RU2765913C1 - Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus - Google Patents
Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2765913C1 RU2765913C1 RU2020141356A RU2020141356A RU2765913C1 RU 2765913 C1 RU2765913 C1 RU 2765913C1 RU 2020141356 A RU2020141356 A RU 2020141356A RU 2020141356 A RU2020141356 A RU 2020141356A RU 2765913 C1 RU2765913 C1 RU 2765913C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- cells
- addition
- solution
- days
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 7
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 17
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 abstract description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 53
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 9
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 9
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 9
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 101150047500 TERT gene Proteins 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 101150006655 INS gene Proteins 0.000 description 2
- 102100040061 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710120843 Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 101150022708 Ippk gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000700207 Mus macedonicus Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 229910001422 barium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000031261 interleukin-10 production Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000004515 macrogranule Substances 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0676—Pancreatic cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области клеточной инженерии для лечения и профилактики осложнений сахарного диабета 1 типа (СД 1 типа) в частности, способ создания инкапсулированных инсулин-продуцирующих конструктов, которые могут быть использованы при трансплантации пациентам больным СД 1 типа для лечения инсулиновой недостаточности.The invention relates to the field of cell engineering for the treatment and prevention of complications of type 1 diabetes mellitus (type 1 diabetes), in particular, a method for creating encapsulated insulin-producing constructs that can be used in transplantation to patients with type 1 diabetes for the treatment of insulin deficiency.
Экспериментальные и клинические исследования по лечению СД 1 типа с применением разного рода трансплантационных материалов проводятся уже на протяжении длительного времени [1, 2]. Однако пересадка поджелудочной железы и ее участков не привели к желаемому результату, так как для успешного и длительного функционирования подобных трансплантатов необходимо применение пожизненной иммуносупрессивной терапии, которая имеет широкий спектр побочных эффектов и тяжело переносится пациентами [3, 4, 5]. В связи с вышесказанным эта операция не получила широкого клинического распространения [5, 6, 7]. В настоящее время активно изучается трансплантация островковых клеток поджелудочной железы, синтезирующих инсулин. Данный подход характеризуется меньшими хирургическими рисками и потенциально высокой эффективностью в отношении снижения уровня глюкозы в периферической крови.Experimental and clinical studies on the treatment of type 1 diabetes using various types of transplant materials have been carried out for a long time [1, 2]. However, transplantation of the pancreas and its sections did not lead to the desired result, since the successful and long-term functioning of such transplants requires the use of lifelong immunosuppressive therapy, which has a wide range of side effects and is difficult to tolerate by patients [3, 4, 5]. In connection with the foregoing, this operation has not received wide clinical distribution [5, 6, 7]. Currently, transplantation of pancreatic islet cells that synthesize insulin is being actively studied. This approach is characterized by lower surgical risks and potentially high efficacy in lowering peripheral blood glucose levels.
Из уровня техники известен способ создания имплантата для хирургического лечения сахарного диабета 1 типа, который состоит из суспензии клеток поджелудочной железы, помещенной в иммуноизолированное вместилище из пористого никелида титана с порами, через которые осуществляется обмен веществ (RU 2143867, A61F 2/02, опубл. 10.01.2000). Недостатком известного устройства является то, что составляющая импланта из никелида титана может приводить к развитию онкологических заболеваний.The prior art method of creating an implant for the surgical treatment of type 1 diabetes mellitus, which consists of a suspension of pancreatic cells placed in an immunoisolated container of porous titanium nickelide with pores through which metabolism is carried out (RU 2143867, A61F 2/02, publ. 01/10/2000). The disadvantage of the known device is that the titanium nickelide component of the implant can lead to the development of oncological diseases.
Принципиально похожим изобретением является способ создания имплантата для лечения инсулинзависимого диабета в виде макрогранулы из гидрофильного геля (из агарозы, смеси агарозы и коллагена или агарозы и желатина), внутри которого инкапсулированы клетки (RU 2208636, C12N 11/04 и RU 2208636 C2 RU от 20.07.2003). Недостатком данного способа является его неточность, заключающаяся в образовании множества пустых гранул и их слипании. Данные гранулы, в связи с их хрупкостью, трудно извлечь после трансплантации.A fundamentally similar invention is a method for creating an implant for the treatment of insulin-dependent diabetes in the form of a macrogranule from a hydrophilic gel (from agarose, a mixture of agarose and collagen or agarose and gelatin), inside which cells are encapsulated (RU 2208636, C12N 11/04 and RU 2208636 C2 RU dated 20.07 .2003). The disadvantage of this method is its inaccuracy, which consists in the formation of many empty granules and their sticking together. These granules, due to their fragility, are difficult to extract after transplantation.
Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является способ создания клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы (RU 137198 U1, C12N 5/071 от 29.12.2012). Имплантат представляет собой биоинженерную конструкцию с подложкой в виде микрочастиц сферической формы из пористого сшитого желатина и аутологичных энтодермальных клеток человека. Имплантат не слипается и легко инъецируется без травмирования тканей. Имплантат крупнопористой структуры и создает оптимальные условия для адгезии и пролиферации клеток, что увеличивает их жизнеспособность. Недостатком данного способа является недостаточно длительная жизнеспособность клеточного компонента.The closest in its features, taken as a prototype, is a method of creating a cellular implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas (RU 137198 U1, C12N 5/071 from 29.12.2012). The implant is a bioengineered structure with a substrate in the form of spherical microparticles made of porous cross-linked gelatin and autologous human endodermal cells. The implant does not stick together and is easily injected without tissue injury. The implant has a large-pore structure and creates optimal conditions for cell adhesion and proliferation, which increases their viability. The disadvantage of this method is not enough long-term viability of the cellular component.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является снижение иммуногенности аллогенных трансплантируемых клеток и тканей поджелудочной железы, для предотвращения аутоиммунной агрессии реципиента и купирование воспалительных реакций, приводящих к фиброзированию и тромбированию инсулинпродуцирующих конструктов, что приводит к атрофии трансплантата.The task to be solved by the claimed invention is to reduce the immunogenicity of allogeneic transplanted cells and pancreatic tissues, to prevent autoimmune aggression of the recipient and to stop inflammatory reactions leading to fibrosis and thrombosis of insulin-producing constructs, which leads to graft atrophy.
Поставленная задача решается за счет того, что в заявляемом способе создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа используют со-культивирование инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК), которое позволяет снизить локальную воспалительную реакцию при трансплантации инсулинпродуцирующего конструкта и позволяет сформировать строму, имитирующую клеточное микроокружение. Дополнительным аспектом, обеспечивающим иммуноизоляторные свойства конструкта, является его инкапсуляция в биоинертный материал, обладающий свойствами полупроницаемой мембраны. Таким образом созданные трансплантаты способствуют пролонгированному выживанию клеточного компонента и улучшению функциональной активности β-клеток.The problem is solved due to the fact that in the claimed method of creating cell transplants for the treatment of type 1 diabetes mellitus, co-cultivation of insulin-producing cells of the pancreas with multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) is used, which reduces the local inflammatory response during transplantation of the insulin-producing construct and allows the formation of a stroma that mimics the cellular microenvironment. An additional aspect that provides the immunoinsulating properties of the construct is its encapsulation in a bioinert material that has the properties of a semipermeable membrane. Thus created transplants contribute to the prolonged survival of the cellular component and improve the functional activity of β-cells.
