RU2768752C1 - Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) - Google Patents
Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768752C1 RU2768752C1 RU2020142822A RU2020142822A RU2768752C1 RU 2768752 C1 RU2768752 C1 RU 2768752C1 RU 2020142822 A RU2020142822 A RU 2020142822A RU 2020142822 A RU2020142822 A RU 2020142822A RU 2768752 C1 RU2768752 C1 RU 2768752C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- poly
- dsrna
- composition
- plant
- plants
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 title description 53
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 title description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 38
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims abstract description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 5
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 abstract 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 6
- 102100032814 ATP-dependent zinc metalloprotease YME1L1 Human genes 0.000 description 5
- 101800000795 Proadrenomedullin N-20 terminal peptide Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102100023274 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 4 Human genes 0.000 description 3
- 101001115395 Homo sapiens Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 4 Proteins 0.000 description 3
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 101000616090 Arabidopsis thaliana Somatic embryogenesis receptor kinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000710175 Carlavirus Species 0.000 description 2
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000710007 Potexvirus Species 0.000 description 2
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 2
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 2
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-phenylpropan-2-amine Chemical compound CNC(C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005687 plant receptors Proteins 0.000 description 2
- 108700002563 poly ICLC Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 1
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 1
- 241000710179 Potato virus S Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000003082 abrasive agent Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000004665 defense response Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- -1 imidazole choline compound Chemical class 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N35/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having two bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. aldehyde radical
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу индукции неспецифического защитного ответа картофеля. Также раскрыта композиция для осуществления указного способа, содержащая полимерную полиадениловую:полиуридиловую кислоту. Изобретение позволяет эффективно вызывать неспецифический иммунный ответ у растения, при контактен с композицией, содержащей стимулирующую полимерную дцРНК. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил, 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и молекулярной биологии и направлено на разработку эффективного средства биологической защиты Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(А):поли(У) растений широкого спектра действия против вирусов на основе стимуляции неспецифического защитного ответа растения по типу иммунитета, связанного с узнаванием молекулярных паттернов, ассоциированных с патогеном (МАМР или РАМР), рецепторами растения (РАМР-иммунитет - PTI) (иммуномодулирующее действие). В соответствии с настоящим изобретением получен биомолекулярный комплекс, включающий наночастицы хитозана, функционализированные синтетической двуцепочечной полирибонуклеиновой кислотой полиадениловая:полиуридиловая кислота (поли(А):поли(У)), который может быть использован для обработки сельскохозяйственных растений с целью их защиты от различных вирусов.
Описание чертежей
Фигура 1. Анализ синтетической поли(А):поли(У) методом электрофореза в геле агарозы. а - исходный препарат поли(А):поли(У); б - препарат поли(А):поли(У) после обработки ультразвуком различной мощности в течение 1, 2, 5, 7 и 10 мин.
Фигура 2. Характеристика синтезированных наночастиц хитозана методом трансмиссионной электронной микроскопии (а) и методом динамического лазерного светорассеяния (б).
Фигура 3. Связывание дцРНК с НЧХ, изученное методом «задержки» в агарозном геле. Постоянное количество поли(А):поли(У) инкубировали с возрастающим количеством НЧХ (наночастиц хитозана), образцы наносили в лунки неденатурирующего геля агарозы и проводили электрофорез. Над лунками указано весовое соотношение компонентов поли(А):поли(У):НЧХ.
Фигура 4. Стабильность комплекса поли(А):поли(У):НЧХ в растворе, охарактеризованная методом ДЛС в течение двух часов после начала эксперимента. Приведены данные по интенсивности и числу частиц.
Фигура 5. Угнетение репродукции Υ вируса картофеля (ΥΒΚ) в растениях картофеля сорта Индиго на 14 и 21 дни после начала инфекции (дли) препаратом поли(А):поли(У) различной полимерности.
Фигура 6. Угнетение репродукции X вируса картофеля (ХВК) в растениях картофеля сорта Индиго на 14 и 21 дни.
Фигура 7. Угнетение репродукции S вируса картофеля (SBK) в растениях картофеля сорта Г265 на 14 и 21 дни.
