RU2765951C1 - Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов - Google Patents
Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2765951C1 RU2765951C1 RU2021113781A RU2021113781A RU2765951C1 RU 2765951 C1 RU2765951 C1 RU 2765951C1 RU 2021113781 A RU2021113781 A RU 2021113781A RU 2021113781 A RU2021113781 A RU 2021113781A RU 2765951 C1 RU2765951 C1 RU 2765951C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hyaluronate
- solution
- sodium
- sodium chloride
- precipitate
- Prior art date
Links
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 title claims abstract description 69
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 82
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims abstract description 49
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims abstract description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 23
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 21
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 claims abstract description 18
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 14
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229960004830 cetylpyridinium Drugs 0.000 claims abstract description 10
- NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N cetylpyridinium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 NEUSVAOJNUQRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 15
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 abstract description 12
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 abstract description 10
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 abstract description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical group OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical group 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNLZBVFSCVTSLA-UHFFFAOYSA-N 2-keto-3-deoxyoctonic acid Chemical group OCC(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1O NNLZBVFSCVTSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- -1 Ca 2+ and Mg 2+ Chemical class 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- BGWQRWREUZVRGI-OLLRPPRZSA-N D-glucoheptopyranose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O BGWQRWREUZVRGI-OLLRPPRZSA-N 0.000 description 1
- 101800001148 Delta-peptide Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- YPZMPEPLWKRVLD-UHFFFAOYSA-N L-glycero-D-manno-heptose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)C=O YPZMPEPLWKRVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 208000001871 Tachycardia Diseases 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical group 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N lipid fragment Chemical compound CC(C)CCCCCCCCCCCC[C@@H](C)CCCCCCCC(C)C ZADHKSJXSZBQFB-HHHXNRCGSA-N 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000006794 tachycardia Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/02—Reverse osmosis; Hyperfiltration ; Nanofiltration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающемуся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, отличающемуся тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5 %, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75 %-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5 %-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охлажденном до температуры 5-7 °С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5 %-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15 %, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9 %-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2 %, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат. Настоящее изобретение обеспечивает сохранение в процессе очистки исходной молекулярной массы гиалуроновой кислоты (ее солей), реологических свойств, обеспечивает чистоту конечного продукта вследствие исключения использования органических растворителей, а также обеспечивает повышение выхода конечного продукта. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано при очистке соли гиалуроната натрия от эндотоксинов для медицинских целей.
Эндотоксины - бактериальные токсические вещества, которые представляют собой структурные компоненты определенных бактерий и высвобождаются только при лизисе (распаде) бактериальной клетки. Это отличает эндотоксины от экзотоксинов, растворимых соединений, секретируемых живой бактериальной клеткой.
Бактериальные эндотоксины состоят из полисахаридного и липидного фрагментов. Полисахаридный фрагмент содержит О-специфическую цепь (O-антиген), включающую повторяющуюся последовательность олигосахаридных единиц на основе гликозильных остатков (до 50), а также ядро. Липид А и внутреннее ядро полисахаридной составляющей эндотоксинов частично фосфорилированы. Это приводит к тому, что в растворах с нейтральным или основным рН эндотоксины будут иметь выраженный отрицательный заряд (рКа 1,3).
Молекулярная масса мономеров различных липополисахаридов может варьировать в достаточно широких диапазонах, что объясняется вариабельностью О-специфической цепи. Известны эндотоксины с молекулярными массами от 2,5 кДа (с укороченной О-специфической цепью) до 70 кДа (с очень длинной О-специфической цепью). Большая же часть липополисахаридов имеет молекулярную массу от 10 до 20 кДа.
Однако необходимо отметить, что мономерные липополисахариды могут образовывать супрамолекулярные структуры за счет неполярных взаимодействий между липидными «хвостами», а также за счет образования «сшивок» фосфатных групп бивалентными катионами. Таким образом в водных растворах эндотоксины могут агрегировать в ламелярные, кубические или инвертированные гексагональные структуры, такие как мицеллы или везикулы. Диаметр подобных структур достигает 0,1 мкм, а молекулярная масса - 1000 кДа. Бивалентные катионы, такие как Ca2+и Mg2+, способствуют образованию супрамолекулярных структур, а детергенты, ЭДТА и белки, наоборот, смещают равновесие в сторону образования мономерных форм.