В способе создания клеточных трансплантатов для лечения сахарного диабета 1-го типа, ИПК и ММСК жировой ткани инкапсулируют в иммуноизоляторный материал, согласно изобретению, клеточную составляющую (ИПК и ММСК) получают методом ферментативной обработки тканей поджелудочной железы и жировой ткани, соответственно, с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES, после чего:In a method for creating cell transplants for the treatment of type 1 diabetes mellitus, IPC and MMSC of adipose tissue are encapsulated in an immunoisolator material, according to the invention, the cellular component (IPC and MMSC) is obtained by enzymatic treatment of pancreatic and adipose tissue, respectively, using a solution collagenase 1A at a concentration of 0.1% with the addition of Hank's solution and culture medium with the addition of 15 mm HEPES, after which:
- ММСК жировой ткани после ферментации и отмывки раствором Хенкса высаживают на подложку в количестве 10×103 ЯСК (ядросодержащих клеток)/см2, культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней.- MMSCs of adipose tissue after fermentation and washing with Hank's solution are planted on a substrate in the amount of 10×10 3 NSCs (nucleated cells)/cm2, cultivating in order to grow and clear non-target cells for 10-14 days.
- полученные из поджелудочной железы островки после ферментации центрифугируются на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Далее ИПК высаживаются на подложку в концентрации 10×104 ЯСК/см2.- obtained from the pancreas, the islets after fermentation are centrifuged in a density gradient cascade using ficoll-urografin to clear the islets from pancreatic tissues and non-target cells. The islets are then disaggregated by fermentation in a 0.25% Trypsin-EDTA solution, followed by centrifugation with Hank's solution supplemented with 15 mM HEPES. Next, IPCs are deposited on a substrate at a concentration of 10×10 4 NSA/cm2.
ИПК культивируют на протяжении 10-14 дней в два этапа с чередованием сред DMEM: 1. С низким содержанием глюкозы (1 г/л) в течении 8 дней для пролиферации и гомогенизации клеточного пула культуры; 2. С высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) в течении 2-6 дней для индукции инсулинпродуцирующих свойств. Смену сред производят каждые 48 часов, с отмывом культуры раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. При достижении культурой 65% конфлуентности, производят пассаж культуры с применением метода трипсинизации, далее высаживают культуру ИПК на новую подложку в концентрации 10×104 ЯСК/см2. После культивирования инсулинпродуцирующие клетки смешиваются с ММСК жировой ткани в соотношении 1:1 и полученную клеточную составляющую инкапсулируют в альгинат натрия 1% вязкости с добавлением физраствора - натрия хлорид 0,9%, полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%.IPC is cultivated for 10-14 days in two stages with alternating DMEM media: 1. With a low glucose content (1 g/l) for 8 days for proliferation and homogenization of the cell culture pool; 2. With a high glucose content (4.5 g/l) for 2-6 days to induce insulin-producing properties. The change of media produced every 48 hours, washing the culture with Hank's solution with the addition of 15 mm HEPES. When the culture reaches 65% confluence, the culture is passaged using the trypsinization method, then the IPC culture is planted on a new substrate at a concentration of 10×10 4 YSC/cm 2 . After cultivation, insulin-producing cells are mixed with adipose tissue MMSC in a ratio of 1:1, and the resulting cellular component is encapsulated in sodium alginate 1% viscosity with the addition of saline - sodium chloride 0.9%, polymerized by the addition of BaCl2 at a concentration of 2.2%.
Пример осуществления заявляемого способа.An example of the proposed method.
Полученные инсулин-продуцирующие клетки (ИПК) из биоптатов тканей крыс Wistar промывают PBS (Sigma, США) с 10Х антибиотиком и 1М HEPES (Sigma, США). Далее проводят механическую дезагрегацию и ферментативную обработку тканей. В результате ферментирования в растворе коллагеназы, полученные островки центрифугируют при 300g 10 минут на каскаде градиентов плотности для очищения от тканей и нецелевых клеток. Далее, ИПК из островков дезагрегируют методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА. После чего добавляют раствор Хэнкса и 15 мМ HEPES и центрифугируют.Obtained insulin-producing cells (IPCs) from Wistar rat tissue biopsies were washed with PBS (Sigma, USA) with 10X antibiotic and 1M HEPES (Sigma, USA). Next, mechanical disaggregation and enzymatic treatment of tissues are carried out. As a result of fermentation in a collagenase solution, the resulting islets are centrifuged at 300g for 10 minutes in a density gradient cascade to clear tissues and non-target cells. Next, IPC from the islets disaggregated by fermentation in a solution of 0.25% Trypsin-EDTA. Then add Hank's solution and 15 mm HEPES and centrifuge.
Полученные клетки засевают в культуральные флаконы площадью 25 см2, с плотностью посева 40×103 ЯСК/см2 для ММСК и 40×104 ЯСК/см2 для ИПК в 5 мл соответствующей полной (ростовой) питательной среды и наращивают в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. В качестве базовой среды для наращивания β-клеток поджелудочной железы используют RPMI 1640, для ММСКжт и ММСКкм - DMEM/F12, все ростовые среды содержат 10% сыворотки FBS, L-глютамина (200 mM/мл), пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), все реактивы производства Sigma, США.The resulting cells are seeded in culture flasks with an area of 25 cm 2 , with a seeding density of 40×10 3 CSC/cm 2 for MMSC and 40×10 4 CSC/cm 2 for IPC in 5 ml of the appropriate complete (growth) nutrient medium and grow in a CO2 incubator at 5% CO2 and 20%O2. RPMI 1640 is used as a base medium for growing pancreatic β-cells, DMEM/F12 is used for MMSC ajt and MMSC km, all growth media contain 10% FBS serum, L-glutamine (200 mM/ml), penicillin (100 U/ml) , streptomycin (100 μg/ml), all reagents manufactured by Sigma, USA.
После чего, ИПК культивируют на протяжении 10-14 дней с чередованием сред DMEM с низким и высоким содержанием глюкозы: с низким содержанием глюкозы (1 г/л) в течении 8 дней для пролиферации; с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) в течении 2-6 дней для индукции инсулин продуцирующих свойств. Смена сред производятся каждые 48 часов с отмывкой раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES.After that, IPC is cultivated for 10-14 days with alternating low and high glucose DMEM media: low glucose (1 g/l) for 8 days for proliferation; with a high glucose content (4.5 g / l) for 2-6 days to induce insulin-producing properties. The media are changed every 48 hours with washing with Hank's solution supplemented with 15 mM HEPES.
При достижении культурой 65% конфлюэнтности, произведен пассаж культуры методом трипсинизации на новую подложку в концентрации 40×104 ЯСК/см2.When the culture reached 65% confluence, the passage of the culture was carried out by trypsinization on a new substrate at a concentration of 40×10 4 YSC/cm 2 .
После культивирования ИПК смешиваются с ММСК 1:1, полученную клеточную составляющую инкапсулируют в альгинат натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%) полимеризованный добавлением BaCl2 в концентрации 2,2%.After cultivation, IPC is mixed with MMSC 1:1, the resulting cellular component is encapsulated in low-viscosity sodium alginate 1% with the addition of saline (0.9% sodium chloride), polymerized by adding BaCl2 at a concentration of 2.2%.