Фигура 8. Угнетение репродукции репродукции Μ вируса картофеля (МВК) в растениях картофеля сорта Прайм на 14 и 21 дни.
Термины и определения
НЧХ - наночастицы хитозана
поли(А):поли(У) - синтетическая двуцепочечная полирибонуклеиновая кислота, polyadenylic-polyuridylic acid. Встречаются различные варианты написания: PolyA. PolyU, PolyA:PolyU, PolyA:U, Poly(A): Poly(U), polyA-polyU и др.
Функционализированная частица - частица, связанная с какими-либо молекулами, наделяющими частицу способностью выполнять определять функцию.
дцРНК - двуцепочечная РНК
шдцРНК - шпилечная двуцепочечная РНК
ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние
дпи - дни после инфицирования
пн - пары нуклеотидов
Задача настоящего изобретения состояла в разработке технически простого универсального средства защиты растений, стимулирующего врожденный защитный ответ растений на инфекцию различными вирусами. В соответствии с настоящим изобретением получен комплекс, включающий наночастицы хитозана, функционализированные синтетической полирибонуклеиновой кислотой поли(А):поли(У), для обработки путем опрыскивания листьев растений с целью защиты сельскохозяйственных культур от заражения вирусами. Данный подход основан на использовании естественных механизмах иммунитета растений. Недавние исследования показали, что растения способны успешно экспрессировать искусственные гены, ответственные за синтез двуцепочечных РНК (дцРНК) и шпилечных двуспиральных РНК (шдцРНК), а также процессировать экзогенные дцРНК и шдцРНК для подавления экспрессии целевых генов патогенов. Как эндогенные, так и экзогенные дцРНК процессируются в малые интерферирующие РНК, которые распространяются по растению локально и системно и индуцируют резистентность растений к вирусам и другим патогенам на основе механизма РНК-интерференции. Эта весьма целенаправленная и экологически чистая стратегия защиты растений гораздо более приемлема для общественного мнения, чем, например, химические обработки. Вместе с тем технология использования дцРНК является специфической и направлена на придание устойчивости растений против индивидуального вируса/патогена или группы близкородственных патогенов, поскольку ее мишенью является специфическая РНК, синтезируемая данным вирусом/патогеном в процессе его репродукции в зараженном растении. Однако существуют препараты на основе аналогов дцРНК, давно применяемые в биомедицине и ветеринарии, которые стимулируют неспецифический иммунитет человека и животных путем индукции синтеза интерферона или активации Т-клеточного иммунитета, в частности, препараты на основе синтетических полирибонуклеиновых кислот - препараты поли(А):поли(У) и полиИ:полиЦ.
Двуцепочечные молекулы РНК, такие как поли(А):поли(У) и полиИ:поли(У) (polyI:polyU) и композиции, содержащие смесь Poly(I) (полиИ), Poly(С) (полиЦ), или PolyI:C (полиИ:полиЦ), известны как неспецифические иммуностимулирующие/ иммуномодулирующие агенты и достаточно давно применяются в различных областях биомедицины и ветеринарии. Первые публикации об их активности появились около полувека назад (например, 
Η et al., 1974). Так доклинические исследования, выполненные в 1970-1980-х годах показали, что инкубация мононуклеарных клеток крови с poly A-poly U индуцирует секрецию альфа интерферона, а инъекции poly A-poly U активирует натуральные киллеры in vitro (ЕР281 380; ЕР113 162). На основании результатов биологического тестирования среди двуспиральных полирибонуклеотидных комплексов разной структуры были отобраны поли(А):поли(У), полиИ:полиЦ и полиГ:полиЦ, имеющие наиболее выраженные интерферон-индуцирующую и противовирусную активности. Серией экспериментальных и клинических исследований установлено, что двуспиральные полирибонуклеотиды могут быть использованы в качестве адъювантов для модуляции и оптимизации антиген-специфического иммунного ответа (Caskey et al., 2011). Например, совместное введение полиИ-полиЦ, липотейхоевой кислоты и CL097 (имидазолхолинового соединения) с инактивированной вакциной против вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней обеспечивало высокий уровень защиты от инфекции (Zhan et al., 2013).
