственно тяжелой цепи крысиного и/или мышиного иммуноглобулина.

Следовательно, антитела, «происходящие» из крыс и/или мышей, включают также антитела, содержащие тяжелые цепи, последовательности которых идентичны по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% последовательности СН3-участка или Fc-области соответственно тяжелой цепи крысиного и/или мышиного иммуноглобулина по всей ее длине. Кроме того, предпочтительно также, если антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой крысиное и/или мышиное антитело или антигенсвязывающий фрагмент. Это означает, что последовательности всех тяжелых и легких цепей, содержащихся в антителе или антигенсвязывающем фрагменте, идентичны по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% последовательностям тяжелой или легкой цепи крысиного и/или мышиного иммуноглобулина соответственно.

Однако, поскольку антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно предназначено для применения на людях, то предпочтительно, чтобы по меньшей мере три CDR (гипервариабельные участки) и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи (и легкой цепи) имели человеческое происхождение или были гуманизированы для того, чтобы обеспечивать специфичность в отношении (человеческого) антигена Т-клеточной поверхности и специфичность в отношении (человеческого) ассоциированного с раком и/или опухолью антигена. Следовательно, предпочтительное антитело или предпочтительный антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит тяжелую цепь, имеющую (I) СН3-участок, предпочтительно Fc-область, последовательность которого/которой идентична по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% последовательности СН3-участка или Fc-области соответственно тяжелой цепи крысиного и/или мышиного иммуноглобулина; и (II) по меньшей мере три CDR (гипервариабельные участки) и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имели человеческое происхождение или были гуманизированы. Более предпочтительно обе тяжелые цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предназначенного для применения согласно настоящему изобретению, имеют (I) СН3-участок, предпочтительно Fc-область, последовательность которого/которой идентична по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, боле предпочтительно по меньшей мере на 98%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно на 100% последовательности СН3-участка или Fc-области соответственно тяжелой цепи крысиного или мышиного иммуноглобулина; и (II) по меньшей мере три CDR (гипервариабельные участки) и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы. Кроме того, предпочтительно также по меньшей три CDR (гипервариабельные участки) и/или каркасные участки вариабельной области легкой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы.

Наиболее предпочтительно антитело представляет собой крысиное/мышиное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В контексте настоящего описания понятие «крысиное/мышиное антитело» относится к антителу, которое содержит

(а) (тяжелую) цепь, которая отличается от крысиной (тяжелой) цепи только тем, что три CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы (т.е. все последовательности, отличные от CDR и/или каркасных участков, представляют собой последовательности крысиной (тяжелой) цепи); и

(б) (тяжелую) цепь, которая отличается от мышиной (тяжелой) цепи только тем, что три CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы (т.е. все последовательности, отличные от CDR и/или каркасных участков, представляют собой последовательности мышиной (тяжелой) цепи).

Наиболее предпочтительно антитело представляет собой антитело в виде мышиного IgG2a/крысиного IgG2b, или его антигенсвязывающий фрагмент. В контексте настоящего описания понятие «антитело в виде мышиного IgG2a/крысиного IgG2b» относится к антителу, которое содержит

(а) (тяжелую) цепь, которая отличается от (тяжелой) цепи крысиного IgG2b только тем, что три CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы (т.е. все последовательности, отличные от CDR и/или каркасных участков, представляют собой последовательности (тяжелой) цепи крысиного gG2b; и

(б) (тяжелую) цепь, которая отличается от (тяжелой) цепи мышиного IgG2a только тем, что три CDR и/или каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи имеют человеческое происхождение или гуманизированы (т.е. все последовательности, отличные от CDR и/или каркасных участков, представляют собой последовательности (тяжелой) цепи мышиного IgG2a.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, выбирают из одной или нескольких следующих комбинаций изотипов (где подразумевается в частности, что в каждом/каждой изотипе/комбинации по меньшей мере CDR и/или каркасные участки, предпочтительно вариабельные области, предпочтительно имеют человеческое происхождение или гуманизированы - даже если изотип является только крысиным/мышиным):

- крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2a,

- крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2b,

- крысиный-IgG2b/мышиный-IgG3,

- крысиный-IgG2b/человеческий-IgG1,

- крысиный-IgG2b/человеческий-IgG2,

- крысиный-IgG2b/человеческий-IgG3 [восточный аллотип G3m (st) = имеет место связывание с белком А],

- крысиный-IgG2b/человеческий-IgG4,

- крысиный-IgG2b/крысиный-IgG2c,

- мышиный-IgG2a/человеческий-IgG3 [кавказские аллотипы G3m (b+g) = связывание с белком А отсутствует, ниже помечены *],

- мышиный-IgG2a/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- мышиный-IgG2a/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- мышиный-IgG2a/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1/Rat-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4/Rat-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир]-человеческий-IgG4[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[СН3],

- крысиный-IgG2b/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир-СН2-СН3],

- крысиный-IgG2b/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG2-[шарнир-СН2-СН3],

- крысиный-IgG2b/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG3-[шарнир-СН2-СН3, восточный аллотип],

- крысиный-IgG2b/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир-СН2-СН3],

- человеческий-IgG1/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*[СН2-СН3],

- человеческий-IgG1/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG4[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[CH3],

- человеческий-IgG1/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG4[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[CH3],

- человеческий-IgG1/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG2[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[CH3],

- человеческий-IgG1/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[Шарнир]-человеческий-IgG2[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[CH3],

- человеческий-IgG1/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- человеческий-IgG1/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- человеческий-IgG2/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG2-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- человеческий-IgG4/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- человеческий-IgG4/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир]-человеческий-IgG4[N-концевая область СН2]-человеческий-IgG3*[С-концевая область СН2: после аминокислотного положения 251]-человеческий-IgG3*[CH3],

- мышиный-IgG2b/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[CH2-CH3],

- мышиный-IgG2b/человеческий-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*[СН2-СН3],

- мышиный-IgG2b/мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий-IgG3*-[СН2-СН3],

- мышиный-[VH-CH1,VL-CL]-человечиский-IgG4/Rat-[VH-CH1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир]-человеческий-IgG4-[СН2]-человеческий-IgG3*-[СН3],

- человеческий-IgG1/крысиный[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1[шарнир]-человеческий-IgG4-[СН2]-человеческий-IgG3*[СН3],

- человеческий-IgG1/мышиный[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1[шарнир]-человеческий-IgG4-[СН2]-человеческий-IgG3*[СН3], и

- человеческий-IgG4/человеческий[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG4-[шарнир]-человеческий-IgG4-[СН2]-человеческий-IgG3*-[СН3].

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно изобретению, представляет собой антитело IgG-типа (которое обозначают также как «IgG-подобное» антитело), содержащее сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего, Fc-область. Более предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно изобретению, представляет собой трехфункциональное биспецифическое антитело, которое является гетерологичным крысиным/мышиным антителом, содержащим сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего, Fc-область. При этом предпочтительным является антитело с комбинацией подклассов мышиного IgG2a и крысиного IgG2b. Наиболее предпочтительным является гетерологичное крысиное/мышиное антитело, содержащее сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего Fc-область, с тяжелыми цепями, происходящими из подклассов мышиного IgG2a и крысиного IgG2b, в каждом случае предпочтительно с соответствующими им легкими цепями.

Для антител, содержащих сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, прежде всего Fc-область, с тяжелыми цепями, происходящими из подклассов мышиного IgG2a и крысиного IgG2b, прежде всего для антител формата Triomab, было продемонстрировано, что такие антитела связываются с более высокой аффинностью с человеческим FcγRIIa, чем с человеческим FcγRIIb, и характеризуются значительно более высоким соотношением уровней связывания FcγRIIa/FcγRIIb (Lindhofer Н., Hess J., Ruf P., Trifunctional Triomab^® antibodies for cancer therapy. в: Bispecific antibodies, под ред. Kontermann R.E., изд-во Springer, Berlin, 2011, cc. 289-312). Так, указанные антитела приводят к усиленному фагоцитозу макрофагами опухолевых клеток, несущих на своей поверхности антитело, и повышенному непосредственному цитолизу опухолевых клеток. Следовательно, такие антитела являются наиболее предпочтительными.

В целом, многофункциональное антитело, предназначенное для применения согласно изобретению, предпочтительно имеет в своей Fc-области следующую комбинацию изотипов: крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2a, крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2b, крысиный-IgG2b/человеческий-IgG1 или мышиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1/крысиный-[VH-СН1,VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий IgG3*-[CH2-CH3], где * обозначает кавказские аллотипы G3m(b+g), не связывающиеся с белком А.

Наиболее предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, имеет формат Triomab. Triomab представляют собой трехфункциональные биспецифические IgG-подобные антитела, имеющие специфичность в отношении CD3 и специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена. Указанные химеры состоят из двух полуантител, каждое из которых имеет одну легкую и одну тяжелую цепь, происходящие из родительских мышиного IgG2a и крысиного IgG2b изотипов. Следовательно, Fc-область Triomab соответствует мышиному IgG2a/крысиному IgG2b изотипу.

Предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения согласно изобретению, выбирают из группы, состоящей из катумаксомаба (анти-CD3 × анти-ЕрСАМ), FBTA05/лимфомун (анти-CD3 × анти-CD20), эртумаксомаба (анти-CD3 × анти-HER2/neu) и/или эктомуна (анти-CD3 × анти-GD2), предпочтительно антитело представляет собой атумаксомаб и/или эктомун.

Наиболее предпочтительным примером трехфункциональных биспецифических антител является катумаксомаб (Removab^®) (анти-CD3 × анти-CD3). Removab® разрешен ЕМА для лечения злокачественных асцитов в 2009 г. (Linke и др., Catumaxomab - clinical development and future directions., 2010, mAbs 2:2). Другие предпочтительные примеры трехфункциональных биспецифических антител включают (I) FBTA05 (которое называют также как «лимфомун»), трехфункциональное антитело EMA-CD20, (II) эртумаксомаб, трехфункциональное антитело EMA-HER2, (III) эктомун, трехфункциональное антитело EMA-GD2, и (IV) TRBs02, трехфункциональное антитело, специфическое в отношении человеческой меланомы (Ruf и др., Int J Cancer, 108, 2004, сс. 725-732).

Модулятор иммунных контрольных точек

В контексте настоящего описания (т.е. в настоящей заявке) понятие «модулятор иммунных контрольных точек» (который называют также «модулятором контрольных точек») относится к молекуле или соединению, которая/которое модулирует (например, полностью или частично снижает, ингибирует, взаимодействует с, активирует, повышает, усиливает или поддерживает) функцию одной или нескольких молекул контрольных точек. Так, модулятор иммунных контрольных точек может представлять собой «ингибитор иммунных контрольных точек» (который называют также «ингибитором контрольных точек» или «ингибитором») или «активатор иммунных контрольных точек» (который называют также «активатором контрольных точек» или «активатором». «Ингибитор иммунных контрольных точек» (который называют также «ингибитором контрольных точек» или «ингибитором») полностью или частично снижает, ингибирует, взаимодействует с или негативно модулирует функцию одной или нескольких молекул контрольных точек. «Активатор иммунных контрольных точек» (который называют также «активатором контрольных точек» или «активатором») полностью или частично активирует, стимулирует, повышает, усиливает, поддерживает или позитивно модулирует функцию одной или нескольких молекул контрольных точек. Модуляторы иммунных контрольных точек, как правило, обладают способностью модулировать (I) аутотолерантность и/или (II) амплитуду и/или продолжительность иммунного ответа. Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек, применяемый согласно настоящему изобретению, модулирует функцию одной или нескольких молекул человеческих контрольных точек и, таким образом, представляет собой «модулятор человеческих контрольных точек». Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой активатор или ингибитор одной или нескольких молекул иммунных контрольных точек, выбранной(ых) из CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR, ICOS, A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA (CD272), CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR и/или FasR/DcR3; или активатор или ингибитор одного или нескольких их лигандов.

Молекулы контрольных точек (которые называют также как «молекулами иммунных контрольных точек» или «иммунными контрольными точками») представляют собой молекулы, такие как белки, которые, как правило, участвуют в путях иммунного ответа и, например, регулируют активацию Т-клеток, пролиферацию Т-клеток и/или функцию Т-клеток. Следовательно, функция молекул контрольных точек, которая модулируется (например, полностью или частично снижается, ингибируется, подвергается воздействию, активируется, стимулируется, повышается, усиливается или поддерживается) модуляторами контрольных точек, как правило, заключается в (регуляции) активации Т-клеток, пролиферации Т-клеток и/или функции Т-клеток. Так, молекулы иммунных контрольных точек регулируют и поддерживают аутотолерантность и продолжительность, и амплитуду физиологических иммунных ответов. Многие из молекул иммунных контрольных точек относятся к семейству B7:CD28 или суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) и, посредством связывания со специфическими лигандами активируют сигнальные молекулы, которые рекрутируются к цитоплазматическому домену (см. Susumu Suzuki и др., Current status of immunotherapy. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2016: doi: 10.1093/jjco/hyv201 [электронная публикация до выхода в печать]; см., прежде всего, таблицу 1).

Семейство B7:CD28 включает наиболее часто таргетируемые пути при исследовании иммунных контрольных точек, в том числе путь CTLA-4 - В7-1/В7-2 и путь PD-1 - B7-H1(PDL1)/B7-DC(PD-L2). Другим членом этого семейства является ICOS-ICOSL/B7-H2. Другими членами этого семейства являются CD28, В7-Н3 и В7-Н4.

CD28 конститутивно экспрессируется почти на всех человеческих CD4⁺-T-клетках и примерно на половине всех CD8⁺-Т-клеток. Связывание с двумя его лигандами, CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2), которые экспрессируются на дендритных клетках, стимулирует экспансию Т-клеток. Костимуляторная молекула контрольных точек CD28 конкурирует с ингибирующей молекулой контрольных точек CTLA4 за эти же самые лиганды, CD80 и CD86 (см. Buchbinder Е.I. и Desai A., CTLA-4 and PD-1 Pathways - Similarities, Differences and Implications of Their Inhibition; American Journal of Clinical Oncology, 39(1), 2016, cc. 98-106).

Ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами белок 4 (CTLA4; известный также как CD152) представляет собой гомолог CD28, обладающий намного большей аффинностью связывания с В7. Лигандами CTLA-4 являются CD80 (В7-1) и CD86 (В7-2), аналогично CD28. Однако в отличие от CD28, связывание CTLA4 с В7 не приводит к формированию стимулирующего сигнала, но препятствует костимулирующему сигналу, в норме обеспечиваемому CD28. Кроме того, предполагается, что связывание CTLA4 с В7 даже приводит к возникновению ингибирующего сигнала, противодействующего стимулирующим сигналам, возникающим при связывании CD28:B7 и TCR:ГКГС. CTLA-4 рассматривается в качестве «лидера» среди ингибирующих иммунных контрольных точек, поскольку он задерживает потенциально аутореактивные Т-клетки на начальной стадии активации наивных Т-клеток, как правило, в лимфатических узлах (Buchbinder Е.I. и Desai A., CTLA-4 and PD-1 Pathways: Similarities, Differences and Implications of Their Inhibition; American Journal of Clinical Oncology, 39(1), 2016, cc. 98-106). Предпочтительные ингибиторы контрольной точки CTLA4 включают моноклональные антитела Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и тремелимумаб (фирма Pfizer/MedImmune). Другими предпочтительными ингибиторами CTLA-4 являются антитела к CTLA4, описанные в WO 2001/014424, WO 2004/035607, US 2005/0201994 и ЕР 1212422 В1. Дополнительные предпочтительные антитела к CTLA-4 описаны в US 5811097, US 5855887, US 6051227, US 6984720, WO 01/14424, WO 00/37504, US 2002/0039581 и US 2002/086014. Другие предпочтительные антитела к CTLA-4, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, включают, например, антитела, описанные в WO 98/42752; US 6682736 и US 6207156; у Hurwitz и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17), 1998, cc. 10067-10071; Camacho и др., J. Clin. Oncology, 22(145): реферат №2505, 2004) (антитело CP-675206); Mokyr и др., Cancer Res., 58, 1998, cc. 5301-5304, в US 5977318, US 6682736, US 7109003 и US 7132281. В контексте настоящего изобретения наиболее предпочтительной молекулой контрольных точек является CTLA-4.

Рецептор программированной гибели клеток 1 (PD1) имеет два лиганда, PD-L1 (известный также как В7-Н1 и CD274) и PD-L2 (известный также как В7-DC и CD273). Путь PD1 регулирует предварительно активированные Т-клетки на более поздних стадиях иммунного ответа, в основном в периферических тканях. Таким образом, преимущество таргетирования PD1 заключается в том, что оно может восстанавливать иммунную функцию в микроокружении опухоли. Предпочтительные ингибиторы пути PD1 включают Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), дурвалумаб (фирма MedImmune/AstraZeneca), MEDI4736 (фирма AstraZeneca; см. WO 2011/066389 А1), атезолизумаб (MPDL3280A, фирма Roche/Genentech; см. US 8217149 В2), пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), авелумаб (фирма Merck), MSB-0010718C (фирма Merck), PDR001 (фирма Novartis), BMS-936559 (фирма Bristol Myers Squibb), REGN2810 (фирма Regeneron Pharmaceuticals), MIH1 (фирма Affymetrix), AMP-224 (фирма Amplimmune, GSK), BGB-A317 (фирма BeiGene) и ламбролизумаб (например, он под названием hPD109A и его гуманизированные производные h409All, h409A16 и h409A17 описаны в WO 2008/156712; у Hamid и др., N. Engl. J. Med. 369, 2013, cc. 134-144).

Индуцибельный костимулятор Т-клеток (ICOS; известный также как CD278) экспрессируется на активированных Т-клетках. Его лигандом является ICOSL (В7-Н2; CD275), экспрессируемый в основном на В-клетках и дендритных клетках. Указанная молекула, по-видимому, имеет важное значение для эффекторной функции Т-клеток.

В7-Н3 (известный также как CD276) первоначально рассматривался в качестве костимуляторной молекулы, но в настоящее время считается коингибиторной молекулой. Предпочтительным ингибитором контрольной точки В7-Н3 является моноклональное антитело эноблитузумаб с оптимизированной Fc-областью (MGA271; фирма MacroGenics; см. US 2012/0294796 А1).