Процедура выделения ИПК включает следующие шаги:The IPC allocation procedure includes the following steps:
1. Подготовка животного к забору материала путем усыпления эфирным наркозом в летальной концентрации в эксикаторе.1. Preparation of the animal for sampling by euthanization with lethal concentration of ether anesthesia in a desiccator.
2. Процедура операции для забора биоматериала заключается во вскрытии брюшной полости в направлении от ануса к диафрагме препаровальными инструментами, для обнаружения поджелудочной железы и общего желчного потока. При пережатии двенадцатиперстной кишки, параллельно линии поджелудочной железы, в желчный пузырь вставляют игла шприца с раствором коллагеназы. Через желчный проток вводят шесть миллилитров раствора коллагеназы. Поджелудочную железу аккуратно удаляют целиком и помещают в 50 мл пробирку.2. The operation procedure for biomaterial sampling consists in opening the abdominal cavity in the direction from the anus to the diaphragm with dissecting instruments to detect the pancreas and the common bile stream. When clamping the duodenum, parallel to the line of the pancreas, a syringe needle with a collagenase solution is inserted into the gallbladder. Six milliliters of collagenase solution is injected through the bile duct. The pancreas is carefully removed entirely and placed in a 50 ml tube.
3. Далее добавляют пять миллилитров солевого раствора в пробирку и помещают на водяную баню на 20 минут (+37°C).3. Next, add five milliliters of saline solution to the tube and place in a water bath for 20 minutes (+37°C).
4. Пробирки из водяной бани переносят на лед, с последующим удалением жидкой фазы.4. Tubes from the water bath are transferred to ice, followed by removal of the liquid phase.
5. Ферментацию останавливают путем добавления 15 мл ледяного раствора 1.1 среды RPMI (+2-4°C).5. The fermentation is stopped by adding 15 ml of an ice-cold solution of 1.1 RPMI medium (+2-4°C).
6. Полученную массу на шейкере встряхивают с интервалом три раза/сек в течение одной минуты, не переворачивая пробирку. Далее пробирку помещают на лед.6. The resulting mass on the shaker is shaken at intervals of three times / sec for one minute, without turning the tube over. Next, the tube is placed on ice.
7. В новую 50 мл пробирку через сито (500 мкм), смоченное холодной средой RPMI, процеживают ферментированную поджелудочную железу. Остатки поджелудочной железы вымывают из пробирки добавлением 30 мл RPMI, затем опять процеживают через сито. Далее пробирку помещают на лед, инкубируют 10 мин для осаждения на дно клеточной составляющей.7. Into a new 50 ml tube, strain the fermented pancreas through a sieve (500 µm) moistened with cold RPMI medium. The remains of the pancreas are washed out of the tube by adding 30 ml of RPMI, then again filtered through a sieve. Next, the tube is placed on ice, incubated for 10 min to precipitate the cell component on the bottom.
8. Супернатант собирают, оставляя 10-15 мл на дне клеточной суспензии. Затем доводят объем до 30 мл средой RPMI, осторожно перемешивая переворачивание пробирки 2-3 раза.8. The supernatant is collected, leaving 10-15 ml at the bottom of the cell suspension. The volume is then adjusted to 30 ml with RPMI medium by gently mixing by inverting the tube 2-3 times.
9. Центрифугируют пробирку на 215 g в течение 2 минут при комнатной температуре.9. Centrifuge the 215 g tube for 2 minutes at room temperature.
10. Аккуратно удаляют супернатант, не касаясь клеточного осадка. Затем пробирку с осадком переворачивают на лист бумаги, чтобы остатки среды стекли из пробирки, а клеточная составляющая осталась на дне пробирке. Для создания градиента с Фиколлом, необходимо удалить всю среду из пробирки.10. Gently remove the supernatant without touching the cell pellet. Then the test tube with the sediment is turned over onto a sheet of paper so that the remnants of the medium drain from the tube, and the cellular component remains at the bottom of the tube. To create a Ficoll gradient, you must remove all of the medium from the tube.
11. Ресуспендируют осадок в 3 мл 25% Фиколла. Затем наслаивают градиент фиколла: поверх 3 мл 23% Фиколла, затем 2 мл 20% Фиколла и 2 мл 11% Фиколла.11. Resuspend the pellet in 3 ml of 25% Ficoll. Then a Ficoll gradient is layered: over 3 ml of 23% Ficoll, then 2 ml of 20% Ficoll and 2 ml of 11% Ficoll.
12. Центрифугируют на 800 g 10 мин. Островки концентрируются на границе раздела фаз 11% и 20% Фиколла. Часть островков обнаруживают на границе раздела между 20% и 23% Фиколла.12. Centrifuge at 800 g for 10 min. The islands are concentrated at the 11% and 20% Ficoll interface. Some islets are found at the interface between 20% and 23% Ficoll.
13. Островки собирают с помощью автоматического дозатора. Далее клетки помещают в 50 мл пробирку с 6 мл холодного промывочного раствора. Процедуру промывки проводят 3 раза (центрифугируя на 250 g 1 минуту).13. Islets are collected using an automatic dispenser. Next, the cells are placed in a 50 ml tube with 6 ml of cold wash solution. The washing procedure is carried out 3 times (centrifuging at 250 g for 1 minute).
14. Далее центрифугируют островки на 250 g 5 минут. Супернатант удаляют.14. Next, the islets are centrifuged at 250 g for 5 minutes. The supernatant is removed.
15. К осадку добавляют 300 мкл трипсина и ресуспендируют.15. Add 300 µl of trypsin to the pellet and resuspend.
16. Инкубируют 5 минут при 37°C на водяной бане.16. Incubate 5 minutes at 37°C in a water bath.
17. Ресуспендируют островки 10 раз, используя автоматический дозатор.17. Resuspend the islets 10 times using an automatic dispenser.
18. Для остановки процесса ферментации добавляют полную питательную среду RPMI (10% FBS) и центрифугируют в течение 5 мин на 305g для осаждения отдельных клеток.18. To stop the fermentation process, complete RPMI culture medium (10% FBS) is added and centrifuged for 5 min at 305g to pellet individual cells.
19. Далее удаляют супернатант и помещают в 1 мл полной питательной среды RPMI.19. Next, remove the supernatant and place in 1 ml of complete RPMI culture medium.
20. Клетки инкубируют при 37°C, 5% CO2 с содержанием кислорода и CO2 (5% и 5%, соответсвенно).20. Cells are incubated at 37°C, 5% CO2 with oxygen and CO2 (5% and 5%, respectively).
Для инкапсулирования используют раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физиологического раствора (Натрия хлорид 0,9%) для полимеризации с добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%.For encapsulation, a low-viscosity sodium alginate solution of 1% is used with the addition of physiological saline (Sodium chloride 0.9%) for polymerization with the addition of BaCl2 (Sigma, USA) at a concentration of 2.2%.
Проведение экспериментальной части.Conducting the experimental part.