В экспериментах in vitro и in vivo показано, что полиА:поли(У) подавляет репродукцию вирусов герпеса, репродуктивно-респираторного синдрома, трансмиссивного гастроэнтерита и африканской чумы свиней (Yershov and Zdanov, 1982; Sharypova et al., 2018), и является активным индуктором интерферонов.
В России на основе поли(А):поли(У) в 1970-х годах был создан и зарегистрирован в качестве лекарственного средства препарат Полудан («Верофарм», Россия), который до 2016 года применялся в виде глазных и назальных капель при вирусных заболеваниях глаз, в комплексной терапии гриппа и других острых респираторных инфекций. Во Франции на основе поли(А):поли(У) создан препарат Polyadenur («Beaufour Ipsen» (France) совместно с «Hemispherx Biopharma» (USA)), успешно прошедший клинические испытания в качестве компонента комплексной терапии гепатитов В и С, а также лечения рака молочной железы (De Paillette, 2003, Patent No.: US 6,509,154 B1. Appl. No 09/485,086, Date of Patent 21.01.2003; Fabrice and Sabourin, 2006, Int.Pub.No: WO 2006/054129 A1. International Appl. No: РСТ/IB2004/004093, Publication Date 26.05.2006). Еще в серии ранних работ Вильнера с соавт.(Vilner et al., 1982; Vilner et al., 1985) было показано, что противовирусная активность синтетических полирибонуклеотидов существенным образом зависит от длины полимера.
Проводятся исследования, направленные на повышение терапевтической эффективности двуспиральных полирибонуклеотидов, в частности получение комбинированых композиций с веществами, стабилизирующих нуклеиновые кислоты, усиливающими действие основного вещества или ослабляющими побочные эффекты, получение препаратов на полимерных носителях и в средствах адресной доставки (Nacano et al., 2018; Torchilin, 2013; Ghosh and Chowdhury, 2013; Alikin et al., 2001, Patent RF №2172631. Appl.99121277 from 08.10.1999; publ. 27.08.2001 in BI №24). Так, на основе полиИ-полиЦ, стабилизированной поли L-лизином и карбоксиметилцеллюлозой компанией «Oncovir» (USA) был разработан препарат Hiltonol (Levy, 1982, Patent No.: US 4,349,538. Appl. No.: 208029. Publication Date: 14.09.1982): Этот препарат индуцирует синтез интерферонов, оказывает модулирующее действие на клетки иммунной системы, включая активацию Т-клеток, натуральных киллеров и дендритных клеток, синтез интерлейкинов и альфа-TNF, кортикостероидов, отличается сниженной по сравнению с аналогами токсичностью, что позволяет применять более высокие дозы вещества при лечении запущенных неоперабельных случаев рака (Levy, 1982, Patent No.: US 4,349,538. Appl. No.: 208029. Publication Date: 14.09.1982). В Базе данных ClinicalTrials.gov зарегистрировано 97 клинических испытаний соединения Hiltonol для лечения онкологических заболеваний различной локазизации, гриппа, тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и других вирусных заболеваний (Salazar, Oncovir Inc. http://www.oncovir.com/id2.html. Дата обращения 11.01.2018). В настоящее время механизм действия полирибонуклеотидов рассматривается с точки зрения регуляции ими экспрессии генов, однако подробно не изучен (Zarudnaya et al., 2019).
Сведения по использованию поли(А)-поли(У) в качестве средства профилактики и лечения вирусных заболеваний растений в литературе отсутствуют.
Наиболее близким аналогом к молекулам, применяемым в настоящем изобретении, является полиинозиновая:полицитидиловая кислота (далее polyI:C или полиИ:полиЦ). Эта синтетическая полирибонуклеиновая кислота с известным иммуномодулирующим действием у животных и человека, использование препаратов на основе которой защищено многими патентами, была испытана на растениях (Double-stranded RNAs induce a pattern-triggered immune signaling pathway in plants, Niehl et al., 2016). Исследования, проведенные на животных, показали, что интерферон-индуцирующая активность поли(А):поли(У) несколько ниже, чем активность полиИ:полиЦ и полиГ:полиЦ, но токсичность поли(А):поли(У) также ниже, чем у этих препаратов. Таким образом, применение защитной композиции на основе поли(А):поли(У) для индукции неспецифического иммунитета у растений могло быть предпочтительнее в части биобезопасности, однако до настоящего эффективность ее не была где-либо показана. В заявленном изобретении впервые продемонстировано успешное применение подобной композиции на практике. Показано, что вызываемая ею неспецифическая индукция иммунитета достаточна для того, чтобы в обработанном растении успешно подавлялась репродукция различных видов вирусов.