О-специфическая цепь уникальна для каждого прокариотического штамма; она вносит существенный вклад в серологическую специфичность, вызывая иммунный ответ в организмах человека и животных.
Основными составляющими ядра являются остатки гептозы (гексапиранозы во внешней части ядра и L-глицеро-D-манногептозы во внутренней части), а также группы 2-кето-3-деоксиоктоновой кислоты.
Липидный фрагмент эндотоксинов или липид А является наименее вариабельной и наиболее консервативной частью. Липид А отвечает за эндотоксическую активность. Она проявляется в стимулировании производства и высвобождения гранулоцитами и макрофагами эндогенных медиаторов, таких как биоактивные липиды, NO, цитокины (например, интерлейкин-1). Большие концентрации таких медиаторов в организме могут привести к множеству различных патофизиологических реакций, как-то повышение температуры тела, лейкопения, тахикардия, гипотония, рассеянная внутрисосудистая коагуляция и т.д.
Все выше сказанное подтверждает актуальную необходимость освобождения препаратов гиалуроната от эндотоксинов.
В совокупности существует целый ряд способов снижения содержания эндотоксинов в биологических растворах. Но в случае, в частности, белков к настоящему времени отсутствуют стандартные способы для широкого применения. Соответствующие используемые способы адаптированы к конкретным свойствам соответствующего белка и к соответствующим способам получения этого белка. Существуют различные возможности снижения содержания эндотоксинов, каждая из которых имеет конкретные преимущества и недостатки.
Ультрафильтрация (Petsch, D.&Anspach, F.В., 2000, J. Biotechnol. 76, 97-119 и ссылки) используется для снижения содержания эндотоксинов в воде и растворах с низкомолекулярными компонентами, такими как соли, сахара и антибиотики, но не подходит для высокомолекулярных белков или ДНК.
Двухфазная экстракция (например, WO 0166718, Merck) предназначена для отделения водорастворимых белков и ДНК от эндотоксина, но приводит к наличию остатков детергентов в очищенном продукте. Кроме того, этот метод требует много времени из-за многократного повторения процедуры очистки.
Для снижения содержания эндотоксинов в ДНК и основных белках используется также метод анионного обмена (диэтиламиноэтил (DEAE)-целлюлоза) (например, US 5990301, Qiagen; WO 9414837, Enzon), но он требует низкой ионной силы (менее 50 мМ NaCl) и приводит в случае кислых белков к совместной адсорбции белков.
Еще одним методом снижения содержания эндотоксинов в ДНК и белках (например, БСА (бычий сывороточный альбумин), миоглобине, гамма-глобулине, цитохроме С) является аффинная адсорбция (например, полимиксин В, гистамин, гистидин, полилизин) согласно, например, GB 2192633 (HammersmithHospital), которая, однако, является токсичной в случае полимиксина В и может приводить к совместной адсорбции белков в случае низких ионных сил.
Кроме того, используется иммуноаффинная хроматография, при которой специфичности в отношении конкретных эндотоксинов можно добиться только при помощи дорогостоящих антител (US 5179018, Centocor; WO 0008463, Bioserv) против коревого олигосахарида.
Кроме того, с белками (например БСА, химотрипсиногеном) используют S3-дельта-пептид (WO 0127289) фактора С (компонент ЛАЛ-теста) (WO 9915676 обе: Национальный университет Сингапура), причем этот метод имеет низкую эффективность в случае высоких ионных сил, а также требует высоких затрат на производство продукции.
В фармацевтической промышленности для растворов биополимеров нашли применение по существу три метода, адаптированные к свойствам целевых белков:
- анионообменная хроматография;
- обращенно-фазовая хроматография; ее недостатком является то, что она не одинаково подходит для всех белков, в частности, возникают проблемы в случае гидрофобных белков; этот метод, кроме того, требует очень больших затрат времени;
- RemTox (компания Millipore): недостатком этого метода является то, что помимо очень большой продолжительности инкубации высок компонент неспецифического связывания, и извлечение белка часто неадекватно.