В7-Н4 (известный также как VTCN1), экспрессируется опухолевыми клетками и ассоциированными с опухолью макрофагами и участвует в ускользании опухоли от иммунологического надзора. Предпочтительными ингибиторами В7-Н4 являются антитела, описанные у Dangaj D. и др. в Cancer Research 73(15), 2013, сс. 4820-4829 и в таблице 1, соответствующее описание дано также у Jenessa В. Smith и др., В7-Н4 as a potential target for immunotherapy for gynecologic cancers: A closer look. Gynecol Oncol 134(1), 2014, cc. 181-189. Другими предпочтительными примерами ингибиторов В7-Н4 являются антитела к человеческому В7-Н4, описанные, например, в WO 2013/025779 А1 и WO 2013/067492 А1, или растворимые рекомбинантные формы В7-Н4, описанные в US 2012/0177645 А1.

Суперсемейство TNF включает, в частности, 19 белков-лигандов, которые связываются с 29 цитокиновыми рецепторами. Они участвуют во многих физиологических ответах, таких как апоптоз, воспаление или выживание клеток (Croft М., С.A. Benedict и C.F. Ware, Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies. Nat Rev Drug Discov12(2), 2013, cc. 147-68). В случае рака предпочтительными являются следующие молекулы контрольных точек/пути: TNFRSF4 (OX40/0X40L), TNFRSFS (CD40L/CD40), TNFRSF7 (CD27/CD70), TNFRSF8 (CD30/CD30L), TNFRSF9 (4-1BB/4-1BBL), TNFRSF10 (TRAILR/TRAIL)), TNFRSF12 (FN14/TWEAK), TNFRSF13 (BAFFRTACI/APRIL-BAFF) и TNFRSF18 (GITR/GITRL). Другие предпочтительные молекулы контрольных точек/пути включают Fas-лиганд и TNFRSF1 (TNFα/TNFR). Кроме того, В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA)/путь медиатора проникновения вируса герпеса (HVEM) являются предпочтительными для усиления иммунного ответа, точно также как и блокада CTLA-4. Следовательно, в контексте настоящего изобретения предпочтительными для применения для лечения и/или предупреждения рака являются такие модуляторы контрольных точек, которые модулируют одну или несколько молекул контрольных точек, выбранных из TNFRSF4 (OX40/0X40L), TNFRSFS (CD40L/CD40), TNFRSF7 (CD27 /CD70), TNFRSF9 (4-1BB/4-1BBL), TNFRSF18 (GITR/GITRL), FasR/DcR3/Fas-лиганд, TNFRSF1 (TNFα/TNFR), BTLA/HVEM и CTLA4.

ОХ40 (известный также как CD134 или TNFRSF4) стимулирует экспансию эффекторных Т-клеток и Т-клеток памяти, но он обладает также способностью подавлять дифференцировку и активность регуляторных Т-клеток и регулировать производство цитокинов. Лигандом ОХ40 является OX40L (известный также как TNFSF4 или CD252). ОХ40 кратковременно экспрессируется после контактирования с Т-клеточным рецептором и подвергается повышающей регуляции лишь на непосредственно перед этим активированных антигеном Т-клетках в областях воспалительных повреждений. Предпочтительные модуляторы контрольной точки ОХ40 включают MEDI6469 (фирма MedImmune/AstraZeneca), MEDI6383 (фирма MedImmune/AstraZeneca), MEDI0562 (фирма MedImmune/AstraZeneca), MOXR0916 (RG7888; фирма Roche/Genentech) и GSK3174998 (фирма GSK).

CD40 (известный также как TNFRSF5) экспрессируется различными клетками иммунной системы, включая антигенпрезентирующие клетки. Его лигандом является CD40L, известный также как CD154 или TNFSF5, который кратковременно экспрессируется на поверхности активированных CD4⁺-T-клеток. Сигнал, передаваемый CD40, «разрешает» созревать дендритным клеткам и тем самым запускает активацию и дифференцировку Т-клеток. Однако, CD40 может экспрессироваться также опухолевыми клетками. Таким образом, стимуляция/активация CD40 в организме страдающих раком пациентов может быть как благоприятной, так и вредной. Поэтому были разработаны стимуляторные и ингибиторные модуляторы указанной иммунной контрольной точки (Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie

, Barbara Nicola Olsen and Anders Elm Pedersen, Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 2014, cc. 96-104). Предпочтительными примерами модуляторов контрольной точки CD40 являются (I) агонистические антитела к CD, такие, как описанные у Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie

, Barbara Nicola Olsen and Anders Elm Pedersen, Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 2014, cc. 96-104, такие как дацетузумаб (SGN-40), CP-870893, FGK 4.5/FGK 45 и FGK115, предпочтительно дацетузумаб, и (II) антагонистические антитела к CD, такие, как описанные у Sufia Butt Hassan, Jesper Freddie

Barbara Nicola Olsen and Anders Elm Pedersen, Anti-CD40-mediated cancer immunotherapy: an update of recent and ongoing clinical trials, Immunopharmacology and Immunotoxicology, 36:2, 2014, cc. 96-104, такие как лукатумумаб (HCD122, CHIR-12.12). Другие предпочтительные модуляторы иммунной контрольной точки CD40 включают SEA-CD40 (фирма Seattle Genetics), ADC-1013 (фирма Alligator Biosciences), APX005M (фирма Apexigen Inc) и RO7009789 (фирма Roche).

CD27 (известный также как TNFRSF7) поддерживает антигенспецифическую экспансию наивных Т-клеток и играет важную роль в создании Т-клеток памяти. CD27 является также маркером В-клеток памяти. Кратковременная доступность его лиганда, CD70 (известного также как TNFSF7 или CD27L), на лимфоцитах и дендритных клетках регулирует активность CD27. Кроме того, известно, что костимуляция CD27 подавляет функцию эффекторных Th17-клеток. Предпочтительным модулятором иммунной контрольной точки CD27 является варлилумаб (фирма Celldex). Предпочтительными модуляторами иммунной контрольной точки CD70 являются ARGX-110 (фирма arGEN-X) SGN-CD70A (фирма Seattle Genetics).

CD137 (известный также как 4-1ВВ или TNFRSF9) является членом семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) и он в значительной степени ассоциирован с костимуляторной активностью в отношении активированных Т-клеток. В частности, передача сигнала CD137 (посредством его лиганда CD137L, известного также как TNFSF9 или 4-1BBL) приводит к пролиферации Т-клеток и защищает Т-клетки, прежде всего, CD8⁺-T-клетки, от индуцированной активацией клеточной гибели. Предпочтительными модуляторами контрольной точки CD137 являются PF-05082566 (фирма Pfizer) и урелумаб (фирма BMS).

Ген индуцированного глюкокортикоидами родственного семейству TNFR белка (GITR, известного также как TNFRSF18), усиливает экспансию Т-клеток, включая экспансию Treg. Лиганд GITR (GITRL, TNFSF18) в основном экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках. Было продемонстрировано, что антитела к GITR стимулируют противоопухолевый ответ посредством утраты стабильности линии Treg. Предпочтительными модуляторами контрольной точки GITR являются BMS-986156 (фирма Bristol Myers Squibb), TRX518 (фирма GITR Inc) и MK-4166 (фирма Merck).

Другой предпочтительной для модулирования молекулой контрольной точки является BTLA. В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA; известный также как CD272) экспрессируется, прежде всего, CD8⁺-T-клетками, при этом экспрессия BTLA на поверхности постепенно подвергается понижающей регуляции в процессе дифференцировки человеческих CD8⁺-T-клеток от наивных клеток к фенотипу эффекторных клеток. Однако, опухольспецифические человеческие CD8⁺-T-клетки экспрессируют высокие уровни BTLA. Экспрессия BTLA индуцируется в процессе активации Т-клеток и экспрессия BTLA сохраняется на Th1-клетках, но не на Th2-клетках. Подобно PD1 и CTLA4, BTLA взаимодействует с гомологом В7, В7Н4. Однако, в отличие от PD-1 и CTLA-4, BTLA осуществляет ингибирование Т-клеток посредством взаимодействия с рецепторами семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF-R), а не с рецепторами клеточной поверхности семейства В7. BTLA является лигандом для члена 14 суперсемейства (рецепторов) фактора некроза опухоли (TNFRSF14), известного также как медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM; медиатор проникновения вируса герпеса, известный также как CD270). Комплексы BTLA-HVEM осуществляют негативное регулирование Т-клеточных иммунных ответов. Предпочтительными ингибиторами BTLA являются антитела, описанные в таблице 1 публикации Alison Crawford и Е. John Wherry, Editorial: Therapeutic potential of targeting BTLA. Journal of Leukocyte Biology 86, 2009, cc. 5-8, прежде всего, представленные в ней человеческие антитела. Другие предпочтительные в указанном контексте антитела, которые блокируют взаимодействие человеческого BTLA с его лигандом, описаны в WO 2011/014438, например, «4С7», описанное в WO 2011/014438.

Другое семейство молекул контрольных точек включает молекулы контрольных точек, связанные с двумя основными классами молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) (ГКГС класса I и класса II). Это семейство включает Ig-подобный рецептор клеток-киллеров(KIR) для молекул класса I и ген активации лимфоцитов 3 (LAG-3) для молекул класса II.

Иммуноглобулин-подобный рецептор клеток-киллеров (KIR) представляет собой рецептор для молекул ГКГС класса I на естественных клетках-киллерах. Примером ингибитора KIR является моноклональное антитело лирилумаб (IPH 2102; фирма Innate Pharma/BMS; см. US 8119775 В2 и Benson и др., Blood 120, 2012, cc. 4324-4333).

Передача сигнала гена активации лимфоцитов 3 (LAG3, известного также как CD223) приводит к подавлению иммунного ответа путем воздействия на Treg, а также прямых воздействий на CD8⁺-T-клетки. Предпочтительным примером ингибитора LAG3 является моноклональное антитело к LAG3 BMS-986016 (фирма Bristol-Myers Squibb). Другими предпочтительными примерами ингибиторов LAG3 являются LAG525 (фирма Novartis), IMP321 (фирма Immutep) и LAG3-Ig, описанные в WO 2009/044273 А2 и у Brignon и др., Clin. Cancer Res. 15, 2009, cc. 6225-6231, а также мышиные или гуманизированные антитела, блокирующие человеческий LAG3 (например, IMP701, описанное в WO 2008/132601 А1), или полностью человеческие антитела, блокирующие человеческий LAG3 (такие, как описанные в ЕР 2320940 А2).

Другой путь молекул контрольных точек представляет собой путь TIM-3/GAL9). Т-клеточный иммуноглобулин и домен муцина 3 (TIM-3, известный также как HAVcr-2) экспрессируется на активированных человеческих CD4⁺-T-клетках и регулирует цитокины, экспрессируемые Th1 и Th17. TIM-3 действует в качестве негативного регулятора функции Th1/Tc1, запуская гибель клеток после взаимодействия со своим лигандом, галектином-9 (GAL9). TIM-3 является молекулой клеточной поверхности, специфической для Т-клеток-хелперов типа 1, которая регулирует индукцию периферической толерантности. Так, в проведенном в последнее время исследовании продемонстрировано, что антитела к TIM-3 могут значительно повышать противоопухолевый иммунитет (Ngiow S.F. и др., Anti-TIM3 antibody promotes Т cell IFN-gammamediated antitumor immunity and suppresses established tumors. Cancer Res, 71(10), 2011, cc. 3540-3551). Предпочтительными примерами ингибиторов TIM-3 являются антитела, таргетирующие человеческий TIM3 (например, описанные в WO 2013/006490 А2), или, прежде всего, блокирующее антитело к человеческому TIM3 F38-2E2, описанное у Jones и др., J Exp Med. 205 (12), 2008, cc. 2763-2779.

СЕАСАМ1 (родственная карциноэмбриональному антигену молекула клеточной адгезии 1) представляет собой еще одну молекулу контрольной точки (Huang Y.H. и др., СЕАСАМ1 regulates TIM-3-mediated tolerance and exhaustion. Nature, 517(7534), 2015, cc. 386-390; Gray-Owen S.D. и R.S. Blumberg, CEACAM1: contact-dependent control of immunity. Nat Rev Immunol, 6(6), 2006, cc. 433-446). Предпочтительным модулятором CEACAM1 является CM-24 (фирма сСАМ Biotherapeutics).

Другой молекулой иммунной контрольной точки является GARP, которая играет роль в способности опухолей ускользать от иммунной системы пациента. В проводимых в настоящее время клинических испытаниях продемонстрировано, что молекула-кандидат (ARGX-115), по-видимому, обладает представляющим интерес действием. Следовательно, ARGX-115 представляет собой предпочтительный модулятор контрольной точки GARP.

Кроме того, различные группы исследователей продемонстрировали, что при лечении рака можно таргетировать еще одну молекулу контрольной точки, представляющую собой фосфатидилсерин (обозначаемую также как «PS») (Creelan B.C., Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer. Cancer Control, 21(1), 2014, cc. p. 80-89; Yin Y. и др., Phosphatidylserine-targeting antibody induces Ml macrophage polarization and promotes myeloid-derived suppressor cell differentiation. Cancer Immunol Res, 1(4), 2013, cc. cc. 256-268). Предпочтительным модулятором контрольной точки фосфатидилсерина (PS) является баватитуксимаб (фирма Peregrine).

Другим путем контрольной точки является CSF1/CSF1R (Zhu Y., и др., CSF1/CSF1R Blockade Reprograms Tumor-Infiltrating Macrophages and Improves Response to T-cell Checkpoint Immunotherapy in Pancreatic Cancer Models. Cancer Research, 74(18), 2014, cc. 5057-5069). Предпочтительными модуляторами контрольной точки CSF1R являются FPA008 (фирма FivePrime), IMC-CS4 (фирма Eli-Lilly), PLX3397 (фирма Plexxicon) и RO5509554 (фирма Roche).

Кроме того, оценивали роль молекулы рецептор естественной клетки-киллера CD94/NKG2A при карциноме шейки матки (Sheu B.C. и др., Up-regulation of inhibitory natural killer receptors CD94/NKG2A with suppressed intracellular perforin expression of tumor infiltrating CD8+ T lymphocytes in human cervical carcinoma. Cancer Res, 65(7), 2005, cc. 2921-2929) и лейкозе (Tanaka J. и др., Cytolytic activity against primary leukemic cells by inhibitory NK cell receptor (CD94/NKG2A)-expressing T cells expanded from various sources of blood mononuclear cells. Leukemia, 19(3), 2005, cc. 486-489). Предпочтительными модулятором контрольной точки NKG2A является IPH2201 (фирма Innate Pharma).

Другой предпочтительной молекулой контрольной точки является IDO, фермент индоламин-2,3-диоксигеназа, участвующий в кинурениновом пути (Ball, H.J. и др., Indoleamine 2,3-dioxygenase-2; a new enzyme in the kynurenine pathway. Int J Biochem Cell Biol, 41(3), 2009, cc. 467-471). Индоламин-2,3-диоксигеназа (IDO) представляет собой катаболизирующий триптофан фермент, обладающий ингибирующими иммунитет свойствами. Известно, что IDO подавляет Т- и NK-клетки, участвует в формировании и активации Treg-клеток и супрессорных клеток миелоидного происхождения, и стимулирует ангиогенез опухоли. IDO1 сверхэкспрессируется при многих видах рака, и было установлено, что он способствует ускользанию опухолевых клеток от иммунной системы (Liu X. и др., Selective inhibition of ID01 effectively regulates mediators of antitumor immunity. Blood, 115(17), 2010, cc. 3520-3530; Ino K. и др., Inverse correlation between tumoral indoleamine 2,3-dioxygenase expression and tumor-infiltrating lymphocytes in endometrial cancer: its association with disease progression and survival. Clin Cancer Res, 14(8), 2008, cc. 2310-2317) и способствует прогрессированию хронической опухоли при индукции в результате локального воспаления (Muller A.J. и др., Chronic inflammation that facilitates tumor progression creates local immune suppression by inducing indoleamine 2,3 dioxygenase. Proc Natl Acad Sci US A, 105(44), 2008, cc. 17073-17078). Предпочтительными ингибиторами IDO являются эксигуамин A, эпадостат (INCB024360; фирма InCyte), индоксимод (фирма NewLink Genetics), NLG919 (фирма NewLink Genetics/Genentech), GDC-0919 (фирма NewLink Genetics/Genentech), F001287 (фирма Flexus Biosciences/BMS) и малые молекулы, такие как 1-метилтриптофан, прежде всего, 1-метил-[D]-триптофан и ингибиторы IDO, перечисленные в таблице 1 публикации Sheridan С., IDO inhibitors move center stage in immune-oncology; Nature Biotechnology 33, 2015, cc. 321-322.

Другой пригодной для модулирования молекулой иммунной контрольной точки является также член пути метаболизма кинуренина: TDO (триптофан-2,3-диоксигеназа). В нескольких исследованиях уже было продемонстрировано, что TDO представляет интерес с точки зрения ракового иммунитета и аутоиммунитета (Garber K., Evading immunity: new enzyme implicated in cancer. J Natl Cancer Inst, 104(5), 2012, cc. 349-352; Platten M., W. Wick и B.J. Van den Eynde, Tryptophan catabolism in cancer: beyond !DO and tryptophan depletion. Cancer Res, 72(21), 2012, cc. 5435-5440; Platten M. и др., Cancer Immunotherapy by Targeting IDOl/TDO and Their Downstream Effectors. Front Immunol, 5, 2014, c. 673).

Другой пригодной для модулирования молекулой иммунной контрольной точки является A2AR. Рецептор аденозина А2А (A2AR) рассматривается в качестве важной контрольной точки в противораковой терапии, поскольку в микроокружении опухоли, как правило, присутствуют относительно высокие концентрации аденозина, который активирует A2AR. Такая передача сигнала формирует негативную иммунную петлю обратной связи в иммунном микроокружении (см. обзор Robert D. Leone и др., A2aR antagonists: Next generation checkpoint blockade for cancer immunotherapy. Computational and Structural Biotechnology Journal 13, 2015, cc. 265-272). Предпочтительными ингибиторами A2AR являются истрадефиллин, PBS-509, ST1535, ST4206, тозаденант, V81444, преладенант, випаденант, SCH58261, SYN115, ZM241365 и FSPTP.