Публикации об использовании поли(А):поли(У) как средства защиты от патогенов в растениеводстве отсутствуют. Известные публикации относятся к применению данного вещества в области биомедицины и ветеринарии при лечении вирусных инфекций и онкологических заболеваний.
В пионерской работе Niehl с соавторами (2016) показано, что аналог дцРНК -поли(И):поли(Ц) (polyI:C) способен индуцировать в растениях Arabidopsis типичный неспецифический защитньш ответ по типу иммунитета, связанного с узнаванием молекулярных паттернов, ассоциированных с патогеном (МАМР или РАМР), рецепторами растения (РАМР-иммунитет - PTI). Этот защитный ответ (PTI), зависит от корецептора рецептор-подобной киназы-1 соматического эмбриогенеза (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1, SERK1), но не зависит от DICER-подобных белков, участников механизма РНК-интерференции. Обработка поли(И):поли(Ц) растений Arabidopsis индуцирует SERK1-зависимую антивирусную устойчивость. Авторы предположили, что дцРНК могут распознаваться растениями как подлинные РАМР, индуцирующие сигнальные каскады, в которые вовлечены SERK1 и специфический рецептор дцРНК. Таким образом, опосредованные неспецифической дцРНК процессы оперируют независимо от механизма РНК-интерференции, что может быть использовано в практическом плане для повышения антивирусной устойчивости у сельскохозяйственных растений.
Задача настоящего изобретения состояла в разработке универсального (в отличие от метода, основанного на механизме специфической РНК-интерференции) метода защиты растений от неродственных вирусов, основанного на естественном механизме защиты растений - механизме врожденного неспецифического защитного ответа растения.
Ключевые для потребителя характеристики, по которым у продукта/технологии есть преимущества над аналогами: Для конечных потребителей создаваемых препаратов основное преимущество противовирусного препарата - возможность прямой защиты против вирусов из различных таксономических групп с частичным отказом (сокращением объемов) от трудозатратных профилактических мероприятий по фитопрочистке, выбраковке посадок.
В результате осуществления заявленного изобретения получена композиция на основе полиадениловой + полиуридиловой кислоты (далее поли(А):поли(У)) широкого спектра действия для обработки сельскохозяйственных растений с целью защиты их от вирусов. Один из дополнительных вариантов композиции раскрывает состав, содержащий частицы хитозана размером до 100 нм, покрытые молекулами поли(А):поли(У). Определен уровень оптимальной степени полимерности поли(А):поли(У) в составе композиции.
Способ защиты растений с использованием предложенной композиции включает приведение поверхности листа растения и указанного композиции в контакт друг с другом посредством опрыскивания. Далее композиция поглощается растительной клеткой, содержащей клеточную стенку, что и обеспечивает ингибирование размножения вируса в растении более, чем в 2 раза в течение не менее 21 дня после однократной обработки препаратом.
Технический результат достигается за счет оптимальной комбинации приемов и средств, применяемых при осуществлении процедуры обработки растений: в частности, получения частиц хитозана оптимальной величины, их связывания с поли(А):поли(У) определенной молекулярной массы и обработки приготовленным таким образом препаратом/комплексом листьев растений путем опрыскивания.
Однократное опрыскивание листьев растений картофеля восприимчивых сортов композицией, которая содержит 15 мкг или 7,5 мкг наночастиц хитозана, функционализированных 30 или 15 мкг поли(А):поли(У), соответственно, в 100 мкл раствора, приводит к ингибированию размножения 4-х вирусов, имеющих важное экономическое значение для картофелеводства (Y вируса картофеля (род Potyvirus); X вируса картофеля (род Potexvirus); Μ вируса картофеля и S вируса картофеля (оба представители рода Carlavirus)), в условиях искусственного заражения в диапазоне от 5 до 20% до 14 дня и 20-50% до 21 дня после заражения по сравнению с контрольными растениями.