Материалом для исследования служили клеточные культуры, полученные из биоптатов тканей крыс Wistar, умерщвленных путем цервикальной дислокации спинного мозга под наркозом диэтилового эфира (Sigma, США). Все работы проводились в соответствии с правилами работы с лабораторными животными, п. 6 «2». Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений РД-АПК 3.10.07.02-09» [2] и биоэтическими нормами. Полученные поджелудочные железы и биоптаты жировой ткани промывали PBS (Sigma, США) с 10Х антибиотиком и 1М HEPES (Sigma, США). Далее клеточную составляющую (ИПК и ММСК) получали методом ферментативной обработки тканей поджелудочной железы и жировой ткани, соответственно, с использованием раствора коллагеназы 1А в концентрации 0,1% с добавлением раствора Хенкса и среды для культивирования с добавлением 15 мМ HEPES, после чего:The material for the study was cell cultures obtained from tissue biopsies of Wistar rats sacrificed by cervical dislocation of the spinal cord under diethyl ether anesthesia (Sigma, USA). All work was carried out in accordance with the rules for working with laboratory animals, clause 6 "2". Guidelines for keeping laboratory animals in vivariums of research institutes and educational institutions RD-APK 3.10.07.02-09” [2] and bioethical norms. The resulting pancreas and adipose tissue biopsies were washed with PBS (Sigma, USA) with 10X antibiotic and 1M HEPES (Sigma, USA). Next, the cellular component (IPC and MMSC) was obtained by enzymatic treatment of pancreatic and adipose tissue, respectively, using a collagenase 1A solution at a concentration of 0.1% with the addition of Hank's solution and a culture medium with the addition of 15 mM HEPES, after which:
- ММСК жировой ткани после ферментации и отмывки раствором Хенкса высаживали на подложку в количестве 10×103 ЯСК (ядросодержащих клеток)/см2, культивируя с целью наращивания и очистки от нецелевых клеток на протяжении 10-14 дней.- MMSCs of adipose tissue after fermentation and washing with Hank's solution were planted on a substrate in the amount of 10×10 3 NSCs (nucleated cells)/cm2, cultivating in order to grow and clear non-target cells for 10-14 days.
- полученные из поджелудочной железы островки после ферментации центрифугировали на каскаде градиентов плотности с использованием фиколл-урографина для очистки островков от тканей поджелудочной железы и нецелевых клеток. Далее островки дезагрегировали методом ферментирования в растворе 0,25% Трипсина-ЭДТА с последующим центрифугированием с раствором Хенкса с добавлением 15 мМ HEPES. Далее ИПК высаживаются на подложку в концентрации 10×104 ЯСК/см2.- obtained from the pancreas, the islets after fermentation were centrifuged on a density gradient cascade using ficoll-urografin to clear the islets from pancreatic tissues and non-target cells. Next, the islets were deaggregated by fermentation in a solution of 0.25% Trypsin-EDTA, followed by centrifugation with Hank's solution with the addition of 15 mm HEPES. Next, IPCs are deposited on a substrate at a concentration of 10×10 4 NSA/cm2.
Полученную суспензию клеточной массы промывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 300g, 10 минут. Выделение ММСК из костного мозга крыс проводили вымыванием клеток из костномозгового канала бедренной кости по стандартной методике, с использованием среды DMEM/F12 содержащей 10% сыворотки FBS, L-глютамин (200 mM/мл), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл). Полученные клетки засевали в культуральные флаконы площадью 25 см2, с плотностью посева 40×103 ЯСК/см2 в 5 мл соответствующей полной (ростовой) питательной среды и наращивали в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. В качестве базовой среды для наращивания β-клеток поджелудочной железы использовали RPMI 1640, для ММСКжт и ММСКкм - DMEM/F12, все ростовые среды содержали 10% сыворотки FBS, L-глютамин (200 mM/мл), пенициллин (100 Ед/мл), стрептомициа (100 мкг/мл), все реактивы производства Sigma, США.The resulting cell mass suspension was washed with Hank's solution followed by centrifugation at 300g for 10 minutes. Isolation of MMSCs from the bone marrow of rats was carried out by washing out cells from the medullary canal of the femur according to the standard method, using DMEM/F12 medium containing 10% FBS serum, L-glutamine (200 mM/ml), penicillin (100 U/ml), streptomycin ( 100 µg/ml). The resulting cells were seeded in culture flasks with an area of 25 cm 2 , with a seeding density of 40×10 3 NSC/cm 2 in 5 ml of the appropriate complete (growth) nutrient medium and grown in a CO2 incubator at 5% CO2 and 20%O2. RPMI 1640 was used as a base medium for growing pancreatic β-cells, DMEM/F12 was used for MMSC ajt and MMSC km, all growth media contained 10% FBS serum, L-glutamine (200 mM/ml), penicillin (100 U/ml) , streptomy (100 μg/ml), all reagents manufactured by Sigma, USA.
Для инкапсулирования использовался раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%) и полимеризовали добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%.For encapsulation, a solution of low viscosity sodium alginate 1% was used with the addition of saline (Sodium chloride 0.9%) and polymerized by adding BaCl2 (Sigma, USA) at a concentration of 2.2%.
Варианты экспериментальных систем in vitro, отражающих процессы клеточного взаимодействия представлены ниже: клеточная система №1:Variants of experimental systems in vitro, reflecting the processes of cellular interaction are presented below: cellular system No. 1:
инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ИПК (иИПК); клеточная система №2:alginate capsule encapsulated IPC monocultures (iIPCs); cell system #2:
инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ММСКжт (иММСКжт); клеточная система №3:monocultures encapsulated in alginate capsules MMSKajt (iMMSCajt); cell system #3:
инкапсулированные в альгинатные капсулы монокультуры ММСКкм (иММСКкм); клеточная система №4:monocultures encapsulated in alginate capsules MMSCkm (iMMSCkm); cellular system No. 4:
инкапсулированные в альгинатных капсулах ИПК, сокультивированные с адгезированными на пластике ММСКжт (иИПК + аММСКжт);IPC encapsulated in alginate capsules, co-cultivated with plastic-adhered MMSC ajt (iIPC + aMMSC ajt);
клеточная система №5:cell system #5:
инкапсулированные в альгинатных капсулах ИПК, сокультивированные с адгезированными на пластике ММСКкм (иИПК + аММСКкм).encapsulated in alginate capsules IPC, co-cultivated with MMSC km adhered to plastic (iIPK + aMMSC km).
Системы сокультивирования №1-3 использовали в качестве контрольных монокультур для оценки функциональных и молекулярно-генетических изменений в экспериментальных системах сокультивирования №4-5. Все клеточные системы инкубировали в течение 24 и 48 часов. В качестве контроля для оценки уровня относительной экспрессии генов использовали клеточные системы с 3-х часовым периодом инкубации. Культивирование ММСК и ИПК в эксперименте осуществлялось в среде DMEM с L-глютамином, с высоким содержанием глюкозы 4,0 г/л (Sigma, США), все остальные компоненты соответствовали стандартному протоколу.Cocultivation systems #1-3 were used as control monocultures to assess functional and molecular genetic changes in experimental cocultivation systems #4-5. All cell systems were incubated for 24 and 48 hours. Cell systems with a 3-hour incubation period were used as a control to assess the level of relative gene expression. The cultivation of MMSC and IPC in the experiment was carried out in DMEM medium with L-glutamine, with a high glucose content of 4.0 g/l (Sigma, USA), all other components corresponded to the standard protocol.