Другой пригодной для модулирования молекулой иммунной контрольной точки является VISTA. Содержащий V-домен Ig супрессор Т-клеточной активации (VISTA; известный также как C10orf54) экспрессируется в основном на гематопоэтических клетках, так что постоянная экспрессия VISTA на лейкоцитах в опухолях может позволять VISTA осуществлять эффективную блокаду в широком разнообразии солидных опухолей. Предпочтительным ингибитором VISTA является JNJ-61610588 (фирма ImmuNext), антитело к VISTA, которое недавно было включено в фазу 1 клинического испытания.

Другой молекулой иммунной контрольной точки является CD122. CD122 представляет собой бета-субъединицу рецептора интерлейкина-2. CD122 усиливает пролиферацию эффекторных CD8⁺-Т-клеток.

Наиболее предпочтительные примеры молекул контрольных точек включают «CTLA4-путь» и «PD1-путь», в которых участвуют CTLA4 и его лиганды CD80 и CD86, а также PD1 с его лигандами PD-L1 и PD-L2 (более подробно пути CTLA4 и PD-1, а также другие участвующие в них молекулы описаны у Buchbinder Е.I. и Desai A., CTLA-4 and PD-1 Pathways - Similarities, Differences and Implications of Their Inhibition; American Journal of Clinical Oncology, 39(1), 2016, cc. 98-106). В более широком смысле предпочтительные примеры молекул контрольных точек включают CD27, CD28, CD40, CD 122, CD137, ОХ40, GITR, ICOS, A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR и/или FasR/DcR3, а также, в частности, их лиганды.

Однако, может оказаться предпочтительным также, если модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой антитело к CD28. Более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек не направлен против CD28 (т.е. CD28 предпочтительно не является мишенью модулятора иммунных контрольных точек, указанного в настоящем описании).

Кроме того, может оказаться предпочтительным также, если модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой ингибитор PD-1. Более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой ингибитор/антагонист пути PD-1 (который обозначают также как «PD-1-ось», которая включает помимо самого PD-1 также его лиганды PD-L1 и PD-L2).

Молекулы иммунных контрольных точек ответственны за костимулирующие или ингибирующие взаимодействия с Т-клеточными ответами. Следовательно, молекулы контрольных точек можно подразделять на (I) (ко-)стимуляторные молекулы контрольных точек и (II) ингибиторные молекулы контрольных точек. Как правило, (ко-)стимуляторные молекулы контрольных точек оказывают позитивное действие совместно с передачей сигнала Т-клеточного рецептора (TCR), индуцированного антигенной стимуляцией, в то время как ингибирующие молекулы контрольных точек осуществляют негативную регуляцию передачи сигнала TCR. Примеры (ко-)стимуляторных молекул контрольных точек включают CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR и ICOS. Примеры ингибиторных молекул контрольных точек включают CTLA4, а также PD1 с его лигандами PD-L1 и PD-L2; и A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и FasR/DcR3.

Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой активатор (ко-)стимуляторной молекулы контрольной точки или ингибитор ингибиторной молекулы контрольной точки, или их комбинацию. Таким образом, более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой (I) активатор CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR и/или ICOS или (II) ингибитор A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, СЕАСАМ1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или FasR/DcR3.

Как указано выше, известно большое количество модуляторов (ингибиторов/активаторов) CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR, ICOS, A2AR, В7-Н3, В7-Н4, CTLA-4, PD1, PDL-1, PD-L2, IDO, LAG-3, BTLA, TIM3, VISTA, KIR, СЕАСАМ1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или FasR/DcR3, и некоторые из них уже проходят клинические испытания или даже разрешены для применения. На основе указанных известных модуляторов иммунных контрольных точек в (ближайшем) будущем могут быть разработаны альтернативные модуляторы иммунных контрольных точек. В частности, можно применять сами известные модуляторы предпочтительных контрольных точек или можно применять их аналоги, в частности, химеризованные, гуманизированные или человеческие формы антител.

Более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор ингибиторной молекулы контрольной точки (но предпочтительно не ингибитор стимуляторной молекулы контрольной точки). Следовательно, еще более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или DcR3, или его лиганд.

Предпочтительно также модулятор иммунной контрольной точки представляет собой активатор стимуляторной или костимуляторной молекулы контрольной точки (но предпочтительно не активатор ингибиторной молекулы контрольной точки). Следовательно, модулятор иммунной контрольной точки более предпочтительно представляет собой активатор CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR и/или ICOS, или его лиганда.

Более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1, PD-L1 и/или PD-L2, еще более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1 и/или PD-L1, и наиболее предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4 и/или PD-1. Наиболее предпочтительным является ингибитор CTLA-4.

Следовательно, модулятор контрольной точки можно выбирать из известных ингибиторов пути CTLA-4 и/или пути PD-1. Предпочтительные ингибиторы пути CTLA-4 и пути PD-1 включают моноклональные антитела Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и тремелимумаб (фирма Pfizer/MedImmune), а также Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), дурвалумаб (фирма MedImmune/AstraZeneca), MEDI4736 (фирма AstraZeneca; см. WO 2011/066389 A1), MPDL3280A (фирма Roche/Genentech; см. US 8217149 В2), пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), MSB-0010718С (фирма Merck), MIH1 (фирма Affymetrix) и ламбролизумаб (например, описанный под названием hPD109A и его гуманизированные производные h409All, h409A16 и h409A17 в WO 2008/156712; у Hamid и др., N. Engl. J. Med. 369, 2013, cc. 134-144). Более предпочтительные ингибиторы контрольных точек включают ингибиторы CTLA-4 Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и тремелимумаб (фирма Pfizer/MedImmune), и/или ингибиторы PD-1 Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), АМР-224 и ламбролизумаб (например, описанный под названием hPD109A и его гуманизированные производные h409All, h409A16 и h409A17 в WO 2008/156712; у Hamid О. и др., N. Engl. J. Med. 369, 2013, cc. 134-144).

В контексте настоящего изобретения предпочтительно применяют более одного модулятора иммунной контрольной точки (например, ингибитора контрольной точки), в частности, применяют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных модуляторов иммунных контрольных точек (например, ингибитора контрольной точки), предпочтительно применяют 2, 3, 4 или 5 различных модуляторов иммунных контрольных точек (например, ингибитора контрольной точки), более предпочтительно применяют 2, 3 или 4 различных модулятора иммунных контрольных точек (например, ингибитора контрольной точки), еще более предпочтительно применяют 2 или 3 различных модулятора иммунных контрольных точек (например, ингибитора контрольной точки) и наиболее предпочтительно применяют 2 различных модулятора иммунных контрольных точек (например, ингибитора контрольной точки). В данном случае выражение «различные» модуляторы иммунных контрольных точек (например, ингибиторы контрольных точек) означает, в частности, что они модулируют (например, ингибируют) различные пути молекул контрольных точек.

Предпочтительно ингибитор пути PD-1 объединяют с ингибитором пути CTLA-4. Например, как указано выше, комбинированная терапия с использованием ниволумаба (антитело к PD1) и ипилимумаба (антитело к CTLA-4) разрешена FDA в 2015 г. для лечения пациентов с BRAF V600 дикого типа, неоперабельной или метастатической меланомы. Кроме того, недавно опубликованы данные об успешном проведении фазы 1b исследования комбинации дурвалумаба (антитело к PD-L1) и тремелимумаба (антитело к CTLA-4) в случае немелкоклеточного рака легких (Antonia, Scott и др., Safety and antitumour activity of durvalumab plus tremelimumab in non-small cell lung cancer: a multicentre, phase 1b study; Lancet Oncol. 5 февраля 2016 г. pii: S1470-2045(15)00544-6. doi: 10.1016/S1470-2045(15)00544-6. [электронная публикация до выхода в печать]). Так, предпочтительными комбинациями модуляторов иммунных контрольных точек пути PD-1 и пути CTLA-4 являются (I) ниволумаб (антитело к PD1) и ипилимумаб (антитело к CTLA-4) или (II) дурвалумаб (MEDI4736; антитело к PD-L1) и тремелимумаб (антитело к CTLA-4). Предпочтительными являются также их комбинация, например, ниволумаб (антитело к PD1) и тремелимумаб (антитело к CTLA-4) или дурвалумаб (MEDI4736; антитело к PD-L1) и ипилимумаб (антитело к CTLA-4).

Другие предпочтительные комбинации по меньшей мере двух различных модуляторов иммунных контрольных точек в контексте настоящего изобретения могут содержать комбинацию, выбранную из (I) комбинации ингибитора KIR и ингибитора CTLA-4, такой как лирилумаб/ипилимумаб; (II) комбинации ингибитора KIR и ингибитора пути PD-1, такого как PD-1, например, лирилумаб/ниволумаб; (III) комбинации ингибитора LAG3 и ингибитора пути PD-1, такого как ингибитор PD-1 или ингибитор PD-L1, например, описанные у Woo и др., Cancer Res. 72, 2012, cc. 917-927 или у Butler N.S. и др., Nat Immunol. 13, 2011, cc. 188-195), и предпочтительные примеры такой комбинации включают новилумаб/ВМ8-986016 и PDR001/LAG525; (IV) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих ICOS, и ингибитора CTLA-4, например, описанной у Fu и др., Cancer Res. 71, 2011, cc. 5445-5454; (V) комбинации модуляторов контрольных точек, модулирующих 4-1ВВ, ингибиторов CTLA-4, такой как описанная у Curran и др., PLoS One 6(4), 2011, el 9499); (VI) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD1 и CD27, такой как новилумаб/варлилумаб и атозолизумаб/варлилумаб; (VII) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих ОХ40 и CTLA-4, такой как MEDI6469/тремелимумаб; (VIII) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих ОХ40 и PD-1, такой как MEDI6469/MEDI4736, MOXR0916/MPDL3280A, MEDI6383/MEDI4736 и GSK3174998/пембролизумаб; (IX) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и 4-1ВВ, такой как новилумаб/урелумаб, пембролизумаб/РТ-05082566 и авелумаб/РТ-05082566; (X) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и IDO, такой как ипилимумаб/индоксимод, пембролизумаб/INCB024360, MEDI4736/INCB024360, MPDL3280A/GDC-0919 и атезолизумаб/INCB024360; (XI) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и CSF1R, такой как пембролизумаб/PLX3397, новилумаб/FPAOOS и MPDL3280A/RO5509554; (XII) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и GITR, такой как новилумаб/BMS-986156 и пембролизумаб/MK-4166; (XIII) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и CD40, такой как MPDL3280A/RO7009789; (XIV) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих PD-1 и В7-Н3, такой как пембролизумаб/MGA271; (XV) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих CTLA-4 и В7-Н3, такой как ипилимумаб/MGA271 и (XVI) комбинации модуляторов контрольных точек, таргетирующих KIR и 4-1ВВ, такой как лирилумаб/урелумаб.

Наиболее предпочтительно комбинация модулятора иммунной контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его фрагмента, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1, PD-L1 и/или PD-L2, предпочтительно по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1. Примеры такой предпочтительной комбинации включают комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и дурвалумаб (фирма MedImmune/AstraZeneca), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и MEDI4736 (фирма AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 A1), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и MPDL3280A (фирма Roche/Genentech; cf. US 8217149 B2), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и MSB-0010718C (фирма Merck), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и MIH1 (фирма Affymetrix), комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и АМР-224, комбинацию Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и ламбролизумаба, комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и дурвалумаба (фирма MedImmune/AstraZeneca), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и MEDI4736 (фирма AstraZeneca; cf. WO 2011/066389 A1), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и MPDL3280A (фирма Roche/Genentech; cf. US 8217149 В2), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и пидилизумаба (СТ-011; фирма CureTech), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и MSB-0010718С (фирма Merck), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и MIH1 (фирма Affymetrix), комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и АМР-224 и комбинацию тремелимумаба (фирма Pfizer/MedImmune) и ламбролизумаба.

В контексте настоящего изобретения предпочтительно также применяют более одного модулятора иммунной контрольной точки (например, ингибитора контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки, в частности, применяют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 модуляторов иммунной контрольной точки (например, ингибиторов контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки, предпочтительно применяют 2, 3, 4 или 5 модуляторов иммунной контрольной точки (например, ингибиторов контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки, более предпочтительно применяют 2, 3 или 4 модулятора иммунной контрольной точки (например, ингибитора контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки, еще более предпочтительно применяют 2 или 3 модулятора иммунной контрольной точки (например, ингибитора контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки и наиболее предпочтительно применяют 2 модулятора иммунной контрольной точки (например, ингибитора контрольной точки) одного и того же пути контрольной точки. Предпочтительными для модулирования путями контрольных точек являются путь PD-1 или путь CTLA-4. Например, можно применять комбинацию MEDI4736 и MEDI0680 для модулирования, прежде всего для ингибирования, пути PD-1.

В контексте настоящего изобретения модуляторы иммунных контрольных точек могут представлять собой молекулу или агент любого типа, если только они полностью или частично снижают, ингибируют, взаимодействуют с, активируют, стимулируют, повышают, усиливают или поддерживают функцию одной или нескольких описанных выше молекул контрольных точек. В частности, модулятор иммунных контрольных точек связывается с одной или несколькими молекулами контрольных точек, такими как белки контрольных точек, или с их предшественниками, например, на уровне ДНК или РНК, модулируя тем самым (например, полностью или частично снижая, ингибируя, взаимодействуя с, активируя, стимулируя, повышая, усиливая или поддерживая) функцию одной или нескольких описанных выше молекул контрольных точек. Предпочтительными модуляторами иммунных контрольных точек являются олигонуклеотиды, siРНК, shРНК, рибозимы, антисмысловые молекулы РНК, иммунотоксины, низкомолекулярные ингибиторы и антитела или их антигенсвязывающие фрагменты (например, антитела или фрагменты антител, антагонистические антитела или фрагменты антител, или агонистические антитела или фрагменты антител, блокирующие молекулы контрольных точек).

Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой олигонуклеотид. Такой олигонуклеотид предпочтительно применяют для снижения экспрессии белка, прежде всего для снижения экспрессии белка контрольной точки, такого как описанные выше рецепторы или лиганды контрольной точки. Олигонуклеотиды представляют собой короткие молекулы ДНК или РНК, как правило, содержащие от 2 до 50 нуклеотидов, предпочтительно от 3 до 40 нуклеотидов, более предпочтительно от 4 до 30 нуклеотидов и еще более предпочтительно от 5 до 25 нуклеотидов, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Олигонуклеотиды, как правило, создают в лаборатории путем твердофазного химического синтеза. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, однако, в контексте настоящего изобретения олигонуклеотид предпочтительно является одноцепочечным. Более предпочтительно олигонуклеотид, представляющий собой модулятор контрольной точки, является антисмысловым олигонуклеотидом. Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой ДНК или РНК с одной цепью, комплементарные выбранной последовательности, в частности последовательности, выбранной из последовательности ДНК или РНК (или ее фрагмента) белка контрольной точки. Антисмысловую РНК, как правило, применяют для предупреждения трансляции в белок цепей матричной РНК, например, мРНК белка контрольной точки, посредством связывания с мРНК. Антисмысловую ДНК, как правило, применяют для таргетирования специфической комплементарной (кодирующей или некодирующей) РНК. Если имеет место связывание, то такие гибриды ДНК/РНК могут расщепляться ферментом РНКазой Н. Кроме того, можно применять антисмысловые морфолино-олигонуклеотиды для нокдауна генов у позвоночных. Например, Kryczek с соавторами (Kryczek I., Zou L., Rodriguez P., Zhu G., Wei S., Mottram P. и др., B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J Exp Med., 203, 2006, cc. 871-881) сконструировали В7-Н4-специфический морфолино-олигонуклеотид, который специфически блокирует экспрессию В7-Н4 в макрофагах, что приводит к повышению пролиферации Т-клеток и уменьшению объемов опухолей у мышей, имеющих специфические в отношении ассоциированного с опухолью антигена (ТАА) Т-клетки.

Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой siРНК. Малая, интерферирующая РНК (siРНК), которую иногда обозначают как короткая интерферирующая РНК или вызывающая «молчание» РНК, относится к классу двухцепочечных молекул РНК, как правило, длиной 20-25 пар оснований. В пути РНК-интерференции (РНКi) siРНК оказывает воздействие на экспрессию специфических генов, таких как гены, кодирующие белки контрольных точек, имеющие комплементарные нуклеотидные последовательности. Функции siРНК, заключающиеся в разрушении мРНК после транскрипции, приводят к отсутствию трансляции. Для нокдауна гена можно применять трансфекцию экзогенной siРНК, однако эффект может быть лишь кратковременным, особенно в случае быстро делящихся клеток. Эту проблему можно преодолевать, например, путем модификации РНК или путем применения экспрессионного вектора для siРНК. Последовательность siРНК можно также модифицировать посредством интродукции короткой петли между двумя цепями. Полученный в результате этого транскрипт представляет собой короткую РНК-шпильку (shРНК, также называемую «малой РНК-шпилькой»), из которой в результате происходящего обычным образом процессинга под действием фермента Dicer образуется функциональная siРНК. shРНК представляет собой обладающий преимуществом медиатор РНКi, поскольку он характеризуется относительно низкой скоростью расщепления и турновера. Следовательно, модулятор иммунных контрольных точек предпочтительно представляет собой shРНК. Для shРНК, как правило, требуется применять экспрессионный вектор, например, плазмиду или вирусный или бактериальный вектор.

Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой имунотоксин. Иммунотоксины представляют собой химерные белки, которые содержат таргетирующий фрагмент (такой как антитело), который, как правило, таргетирует антиген на конкретной клетке, такой как раковая клетка, сцепленный с токсином. В контексте настоящего изобретения предпочтительным является иммунотоксин, содержащий таргетирующий фрагмент, который таргетирует молекулу контрольной точки. Когда иммунотоксин связывается с клеткой, несущей антиген, например, молекулой контрольной точки, то он поглощается посредством эндоцитоза и токсин может убивать клетку. Иммунотоксины предпочтительно содержат (модифицированное) антитела или фрагмент антитела, сцепленное/сцепленный с (фрагментом) токсина. Методы осуществления сцепления хорошо известны в данной области. Таргетирующий участок иммунотоксина, как правило, содержит Fab-фрагмент антитела, который таргетирует конкретный тип клетки. Токсин, как правило, является цитотоксическим, таким как белок, происходящий из бактериального или растительного белка, из которого удален встречающийся в естественных условиях связывающий домен, в результате чего таргетирующий фрагмент иммунотоксина направляет токсин к антигену на клетке-мишени. Однако, иммунотоксины могут также содержать таргетирующий фрагмент, отличный от антитела или фрагмента антитела, такой как фактор роста. Например, рекомбинантные слитые белки, содержащие токсин и фактор роста, также относятся к рекомбинантным иммунотоксинам.

Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство (называемое также «низкомолекулярным ингибитором»). Низкомолекулярное лекарственное средство представляет собой органическое соединение с низкой молекулярной массой (вплоть до 900 Да), которое, как правило, воздействует на (регулирует) биологический процесс. В контексте настоящего изобретения низкомолекулярное лекарственное средство, которое представляет собой модулятор иммунной контрольной точки, представляет собой органическое соединение, имеющее молекулярную массу не более 900 Да, которое полностью или частично снижает, ингибирует, взаимодействует с или негативно модулирует функцию одной или нескольких описанных выше молекул контрольных точек. Верхний предел молекулярной массы, составляющий 900 Да, дает возможность быстро диффундировать через клеточные мембраны и обеспечивает оральную биодоступность. Более предпочтительно молекулярная масса низкомолекулярного лекарственного средства, представляющего собой модулятор иммунных контрольных точек, не превышает 500 Да. Например, различные антагонисты A2AR, известные в данной области, представляют собой органические соединения, имеющие молекулярную массу менее 500 Да.

Наиболее предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Такие представляющие собой модуляторы иммунных контрольных точек антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, включают, в частности, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с рецепторами иммунных контрольных точек, или антитела, которые связываются с лигандами рецепторов иммунных контрольных точек. Предпочтительно представляющие собой модуляторы иммунных контрольных точек антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются агонистами или антагонистами рецепторов иммунных контрольных точек или лигандов рецепторов иммунных контрольных точек. Примеры модуляторов контрольных точек типа антител включают описанные выше модуляторы иммунных контрольных точек, которые разрешены для применения в настоящее время, а именно, Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), и другие описанные выше антитела к рецепторам контрольных точек или антитела к лигандам рецепторов контрольных точек.

Предпочтительно модуляторы иммунных контрольных точек, входящие в комбинацию, применяемую согласно настоящему изобретению, представляют собой антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые могут частично или полностью блокировать путь PD-1 (например, они могут представлять собой частичные или полные антагонисты пути PD-1), в частности PD-1, PD-L1 или PD-L2, более предпочтительно антитело может частично или полностью блокировать PD-1 (например, могут представлять собой частичные или полные антагонисты PD-1). Такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты включают антитела к PD-1, человеческие антитела к PD-1, мышиные антитела к PD-1, антитела к PD-1 млекопитающих, гуманизированные антитела к PD-1, моноклональные антитела к PD-1, поликлональные антитела к PD-1, химерные антитела к PD-1, антитела к PD-L1, антитела к PD-L2, анти-PD-1-аднектины, доменные антитела к PD-1, одноцепочечные фрагменты антител к PD-1, фрагменты тяжелой цепи антител к PD-1 и фрагменты легкой цепи антител к PD-1. Например, антитело к PD-1 может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент. Предпочтительно антитело к PD-1 обладает способностью связываться с человеческим PD-1 и частично или полностью блокировать активность (человеческого) PD-1 (например, такие антитела могут являться частичными или полными антагонистами PD-1), запуская тем самым, в частности, функцию иммунных клеток, экспрессирующих PD-1.

Предпочтительно модуляторы иммунных контрольных точек, входящие в комбинацию, применяемую согласно настоящему изобретению, представляют собой антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые могут частично или полностью блокировать путь CTLA-4 (например, они могут являться частичными или полными антагонистами пути CTLA-4). Такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты включают антитела к CTLA4, человеческие антитела к CTLA4, мышиные антитела к CTLA4, антитела к CTLA4 млекопитающих, гуманизированные антитела к CTLA4, моноклональные антитела к CTLA4, поликлональные антитела к CTLA4, химерные антитела к CTLA4, MDX-010 (ипилимумаб), тремелимумаб, антитела к CD28, анти-CTLA4-аднектины, доменные антитела к CTLA4, одноцепочечные фрагменты антител к CTLA4, фрагменты тяжелой цепи антител к CTLA4 и фрагменты легкой цепи антител к CTLA4. Например, антитело к CTLA4 может представлять собой антигенсвязывающий фрагмент. Предпочтительно антитело к CTLA4 обладает способностью связываться с человеческим CTLA4 и частично или полностью блокировать активность CTLA4 (например, такие антитела могут являться частичными или полными антагонистами CTLA-4), запуская тем самым, в частности, функцию иммунных клеток, экспрессирующих CTLA4.

Предпочтительные комбинации предпочтительного модулятора иммунной контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела

Как указано выше, предпочтительная комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит описанный выше предпочтительный модулятор иммунной контрольной точки. Кроме того, предпочтительная комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит описанное выше предпочтительное перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или описанный выше антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий (предпочтительную) специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхности, (предпочтительную) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и (предпочтительный) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII.

Более предпочтительная комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит (I) предпочтительный модулятор иммунной контрольной точки, представленный в настоящем описании, и (II) предпочтительное перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, которое/который содержит (предпочтительную) специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхности, (предпочтительную) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена и (предпочтительный) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII. В представленных ниже предпочтительных вариантах осуществления изобретения описана предпочтительная комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению.

В предпочтительной комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело представляет собой трехфункциональное биспецифическое антитело IgG-типа, в котором

а) специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхности представляет собой специфичность (сайт связывания) в отношении (человеческого) CD3;

б) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена представляет собой специфичность (сайт связывания) в отношении ЕрСАМ, HER2/neu, GD2 или CD20;

в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII представляет собой Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b.

Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело представляет собой катумаксомаб и/или эктомаб.

Предпочтительно также, когда в комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1, PD-L1 и/или PD-L2, и более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4 и/или PD-1. Наиболее предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки представляет собой ингибитор CTLA-4.

Например, предпочтительная комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит

- трехфункциональное биспецифическое антитело IgG-типа, имеющее

а) специфичность (сайт связывания) в отношении (человеческого) CD3;

б) специфичность (сайт связывания) в отношении ЕрСАМ, HER2/neu, GD2 или CD20; и

в) Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b; и

- ингибитор CTLA-4, PD-L1, PD-L2 и/или PD-1, предпочтительно ингибитор CTLA-4 и/или PD-1.

Другой предпочтительный пример комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению, содержит

б) специфичность (сайт связывания) в отношении ЕрСАМ, HER2/neu, или GD2; и

в) Fc-область мышиного IgG2a/крысиного IgG2b; и

Наиболее предпочтительно комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, содержит (I) катумаксомаб или эктомаб и (II) ингибитор CTLA-4.

Применение для терапевтического лечения ракового заболевания

Комбинация модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании, и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, предназначена для применения для лечения ракового заболевания.

Такая комбинация модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании, и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитело или антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, обладает способностью инициировать действие или усиливать эффективность модуляторов контрольных точек, в частности, в условиях терапевтического применения, что продемонстрировано в примерах, представленных в настоящем описании.

В контексте настоящего описания понятие «терапевтическое лечение» относится к лечению после начала заболевания. В частности, «терапевтическое лечение» не включает профилактические меры, предпринятые до начала заболевания. Поскольку начало заболевания часто ассоциировано с симптомом(ами) заболевания, то человека или животных часто подвергают «терапевтическому» лечению после установления диагноза или по меньшей мере наличия (большой) вероятности того, что индивидуум страдает конкретным заболеванием. Цель терапевтического лечения заключается, в частности (I) в облегчении, улучшении или излечении заболевания (состояния) или (II) в ингибировании или замедлении прогрессирования заболевания (например, путем увеличения среднего времени выживания для страдающих раком пациентов). Однако предупреждение начала заболевания, как правило, не может достигаться с помощью терапевтического лечения.

Комбинация, представленная в настоящем описании, предназначена для применения (для приготовления лекарственного средства) для терапевтического лечения ракового заболевания. Понятие «заболевание», применяемое в контексте настоящего изобретения, как правило, является синонимом и употребляется взаимозаменяемо с понятиями «нарушение» и «состояние» (как в случае медицинского состояния), в том плане, что все они характеризуют аномальное состояние организма человека или животного или одной из его частей, которое ухудшает нормальное функционирование, как правило, проявляющееся в виде отличительных признаков и симптомов, и которое приводит к уменьшению продолжительности или качества жизни человека или животного.

Раковые заболевания представляют собой группу заболеваний, характеризующихся аномальным ростом клеток, которые, в частности, могут захватывать или распространяться в другие части организма. Для раковых клеток/ткани, как правило, характерны шесть отличительных признаков рака, а именно (I) рост и деление клеток в отсутствии соответствующего сигнала; (II) продолжение роста и деления даже при наличии противодействующих сигналов; (III) избегание запрограммированной смерти клеток; (IV) неограниченное количество делений клетки; (V) стимулирование образования кровеносных сосудов; и (VI) инвазия в ткань и образование метастазов.

Раковые заболевания включают заболевания, вызываемые нарушением апоптоза. Рак может представлять собой солидную опухоль, рак крови или лимфатический рак. В частности, рак может представлять собой доброкачественное, злокачественное новообразование или быть метастатическим.

Предпочтительно при терапевтическом лечении ракового заболевания комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, ингибирует/замедляет продолжающийся/дальнейший рост опухоли (или метастазов) или уменьшает размер опухоли (или количество метастазов), или предупреждает рецидив опухоли и/или метастазов.

Предпочтительные примеры раковых заболеваний предпочтительно выбирают из следующих заболеваний: акустическая невринома, анальная карцинома, астроцитома, базалиома, синдром Бехчета, рак мочевого пузыря, бластома, рак кости, метастазы в головной мозг, опухоли головного мозга, рак головного мозга (глиобластомы), рак молочной железы (карцинома молочной железы), лимфома Беркитта, карциноиды, рак шейки матки, карцинома ободочной кишки, колоректальный рак, карцинома тела матки, краниофарингеомы, синдром CUP, карцинома эндометрия, рак желчного пузыря, опухоли гениталий, включая раки мочеполового тракта, глиобластома, глиомы, опухоли головы/шеи, гепатомы, гистиоцитарная лимфома, синдромы или лимфомы Ходжкина и неходжкинские лимфомы, опухоль гипофиза, рак кишечника, включая опухоли тонкого кишечника и желудочно-кишечные опухоли, саркома Капоши, рак почки, карциномы почки, ларингеальный рак или рак гортани, лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз (AML), эритролейкоз, острый лимфоидный лейкоз (ALL), хронический миелоидный лейкоз (CML) и хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), опухоль века, рак печени, метастазы в печень, карциномы легкого (=рак легкого = бронхиальная карцинома), мелкоклеточные карциномы легкого и немелкоклеточные карциномы легкого, и аденокарцинома легкого, лимфомы, рак лимфатической системы, злокачественные меланомы, карциномы молочной железы (=рак молочной железы), медуллобластомы, меланомы, менингиомы, грибовидный микоз, неопластическая невринома, рак пищевода, карцинома пищевода (=рак пищевода), олигодендроглиома, рак яичника (=карцинома яичника), карцинома яичника, карцинома поджелудочной железы (=рак поджелудочной железы), пенильный рак, рак пениса, рак гортани, опухоль гипофиза, плазмоцитома, рак предстательной железы (=опухоли предстательной железы), ректальная карцинома, ректальные опухоли, рак почки, карциномы почки, ретинобластома, саркомы, болезнь Шнеебергера, рак кожи, например меланома или немеланомный рак кожи, включая базальноклеточные и плоскоклеточные карциномы, а также псориаз, пузырчатка, опухоли мягких тканей, спиналиома, рак желудка, тестикулярный рак, рак глотки, тимома, карцинома щитовидной железы, рак языка, рак мочеиспускательного канала, рак матки, рак влагалища, различные индуцированные вирусом опухоли, такие, например, как индуцированные папилломой карциномы (например, карцинома шейки матки = рак шейки матки), аденокарциномы, индуцированные вирусом герпеса опухоли (например, лимфома Беркитта, индуцированная EBV В-клеточная лимфома, карцинома шейки матки), индуцированные вирусом гепатита В опухоли (гепатоклеточные карциномы), индуцированные HTLV-1 и HTLV-2 лимфомы, рак вульвы, состояния обусловленные или связанные с бородавками и т.д.

Другие предпочтительные примеры раков, подлежащих лечению с помощью комбинации модулятора иммунных контрольных точек, представленного в настоящем описании, и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его фрагмента, представленного в настоящем описании, включают рак головного мозга, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода, рак легкого, рак печени, рак почки, меланому, карциному кишечника, карциному легкого, плоскоклеточную карциному головы и шеи, лимфому Хджкина, хронический миелоидный лейкоз, колоректальную карциному, карциному желудка, карциному эндометрия, миелолейкоз, плоскоклеточную карциному легкого, острый лимфобластный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, опухоль мочевого пузыря, промиелоцитарный лейкоз, немелкоклеточную карциному легкого, плазмоцитому и саркому.

Более предпочтительно раковое заболевание выбирают из рака легкого, рака желудка, рака яичника, рака молочной железы, меланомы, рака предстательной железы, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, лимфомы Ходжкина, неходжкинских лимфом, опухоли мочевого пузыря, плазмоцитомы и/или саркомы.

В целом, понятие «комбинация» модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании, и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его фрагмента, представленного в настоящем описании, означает, что терапию с использованием модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании, объединяют с терапией с использованием перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его фрагмента, представленного в настоящем описании. Иными словами, даже если один компонент (модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело) не вводят, например, в тот же самый день, что и другой компонент (другой модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело), то их графики лечения «переплетаются». Это означает, что «комбинация» в контексте настоящего изобретения не включает, в частности, условие того, что терапию с использованием одного компонента (модулятора контрольной точки или перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) начинают после окончания терапии с использованием другого компонента (другого модулятора контрольной точки или перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела). В более общем смысле понятие «переплетенный» график лечения модулятором контрольной точки и перенаправляющим Т-клетки многофункциональным антителом - и, следовательно, комбинацией модулятора контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела - означает, что:

(I) не каждое введение модулятора контрольной точки (и, следовательно, полную терапию с использованием модулятора контрольной точки) завершают более чем за одну неделю (предпочтительно более чем за 3 дня, более предпочтительно более чем за 2 дня, еще более предпочтительно более чем за один день) до первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (и, следовательно, до начала полной терапии с использованием перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела); или

(II) не каждое введение перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (и, следовательно, полную терапию с использованием перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) завершают более чем за одну неделю (предпочтительно более чем за 3 дня, более предпочтительно более чем за 2 дня, еще более предпочтительно более чем за один день) до первого введения модулятора контрольной точки (и, следовательно, до начала полной терапии с использованием модулятора контрольной точки).

Например, в случае комбинации модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании, и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, представленного в настоящем описании, которая предназначена для применения согласно настоящему изобретению, один компонент (модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело) можно вводить один раз в неделю, а второй компонент (другой модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело) можно вводить один раз в месяц. Для реализации описанной в данном примере «комбинации», как она определена в контексте настоящего изобретения, вводимый ежемесячно компонент следует вводить по меньшей мере один раз в течение той же самой недели, когда вводят еженедельно вводимый другой компонент.

Как указано выше, введение модулятора иммунной контрольной точки и/или перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, входящих в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, может требовать осуществления нескольких последовательных введений, например, нескольких инъекций. Так, введение можно повторять по меньшей мере два раза, например, один раз в виде инъекций для первичной иммунизации и затем в виде бустерных инъекций.

В частности, модулятор иммунной контрольной точки и/или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящие в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить многократно или непрерывно. Модулятор иммунной контрольной точки и/или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящие в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить многократно или непрерывно в течение периода, составляющего по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недели; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 или 12 месяцев; или 2, 3, 4 или 5 лет. Например, модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить дважды в день, один раз в день, каждые два дня, каждые три дня, один раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц или каждые два месяца. Например, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить дважды в день, один раз в день, каждые два дня, каждые три дня, один раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц или каждые два месяца.

Предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят согласно режиму наращивания дозы. Как правило, «режим наращивания дозы» относится к повторному введению антитела, при котором начальная доза (т.е., как правило, однократная доза при первом введении антитела, например, в целом или применительно к одному однократному циклу введения) меньше, чем конечная доза (т.е., как правило, однократная доза при конечном введении антитела, например, в целом или применительно к одному однократному циклу введения). В частности, дозу антитела повышают при повторяющихся введениях антитела согласно режиму наращивания доз. В частности, режим наращивания дозы включает два или большее количество «уровней доз», которые вводят в порядке их увеличения, а именно, начинают с наиболее низкого уровня дозы, после чего применяют следующий более высокий уровень дозы, после которого необязательно применяют следующий более высокий уровень дозы и т.д. Понятие «уровень дозы» относится к конкретной дозе/количеству антитела. Например, уровень дозы, составляющий «10 мкг», означает, что однократную дозу антитела, составляющую 10 мкг, вводят один раз или несколько раз (например, два или три раза) до того, как начинают применять следующий более высокий уровень дозы (например, при котором вводят один раз или несколько раз однократную дозу антитела, составляющую 50 мкг). Следовательно, при каждом уровне доз можно вводить однократные дозы один или большее количество раз (например, два или три раза). Если при (одном) уровне доз вводят более одной однократной дозы, то это означает, что однократные дозы (при указанном уровне доз) являются одинаковыми, т.е. количество антитела, вводимого с каждой однократной дозой при (одном) уровне доз, является одним и тем же. Следовательно, при режиме наращивания дозы, за исключением начальной дозы, т.е. при первом введении антитела, однократная доза, вводимая при каждом однократном введении антитела, либо выше, чем доза при предшествующим введении антитела (для того, чтобы перейти на следующий более высокий уровень доз), либо остается такой же, что и при предшествующем введении антитела (для поддержания «существующего» уровня доз). При этом понятие «предшествующее введение» относится к введению (антитела), непосредственно предшествующему рассматриваемому введению (антитела). Например, в случае третьего введения (антитела) «предшествующее введение» представляет собой второе введение (антитела), но не первое введение (антитела); или в случае четвертого введения (антитела) «предшествующее введение» представляет собой третье введение (антитела), но не первое введение (антитела) или второе введение (антитела). Например, при режиме наращивания дозы (I) начальная доза может представлять собой наиболее низкую дозу и при каждом последующем введении (антитела) однократная доза может быть выше, чем при соответствующем предшествующем введении (антитела), так что при каждом уровне доз вводят только одну однократную дозу; или (II) при одном или нескольких (но не при всех) введениях (антитела) однократные дозы могут быть такими же, что и при соответствующем предшествующем введении (антитела) (так что при одном или нескольких уровнях доз, например, при каждом уровне доз, вводят более чем одну однократную дозу).

Предпочтительно комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят в течение одного или нескольких циклов обработки. В контексте настоящего изобретения цикл обработки представляет собой курс, включающий одну или несколько обработок, которые можно повторять согласно регулярному графику с периодами отдыха между ними. Например, комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить в течение одного цикла обработки (например, путем введения однократной дозы или повторных доз) и после этого можно осуществлять наблюдение за тем, имеет ли место рецидив рака или опухоли. В частности, если имеет место рецидив рака/опухоли, то можно осуществлять следующий цикл обработки. Однако следующий цикл обработки можно проводить также и в качестве профилактической меры. В частности, интервал между двумя обработками (например, между введениями двух однократных доз антитела и/или между введением двух однократных доз модулятора контрольной точки) в рамках одного цикла обработки предпочтительно не должен превышать один месяц (31 день), более предпочтительно не должен превышать 3 недели, в то время как интервал между концом одного цикла обработки и началом следующего цикла обработки (прежде всего, это относится к введению антитела и/или модулятора иммунной контрольной точки) должен составлять предпочтительно по меньшей мере один месяц, предпочтительно по меньшей мере два месяца, более предпочтительно по меньшей мере 3 месяца, еще более предпочтительно по меньшей мере 4 месяца и наиболее предпочтительно по меньшей мере 6 месяцев. Иными словами, интервал между двумя обработками/введениями (антитела и/или модулятора контрольной точки) в рамках одного цикла обработки предпочтительно составляет менее чем один месяц (например, не более двух или трех недель), в то время как интервал между двумя циклами обработки (касательно введения антитела и/или модулятора контрольной точки) предпочтительно составляет более чем один месяц (например, по меньшей мере два или три месяца).

Предпочтительно один цикл обработки включает (I) одно однократное введение или (II) введение одной начальной дозы (первое введение) и одно или несколько последующих введений антитела и/или модуляторов иммунной контрольной точки. Пациента можно подвергать одному однократному или различным циклам обработки. Каждый цикл обработки, как правило, включает от 2 до 28, предпочтительно от 2 до 20, более предпочтительно от 3 до 10 и еще более предпочтительно от 5 до 8, например, 6 или 7 однократных введений антитела и/или модулятора иммунной контрольной точки.

Предпочтительно один цикл обработки включает один или несколько уровней доз. Иными словами, предпочтительно один цикл обработки включает (I) повторное введение одних и тех же однократных доз (один уровень однократных доз) или (II) введение одной или нескольких увеличивающихся однократных доз (при этом при каждом уровне доз можно вводить одну или несколько однократных доз, как указано выше). В последнем случае уровни доз, следующие после начального уровня доз (введения(й) дозы, предназначенной для первого введения), как правило, выше чем начальный уровень доз. В частности, начальный уровень доз предпочтительно может предусматривать только одно однократное введение, т.е. наиболее низкую дозу вводят только один раз в самом начале цикла обработки/введения (первое введение). В этом случае однократная(ые) доза(ы) при одном или нескольких последующих введениях является(ются) более высокой(ими), чем начальная доза.

Иными словами, предпочтительно, когда в цикле обработки (начиная с введения начальной дозы и заканчивая введением конечной дозы) однократная доза при каждом однократном введении (за исключением начальной дозы) не ниже предшествующей введенной дозы, т.е. каждая последующая доза равна или больше, чем предшествующая. Более предпочтительно цикл обработки соответствует режиму наращивания дозы, описанному выше. Еще более предпочтительно, когда применяют более одного цикла обработки, каждый цикл обработки соответствует режиму наращивания дозы, описанному выше. При этом режим дозирования в каждом цикле обработки может быть одним и тем же или различным. Как описано выше, такой режим наращивания дозы может включать также дозы, которые равны предшествующей (т.е. введение более одной однократной дозы при одном (однократном) уровне доз). Например, более низкой может быть только начальная доза, а все последующие вводимые однократные дозы могут быть одинаковыми (и более высокими, чем начальная доза), или начальная доза может быть более низкой, однократная доза при втором введении может быть выше, чем начальная доза, но ниже, чем все последующие вводимые однократные дозы, при этом все последующие вводимые однократные дозы предпочтительно являются одинаковыми (и более высокими, чем начальная доза и вторая доза). Таким образом, предпочтительно, когда одна или несколько однократных доз, вводимых после начальной дозы, больше, чем однократная доза при предшествующем введении.

Конечная доза (уровень) в цикле обработки, как правило, соответствует наиболее высокой однократной дозе антитела, предназначенной для введения в одном цикле обработки; т.е. максимальной однократной дозе в цикле обработки. В частности, в конце цикла обработки можно вводить одну, две, три, четыре, пять или большее количество однократных доз, соответствующих максимальной однократной дозе.

В целом, основной принцип наращивания дозы состоит в том, чтобы не подвергать пациента воздействию субтерапевтических доз, сохраняя при этом безопасность и обеспечивая быстрое наращивание дозы. Предпочтительно в течение одного и того же цикла обработки ни одна из однократных доз не является более низкой, чем предшествующая.

Как правило, один цикл обработки включает по меньшей мере начальное (первое) введение и второе введение антитела и/или ингибитора иммунной контрольной точки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения один цикл обработки может включать начальное введение, второе введение, третье введение, четвертое введение, пятое введение и предпочтительно шестое введение антитела и/или ингибитора иммунной контрольной точки. В одном цикле обработки последующее введение антитела и/или ингибитора иммунной контрольной точки предпочтительно можно осуществлять через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день после предшествующего введения, предпочтительно последующее введение осуществляют через 2-15 дней после предшествующего введения, более предпочтительно последующее введение осуществляют через 2-10 дней после предшествующего введения, еще более предпочтительно последующее введение осуществляют через 3-8 дней после предшествующего введения.

В случае комбинации, содержащей модулятор иммунной контрольной точки, представленный в настоящем описании, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, представленное в настоящем описании, которая предназначена для применения согласно настоящему изобретению, модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело предпочтительно вводят примерно в одно и то же время.

Понятие «примерно в одно и то же время», применяемое в настоящем описании, означает, в частности, одновременное введение или, в частности, то, что сразу после введения модулятора иммунной контрольной точки вводят перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или сразу после введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела вводят модулятор иммунной контрольной точки. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что понятие «сразу после» включает промежуток времени, необходимый для подготовки ко второму введению, в частности, промежуток времени, необходимый для обнажения и дезинфекции места для второго введения, а также соответствующую подготовку «устройства для введения» (например, шприца, насоса и т.д.). Одновременное введение включает также введение, при котором периоды введения модулятора контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела перекрываются или при котором, например, один компонент (модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело) вводят в течение более продолжительного периода времени, такого как 30 мин, 1 ч, 2 ч или даже больше, например, путем инфузии, а другой компонент (модулятор контрольной точки или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело) вводят в определенный момент времени в пределах такого длинного периода времени. Введение модулятора иммунной контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела примерно в одно и то же время является особенно предпочтительным, если используют различные пути введения и/или введение осуществляют в различные места.

Предпочтительно также в случае комбинации, содержащей модулятор иммунной контрольной точки, представленный в настоящем описании, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, представленное в настоящем описании, которая предназначена для применения согласно настоящему изобретению, модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело вводят последовательно. Например, модулятор иммунной контрольной точки предпочтительно вводят перед введением перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела. Предпочтительно также, если модулятор иммунной контрольной точки вводят после перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела.

При последовательном введении интервал времени между введениями первого компонента (модулятора контрольной точки или перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) и введением второго компонента (другого модулятора контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) предпочтительно составляет не более одной недели, более предпочтительно не более 3 дней, еще более предпочтительно не более 2 дней и наиболее предпочтительно не более 24 ч. Наиболее предпочтительно, если модулятор контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело вводят в один и тот же день с интервалом времени между введением первого компонента (модулятора контрольной точки или перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) и введением второго компонента (другого из указанных модулятора контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела) составляет предпочтительно не более 6 ч, более предпочтительно не более 3 ч, еще более предпочтительно не более 2 ч и наиболее предпочтительно не более 1 ч.

Однако, наиболее предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки вводят после перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки вводят по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Иными словами, в предпочтительном варианте осуществления изобретения интервал между введением перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и или его антигенсвязывающего фрагмента (вводимого первым) и введением модулятора иммунной контрольной точки (вводимого после антитела) составляет по меньшей мере 6 ч, предпочтительно по меньшей мере 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере 48 ч. Например, (в цикле обработке или в общем случае) первое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В качестве другого примера (в цикле обработки или в общем случае) конечное введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после конечного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Наиболее предпочтительно (в цикле обработки или в общем случае) каждое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после каждого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Следовательно, наиболее предпочтительно, если (в цикле обработки или в общем случае) (I) первое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и (II) конечное введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 18 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после конечного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Предпочтительно также, если модулятор иммунной контрольной точки вводят не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Иными словами, в предпочтительном варианте осуществления изобретения интервал между введением перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (вводимого первым) и введением модулятора иммунной контрольной точки (вводимого после антитела) составляет не более 96 ч, предпочтительно не более 84 ч, более предпочтительно не более 72 ч и наиболее предпочтительно не более 60 ч. Например, (в цикле обработки или в общем случае) первое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом примере (в цикле обработки или в общем случае) конечное введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после конечного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Наиболее предпочтительно (в цикле обработки или в общем случае) каждое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после каждого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Следовательно, наиболее предпочтительно, если (в цикле обработки или в общем случае) (I) первое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и (II) конечное введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют не более чем через 96 ч, предпочтительно не более чем через 84 ч, более предпочтительно не более чем через 72 ч и наиболее предпочтительно не более чем через 60 ч после конечного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Наиболее предпочтительно (в цикле обработки или в общем случае) (I) первое введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют через 12-96 ч, предпочтительно 24-84 ч, более предпочтительно 36-72 ч и наиболее предпочтительно 48-60 ч после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или (II) конечное введение модулятора иммунной контрольной точки осуществляют через 12-96 ч, предпочтительно 24-84 ч, более предпочтительно 36-72 ч и наиболее предпочтительно 48-60 ч после конечного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что имеет место повышение экспрессии молекул иммунных контрольных точек после активации Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами, представленными в настоящем описании. Как продемонстрировано в примере 2 настоящего описания, активация Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами, представленными в настоящем описании, повышает экспрессию молекулы иммунной контрольной точки, прежде всего CTLA-4, которая считается «лидером» среди ингибирующих молекул иммунных контрольных точек, описанных выше, которая достигает пика через 48-72 ч после введения антитела. Эти данные свидетельствуют о том, что активацию Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами, представленными в настоящем описании, которая имеет решающее значение при лечении раковых и опухолевых заболеваний, можно пролонгировать прежде всего в том случае, если модулятор иммунной контрольной точки оказывает свое действие тогда, когда экспрессия молекул иммунных контрольных точек повышается или даже достигает пика. Описанный выше предпочтительный порядок введения (сначала антитело, затем модулятор иммунной контрольной точки) и временные интервалы основаны на указанных данных и представляют собой графики введения, которые, как ожидается, должны приводить к пролонгированной активации Т-клеток и, следовательно, к повышенной эффективности при лечении раковых и/или опухолевых заболеваний.

Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят в терапевтически эффективном количестве. Понятие «терапевтически эффективное количество», применяемое в настоящем описании, означает количество, которое достаточно для облегчения симптомов заболевания или состояния, подлежащего лечению, или для ингибирования или замедления прогрессирования заболевания. Иными словами, «терапевтически эффективное количество» означает количество перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и/или модулятора контрольной точки, которое достаточно для индукции положительного изменения заболевания или нарушения, т.е. количество перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и/или модулятора контрольной точки, которое вызывает желательный биологический или медицинский ответ в ткани, системе, организме животного или человека. Понятие включает также количество перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и/или модулятора контрольной точки, достаточное для уменьшения прогрессирования заболевания, особенно для снижения или ингибирования роста опухоли и, следовательно, для вызывания желательного (иммунного) ответа (т.е. «эффективное в отношении ингибирования количество»). Однако, в то же самое время «терапевтически эффективное количество» предпочтительно является достаточно малым для того, чтобы избежать серьезных побочных действий, то есть для обеспечения разумного соотношения между пользой и риском. Определение этих пределов, как правило, осуществляют на основе рациональной медицинской оценки. Кроме того, «терапевтически эффективное количество» перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и/или модулятора контрольной точки можно варьировать в зависимости от конкретного ракового состояния, подлежащего лечению, а также от возраста и физического состояния пациента, подлежащего лечению, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени ведения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств, активности конкретных компонентов (модулятора контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела), серьезности состояния, продолжительности лечения, природы сопутствующей терапии, конкретного применяемого фармацевтически приемлемого носителя и подобных факторов, что может осуществлять на основе своих знаний и опыта осуществляющий лечение врач.

Таким образом, дозы, вводимые индивидууму как однократно, так и многократно, должны варьироваться в зависимости от многих факторов, включая фармакокинетические свойства, состояние индивидуума и его характеристики (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, конституцию), уровень симптомов, одновременно проводимые лечения, частота обработок и желаемое действие.

Предпочтительно для лечения рака терапевтически эффективная однократная доза перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, входящего в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, составляет от примерно 0,001 до 10 мг, предпочтительно от примерно 0,01 до 5 мг, более предпочтительно от примерно 0,1 до 2 мг на инъекцию или от примерно 1 нмоля до 1 ммоля на инъекцию, в частности, от 10 нмолей до 100 мкмолей на инъекцию, предпочтительно от 0,1 до 10 мкмолей на инъекцию. Предпочтительно также терапевтически терапевтически эффективная однократная доза перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, входящего в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, составляет (на килограмм веса тела), в частности для лечения рака, от примерно 0,01 до 100 мкг/кг, предпочтительно от примерно 0,1 до 50 мкг/кг, более предпочтительно от примерно 1 до 25 мкг/кг, еще более предпочтительно от примерно 2 до 20 мкг/кг и наиболее предпочтительно от примерно 2,5 до 5 мкг/кг.

Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленный в настоящем описании, вводят в виде однократной дозы в диапазоне от 0,1 до 5000 мкг, предпочтительно в виде однократной дозы в диапазоне от 1 до 1000 мкг, более предпочтительно в виде однократной дозы в диапазоне от 2 до 750 мкг, еще более предпочтительно в виде однократной дозы в диапазоне от 3 до 700 мкг, еще более предпочтительно в виде однократной дозы в диапазоне от 5 до 600 мкг и наиболее предпочтительно в виде однократной дозы в диапазоне от 10 до 500 мкг.

В контексте настоящего изобретения «однократная доза» (или «каждая доза») представляет собой индивидуальную дозу, которую вводят одному пациенту в один момент времени.

Наиболее предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят в виде однократной дозы, составляющей не более 1 мг, предпочтительно не более 0,9 мг, более предпочтительно не более 0,8 мг, еще более предпочтительно не более 0,75 мг, еще более предпочтительно не более 0,6 мг и наиболее предпочтительно не более 0,5 мг.

Предпочтительно начальная доза антитела или его антигенсвязывающего фрагмента находится в диапазоне от 0,5 до 200 мкг, предпочтительно от 1 до 150 мкг, более предпочтительно от 2 до 100 мкг, наиболее предпочтительно от 5 до 70 мкг. Начальная доза представляет собой однократную дозу при первом введении и предпочтительно она является наименьшей дозой в одном цикле обработки.

Предпочтительно первый последующий уровень доз антитела или его антигенсвязывающего фрагмента превышает начальный уровень дозы (количество, вводимое в качестве начальной дозы), предпочтительно в 1,1-10,0 раз, более предпочтительно в 1,2-5,0 раз и еще более предпочтительно в 1,5-3,0 раза, и необязательно второй последующий уровень доз и каждый последующий уровень доз превышает начальный уровень дозы (количество, вводимое в качестве начальной дозы) в 1,1-10,0 раз, предпочтительно в 1,5-5,0 раз.

Максимальную дозу (в цикле обработки) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента предпочтительно выбирают из диапазона 25-1000 мкг, предпочтительно 50-750 мкг более предпочтительно 75-500 мкг.

Предпочтительно терапевтически эффективная доза модулятора иммунной контрольной точки, входящего в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, составляет (на килограмм веса тела), в частности для лечения рака, от примерно 0,01 до 100 мг/кг, предпочтительно от примерно 0,05 до 50 мг/кг, более предпочтительно от примерно 0,1 до 25 мг/кг, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до 15 мг/кг и наиболее предпочтительно от примерно 1 до 10 мг/кг.

Перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, можно вводить с помощью различных путей введения, например, системно или местно. Пути системного введения в целом включают, например, чрескожный, оральный и парентеральный пути, который включает подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, внутрикожный и внутрибрюшинный и/или интраназальный пути введения. Пути локального введения в целом включают, например, пути местного введения, а также введение непосредственно в область поражения, такое как внутриопухолевое введение.

Предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят с помощью парентерального пути введения. Более предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят посредством внутривенного, внутриопухолевого, внутрикожного, подкожного, внутримышечного, интраназального или интранодального пути. Еще более предпочтительно, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят внутривенно и/или подкожно.

Предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят посредством одного и того же пути введения, предпочтительно посредством парентерального пути введения, более предпочтительно внутривенно и/или подкожно.

Однако, предпочтительно также, когда перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят посредством различных путей введения, предпочтительно посредством различных парентеральных путей введения, более предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят внутривенно, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят посредством внутриопухолевого, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или интранодального пути, предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, вводят подкожно.

Перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, могут находиться в составе одной и той же или различных композиций.

Предпочтительно перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, входящее в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, и модулятор иммунной контрольной точки, входящий в комбинацию, предназначенную для применения согласно настоящему изобретению, находятся в различных композициях. При этом для перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и для модулятора контрольной точки можно применять различные другие компоненты, например, различные наполнители. Кроме того, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело и модулятор иммунной контрольной точки можно вводить посредством различных путей введения, и дозы (прежде всего конкретные дозы) можно регулировать в соответствии с фактическими требованиями.

Однако, предпочтительно также, когда модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело находятся в составе одной и той же композиции. Такая композиция, содержащая и модулятор иммунной контрольной точки, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, описана более подробно ниже («композиция, предлагаемая в настоящем изобретении»).

Вне зависимости от того, содержит ли композиция только модулятор иммунной контрольной точки (и не содержит перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело), только перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (и не содержит модулятор контрольной точки), или содержит оба компонента, такая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию.

В частности, такая композиция, которая содержит только модулятор иммунной контрольной точки (и не содержит перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело), только перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (и не содержит модулятор контрольной точки), или содержит оба компонента, предпочтительно представляет собой (фармацевтическую) композицию, которая необязательно содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель, или любой эксципиент, буфер, стабилизатор или иные материалы, хорошо известные специалистам в данной области.

В контексте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу фармацевтической композиции. Понятие «совместимый», применяемое в настоящем описании, означает, что указанные компоненты фармацевтической композиции можно смешивать с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, указанным выше, так, что при этом в обычных условиях применения не имеет места взаимодействия, которое может существенно снижать фармацевтическую эффективность фармацевтической композиции. Фармацевтически приемлемые носители и наполнители естественно должны иметь достаточно высокую чистоту и обладать достаточно низкой токсичностью для того, чтобы они были пригодны для введения индивидууму, подлежащему лечению.

Предпочтительно фармацевтическая композиция находится в форме лиофилизированного порошка или в форме жидкой композиции, предпочтительно в форме водного раствора. Таким образом, фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно поставлять в виде безводного лиофилизированного порошка или более предпочтительно в виде раствора (в виде раствора в наполнителе). Если производитель поставляет ее в виде лиофилизированного порошка, то ее, как правило, растворяют в соответствующем растворе (в водном растворе; таком как вода для инъекций или соляной раствор, необязательно забуференный, например, ЗФР) незадолго до введения. Флаконы с жидким лекарственным средством могут быть предназначены для однократного применения или для многократного применения.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения модулятор контрольной точки, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело и/или фармацевтическая композиция (содержащая один или оба компонента) не являются лиофилизированными. Так, предпочтительно, если модулятор контрольной точки, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, и/или фармацевтическая композиция (содержащая один или оба компонента) не являются лиофилизированными, а поставляются в растворе, предпочтительно в водном растворе, более предпочтительно в водном забуференном растворе.

Так, наиболее предпочтительно, если фармацевтическая композиция поставляется в жидкой форме. Таким образом, фармацевтически приемлемый носитель, как правило, должен содержать один или несколько (совместимых) фармацевтически приемлемых жидких носителей. Примеры (совместимых) фармацевтически приемлемых жидких носителей включают свободную от пирогенов воду, изотонические соляные или забуференные (водные) растворы, например, забуференные цитратом растворы; полиолы, такие, например, как полипропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновую кислоту, другие неорганические или органические полимеры, такие как PLGA, предпочтительно для обеспечения эффекта пролонгированного высвобождения присутствующего действующего вещества. Предпочтительно в жидкой фармацевтической композиции носитель может представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонические соляные или забуференные (водные) растворы, например, забуференные цитратом растворы, например, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. растворы. В частности, для инъекции или инстилляции фармацевтической композиции предпочтительно можно применять воду или предпочтительно буфер, более предпочтительно водный буфер, такой как цитратный буфер.

Следовательно, предпочтительно фармацевтическая композиция содержит буфер, предпочтительно содержащий органическую кислоту буфер (т.е. буфер на основе органической кислоты), такой как цитратный буфер, сукцинатный буфер и тартратный буфер, более предпочтительно фармацевтическая композиция содержит цитратный буфер. Таким образом, буфер на основе органической кислоты предпочтительно выбирают из группы, состоящей из цитратного буфера, сукцинатного буфера, тартратного буфера и фосфат-цитратного буфера, более предпочтительно выбирают из группы, состоящей из цитратного буфера, сукцинатного буфера и тартратного буфера. Наиболее предпочтительно буфер представляет собой цитратный буфер. Как правило, буфер может (также) содержать натриевую соль, предпочтительно по меньшей мере 30мМ натриевую соль, кальциевую соль, предпочтительно по меньшей мере 0,05 мМ кальциевую соль, и/или необязательно калиевую соль, предпочтительно по меньшей мере 1 мМ калиевую соль. Натриевая, кальциевая и/или калиевая соли могут находиться в форме их галогенидов, например, хлоридов, йодидов или бромидов, в форме их гидроксидов, карбонатов, бикарбонатов или сульфатов и т.д. Примеры натриевых солей включают (но, не ограничиваясь только ими), например, NaCl, NaI, NaBr, Na₂CO₃, NaHCO₃, Na₂SO₄, примеры необязательных калиевых солей включают, например KCl, KI, KBr, K₂CO₃, KHCO₃, K₂SO₄, а примеры кальциевых солей включают, например, CaCl₂, CaI₂, CaBr₂, СаСО₃, CaSO₄, Са(ОН)₂. Кроме того, в буфере могут содержаться органические анионы указанных выше катионов.

Фармацевтическая композиция может содержать также соляной раствор (0,9% NaCl), лактированный раствор Рингера или ЗФР (забуференный фосфатом соляной раствор). Например, фармацевтическая композиция может поставляться в виде маточного раствора антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в соответствующем буфере, таком как указанный выше буфер на основе органической кислоты, предпочтительно цитратный буфер, и лишь непосредственно перед введением этот маточный раствор можно разводить соляным раствором (0,9% NaCl), лактированным раствором Рингера или ЗФР до достижения концентрации антитела, требуемой для введения.

Кроме того, для фармацевтической композиции можно применять также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей, или капсулирующих соединений, которые пригодны для введения индивидууму, подлежащему лечению. Другие примеры соединений, которые могут содержаться в фармацевтической композиции, включают сахара, такие, например, как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие, например, как кукурузный крахмал или картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие, например, как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; жир; твердые вещества, улучшающие скольжение, такие, например, как стеариновая кислота, стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие, например, как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло из теобромы; полиолы, такие, например, как полипропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновую кислоту. Кроме того, при необходимости можно включать консерванты, стабилизаторы, антиоксиданты и/или другие добавки. Таким образом, фармацевтическая композиция может содержать также стабилизаторы, такие как Tween® 80 или Tween® 20. Необязательно, в фармацевтической композиции могут содержаться также эксципиенты, придающие антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, представленному в настоящем описании, способность к пролонгированному высвобождению.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция не содержит других компонентов помимо (I) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, или модулятора иммунной контрольной точки, представленного в настоящем описании; (II) буфера, представленного в настоящем описании; и необязательно (III) воды для инъекций, соляного раствора и/или ЗФР.

Композиции, прежде всего фармацевтические композиции, представленные в настоящем описании, можно адаптировать для доставки путем повторного введения.

Другие материалы, а также методы приготовления препаративных форм и т.п., которые можно применять в контексте композиций, прежде всего фармацевтических композиций, или в контексте их получения, представлены в части 5 Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22-е издание, 2012 г., изд-во University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins.

Индивидуум, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой человека или животное кроме человека, в частности, млекопитающее или человека. Более предпочтительно индивидуум, подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой человека. Предпочтительно индивидуумы представляют собой пациентов, у которых диагностирован рак. Например, согласно настоящему изобретению можно лечить молодых (возрастом менее 15 лет) или пожилых (возрастом более 60 лет) пациентов. В случае пожилых пациентов наиболее предпочтительно вводить лекарственное средство тем путем, который назначил лечащий врач, поскольку при этом гарантируется соблюдение режима и схемы лечения. В то же время, введение предпочтительно должно быть безболезненным.

В целом, наибольшую пользу от применения комбинации перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела и ингибитора иммунной контрольной точки, предлагаемой в изобретении, могут получать пациенты с раковым заболеванием безотносительно к их возрасту, которые предпочтительно не подвергаются иммуносупрессорному лечению.

Комбинация с глюкокортикоидом

Предпочтительно комбинация, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению, которая представлена в настоящем изобретении, дополнительно содержит

(III) глюкокортикоид.

Иными словами, предпочтительная комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит

(I) модулятор иммунной контрольной точки;

(II) (выделенное) перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий:

(а) специфичность в отношении антигена Т-клеточной поверхности;

(б) специфичность в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена; и

(в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb;

(III) глюкокортикоид,

и она предназначена для применения для терапевтического лечения ракового заболевания.

Следует понимать, что предпочтительные варианты модулятора иммунной контрольной точки, указанные выше, предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, указанные выше, а также предпочтительные варианты комбинации или применения (например, касательно получения, подлежащих лечению заболеваний, введения и т.д.), указанные выше, применимы соответственно к комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, которая дополнительно содержит глюкокортикоид.

Глюкокортикоиды (GC) относятся к классу кортикостероидов, которые связываются с рецептором глюкокортикоида. GC являются компонентом механизма обратной связи в иммунной системе, который снижает определенные проявления иммунной функции, например, уменьшает воспаление. Даже несмотря на то, что, как хорошо известно, GC влияют на некоторые патологические механизмы в раковых клетках и поэтому GC применяют в высоких дозах для лечения определенных типов рака (например, лимфом и лейкозов, в этих случаях GC оказывают ингибирующие воздействия на пролиферацию лимфоцитов), в контексте настоящего изобретения глюкокортикоиды вводят не с целью лечения самого ракового или опухолевого заболевания, а для снижения побочных действий перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или модулятора иммунной контрольной точки. Следовательно, согласно настоящему изобретению глюкокортикоид не вводят ни в качестве (I) индивидуального средства для лечения рака, ни (II) в качестве компонента режима химиотерапии для лечения рака, такого как С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, прокарбазин и преднизон), CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон), m-BACOD (метотрексат, блеомицин, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и леуковорин) и МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и леуковорин). В частности, комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно не содержит (другой) химиотерапевтический агент, такой как циклофосфамид, винкристин, прокарбазин, доксорубицин, метотрексат и блеомицин. Кроме того, раковое заболевание, подлежащее лечению с помощью комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, может не включать лимфомы и/или лейкозы, прежде всего в том случае, если комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит глюкокортикоид. Иными словами, предпочтительно с помощью комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, прежде всего в том случае, если комбинация содержит глюкокортикоид, можно лечить раковое заболевание, отличное от лимфом и/или лейкозов.

Предпочтительно глюкокортикоид выбирают из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, триамцинолона, бетаметазона, дексаметазона, кортизона ацетата, преднилидена, дефлазакорта, клопреднола, флуокортолона и буденосида.

Наиболее предпочтительно глюкокортикоид представляет собой дексаметазон. Дексаметазон обладает очень сильной глюкокортикоидной активностью, в то время как минералокортикоидная активность у него практически отсутствует. Следовательно, дексаметазон является очень сильным глюкокортикоидом. Кроме того, дексаметазон представляет собой глюкокортикоид, обладающий продолжительным действием (биологическое время полужизни составляет 36-54 ч) и, следовательно, является наиболее пригодным для обработок, требующих наличия продолжительной или непрерывной глюкокортикоидной активности. Дексаметазон наиболее пригоден среди других применений также и для пациентов, страдающих сердечной недостаточностью или гипертонией. Кроме того, терапевтически важной является сильная антифлогистическая и иммунносупрессорная (антиаллергическая) активность дексаметазона. Кроме того, преимуществом является то, что после i.v. инъекции дексаметазона максимальная концентрация в плазме достигается в течение нескольких минут.

Предпочтительно глюкокортикоид вводят внутривенно (i.v.) или орально (р.о.).

Дозу глюкокортикоида, как правило, выбирают в зависимости от типа применяемого глюкокортикоида. В случае дексаметазона однократная доза предпочтительно может находиться в диапазоне 1-100 мг, более предпочтительно в диапазоне 2-80 мг, еще более предпочтительно в диапазоне 5-70 мг и наиболее предпочтительно в диапазоне 10-50 мг, например, составлять 10, 20 или 40 мг, наиболее предпочтительно 10 или 20 мг. В случае преднизолона или преднизона доза, как правило, должна быть выше вследствие его более низкой эффективности. Например, однократная доза преднизолона или преднизона предпочтительно может находиться в диапазоне 50-500 мг, более предпочтительно в диапазоне 100-400 мг, еще более предпочтительно в диапазоне 150-300 мг и наиболее предпочтительно в диапазоне 200-250 мг. На основе хорошо известной глюкокортикоидной эффективности различных глюкокортикоидов специалисты в данной области могут легко найти аналогичные диапазоны доз для других глюкокортикоидов. Например, бетаметазон обладает практически такой же глюкокортикоидной активностью, что и дексаметазон, и, таким образом, его можно вводить практически в тех же самых дозах, в то время как, например, преднилиден обладает практически такой же глюкокортикоидной активностью, что и преднизон и преднизолон, и, таким образом, его можно вводить практически в тех же самых дозах.

В целом, глюкокортикоид можно вводить до перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или модулятора иммунной контрольной точки; примерно в то же самое время, что и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и/или модулятор иммунной контрольной точки; или после перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или модулятора иммунной контрольной точки. Предпочтительно глюкокортикоид вводят до введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и/или до введения модулятора иммунной контрольной точки. При этом предпочтительно, если глюкокортикоид вводят не более чем за 6 ч, предпочтительно не более чем за 5 ч, более предпочтительно не более чем за 4 ч, еще более предпочтительно не более чем за 3 ч, еще более предпочтительно не более чем за 2 ч и наиболее предпочтительно не более чем за 1 ч до введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или не более чем за 6 ч, предпочтительно не более чем за 5 ч, более предпочтительно не более чем за 4 ч, еще более предпочтительно не более чем за 3 ч, еще более предпочтительно не более чем за 2 ч и наиболее предпочтительно не более чем за 1 ч до введения модулятора иммунной контрольной точки.

Например, при применении в комбинации с предпочтительным вариантом введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) и модулятора иммунной контрольной точки, описанным выше, в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения сначала вводят глюкокортикоид, а затем перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), который можно вводить, например, не более чем через один или два часа после введения глюкокортикоида, и затем вводят модулятор иммунной контрольной точки, например, по меньшей мере через 6 ч, предпочтительно по меньшей мере через 12 ч, более предпочтительно по меньшей мере через 24 ч, еще более предпочтительно по меньшей мере через 36 ч и наиболее предпочтительно по меньшей мере через 48 ч после введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента). Необязательно глюкокортикоид можно вводить также перед введением модулятора иммунной контрольной точки, например, не более чем за один или два часа до введения модулятора иммунной контрольной точки.

Согласно графикам обработки, требующим повторного введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) и/или модулятора иммунной контрольной точки, глюкокортикоид предпочтительно вводят по меньшей мере до увеличения дозы антитела/модулятора контрольной точки (например, при первом введении каждого уровня доз согласно режиму наращивания дозы). Более предпочтительно глюкокортикоид вводят до каждого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) и/или модулятора иммунной контрольной точки. Следовательно, описанный выше наиболее предпочтительный вариант графика введения предпочтительно применяют для каждого введения антитела/модулятора контрольной точки, включая, например, первое и/или конечное введение перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) и/или модулятора иммунной контрольной точки.

Предпочтительно также если глюкокортикоид вводят примерно в то же время, что и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и/или глюкокортикоид вводят примерно в то же время, что и модулятор иммунной контрольной точки. При этом выражение « примерно в то же время» имеет то же самое значение, которое указано выше (которое применяют в настоящем описании).

Набор, предназначенный для применения согласно настоящему изобретению

Одним из объектов настоящего изобретения является набор, в частности, набор компонентов, который содержит

(I) модулятор иммунной контрольной точки и

(II) (выделенное) перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который содержит:

(в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb;

предназначенный для применения для терапевтического лечения ракового заболевания, прежде всего у человека.

Прежде всего, такой набор, предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит (I) модулятор иммунной контрольной точки, описанный выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), и (II) перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, описанное выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению). Кроме того, такой набор предназначен для применения для терапевтического лечения ракового заболевания, указанного выше, прежде всего, у человека, как описано выше. Иными словами, предпочтительные варианты модулятора иммунной контрольной точки, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для набора, предлагаемого в настоящем изобретении. Таким образом, предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для набора, предлагаемого в настоящем изобретении. Кроме того, предпочтительные варианты применения для терапевтического лечения ракового заболевания, указанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для набора, предлагаемого в настоящем изобретении.

Например, модулятор иммунной контрольной точки и/или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, могут присутствовать в составе одной и той же композиции или в различных композициях, как описано выше.