Осуществление изобретения
1. Получение композиции поли(А):поли(У)
Поли(А):поли(У) является коммерчески доступным веществом. Для оценки антивирусной активности нами был использован поли(А):поли(У) отечественного производства (синтезирован в Филиале ИБХ РАН). Исходное соединение имеет высокую полимерность, от 10000 до 40000 пн. Для получения действующего вещества необходимой полимерности, оптимальной для доставки в клетки растения, и обладающего биологической активностью, перед использованием высокомолекулярный препарат поли(А):поли(У) обрабатывали ультразвуком («озвучивали») в течение до 10 мин для получения фрагментов, длина которых варьирует от 250 до 2500 пн, в среднем около 1000 пн (Фиг. 1а.б).
2. Получение частиц хитозана и их функционализация
Хитозан (Sigma, CAS Number 9012-76-4) в концентрации 3,0 мг/мл растворяли в 30 мМ Na-ацетатном буфере рН 4,5 (буфер готовили, подводя рН раствора 30 мМ CH3COONa до 4,5 10% раствором СН3СООН) при постоянном встряхивании до полного растворения хитозана. Затем к раствору добавляли водный раствор триполифосфата натрия (ТПФ, Галреахим) в концентрации 1 мг/мл в соотношении хитозан:ТПФ, равном 5:2 (объем/объем). Данные условия приводили к формированию гомогенного препарата частиц хитозана с диаметром около 20 нм (фазово-контрастное изображение, полученное с помощью моторизованного инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия), Фиг. 2а. Сходные данные были получены с помощью метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) (Фиг. 2б).
Подбор оптимальных соотношений НЧХ и поли(А):поли(У) проводили методом «задержки» в агарозном геле. Получение комплекса дцРНК-носитель осуществлялось за счет электростатической адсорбции поли(А):поли(У) на наночастицах хитозана. Постоянное количество дцРНК инкубировали с возрастающим количеством НЧХ, образцы наносили в лунки неденатурирующего геля агарозы и проводили электрофорез. Данные, представленные на Фиг. 3, показывают, что полное связывание дцРНК в пробе НЧХ наблюдается при весовых соотношениях поли(А):поли(У):НЧХ около 2:1. Агрегация функционализированных дцРНК оценивалась методом ДЛС. При весовом соотношении поли(А):поли(У):НЧХ, соответствующем 2:1 и концентрации поли(А):поли(У) 30 или 15 мкг в 100 мкл заметной агрегации частиц комплекса в течение времени эксперимента, соответствующего 2-м часам, не наблюдалось (Фиг. 4). Размер комплексов варьировал от 150 до 250 нм.
Антивирусный эффект различных композиций, содержащих поли(А):поли(У) и/или поли(А):поли(У):НЧХ испытывали на сортах растений картофеля, чувствительных к определенному вирусу, которые были выращены в теплице в стандартных условиях из безвирусных пробирочных растений. В опытах использовали растения на стадии 5-6 взрослых листьев. Три нижних листа опрыскивали из атомайзера приготовленными опытными и контрольными растворами в присутствии поверхностно активного вещества Неон-99 в разведении 1:2000 из расчета 100 мкл исследуемой композиции на 1 лист. На следующий день обработанные листья, припыленные абразивным материалом - целлитом, заражали вирусом. В экспериментах были использованы следующие вирусы: Υ вирус картофеля (род Potyvirus) штамм обыкновенный (YBK-O); X вирус картофеля (род Potexvirus); Μ вирус картофеля и S вирус картофеля (род Carlavirus). Для оценки уровня заражения растения на 14 и 21 дни после инфицирования (дпи) отбирали пробы с 2-3 листьев над инфицированными, листовой материал гомогенизировали и анализировали на наличие вируса методом ИФА с использованием коммерческих наборов.