Исследование уровня относительной экспрессии генов теломеразной обратной транскриптазы (Tert) и проинсулина (Ins) в клетках осуществлялось в условиях нормоксии и гипоксии: культивирование клеток проводилось как в общепринятых (5% CO2 и 21% O2), так и в низкокислородных условиях (5% CO2 и 5% O2), идентичных газовому составу внутренней среды организма. Деполимеризация альгинатного покрытия осуществлялась обработкой раствором, содержащим 55Мм ЭДТА (Sigma, США) с добавлением 10 мМ HEPES с последующим центрифугированием (5 минут 1000 обр/мин). Выделение РНК из культур клеток проводили с использованием реагента ExtractRNA («Евроген», Россия) согласно протоколу производителя. Обратная транскрипция образцов РНК осуществлялась с применением наборов реагентов MMLV RT kit («Евроген», Россия). Для определения уровня экспрессии исследуемых генов проводили количественную ПЦР в режиме реального времени с использованием реагента qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия) на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad», США). В качестве нормировочного гена использовали гипоксантин фосфорибозилтрансферазу-1 (HPRT). Специфичность продуктов амплификации подтверждалась путем анализа кривых температурной диссоциации ампликонов (Melting curve analysis).The level of relative expression of the telomerase reverse transcriptase (Tert) and proinsulin (Ins) genes in cells was studied under normoxic and hypoxic conditions: cells were cultivated both under conventional (5% CO2 and 21% O2) and low oxygen conditions (5% CO2 and 5% O2), identical to the gas composition of the internal environment of the body. Depolymerization of the alginate coating was carried out by treatment with a solution containing 55 Mm EDTA (Sigma, USA) with the addition of 10 mM HEPES, followed by centrifugation (5 minutes, 1000 rpm). RNA isolation from cell cultures was performed using the ExtractRNA reagent (Evrogen, Russia) according to the manufacturer's protocol. Reverse transcription of RNA samples was carried out using MMLV RT kits (Evrogen, Russia). To determine the level of expression of the studied genes, quantitative real-time PCR was performed using the qPCRmix-HS SYBR reagent (Evrogen, Russia) on a CFX96 amplifier (Bio-Rad, USA). Hypoxanthine phosphoribosyltransferase-1 (HPRT) was used as a normalization gene. The specificity of the amplification products was confirmed by analysis of the temperature dissociation curves of the amplicons (Melting curve analysis).
В проведенном исследовании оптимизирована методика получения, инкапсуляции, культивирования ИПК поджелудочной железы и их со-культивирование с ММСКжт и ММСКкм крыс в условиях in vitro.In the study, the method for obtaining, encapsulating, and cultivating pancreatic IPCs and their co-cultivation with rat MMSCs and MMSCs in in vitro conditions was optimized.
Процедура включала следующие шаги:The procedure included the following steps:
1. Подготовка животного к забору материала путем усыпления эфирным наркозом в летальной концентрации в эксикаторе.1. Preparation of the animal for sampling by euthanization with lethal concentration of ether anesthesia in a desiccator.
2. Процедура операции для забора биоматериала заключалась во вскрытии брюшной полости в направлении от ануса к диафрагме препаровальными инструментами для обнаружения поджелудочной железы и общего желчного потока. При пережатии двенадцатиперстной кишки, параллельно линии поджелудочной железы вставлялась игла шприца в желчный пузырь с раствором коллагеназы. Вводили шесть миллилитров раствора коллагеназы через желчный проток. Поджелудочная железа аккуратно удалялась целиком и помещалась в 50 мл пробирку.2. The operation procedure for biomaterial sampling consisted in opening the abdominal cavity in the direction from the anus to the diaphragm with dissecting instruments to detect the pancreas and the common bile stream. When clamping the duodenum, a syringe needle was inserted parallel to the line of the pancreas into the gallbladder with a collagenase solution. Introduced six milliliters of collagenase solution through the bile duct. The pancreas was carefully removed in its entirety and placed in a 50 ml tube.
3. Далее добавляли пять миллилитров солевого раствора в пробирку и помещали на водяную баню на 20 минут (+37°C).3. Next, five milliliters of saline solution was added to the test tube and placed in a water bath for 20 minutes (+37°C).
4. Пробирки из водяной бани переносили на лед, с последующим удалением жидкой фазы.4. The tubes from the water bath were transferred to ice, followed by removal of the liquid phase.
5. Ферментацию останавливали путем добавления 15 мл ледяного раствора 1.1 RPMI (+2-4°C).5. The fermentation was stopped by adding 15 ml of an ice-cold solution of 1.1 RPMI (+2-4°C).
6. Полученную массу дестабилизировали на шейкере встряхиванием 3 раза/сек в течении 1 минуты, не переворачивая пробирку. Далее пробирку помещали на лед.6. The resulting mass was destabilized on a shaker by shaking 3 times/sec for 1 minute without inverting the tube. Next, the tube was placed on ice.
7. В новую 50 мл пробирку через сито (500 мкм), смоченное холодной средой RPMI, процеживали ферментированную поджелудочную железу. Остатки поджелудочной железы вымывали из пробирки 30 мл RPMI, затем процеживали через сито. Далее помещали пробирку на лед. Инкубировали 10 мин для осаждения клеточной составляющей на дно.7. In a new 50 ml tube, the fermented pancreas was filtered through a sieve (500 µm) moistened with cold RPMI medium. The remains of the pancreas were washed out of the tube with 30 ml of RPMI, then filtered through a sieve. Next, the tube was placed on ice. Incubated for 10 min to sediment the cellular component to the bottom.
8. Собирали супернатант, оставляя 10-15 мл на дне. Затем доводили объем до 30 мл средой RPMI, осторожно перевернув 2-3 раза.8. The supernatant was collected, leaving 10-15 ml at the bottom. The volume was then adjusted to 30 ml with RPMI medium by gently inverting 2-3 times.
9. Центрифугировали пробирку в течение 2 минут на 215 g при комнатной температуре.9. Centrifuge the tube for 2 minutes at 215 g at room temperature.
10. Аккуратно удаляли супернатант, не разбивая осадок. Затем пробирку с осадком переворачивали на лист бумаги, чтобы остатки среды стекли из пробирки. Важно! Необходимо удалить всю среду, для создания градиента с Фиколлом.10. Carefully remove the supernatant without breaking the pellet. Then the test tube with the precipitate was turned over onto a sheet of paper so that the remaining medium drained from the tube. Important! It is necessary to remove the entire environment to create a gradient with Ficoll.
12. Затем ресуспендировали осадок в 3 мл 25% Фиколла. Затем наслаивали градиент фиколла: поверх 3 мл 23% Фиколла, затем 2 мл 20% Фиколла и 2 мл 11% Фиколла.12. The pellet was then resuspended in 3 ml of 25% Ficoll. Then a ficoll gradient was layered: over 3 ml of 23% ficoll, then 2 ml of 20% ficoll and 2 ml of 11% ficoll.
13. Центрифугировали на 800 g 10 мин. Островки концентрировались на границе раздела фаз 11% и 20% Фиколла. Часть островком обнаруживали на границе раздела между 20% и 23% Фиколла.13. Centrifuged at 800 g for 10 min. The islands were concentrated at the 11% and 20% Ficoll interface. Part of the island was found at the interface between 20% and 23% Ficoll.