Перечисленные выше способы очистки биологических препаратов от эндотоксинов предполагают использовать дорогостоящее оборудование и химические реагенты, а также имеют низкий выход целевого продукта.
Наиболее близким к предложенному является способ очистки соли гиалуроновой кислоты от примесей, в том числе, от эндотоксинов, включающий следующие стадии: получение частично очищенной соли гиалуроновой кислоты из культуры микроорганизма, способного продуцировать гиалуроновую кислоту; контактирование частично очищенной соли гиалуроновой кислоты с раствором, содержащим соль, в частности, хлорид натрия, и гидрофильный органический растворитель, для переноса примесей, содержащихся в частично очищенной гиалуроновой кислоте, в жидкую фазу; а также выделение очищенной соли гиалуроновой кислоты из смеси раствора и частично очищенного продукта соли гиалуроновой кислоты центрифугированием; при этом микроорганизм, способный продуцировать гиалуроновую кислоту, принадлежит к роду Streptococcus, а гидрофильный органический растворитель выбран из метанола, этанола, пропанола, изопропанола и ацетона (US 2009/0162905 A1, Hideki, Kazuo [JP], опубл. 25.06.2009).
Недостатком данного способа является невозможность сохранения молекулярной массы гиалуроновой кислоты в процессе очистки, молекулярная масса очищенной гиалуроновой кислоты уменьшается вдвое, что в значительной степени ухудшает характеристики конечного продукта.
Также недостатком данного способа является факт использования органических растворителей, таких как метанол, пропанол, изопропанол и ацетон, что затрудняет применение конечного продукта в медицинских целях без дополнительной стадии очистки от «следов» этих высокотоксичных соединений.
Предложенное изобретение решает техническую проблему, заключающуюся в получении гиалуроната с высокими характеристиками.
Техническим результатом, позволяющим решить данную проблему, является обеспечение сохранения в процессе очистки исходной молекулярной массы гиалуроновой кислоты (ее солей), реологических свойств, обеспечение чистоты конечного продукта вследствие исключения использования органических растворителей, а также повышение выхода конечного продукта.
Техническая проблема решается способом очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающимся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, при этом способ отличается тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5%-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5%, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75%-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5%-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охдажденном до температуры 5-7°С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5%-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15%, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9%-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9%-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2%, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат.
В одном варианте очищенный гиалуронат получают в виде раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану.
В другом варианте очищенный гиалуронат получают путем осаждения его 96%-ным этанолом из раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану, и высушивания осадка.
Предлагается способ очистки от эндотоксинов препаратов гиалуроната с помощью нескольких процессов в технологической цепочке: осаждения, мицеллообразования, растворения в апротонных растворителях и ультрафильтрации на соответствующих молекулярной массе гиалуроната мембранах с последующей отмывкой растворами хлорида натрия.
В предложенном способе используются недорогие реактивы, он характеризуется небольшими временными затратами, большим выходом целевого продукта и высокой эффективностью очистки, а также в процессе очистки можно использовать исходный материал с различной степенью загрязненности эндотоксинами и белками и различной молекулярной массы. В процессе очистки показатели вязкости и молекулярная масса остаются неизменными.
Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов осуществляется следующим образом.
Навеску сухого препарата гиалуроната натрия определенной молекулярной массы, содержащий до 1⋅103 EU/мг эндотоксинов, растворяют в растворе 0,45 - 0,5% хлорида натрия и получают раствор гиалуроната натрия с концентрацией 0,5% - 0,25%. Особенностью данного способа является то, что в процессе очистки можно использовать исходный материал с различной степенью загрязненности эндотоксинами и белками и различной молекулярной массы, а также стабилизированный сшивающими агентами материал. Затем при интенсивном перемешивании действуют 0,5-0,75% раствором соли четвертичного аммония, предпочтительно хлоридом цетилпиридиния. Гиалуронат осаждают эквимолярным количеством соли четвертичного аммония по карбоксильным группам (1 моль гиалуроната по карбоксильным группам и 1 моль соли четвертичного аммония).