В качестве материала для заражения (инокулюма) YBK использовали гомогенат листьев табака сорта Самсун, зараженного YBK в 0,05 Μ фосфатном буфере с приблизительным уровнем рН 7,0 или в стерильной воде (весовое соотношение 2:1). Для заражения ХВК, SBK и МВК в качестве инокулюма использовали гомогенат листьев картофеля, зараженных соответствующим вирусом, в стерильной воде (весовое соотношение 2:1).
Антивирусный эффект комплекса против вирусов ΥΒΚ и ХВК испытывали на растениях картофеля сорта Индиго, SBK - на растениях сорта Г265, МВК - на растениях сорта Прайм.
Пример 1.
Продемонстрировано действие следующих композиций: 1) водный раствор поли(А):поли(У) (30 мкг или 15 мкг в 100 мкг); 2) - наночастицы хитозана, функционализированные поли(А):поли(У) - 15 мкг по хитозану и 30 мкг поли(А):поли(У) в 100 мкл или 7,5 мкг по хитозану и 15 мкг поли(А):поли(У) в 100 мкл. Соотношение НЧХ: поли(А):поли(У) подбирали предварительно на основании данных по связыванию препарата с НЧХ, тестируемому электрофорезом в неденатурирующем геле агарозы (Фиг. 3). Перед использованием высокомолекулярный препарат поли(А):поли(У) «озвучивали» для получения фрагментов с требуемой полимерностью. Оценка антивирусной активности и эффекта полимерности поли(А):поли(У) на антивирусную активность препарат против YBK показала, что до 14 дли все использованные варианты (с полимерностью поли(А):поли(У) более 1500 пн, более 1000 пн и более 500 пн) при содержании поли(А):поли(У) 30 мкг в 100 мкг раствора эффективно ингибировали размножение вируса (от 5 до 25% от контроля). На 21 дпи наиболее эффективным оказался комплекс, включающий поли(А):поли(У) с полимерностью более 1000 пн и количеством 30 мкг поли(А):поли(У) на 15 мкг НЧХ (в расчете на хитозан) в 100 мкл раствора (Фиг. 5).
Пример 2. Угнетение репродукции вирусов ХВК, SBK и МВК в растениях картофеля сортов, чувствительных к данным вирусам.
Композиция и условия эксперимента использовали те же, что и в примере 1. Очевидное угнетение было продемонстрировано как при анализе активности препарата поли(А):поли(У) (полимерность более 1000 пн), так и комплекса поли(А):поли(У):НЧХ против X вируса картофеля (Фиг. 6), S вируса картофеля (Фиг. 7) и Μ вируса картофеля (Фиг. 8).
Таким образом, показано, что однократное опрыскивание листьев растений картофеля, восприимчивых к вирусам сортов, композицией, содержащей поли(А):поли(У) или поли(А):поли(У):НЧХ, ингибирует размножение 4-х экономически значимых вирусов картофеля.
Claims (6)
1. Способ индукции неспецифического защитного ответа картофеля по типу иммунитета, связанного с узнаванием молекулярных паттернов, включающий приведение поверхности листа растения и композиции полимерной дцРНК в контакт друг с другом, отличающийся тем, что стимулирующая полимерная дцРНК представляет собой синтетическую полиадениловую:полиуридиловую кислоту длиной от 500 до 2500 пар нуклеотидных оснований.
2. Композиция для осуществления способа по п.1, содержащая полимерную полиадениловую:полиуридиловую кислоту в количестве 15 мкг на 100 мкг водного раствора, и где длина фрагментов полимерной дцРНК находится в диапазоне от 500 до 2500 пар нуклеотидных оснований.
3. Композиция по п.2, где длина полимерной дцРНК находится предпочтительно в диапазоне от 500 до 1500 пар нуклеотидных оснований.
4. Композиция по п.2, которая дополнительно содержит хитозан.
5. Композиция по п.2, включающая частицы хитозана размером до 100 нм, покрытые молекулами полиадениловой+полиуридиловой кислоты.