14. Островки собирали с помощью дозатора. Далее клетки помещали в 50 мл пробирку с 6 мл холодного промывочного раствора. Процедуру промывки осуществляли 3 раза (центрифугируя на 250 g 1 минуту).14. Islets were collected with a dispenser. Next, the cells were placed in a 50 ml tube with 6 ml of cold wash solution. The washing procedure was carried out 3 times (centrifuging at 250 g for 1 minute).
15. Далее островки центрифугировали на 250 g 5 минут. Супернатант удаляли.15. Next, the islets were centrifuged at 250 g for 5 minutes. The supernatant was removed.
16. Добавляли к осадку 300 мкл трипсина и ресуспендировали.16. Add 300 µl of trypsin to the pellet and resuspend.
17. Инкубировали 5 минут при 37°C на водяной бане.17. Incubated for 5 minutes at 37°C in a water bath.
18. Ресуспендировали островки 10 раз, используя автоматический дозатор на 1000 мкл.18. Resuspend the islets 10 times using a 1000 µl automatic dispenser.
19. Для остановки процесса ферментации добавляли полную питательную среду RPMI (10%FBS).19. Complete RPMI culture medium (10% FBS) was added to stop the fermentation process.
20. Центрифугировали в течение 5 мин на 305 g для осаждения отдельных клеток.20. Centrifuged for 5 min at 305 g to pellet individual cells.
21. Далее удаляли супернатант и помещали в 1 мл полной питательной среды RPMI.21. Next, the supernatant was removed and placed in 1 ml of complete RPMI culture medium.
22. Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO2 с разным содержанием кислорода (5% и 20%).22. Cells were incubated at 37°C, 5% CO2 with different oxygen levels (5% and 20%).
Получение и культивирование ММСК клеток осуществлялось по стандартным методикам.Obtaining and cultivation of MMSC cells was carried out according to standard methods.
Для выделения ММСКжт биоптаты жировой ткани промывали PBS с добавлением HEPES и антибиотика в 10-ти кратном объеме. Дезагрегация тканей проводилась коллагеназой-1А (Sigma, США). Полученную суспензию клеточной массы промывали раствором Хенкса с последующим центрифугированием при 300g 10 минут.To isolate MMSCs, adipose tissue biopsies were washed with PBS with the addition of HEPES and an antibiotic in a 10-fold volume. Tissue disaggregation was performed with collagenase-1A (Sigma, USA). The resulting cell mass suspension was washed with Hank's solution, followed by centrifugation at 300g for 10 minutes.
Выделение ММСК из костного мозга крыс проводили вымыванием клеток из костномозгового канала бедренной кости средой DMEM/F12 с 10% добавлением сыворотки FBS и L-глютамина (200 mM/мл), пенициллина (100 Ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл).Isolation of MMSCs from the bone marrow of rats was carried out by washing out cells from the medullary canal of the femur with DMEM/F12 medium with 10% addition of FBS serum and L-glutamine (200 mM/ml), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) .
Выделенные клетки засевали в культуральные флаконы площадью 25 см2 в 5 мл соответствующей ростовой питательной среды и наращивали в CO2 инкубаторе при 5% CO2 и 20%О2. Исследованные в эксперименте условия гипоксии in vitro являются наиболее приближенным состоянием для органов и тканей макроорганизма млекопитающих.The isolated cells were seeded into 25 cm2 culture flasks in 5 ml of the appropriate growth medium and grown in a CO2 incubator at 5% CO2 and 20%O2. The conditions of hypoxia in vitro studied in the experiment are the most approximate state for the organs and tissues of the macroorganism of mammals.
Были созданы тестовые системы сокультивирования (более подробно см. материалы и методы). Для инкапсулирования использовался раствор альгината натрия низкой вязкости 1% с добавлением физраствора (Натрия хлорид 0,9%), полимеризовали добавлением BaCl2 (Sigma, США) в концентрации 2,2%. Деполимеризация альгинатного покрытия для экстракции мРНК осуществлялась обработкой раствором, содержащим 55 Мм ЭДТА с добавлением 10 мМ HEPES с последующим центрифугированием (5 минут 1000 обр/мин).Test co-cultivation systems were created (see Materials and Methods for more details). For encapsulation, a solution of low viscosity sodium alginate 1% was used with the addition of saline (Sodium chloride 0.9%), polymerized by adding BaCl2 (Sigma, USA) at a concentration of 2.2%. Depolymerization of the alginate coating for mRNA extraction was carried out by treatment with a solution containing 55 Mm EDTA supplemented with 10 mM HEPES, followed by centrifugation (5 minutes, 1000 rpm).
При изучении жизнеспособности культур иИПК было показано положительное влияние условий сокультивирования в сочетании с гипоксией на такие показатели, как общий процент живых клеток и абсолютный показатель живых клеток. Эти результаты наиболее показательны в случае сокультивирования иИПК с ММСКкм. В контрольных системах (№2-3) в условиях гипоксии выявлено возрастание уровня экспрессии мРНК гена Tert в иММСК (км и жт) с увеличением общего количества клеток. В системах №4-5, вне зависимости от состава газовой среды, регистрировались аналогичные изменения в отношении общего количества клеток и их жизнеспособности аММСК (жт и км) и иИПК.When studying the viability of IPC cultures, a positive effect of co-cultivation conditions in combination with hypoxia on such indicators as the total percentage of living cells and the absolute indicator of living cells was shown. These results are most indicative in the case of co-cultivation of iPPK with MMSCkm. In the control systems (nos. 2-3), under hypoxic conditions, an increase in the level of expression of the mRNA of the Tert gene in iMMSCs (km and zht) was revealed with an increase in the total number of cells. In systems No. 4-5, regardless of the composition of the gaseous medium, similar changes were recorded in relation to the total number of cells and their viability of aMMSC (fat and km) and iIPC.
В проведенном нами исследовании выявлено увеличение относительного уровня экспрессии проинсулина монокультурой инкапсулированных ИПК в высококислородных условиях культивирования (через 24 часа) после стимуляции глюкозой; через 48 часов регистрируется рост уровня инсулина в супернатантах культур. Выявленные нами изменения связаны с накоплением клетками синтезированного инсулина в гранулах и его последующим выходом в окружающую среду. Необходимо отметить, что секреторная активность иИПК зависела от газового состава среды. При сокультивировании с аММСКжт и аММСКкм, инкапсулированные ИПК проявляли более высокую функциональную активность в низкокислородных условиях культивирования. В случае монокультур, в низкокислородных условиях продукция инсулина была ниже, чем в культуре иИПК при нормоксии. Сокультивирование иИПК с ММСК различного происхождения увеличивало секрецию инсулина в 2,5-4 раза по сравнению с базальным уровнем, как в стандартных условиях культивирования, так и в условиях гипоксии in vitro.Our study revealed an increase in the relative level of proinsulin expression by a monoculture of encapsulated IPC under high-oxygen cultivation conditions (after 24 hours) after stimulation with glucose; after 48 hours, an increase in the level of insulin in the culture supernatants is recorded. The changes we identified are associated with the accumulation of synthesized insulin in granules by cells and its subsequent release into the environment. It should be noted that iIPC secretory activity depended on the gas composition of the medium. When co-cultivated with aMMSCajt and aMMSCkm, encapsulated IPC showed higher functional activity under low-oxygen cultivation conditions. In the case of monocultures, under low-oxygen conditions, insulin production was lower than in iPPC culture under normoxia. Co-cultivation of iIPCs with MMSCs of various origins increased insulin secretion by 2.5-4 times compared to the basal level, both under standard cultivation conditions and under hypoxic conditions in vitro.