Количество карбоксильных групп гиалуроната натрия может быть вычислено по известной формуле исходя из массы навески гиалуроната натрия. Количество n дисахаридных единиц рассчитывается по формуле
n=m/М,
где m - масса навески гиалуроната натрия, за вычетом примесей;
М - молярная масса дисахаридной единицы гиалуроната натрия (равна 401,22 г/моль).
Количество дисахаридных единиц гиалуроната натрия в навеске и будет равно количеству карбоксильных групп, что дает возможность рассчитать необходимое количество и массу цетилпиридиния хлорида. Например, в 1,00 грамме гиалуроната натрия, содержащего 97,5% целевого вещества, будет следующее количество карбоксильных групп:
масса непосредственно гиалуроната составит 0,9750 г;
n=0,975/401,22=0,00243 (моль).
Навеску хлорида цетилпиридиния рассчитывают по формуле:
m=M ⋅ n,
где m - масса навески хлорида цетилпиридиния;
M - молярная масса хлорида цетилпиридиния, которая составляет 358,01 г/моль.
Таким образом, из примера, если количество карбоксильных групп в 1 г навески гиалуроната составляет 0,00243 моль, то необходимо взять для полного осаждения гиалуроната цетилпиридиния следующую массу соли четвертичного аммония:
m=0,00243 ⋅ 358,01=0,8699 (г).
Раствор оставляют на 8-16 часов для созревания и коагуляции осадка. По истечении заданного времени смесь центрифугируют при 15 тыс. оборотах в минуту в течение 30 минут. Сырой осадок собирают и взвешивают.
Готовят 0,3% - 0,5% раствор гиалуроната цетилпиридиния в 100% диметилсульфоксиде. Так как процесс растворения соли гиалуроната с четвертичным аммонием экзотермичен, то диметилсульфоксид охлаждают до 5С° - 7°С. Растворение протекает медленно при перемешивании в течение 4-7 часов. После полного растворения осадка на раствор действуют 1,25% - 1,5% раствором хлорида натрия.
Для осаждения гиалуроната натрия из раствора диметилсульфоксида берут эквимолярное количество хлорида натрия в растворе. Осадок собирают и растворяют в 0,9% растворе хлорида натрия соблюдая концентрацию 0,1-0,15%. Раствор гиалуроната натрия вливают в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе первоначально поступающего на очистку гиалуроната. Для удаления остатков хлорида цетилпиридиния и диметилсульфоксида в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9% раствора хлорида натрия от объема 0,1% - 0,15% раствора. После промывки раствор гиалуроната натрия в 0,9% растворе хлорида натрия концентрируют до 1% - 2%, фильтруют через стерилизационную мембрану и используют непосредственно раствор, либо осаждают 96% этанолом, или лиофильно сушат. Выход гиалуроната натрия составляет 93,7% - 95,5%. Эндотоксины и белок в препарате после очистки не обнаруживаются. Также, если материал был стабилизирован BDDE, после процесса очистки не обнаруживается BDDE и продукты его гидролиза.
Пример 1.
Взяли 10,0 г сухого порошка гиалуроната натрия, бактериального происхождения, производство Китай, стабилизированного сшивающим агентом BDDE. Приготовили 0,3% раствор гиалуроната натрия в 0,45% растворе хлорида натрия, для чего в 3333 мл дистиллированной воды растворили 14,999 г хлорида натрия и затем порошок гиалуроната натрия и перемешивали в пакете на лопаточном гомогенизаторе в течение 2 часов.
Рассчитали массу хлорида цетилпиридиния для эквимолярного осаждения гиалуроната натрия по карбоксильным группам:
n (карбоксильных групп)=10,0/401,22=0,0249 (моль),
n (цетилпиридиния хлорида)=n (карбоксильных групп)=0,0249 моль,
m (цетилпиридиния хлорида)=M ⋅ n,
m (цетилпиридиния хлорида)=358,01 ⋅ 0,0249=8,9144 (г).
Приготовили 0,55% раствор цетилпиридиния хлорида, для чего 8,9144 г соли растворили в 1621 мл дистиллированной воды.
Раствор гиалуроната натрия объемом 3333 мл перелили в реактор с мешалкой. При интенсивном перемешивании влили 1621 мл раствора цетилпиридиния хлорида. Мешалку остановили и раствор оставили на 16 часов для созревания и коагуляции осадка.