Кроме того, с учетом предпочтительных однократных доз перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного выше, перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент предпочтительно присутствуют в наборе, предлагаемом в настоящем изобретении, в однократных дозах, где каждая однократная доза не превышает 1 мг, предпочтительно каждая однократная доза не превышает 0,9 мг, более предпочтительно каждая однократная доза не превышает 0,8 мг, еще более предпочтительно каждая однократная доза не превышает 0,75 мг и наиболее предпочтительно каждая однократная доза не превышает 0,5 мг.

Кроме того, набор, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит

(III) глюкокортикоид.

И в этом контексте также предпочтительные варианты глюкокортикоида, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для набора, предлагаемого в настоящем изобретении. Например, глюкокортикоид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, триамцинолона, бетаметазона, дексаметазон, ацетата кортизона, преднилидена, дефлазакорта, клопреднола, флуокортолона и буденосида, наиболее предпочтительно глюкокортикоид представляет собой дексаметазон, как описано выше.

Различные компоненты набора могут быть упакованы в один или несколько контейнеров. Указанные выше компоненты могут присутствовать в лиофилизированной или безводной форме, или могут быть растворены в пригодном буфере. Например, набор может содержать (фармацевтическую) композицию, содержащую модулятор иммунной контрольной точки, описанный выше, и (фармацевтическую) композицию, содержащую перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, описанное выше, при этом, например, каждая композиция может находиться в отдельном контейнере. Набор может содержать также (фармацевтическую) композицию, содержащую и модулятор иммунной контрольной точки, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, указанные выше.

Набор может содержать также дополнительные реагенты, включая, например, буферы для хранения и/или восстановления указанных выше компонентов, растворы для промывки и т.п.

Кроме того, состоящий из частей набор, предлагаемый в настоящем изобретении, необязательно может содержать инструкции по применению. Предпочтительно набор дополнительно содержит листовку-вкладыш в упаковку или этикетку с указаниями по лечению ракового заболевания, указанного в настоящем описании, с применением комбинации модулятора иммунной контрольной точки и перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела. Необязательно комбинация (и, следовательно, указания, данные в листовке-вкладыше в упаковку или этикетке, входящей в набор) могут дополнительно включать (III) глюкокортикоид, описанный выше. В частности, указания по применению комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, которая описана выше, могут включать режимы введения, описанные выше, прежде всего, их предпочтительные варианты.

Композиция, предназначенная для применения согласно настоящему изобретению

Другим объектом настоящего изобретения является также композиция, содержащая

(I) модулятор иммунной контрольной точки и

(в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb.

В частности, такая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит (I) модулятор иммунной контрольной точки, описанный выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), и (II) перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, описанное выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению). Иными словами, предпочтительные варианты модулятора иммунной контрольной точки, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Следовательно, предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Кроме того, композиция, содержащая модулятор иммунной контрольной точки, описанный выше, и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело, описанное выше, и предпочтительные варианты такой композиции описаны выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению). Таким образом, следует понимать, что это же самое описание, прежде всего, те же самые предпочтительные варианты осуществления изобретения, описанные выше для композиции, применимы для композиции, представленной в настоящем описании.

Например, композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно содержит

(III) глюкокортикоид.

И в этом контексте также предпочтительные варианты глюкокортикоида, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Например, глюкокортикоид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, триамцинолона, бетаметазона, дексаметазон, ацетата кортизона, преднилидена, дефлазакорта, клопреднола, флуокортолона и буденосида, наиболее предпочтительно глюкокортикоид представляет собой дексаметазон, как описано выше.

Предпочтительно композиция предназначена для применения в медицине, более предпочтительно композиция предназначена для применения при терапевтическом лечении ракового заболевания, прежде всего у человека. Следовательно, такая композиция предназначена для применения при терапевтическом лечении ракового заболевания, описанного выше, прежде всего у человека, как описано выше. Иными словами, предпочтительные варианты применения для терапевтического лечения ракового заболевания, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для композиции, предлагаемой в настоящем изобретении.

Таким образом, композиция предпочтительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительные примеры такого фармацевтически приемлемого носителя описаны выше.

Предпочтительно также, когда (фармацевтическую) композицию применяют в способе лечения индивидуума, предпочтительно человека, который страдает раковым заболеванием.

Способ и комбинированная терапия, предлагаемые в настоящем изобретении

Другим объектом настоящего изобретения является способ терапевтического лечения рака или инициации, усиления или пролонгирования противоопухолевого ответа у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму

(I) модулятора иммунной контрольной точки и

(II) (выделенного) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который содержит:

В частности, такой способ, предлагаемый в настоящем изобретении, включает введение I) модулятора иммунной контрольной точки, описанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), и (II) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению). Кроме того, такой способ можно применять для терапевтического лечения ракового заболевания, описанного выше, прежде всего у человека, как описано выше. Иными словами, предпочтительные варианты модулятора иммунной контрольной точки, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Таким образом, предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Кроме того, предпочтительные варианты применения для терапевтического лечения ракового заболевания, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению) являются также предпочтительными для способа, предлагаемого в настоящем изобретении.

Например, модулятор иммунной контрольной точки и/или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут находиться в составе одной и той же композиции или в различных композициях, описанных выше. В качестве другого примера, способ, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно включает введение индивидууму

(III) глюкокортикоида.

И в этом контексте также предпочтительные варианты глюкокортикоида, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для способа, предлагаемого в настоящем изобретении. Например, глюкокортикоид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, триамцинолона, бетаметазона, дексаметазон, ацетата кортизона, преднилидена, дефлазакорта, клопреднола, флуокортолона и буденосида, наиболее предпочтительно глюкокортикоид представляет собой дексаметазон, как описано выше.

Предпочтительно индивидуум приставляет собой человека, у которого диагностирован рак.

Кроме того, предпочтительные варианты режима введения, описанные выше в контексте комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, применимы также к способу, предлагаемому в настоящем изобретении. Таким образом, введение (I) модулятора иммунной контрольной точки, и/или (II) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или необязательно (III) глюкокортикоида предпочтительно осуществляют как описано выше.

Другим объектом настоящего изобретения является также способ пролонгирования активации Т-клеток у индивидуума, включающий введение индивидууму комбинации:

(I) модулятора иммунной контрольной точки и

При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент), представленное в настоящем описании, индуцирует повышение экспрессии молекул иммунных контрольных точек, таких как CTLA-4 (ср. пример 2, фиг. 2). А именно, как продемонстрировано в примере 2 настоящего описания, активация Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами, указанными в настоящем описании, повышала экспрессию молекулы иммунной контрольной точки, в частности CTLA-4, которая считается «лидером» среди ингибиторных иммунных контрольных точек, описанных выше. В целом, активация Т-клеток перенаправляющими Т-клетки многофункциональными антителами, указанными в настоящем описании, имеет решающее значение при лечении раковых и опухолевых заболеваний. Молекулы иммунных контрольных точек, такие как CTLA-4, противодействуют активации Т-клеток, прежде всего, вследствие их повышенной экспрессии. Следовательно, введение модулятора иммунной контрольной точки пролонгирует активацию Т-клеток перенаправляющим Т-клетки многофункциональным антителом (или его антигенсвязывающим фрагментом), поскольку оно противодействует повышению экспрессии молекулы иммунной контрольной точки, которое может - при отсутствии модулятора иммунной контрольной точки - прекращать (или по меньшей мере снижать) опосредуемую антителом активацию Т-клеток.

В частности, такой способ, предлагаемый в настоящем изобретении, включат введение (I) модулятора иммунной контрольной точки, описанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), (II) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), и необязательно (III) глюкокортикоида, описанного выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению). Иными словами, предпочтительные варианты модулятора иммунной контрольной точки, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными в способе, предлагаемом в настоящем изобретении. Таким образом, предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными в способе, предлагаемом в настоящем изобретении. Кроме того, предпочтительные варианты применения при терапевтическом лечении ракового заболевания, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными в способе, предлагаемом в настоящем изобретении (включая, например, предпочтительный режим введения).

Другим объектом настоящего изобретения является также комбинированная терапия для терапевтического лечения рака, где комбинированная терапия включает введение

(I) модулятора иммунной контрольной точки и

Предпочтительные варианты такой комбинированной терапии включают предпочтительные варианты перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, описанные выше, варианты модулятора контрольной точки, описанные выше, и/или - в более широком плане - предпочтительные варианты комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению. Набор, предлагаемый в настоящем изобретении, и (фармацевтическую) композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно применять в способе и/или в комбинированной терапии, предлагаемом/предлагаемой в настоящем изобретении.

Например, модулятор иммунной контрольной точки и/или перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут находиться в составе одной и той же композиции или в различных композициях, описанных выше. В качестве другого примера, комбинированная терапия, предлагаемая в настоящем изобретении, предпочтительно включает введение индивидууму

(III) глюкокортикоида.

И в этом контексте также предпочтительные варианты глюкокортикоида, описанные выше (в контексте комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению), являются также предпочтительными для комбинированной терапии, предлагаемой в настоящем изобретении. Например, глюкокортикоид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из преднизона, преднизолона, метилпреднизолона, триамцинолона, бетаметазона, дексаметазон, ацетата кортизона, преднилидена, дефлазакорта, клопреднола, флуокортолона и буденосида, наиболее предпочтительно глюкокортикоид представляет собой дексаметазон, как описано выше.

Индивидуумы, которых подлежащие лечению с применением такой комбинированной терапии, представляют собой тех же индивидуумов, которые указаны при описании комбинации, предназначенной для применения согласно настоящему изобретению. Предпочтительно модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят человеку.

Кроме того, предпочтительные варианты режимов введения, описанные выше в контексте комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, применимы также для комбинированной терапии, предлагаемой в настоящем изобретении. Таким образом, введение (I) модулятора иммунной контрольной точки и/или (II) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или необязательно (III) глюкокортикоида предпочтительно осуществляют как описано выше.

Краткое описание чертежей

Ниже представлено краткое описание прилагаемых чертежей. Чертежи приведены для более подробной иллюстрации настоящего изобретения. Но они никоим образом не направлены на ограничение сущности изобретения.

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическая иллюстрация предполагаемых механизмов, лежащих в основе терапевтической комбинации перенаправляющих Т-клетки трехфункциональных антител, которые содержат специфичность в отношении ассоциированного с опухолью антигена (ТАА) и специфичность в отношении Т-клетки (например, CD3), и антител, блокирующих молекулы контрольных точек. Т-клетки активируются и перенаправляются к таргетируемым опухолевым клеткам трехфункциональными антителами. После этого происходит элиминация опухолевых клеток посредством опосредуемых Т-клетками цитотоксических механизмов типа индукции апоптоза или опосредуемого перфорином лизиса клеток. Повышающая регуляция ингибиторных молекул иммунных контрольных точек типа CTLA-4 и PD-1 на цитотоксических Т-клетках (1) оказывает отрицательное воздействие на опосредуемую Т-клетками противоопухолевую активность. Блокирование ингибиторных молекул контрольных точек антителами, блокирующими молекулы контрольных точек, предупреждает понижающую регуляцию Т-клеток и стимулирует продолжительную активацию Т-клеток. Следовательно, происходит усиление деструкции опухолевых клеток (2);

на фиг. 2 - описанная в примере 2 индукция экспрессии CTLA-4 на Т-клетках, активированных трехфункциональными антителами. Т-клетки, выделенные из клеток мышиной селезенки, инкубировали (I) с трехфункциональным антителом Surek (1 мкг/мл), незрелыми дендритными клетками (5%), облученными опухолевыми клетками B78-D14 (2,5%; верхняя панель) или (II) с антителом BiLu (1 мкг/мл), незрелыми дендритными клетками (5%) и облученными опухолевыми клетками В16-ЕрСАМ (2,5%; нижняя панель) in vitro при 37°С в течение 3 дней. Для контроля проводили опыт без добавления трехфункционального антитела. Каждый день проводили измерение экспрессии CTLA-4 и CD69 на клеточной поверхности с помощью FACS-анализа, позволяющего различать CD4⁺ - и CD8⁺-T-клетки. Представлены обобщенные данные, полученные в трех независимых экспериментах. «Усами» (планками погрешности) показано стандартное отклонение;

на фиг. 3 - описанные в примере 3 результаты радикальной комбинированной терапии, полученные на модели меланомы линии B78-D14. Монотерапия с использованием НВ304 не давала терапевтического эффекта (А): Мышей (n=5) заражали путем внутрибрюшинного (i.p.) введения 5×10⁵ живых опухолевых клеток линии B78-D14 и вводили (i.p.) 100 мкг антитела НВ304 в дни 2 и 5 после инокуляции опухолевых клеток (группа Б) или подвергали контрольной обработке наполнителем (ЗФР) (группа А). Не было выявлено различия в общей выживаемости, все мыши погибли (р=0,4). Добавление НВ304 к Surek повышало его терапевтическую эффективность (Б): Мышей (n=10) заражали путем внутрибрюшинного (i.p.) введения 1×10⁵ живых опухолевых клеток линии B78-D14 и вводили либо только 50 мкг Surek (группа А), либо 50 мкг Surek+100 мкг НВ304 (группа Б) в дни 2 и 5. Контрольным мышам антитело не вводили (группа В). Общая выживаемость при монотерапии с использованием Surek возрастала с 60% до 90% при ее объединении с антителами НВ304 (р=0,08; log-ранговый критерий);

на фиг. 4 - описанные в примере 4 результаты радикальной комбинированной терапии, полученные на модели меланомы линии В16-ЕрСАМ. Мышей (n=10) заражали путем внутривенного введения (i.v.) 1×10⁵ живых опухолевых клеток линии В16-ЕрСАМ и обрабатывали либо 10 мкг трехфункционального антитела BiLu в дни 2 и 5 (группа Б), либо 100 мкг блокирующего CTLA-4 антитела НВ304 в дни 9, 12, 19, 26, 33, 40 (группа Г), либо мышей подвергали соответствующей комбинированной обработке с использованием BiLu+НВ304 (группа В). Контрольных мышей не обрабатывали антителом (группа А).

Примеры

Ниже представлены конкретные примеры, иллюстрирующие различные варианты осуществления изобретения и объекты изобретения. Однако, объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления изобретения, представленными в настоящем описании. Представленные ниже препараты и примеры даны для того, чтобы специалисты в данной области могли более ясно понимать и воплощать на практике настоящее изобретение. Объем настоящего изобретения, однако, не ограничивается представленными в качестве примера вариантами осуществления изобретения, которые следует рассматривать только как иллюстрации отдельных объектов изобретения, и способы, функционально эквивалентные представленным в описании, подпадают под объем изобретения. Фактически, различные модификации изобретения в дополнение к представленным в настоящем описании, должны стать очевидными специалистам в данной области на основе приведенного выше описания и прилагаемых чертежей, и представленных ниже примеров. Все такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Создание трехфункциональных антител

Трехфункциональные антитела («TrAb») получали с помощью технологии квадромы, описанной у Ruf P., Lindhofer Н., Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific antibody. Blood. 98, 2001, cc. 2526-2534; Ruf P.,

В.,

N., Mocikat R., Hess J.,

M., Wosch S., Suckstorff I., Zehetmeier C., Lindhofer H., Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine. 10, 2012, c. 219). Полученные из квадром супернатанты очищали с помощью хроматографии на белке А, применяя последовательное элюирование с изменением рН, а затем стадию очистки с помощью катионообменной хроматографии. Антитело Surek (

N., Ruf Р., Mysliwietz J., Lindhofer H., Mocikat R., Trifunctional bispecific antibody induce tumor-specific T cells and elicit a vaccination effect. Cancer research.; 72, 2012, cc. 3958-3966; Ruf P.,

В.,

N., Mocikat R., Hess J.,M.,

Wosch S., Suckstorff I., Zehetmeier C, Lindhofer H., Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model. Journal of translational medicine; 10, 2012, c. 219;

N., Mysliwietz J., Deppisch N., Ruf P., Lindhofer H., Mocikat R., Potential of the trifunctional bispecific antibody surek depends on dendritic cells: rationale for a new approach of tumor immunotherapy. Molecular medicine.; 19, 2013, cc. 54-61; Deppisch N., Ruf P.,

N., Neff F., Buhmann R., Lindhofer H., Mocikat R., Efficacy and tolerability of a GD2-directed trifunctional bispecific antibody in a preclinical model: Subcutaneous administration is superior to intravenous delivery. Molecular cancer therapeutics.; 14, 2015, cc. 1877-1883) представляет собой trAт, которое создавали путем слияния родительских гибридом 17А2 (крысиное антитело в виде IgG2b к мышиному CD3) и Ме361 (мышиное антитело в виде IgG2a к GD2) (Ruf Р.,

М., Ellwart J., Wosch S., Kusterer E., Lindhofer H., Two new trifunctional antibodies for the therapy of human malignant melanoma. International journal of cancer. 2004; 108: 725-732). BiLu (Ruf P, Lindhofer H. Induction of a long-lasting antitumor 10 immunity by a trifunctional bispecific antibody. Blood.; 98, 2001, cc. 2526-2534), содержит такую же анти-СБ3-специфичность и дополнительно включает связывающее плечо мышиного IgG2a, распознающее человеческий ЕрСАМ, полученное из клона С215. Для получения НВ304 (антитело к мышиному CTLA-4) применяли клон гибридомы хомяка UC10-4F10-11 (Walunas T.L., Lenschow 15 D.J., Bakker C.Y., Linsley P.S., Freeman G.J., Green J.M., Thompson C.B., Bluestone J.A., CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity.; 1, 1994, cc. 405-413). Линии клеток культивировали в не содержащей белок среде, имеющей определенный химический состав. Все антитела создавали на фирме Trion Research GmbH. 20

Пример 2: CTLA-4 подвергается повышающей регуляции после индуцированной trAт активации Т-клеток

Для исследования того, имеет ли место повышающая регуляция молекулы иммунной контрольной точки CTLA-4 на поверхности Т-клеток, активированных нацеленными на опухоль трехфункциональными антителами, 25 обогащенные Т-клетки из клеток мышиной селезенки инкубировали с трехфункциональными антителами (Surek или BiLu, ср. пример 1; 1 мкг/мл), их соответствующими некомпетентными в отношении пролиферации (облученными) опухолевыми клетками-мишенями B78-D14 (2,5%; в случае Surek) или В16-ЕрСАМ (2,5%; в случае BiLu), и незрелыми дендритными 30 клетками (5%) in vitro при 37°С в течение 3 дней.