Исследование содержания цитокинов в супернатантах полученных культур позволило выявить, что инкапсуляция клеток ИПК приводит к снижению их цитокинпродуципующей активности. Наиболее значимые изменения затрагивали продукцию провоспалительного фактора TNF-a (более чем в 20 раз) в ММСКжт и ММСКкм. Выявлена разнонаправленная динамика изменений содержания про- и антивоспалительных цитокинов - TNF-a и IL-10, в зависимости от газового состава среды и системы культивирования.The study of the content of cytokines in the supernatants of the obtained cultures revealed that the encapsulation of IPC cells leads to a decrease in their cytokine-producing activity. The most significant changes affected the production of the pro-inflammatory factor TNF-a (more than 20 times) in MMSCs and MMSCs. Multidirectional dynamics of changes in the content of pro- and anti-inflammatory cytokines - TNF-a and IL-10, depending on the gas composition of the medium and the cultivation system, was revealed.
Так, уровень TNF-a имеет тенденцию к понижению во всех культурах при высоком уровне кислорода, тогда как при гипоксии его уровень снижался только при сокультивировании с ММСКкм. Тогда как содержание IL-10 в супернатантах исследованных клеточных культур напротив, возрастало за исключением всех монокультур в низкокислородных условиях. В случае сокультивирования при гипоксии, повышенный уровень IL-12 в клеточных супернатантах может свидетельствовать о более высокой чувствительности к изменениям газового состава среды систем №4-5.Thus, the level of TNF-a tends to decrease in all cultures at a high level of oxygen, while under hypoxia its level decreased only when co-cultivated with MMSCm. Whereas the content of IL-10 in the supernatants of the studied cell cultures, on the contrary, increased, except for all monocultures under low oxygen conditions. In the case of cocultivation under hypoxia, an increased level of IL-12 in cell supernatants may indicate a higher sensitivity to changes in the gas composition of the environment of systems No. 4-5.
В то же время снижение содержания TNF-a, IL-12 и, напротив, повышение уровня продукции IL-10 в КСК №5 при гипоксии может свидетельствовать о преобладании реакций, направленных на подавление воспаления по сравнению с другими системами.At the same time, a decrease in the content of TNF-a, IL-12 and, on the contrary, an increase in the level of IL-10 production in BSC No. 5 during hypoxia may indicate the predominance of reactions aimed at suppressing inflammation compared to other systems.
Известно, что IL-5 и IL-13 являются регуляторными цитокинами. Однако, учитывая условия изоляции клеточных систем от естественного микроокружения, сделать однозначных выводов о роли изменения содержания IL-5 и IL-13 в системах культивирования не представляется возможным и требует дополнительных исследованийIL-5 and IL-13 are known to be regulatory cytokines. However, given the conditions of isolation of cell systems from the natural microenvironment, it is not possible to draw unambiguous conclusions about the role of changes in the content of IL-5 and IL-13 in culture systems and requires additional research.
Таким образом:In this way:
1. Инкапсуляция исследованных клеточных культур с использованием альгината натрия низкой вязкости, полимеризуемого двухвалентными ионами бария, позволяет поддерживать стабильный функциональный потенциал и жизнеспособность используемых клеток. Альгинатное покрытие не препятствует циркуляции питательных компонентов, продуктов метаболизма и секретируемых молекул, таких как цитокины, ростовые факторы и гормоны.1. Encapsulation of the studied cell cultures using low-viscosity sodium alginate, polymerized by divalent barium ions, allows maintaining a stable functional potential and viability of the cells used. The alginate coating does not interfere with the circulation of nutrients, metabolic products and secreted molecules such as cytokines, growth factors and hormones.
2. Сокультивирование (системы №4 и №5) в низкокислородных условиях способствует повышению выживаемости иИПК на 6% и 18%, соответственно. При культивировании в стандартной газовой среде (5%CO2/21%O2) данный эффект отсутствует.2. Co-cultivation (systems No. 4 and No. 5) under low-oxygen conditions increases the survival rate of iIPK by 6% and 18%, respectively. When cultivating in a standard gaseous medium (5%CO2/21%O2), this effect is absent.
3. Выявлено стимулирующее действие ММСК как жировой ткани, так и костного мозга, на уровень продукции инсулина (содержание инсулина в супернатантах клеточных культур и уровень экспрессии гена Ins) иИПК в условиях гипоксии. Уровень инсулина в супернатантах ко-культур (№4 и №5) в 3 раза превышал аналогичные значения, регистрируемые при исследовании монокультур иИПК.3. The stimulating effect of MMSCs from both adipose tissue and bone marrow on the level of insulin production (insulin content in cell culture supernatants and the level of Ins gene expression) and IPC under hypoxic conditions was revealed. The level of insulin in the supernatants of co-cultures (No. 4 and No. 5) was 3 times higher than similar values recorded in the study of monocultures and IPC.
4. Выявлена тенденция к изменению продукции цитокинов в сторону противовоспалительного профиля при сокультивировании иИПК с ММСК (жт и км), независимо содержания кислорода в газовой среде. Более значимые изменения регистрируются при сокультивировании иИПК с ММСКкм.4. A trend towards a change in the production of cytokines towards an anti-inflammatory profile was revealed during co-cultivation of iIPC with MMSC (fat and km), regardless of the oxygen content in the gaseous medium. More significant changes are recorded during cocultivation of iIPK with MMSCkm.
5. Выявлена зависимость уровня экспрессии мРНК гена Tert во всех исследуемых клеточных системах от состава газовой среды. В системах сокультивирования установлены разнонаправленные изменения уровня экспрессии мРНК гена Tert в ММСК (жт и км) и иИПК.5. The dependence of the expression level of mRNA of the Tert gene in all studied cell systems on the composition of the gaseous medium was revealed. In cocultivation systems, multidirectional changes in the expression level of the Tert gene mRNA in MMSCs (fat and km) and iIPCs were established.
Таким образом, в заявляемом способе лечения сахарного диабета с использованием клеточного трансплантата, биотрансплантант содержит инкапсулированные в альгинатное покрытие инсулинпродуцирующие клетки и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) из жировой ткани. Способ создания технологии лечения сахарного диабета заключается в использовании подхода с инкапсулированием клеточной составляющей в иммуноизоляторный материал с пролонгированием жизнеспособности за счет использования клеток ММСК. Изобретение обеспечивает глюкозозависимую продукцию инсулина, приводит к снижению воспалительных процессов, что может позволить улучшить гликемический контроль.Thus, in the proposed method for the treatment of diabetes mellitus using a cell transplant, the biograft contains insulin-producing cells encapsulated in an alginate coating and multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) from adipose tissue. The way to create a technology for the treatment of diabetes is to use the approach of encapsulating the cellular component in an immunoisolator material with prolongation of viability through the use of MMSC cells. EFFECT: invention provides glucose-dependent insulin production, leads to a decrease in inflammatory processes, which can improve glycemic control.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫLIST OF USED LITERATURE
1. Маслова О.В., Сунцов Ю.И., Болотская Л.Л., Казаков И.В. Эпидемиология сахарного диабета и прогноз его распространенности в Российской Федерации // Сахарный диабет. - 2011. - №1. - С. 15-18.1. Maslova O.V., Suntsov Yu.I., Bolotskaya L.L., Kazakov I.V. Epidemiology of diabetes mellitus and the forecast of its prevalence in the Russian Federation // Diabetes mellitus. - 2011. - No. 1. - S. 15-18.
2. Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений РД-АПК 3.10.07.02-09 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации // Москва, 2009.2. Guidelines for keeping laboratory animals in vivariums of research institutes and educational institutions RD-APK 3.10.07.02-09 Ministry of Agriculture of the Russian Federation // Moscow, 2009.
3. Ярилин, А.А. Иммунология / А.А. Ярилин. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752.3. Yarilin, A.A. Immunology / A.A. Yarilin. - M: GEOTAR-Media, 2010. - 752.
4. Krishnan R, Агога RP, Alexander М, et al. Noninvasive evaluation of the vascular response to transplantation of alginate encapsulated islets using the dorsal skin-fold model. // Biomaterials. - 2014. - Vol. 35, (3). - P. 891-898.4. Krishnan R, Agoga RP, Alexander M, et al. Noninvasive evaluation of the vascular response to transplantation of alginate encapsulated islets using the dorsal skin-fold model. // Biomaterials. - 2014. - Vol. 35, (3). - P. 891-898.
5. Barkai U, Weir GC, Colton CK, et al. Enhanced oxygen supply improves islet viability in a new bioartificial pancreas // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22, (8). P. 1463-76.5. Barkai U, Weir GC, Colton CK, et al. Enhanced oxygen supply improves islet viability in a new bioartificial pancreas // Cell Transplant. - 2013. - Vol. 22, (8). P. 1463-76.
6. Glenn J.D., Smith M.D., Calabresi P.A., Whartenby K.A. Mesenchymal stem cells differentially modulate effector CD8+T cell subsets and exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis // Stem Cells. - 2014. - Vol. 32, (10). - P. 2744-2755.6. Glenn J.D., Smith M.D., Calabresi P.A., Whartenby K.A. Mesenchymal stem cells differentially modulate effector CD8+T cell subsets experimental and exacerbate autoimmune encephalomyelitis // Stem Cells. - 2014. - Vol. 32, (10). - P. 2744-2755.
7. Lanz T.V., Opitz C.A., Ho P.P., Agrawal A., Lutz C., Weller M., Mellor A.L., Steinman L., Wick W., Platten M. Mouse mesenchymal stem cells suppress antigen-specific TH cell immunity independent of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) // Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19, (5). - P. 657-668.7. Lanz TV, Opitz CA, Ho PP, Agrawal A., Lutz C., Weller M., Mellor AL, Steinman L., Wick W., Platten M. Mouse mesenchymal stem cells suppress antigen-specific TH cell immunity independent of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) // Stem Cells Dev. - 2010. - Vol. 19, (5). - P. 657-668.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020141356A RU2765913C1 (en) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020141356A RU2765913C1 (en) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2765913C1 true RU2765913C1 (en) | 2022-02-04 |
Family
ID=80214709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020141356A RU2765913C1 (en) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2765913C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143867C1 (en) * | 1997-11-12 | 2000-01-10 | Дамбаев Георгий Цыренович | Implant for surgical treatment of internal organ diseases |
-
2020
- 2020-12-14 RU RU2020141356A patent/RU2765913C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2143867C1 (en) * | 1997-11-12 | 2000-01-10 | Дамбаев Георгий Цыренович | Implant for surgical treatment of internal organ diseases |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Прорывные научные исследования как двигатель науки нового времени : сборник научных статей по итогам международной научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 25-26 ноября 2016 года. - Санкт-Петербург: Общество с ограниченной ответственностью "Редакционно-издательский центр "КУЛЬТ-ИНФОРМ-ПРЕСС", 2016, 313 с. - ISBN 978-5-8392-0627-4, с. 8-10. * |
| Прорывные научные исследования как двигатель науки нового времени : сборник научных статей по итогам международной научно-практической конференции, Санкт-Петербург, 25-26 ноября 2016 года. - Санкт-Петербург: Общество с ограниченной ответственностью "Редакционно-издательский центр "КУЛЬТ-ИНФОРМ-ПРЕСС", 2016, 313 с. - ISBN 978-5-8392-0627-4, с. 8-10. ШУПЛЕЦОВА В.В. и др. Инкапсуляция клеток и тканей поджелудочной железы: проблемы и пути их преодоления, Гены и Клетки, 2016, Т. 11, No. 1, с. 18-23. * |
| ШУПЛЕЦОВА В.В. и др. Инкапсуляция клеток и тканей поджелудочной железы: проблемы и пути их преодоления, Гены и Клетки, 2016, Т. 11, No. 1, с. 18-23. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | 3D porous calcium-alginate scaffolds cell culture system improved human osteoblast cell clusters for cell therapy | |
| KR100870508B1 (en) | Adipose-derived hepatocytes and lattice | |
| KR100907248B1 (en) | Volume replacement method of body by transplantation of differentiated young fat cells and biodegradable polymer | |
| KR101613478B1 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cell-hydrogel and preparation method thereof | |
| Kallos et al. | Large-scale expansion of mammalian neural stem cells: a review | |
| KR101585032B1 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cell-hydrogel and preparation method thereof | |
| JP2013240306A (en) | Molding base material for producing artificial tissue body for transplantation | |
| US20110027880A1 (en) | Cell culture system for pancreatic islands | |
| JP2021524253A (en) | Cell culture system in bioreactor | |
| CN114045253A (en) | Stem cell and islet beta cell co-culture method based on composite hydrogel | |
| Esmaeili et al. | Co-culture engineering: a promising strategy for production of engineered extracellular vesicle for osteoarthritis treatment | |
| JP4748222B2 (en) | Chondrocyte preparation method | |
| Day | Epithelial stem cells and tissue engineered intestine | |
| RU2765913C1 (en) | Method for creating cell transplants for treatment of type 1 diabetes mellitus | |
| Shi et al. | Advancements in culture technology of adipose-derived stromal/stem cells: implications for diabetes and its complications | |
| EP2610337B1 (en) | Method for expanding blood adult stem cells | |
| CN102100586A (en) | Method for preparing novel mixing artificial blood vessel | |
| CN108841779A (en) | Application of pancreas-specific ECM in promoting proliferation, migration and directed differentiation of BMSCs into insulin-secreting cells | |
| CN104877954B (en) | A method of by stem cell alcove culture stem cell | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| Wang et al. | Research update on bioreactors used in tissue engineering | |
| CN101139573A (en) | Method for inducing islet cells differentiated from stem cells to form islet-like structure in vitro | |
| JP2010046053A (en) | Sheet-shaped animal cell aggregation-cultured composition and method for making the same | |
| CN113174370B (en) | Cord blood stem cell and amplification culture method thereof | |
| RU2618989C1 (en) | Treatment method of live failure |