6. Композиция по п.2, которая дополнительно содержит ПАВ.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020142822A RU2768752C1 (ru) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020142822A RU2768752C1 (ru) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2768752C1 true RU2768752C1 (ru) | 2022-03-24 |
Family
ID=80819482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020142822A RU2768752C1 (ru) | 2020-12-24 | 2020-12-24 | Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2768752C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2428991C9 (ru) * | 2010-06-24 | 2011-12-27 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" | Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе |
| EA201101518A1 (ru) * | 2009-06-10 | 2012-04-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Митотех" | Фармацевтическая композиция для применения в медицинской и ветеринарной офтальмологии |
-
2020
- 2020-12-24 RU RU2020142822A patent/RU2768752C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA201101518A1 (ru) * | 2009-06-10 | 2012-04-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Митотех" | Фармацевтическая композиция для применения в медицинской и ветеринарной офтальмологии |
| US9724313B2 (en) * | 2009-06-10 | 2017-08-08 | Mitotech Sa | Pharmaceutical composition for use in medical and veterinary ophthalmology |
| RU2428991C9 (ru) * | 2010-06-24 | 2011-12-27 | ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "НПО Петровакс Фарм" | Сополимеры гетероцепных алифатических поли-n-оксидов, вакцинирующие и лекарственные средства на их основе |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4772693B2 (ja) | 免疫治療組成物、その製造方法及び使用方法 | |
| JP5669897B2 (ja) | Ｔｌｒ７およびｔｌｒ８に対する安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物 | |
| Sokolova et al. | The use of calcium phosphate nanoparticles encapsulating Toll-like receptor ligands and the antigen hemagglutinin to induce dendritic cell maturation and T cell activation | |
| CN102921003B (zh) | 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物 | |
| Vimal et al. | Delivery of DNA vaccine using chitosan–tripolyphosphate (CS/TPP) nanoparticles in Asian sea bass, Lates calcarifer (Bloch, 1790) for protection against nodavirus infection | |
| AU2008223446B2 (en) | Restrictive agonist of Toll-like receptor 3 (TLR3) | |
| JP2008523094A5 (ru) | ||
| KR20190029576A (ko) | 핵산 카고용 하이브리드 담체 | |
| CN102612561A (zh) | 使用tlr7和tlr9的免疫调节寡核苷酸(iro)拮抗剂强化自身免疫性及炎症性疾病治疗 | |
| WO2011109294A1 (en) | Lipid delivery formulations | |
| Zhao et al. | Dendrigraft poly-L-lysines delivery of DNA vaccine effectively enhances the immunogenic responses against H9N2 avian influenza virus infection in chickens | |
| Avital et al. | Foliar delivery of siRNA particles for treating viral infections in agricultural grapevines | |
| Maeda et al. | DNA‐Based Biomaterials for Immunoengineering | |
| Yang et al. | Polyethylenimine coating to produce serum-resistant baculoviral vectors for in vivo gene delivery | |
| JP2023519413A (ja) | 免疫調節機能を有するＣｐＧ ＯＤＮ及びその使用 | |
| CN101990435A (zh) | Toll样受体3的选择性激动剂 | |
| RU2768752C1 (ru) | Противовирусная композиция для защиты растений на основе поли(а):поли(у) | |
| Rattanakiat et al. | Self-assembling CpG DNA nanoparticles for efficient antigen delivery and immunostimulation | |
| Hua et al. | Protective efficacy of intranasal inactivated pseudorabies vaccine is improved by combination adjuvant in mice | |
| CA3035356C (en) | Nucleic acid-peptide capsule complexes | |
| EP4114459A1 (en) | Coronavirus vaccines comprising a tlr9 agonist | |
| Leung et al. | A novel low-molecular-weight chitosan/gamma-polyglutamic acid polyplexes for nucleic acid delivery into zebrafish larvae | |
| Tomporowski et al. | Carbon nanotubes significantly enhance the biological activity of CpG ODN in chickens | |
| CN107550885A (zh) | 一种包含模式识别受体中tlr3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用 | |
| Hakobyan et al. | Antiviral Activity of Nanocomplexes of Antisense Oligonucleotides Targeting VP72 Protein in Vero Cells Infected by African Swine Fever Virus |