В целом процедура заключалась в следующем: клетки B78-D14 (Haraguchi М., Yamashiro S., Yamamoto A., Furukawa K., Takamiya K., Lloyd K.О., Shiku Н., Furukawa K., Isolation of GD3 synthase gene by expression cloning of GM3 alpha-2,8-sialyltransferase cDNA using anti-GD2 monoclonal antibody. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America.; 91, 1994, cc. 10455-10459) и B16-EpCAM (Ruf P., Lindhofer H., Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific antibody. Blood.; 98, 2001, cc. 2526-2534) выращивали в среде RPMI 1640, дополненной 8,9% и 5% соответственно фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия и 1-кратным количеством заменимых аминокислот. Затем к B78-D14 добавляли 400 мкг/мл G418 и 500 мкг/мл гигромицина В. Клетки интенсивно промывали в ЗФР перед применением. Идентичность клеточных линий регулярно подтверждали на основе морфологии клеток и экспрессии трансгенов. Незрелые DC получали путем культивирования предшественников (клеток) костного мозга из мышей линии C57BL/6 в среде RPMI 1640, дополненной 20% FCS, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом, пируватом натрия и заменимыми аминокислотами в присутствии 100 нг/мл колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF). Среду заменяли в каждый второй день, клетки замораживали при -140°С в день 7. Замороженные DC подвергали оттаиванию, подсчитывали и применяли непосредственно для анализа стимуляции Т-клеток. 4×10⁶ Т-клеток, которые были выделены из селезенок наивных мышей линии C57BL/6 путем пэннинга В-лимфоцитов, нагруженных антителами к IgG+M (фирма Dianova, Гамбург, Германия), культивировали совместно с 2×10⁵ DC и 10⁵ облученных (100 Гр) опухолевых клеток в 24-луночных планшетах в течение 3 дней. Добавляли trАт в концентрации 1 мкг/мл. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1-кратным количеством заменимых аминокислот, 10мМ HEPES и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом.

В контроли трехфункциональное антитело не добавляли. В моменты времени 0, 24, 48 и 72 ч измеряли экспрессию CTLA-4 на клеточной поверхности с помощью FACS-анализа, позволяющего различать CD4⁺ - и CD8⁺-Т-клетки, с использованием антитела НВ304. Конкретно, анализ Т-клеток осуществляли методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) с использованием проточного цитометра FACS Calibur и программы для анализа клеток Cell Quest (фирма BD Bioscience, Гейдельберг, Германия). Маркеры Т-клеточной поверхности окрашивали непосредственно флуоресцентно-меченными МАт к CD4 (клон RM4-5; фирма BD Biosciences) и CD8 (53-6.7, фирма eBioscience, Сан-Диего, США). Экспрессию CTLA-4 на клеточной поверхности измеряли с использованием флуоресцентно меченого антитела НВ304. Процент позитивных клеток определяли на основе сравнения с соответствующими контролями изотипа. Кроме того, оценивали статус активации Т-клеток путем измерения маркера активации Т-клеток CD69 (в моменты времени 0, 24, 48 и 72 ч) с помощью описанного выше FACS-анализа, при этом маркер Т-клеточной поверхности CD69 окрашивали непосредственно флуоресцентно меченным МАт (H1.2F3; фирма BD Bioscience).

Результаты представлены на фиг. 2. Оба трехфункциональных антитела индуцировали сильную активацию CD4⁺-, а также CD8⁺-T-клеток, после чего имела место повышающая регуляция CTLA-4. По сравнению с CD69, для которого пик достигался уже через 24 ч, экспрессия CTLA-4 была замедленной на 1-2 дня и достигала пика в период времени 48-72 ч. В неактивированных Т-клетках экспрессия CTLA-4 не была обнаружена. В целом, эти результаты четко демонстрируют, что после активации Т-клеток трехфункциональными антителами имеет место повышающая регуляция CTLA-4.

Пример 3: Непосредственное уничтожение опухоли усиливается при комбинированной обработке с помощью trAт и антитела к CTLA-4

Для оценки терапевтического/излечивающего потенциала комбинированной терапии с использованием трехфункциональных перенаправляющих Т-клетки антител и антител, блокирующих ингибиторные молекулы контрольных точек, применяли широко распространенную модель мышиной GD2⁺-меланомы B78-D14 (Ruf Р.,

В.,

N., Mocikat R., Hess J.,

М., Wosch S., Suckstorff I., Zehetmeier C, Lindhofer H., Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model, Journal of translational medicine; 10, 2012, c. 219) для осуществления терапевтической/исцеляющей обработки. Эту модель опухоли (выведенная из B16F0 линия меланомы B78-D14) создавали с целью обеспечения экспрессии GD2. Указанный ганглиозид представляет собой перспективный антиген с точки зрения таргетирования мелкоклеточного рака легких и злокачественных заболеваний нейроэктодермального происхождения, таких как нейробластома, глиома, саркома или меланома, у человека.

trAт Surek, обладающее специфичностью в отношении GD2 и мышиного CD3 (Ruf Р.,

В.,

N., Mocikat R., Hess J., М.,

Wosch S., Suckstorff I., Zehetmeier C., Lindhofer H., Ganglioside GD2-specific trifunctional surrogate antibody Surek demonstrates therapeutic activity in a mouse melanoma model, Journal of translational medicine; 10, 2012, c. 219), служило в качестве суррогатного ггАт, перекрестносвязывающего GD2 с рецептором CD3 на мышиных Т-клетках.

В качестве примера антител, блокирующих ингибитор контрольной точки применяли ипилимумаб, суррогатное антитело НВ304 (клон UC10-4F10-11; Walunas T.L., Lenschow D.J., Bakker C.Y., Linsley P.S., Freeman G.J., Green J.M., Thompson C.B., Bluestone J.A., CTLA-4 can function as a negative regulator of T cell activation. Immunity. 1, 1994, cc. 405-413), направленное против мышиного CTLA-4.

Мышей линии C57BL/6 получали от фирмы Taconic (Ри, Дания). Эксперименты на животных осуществляли по меньшей мере в двух повторностях, включая по 5 самок животных в каждую группу. Для тестирования индуцированного trAт отторжения опухоли мышей заражали путем введения 1×10⁵ живых опухолевых клеток B78-D14 и обрабатывали в дни 2 и 5 50 мкг Surek. Одновременно с Surek вводили 100 мкг НВ304 в дни 2 и 5. Все клетки и антитела вводили i.p. В каждый эксперимент включали контрольные группы животных, которым вводили опухолевые клетки и только ЗФР. Мышей умерщвляли, когда признаки роста опухоли становились заметными невооруженным глазом. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами защиты животных и с получением разрешения компетентных органов.

Результаты представлены на фиг. 3. После комбинированной терапии с применением трехфункционального антитела Surek и антитела к CTLA-4 НВ304, которую начинали через 2 дня после летального заражения клетками меланомы B78-D14, общая выживаемость зараженных B78-D14 мышей возрастала. Первые эксперименты продемонстрировали, что монотерапия с применением НВ304 на модели опухоли B78-D14 оказалась неэффективной: не было выявлено пролонгирования выживания по сравнению с контрольной группой, которую не обрабатывали антителом (фиг. 3А). Однако, когда антитела НВ304 применяли в комбинации с трехфункциональными антителами (Surek), общая выживаемость мышей возрастала с 60% (монотерапия с применением Surek) до 90% (комбинация Surek+HB304). Такое четко выраженное увеличение общей выживаемости демонстрирует, что комбинация трехфункциональных антител и блокирующих антител к CTLA-4 повышает их терапевтическую эффективность (фиг. 3Б).

Пример 4: Непосредственное уничтожение опухоли усиливается также при комбинированной обработке с применением trAт и антитела к CTLA-4 в случае другой модели опухоли

Цель исследования, описанного в настоящем примере, заключалась в том, чтобы, имея в распоряжении данные о повышении терапевтической эффективности трехфункциональных антител при добавлении блокирующих CTLA-4 антител, полученные на модели неиммуногенной опухоли B78-D14 (пример 3), оценить терапевтический/излечивающий потенциал комбинированной терапии на модели более иммуногенной опухоли В16-ЕрСАМ (Ruf P., Lindhofer Н., Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific antibody, Blood. 98, 2001, cc. 2526-2534), которая экспрессирует антиген, распознаваемый клинически значимым ггАт катумаксомабом.

trAт BiLu, которое обладает специфичностью в отношении ЕрСАМ и мышиного CD3 (Ruf P., Lindhofer Н., Induction of a long-lasting antitumor immunity by a trifunctional bispecific antibody. Blood. 98, 2001, cc. 2526-2534), служило в качестве суррогатного trAт, перекрестно сшивающего ЕрСАМ с рецептором CD3 на мышиных Т-клетках.

Мышей линии C57BL/6 покупали у фирмы Taconic (Ри, Дания). Эксперименты на животных осуществляли по меньшей мере в двух повторностях, включая по 10 самок животных в каждую группу. Для тестирования индуцированного trAт отторжения опухоли мышей заражали путем внутривенного (i.v.) введения 1×10⁵ живых опухолевых клеток В16-ЕрСАМ и обрабатывали, используя либо 10 мкг трехфункционального антитела BiLu в дни 2 и 5 (группа Б), либо 100 мкг блокирующего CTLA-4 антитела НВ304 в дни 9, 12, 19, 26, 33, 40 (группа Г), либо мышей подвергали комбинированной обработке согласно графикам обработки обоими антителами (группа В (комбинация графиков обработки групп Б и Г)). Контрольным мышам вводили опухолевые клетки и ЗФР, но не обрабатывали антителом (группа А). Мышей умерщвляли, когда признаки роста опухоли становились заметными невооруженным глазом. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с правилами защиты животных и с получением разрешения компетентных органов.

Результаты представлены на фиг. 4. Во-первых, осуществляли поддерживающую терапию с использованием НВ304, которая включала шесть инъекций в дни 9, 12, 19, 26, 33 и 40 после заражения опухолью. Указанная поддерживающая терапия значительно пролонгировала общую выживаемость мышей и по эффективности была сопоставима с монотерапией с использованием трехфункционального антитела BiLu, при этом в обеих группах количество животных, выживших в течение продолжительного периода времени, составляло 20% (фиг. 4). Важно отметить, что применение комбинации обоих антител приводило к дальнейшему увеличению коэффициента выживаемости до 40%. Более того, наиболее продолжительная медианная выживаемость в течение 110 дней была достигнута в обработанной комбинацией группе В, по сравнению с 59 днями в обработанной BiLu группе Б и 51 днем в обработанной НВ304 группе Г. Все мыши в контрольной группе А погибли, при этом медианная выживаемость составляла 41 день. Таким образом, комбинация блокирующих CTLA-4 антител с трехфункциональным антителом BiLu оказывала выраженное положительное терапевтическое действие.

Claims

1. Способ инициации, усиления или пролонгирования противоопухолевого ответа у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму

(I) модулятора иммунной контрольной точки, который является ингибитором ингибиторной молекулы контрольных точек,

(II) перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела, которое содержит:

(a) антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении CD3,

(б) антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена, и

(в) сайт связывания человеческого FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, где антитело связывается с более высокой аффинностью с человеческим FcγRI, FcγRIIa и/или FcγRIII, чем с человеческим FcγRIIb,

причем первое введение модулятора иммунных контрольных точек осуществляют через 12-96 часов после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела.

2. Способ по п. 1, в котором модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело направлены на разные мишени.

3. Способ по п. 1, в котором антиген, ассоциированный с раком и/или опухолью, не является молекулой иммунной контрольной точки и/или ее лигандом, предпочтительно антиген, ассоциированный с раком и/или опухолью, выбран из группы, состоящей из EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, протеогликана, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, альфа (v) бета (3) - интегрина, HLA, HLA-DR, ASC, карбоангидразы, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gp100, тирозиназы, MUC-1, теломеразы, сурвивина, p53, CA125, антигена Wue, антигена Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 и мишени на клеточной поверхности GC182, GT468 или GT512.

4. Способ по п. 1, в котором антитело содержит Fc-фрагмент.

5. Способ по п.4, в котором антитело содержит Fc-область.

6. Способ по п. 5, в котором антитело содержит Fc-область, проявляющую одну из следующих комбинаций изотипов: крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2a, крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2b, крысиный-IgG2b/человеческий-IgG1 или мышиный-[VH-CH1, VL-CL]-человеческий-IgG1/крысиный-[VH-CH1, VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий IgG3 (кавказский аллотип G3m (b + g)) - [CH2-CH3].

7. Способ по п. 1, в котором антитело выбирают из группы, состоящей из катумаксомаба, лимфомуна, эртумаксомаба, эктомаба.

8. Способ по п.7, где антитело представляет собой катумаксомаб или эктомаб.

9. Способ по п. 1, в котором модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или DcR3 или их лиганд.

10. Способ по п. 9, в котором модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1, PD-L1 и/или PD-L2.

11. Способ по п. 10, в котором модулятор иммунных контрольных точек является ингибитором CTLA-4 и/или PD-1.

12. Способ по п. 1, в котором используют более одного модулятора иммунных контрольных точек.

13. Способ по п.12, в котором используют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных модуляторов иммунных контрольных точек.

14. Способ по п.13, в котором используют по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1, PD-L1 и/или PD-L2.

15. Способ по п.14, в котором используют по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1.

16. Способ по п. 1, в котором антитело представляет собой катумаксомаб и/или эктомаб, а модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4.

17. Способ по п. 1, в котором модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело представлены в одной и той же композиции или в разных композициях.

18. Способ по п.1, в котором первое введение модулятора иммунных контрольных точек осуществляют через 24-84 часа, предпочтительно через 36-72 часа и более предпочтительно через 48-60 часов после первого введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела.

19. Способ по п. 1, где перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело вводят в соответствии с режимом возрастающей дозировки.

20. Способ пролонгирования активации T-клеток у индивидуума, включающий введение индивидууму комбинации

(I) модулятора иммунной контрольной точки, который является ингибитором ингибиторной молекулой контрольных точек, и

(б) антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении ассоциированного с раком и/или опухолью антигена; и

21. Комбинированная терапия для терапевтического лечения рака, где комбинированная терапия включает введение

(a) антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении CD3;

22. Комбинированная терапия по п. 21, в которой модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело направлены на разные мишени.

23. Комбинированная терапия по п. 21, в которой антиген,

ассоциированный с раком и/или опухолью, не является молекулой иммунной контрольной точки и/или ее лигандом, предпочтительно антиген, ассоциированный с раком и/или опухолью, выбран из группы, состоящей из EpCAM, HER2/neu, CEA, MAGE, протеогликана, VEGF, EGFR, mTOR, PIK3CA, RAS, альфа (v) бета (3)-интегрина, HLA, HLA-DR, ASC, карбоангидразы, CD1, CD2, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD13, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD41, CD47, CD52, CD138, c-erb-2, CALLA, MHCII, CD44v3, CD44v6, p97, GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b, GT3, GQ1, NY-ESO-1, NFX2, SSX2, SSX4, Trp2, gp100, тирозиназы, MUC- 1, теломеразы, сурвивина, p53, CA125, антигена Wue, антигена Lewis Y, HSP-27, HSP-70, HSP-72, HSP-90, Pgp, MCSP, EphA2 и мишени на клеточной поверхности GC182, GT468 или GT512.

24. Комбинированная терапия по п. 21, в которой антитело содержит Fc-фрагмент.

25. Комбинированная терапия по п.24, в которой антитело содержит Fc-область.

26. Комбинированная терапия по п.25, в которой антитело содержит Fc-область, проявляющую одну из следующих комбинаций изотипов: крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2a, крысиный-IgG2b/мышиный-IgG2b, крысиный-IgG2b/человеческий-IgG1 или мышиный-[VH-CH1, VL-CL]-человеческий-IgG1/крысиный-[VH-CH1, VL-CL]-человеческий-IgG1-[шарнир]-человеческий IgG3 (кавказский аллотип G3m (b + g)) - [CH2-CH3].

27. Комбинированная терапия по п. 21, в которой антитело выбирают из группы, состоящей из катумаксомаба, лимфомуна, эртумаксомаба, эктомаба.

28. Комбинированная терапия по п. 27, в которой антитело представляет собой катумаксомаб или эктомаб.

29. Комбинированная терапия по п. 21, в которой модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или DcR3 или их лиганд.

30. Комбинированная терапия по п. 29, в которой модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-1, PD-L1 и/или PD-L2.

31. Комбинированная терапия по п. 30, в которой модулятор иммунных контрольных точек является ингибитором CTLA-4 и/или PD-1.

32. Комбинированная терапия по п. 21, в которой используют более одного модулятора иммунных контрольных точек.

33. Комбинированная терапия по п. 32, в которой используют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных модуляторов иммунных контрольных точек.

34. Комбинированная терапия по п. 33, в котором используют по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1, PD-L1 и/или PD-L2.

35. Комбинированная терапия по п. 34, в которой используют по меньшей мере (α) ингибитор CTLA-4 и (β) ингибитор PD-1.

36. Комбинированная терапия по п. 21 , в которой антитело представляет собой катумаксомаб и/или эктомаб, а модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4.

37. Комбинированная терапия по п. 21, в которой модулятор иммунной контрольной точки и перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело находятся в одной и той же композиции или в различных композициях.

38. Комбинированная терапия по п. 21, в которой первое введение модулятора иммунных контрольных точек осуществляют через 24-84 часа, предпочтительно через 36-72 часа и наиболее предпочтительно через 48-60 часов после последнего введения перенаправляющего Т-клетки многофункционального антитела.

39. Комбинированная терапия по п. 21, где перенаправляющее Т-клетки многофункциональное антитело вводят в соответствии с режимом возрастающей дозировки.