По истечении заданного времени смесь центрифугировали при 15 тыс. оборотов в минуту в течение 30 минут. Сырой аморфный осадок собрали.
Приготовили 0,4% раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде для чего взяли 2500 мл диметилсульфоксида, охлажденного до 5°С. Растворяли в течение 5 часов при перемешивании до полного растворения осадка.
Рассчитали эквимолярное количество хлорида натрия для осаждения гиалуроната натрия из раствора диметилсульфоксида:
n (карбоксильных групп)=10,0/401,22=0,0249 (моль),
n (хлорида натрия)=n (карбоксильных групп)=0,0249 моль,
m (хлорида натрия)=M ⋅ n,
m (хлорида натрия)=58,44 ⋅ 0,0249=1,4552 (г).
Приготовили 1,3% раствор хлорида натрия, для чего соль растворили в 111,94 мл дистиллированной воды.
К 2500 мл раствора гиалуроната цетилпиридиния добавили при медленном перемешивании 111,94 мл раствора хлорида натрия. Выпавший волокнистый осадок собрали.
Из осадка приготовили 0,1% раствор в 0,9% растворе хлорида натрия, для чего взяли 10 л дистиллированной воды и растворили 90 г хлорида натрия.
Раствор 0,1% гиалуроната натрия влили в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, имеющей размер пор 5 ⋅ 106 нм. Для удаления остатков соли четвертичного аммония и диметилсульфоксида в систему постепенно влили 25 л 0,9% раствора хлорида натрия. После промывки раствор гиалуроната натрия в 0,9% растворе хлорида натрия концентрировали до 1,5%, что по объему составило 632 мл.
Раствор слили из тангенцальной установки и профильтровали через стерилизационную мембрану 0,2 мкм.
Объем раствора после фильтрации составил 625 мл.
Раствор гиалуроната натрия осадили 5 объемами охлажденного до 4°С 96% этанола. Волокнистый осадок собрали, отжали, измельчили и высушили до постоянной массы при 60°С.
Масса осадка составила 9,375 г.
В таблице 1 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.
Таблица 1
| Показатель | Образец гиалуроната до очистки (бактериальный препарат, стабилизированный BDDE) | Образец гиалуроната после очистки |
| Содержание гиалуроната натрия (%) | 99,40 | 99,75 |
| Молекулярная масса | 1,45 ⋅ 106 Да | 1,45 ⋅ 106 Да |
| Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) | 930 | 930 |
| Содержание эндотоксинов (EU/мг) | 15 | Не обнаруживаются |
Пример 2.
Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия бактериального происхождения, производство Китай.
Процесс проводили как описано в примере 1.
В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 25 ⋅ 106 нм.
Раствор сконцентрировали до 1%, что по объему составило 952 мл.
Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 945 мл. Выход целевого продукта составил 94,5%.
В таблице №2 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.
Таблица 2
| Показатель | Образец гиалуроната до очистки (бактериальный препарат без стабилизации и модификаций) |
Образец гиалуроната после очистки |
| Содержание гиалуроната натрия | 99,37 | 99,80 |
| Молекулярная масса | 5,25 ⋅ 106 Да | 5,25 ⋅ 106 Да |
| Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) | 2870 | 2870 |
| Содержание эндотоксинов(EU/мг) | 23 | Не обнаруживаются |
Пример 3.
Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия животного происхождения.
Процесс проводили как описано в примере 1.
В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 50 ⋅ 106 нм.
Раствор сконцентрировали до 0,5%, что по объему составило 1880 мл.
Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 1874 мл. Выход целевого продукта составил 93,7%.
В таблице 3 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.
Таблица 3
| Показатель | Образец гиалуроната до очистки (препарат животного происхождения, без стабилизации и модификаций) |
Образец гиалуроната после очистки |
| Содержание гиалуроната натрия | 99,40 | 99,80 |
| Молекулярная масса | 10,84 ⋅106 Да | 10,84 ⋅ 106 Да |
| Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) | 4320 | 4320 |
| Содержание эндотоксинов(EU/мг) | 18 | Не обнаруживаются |
Пример 4.
Взяли 10,0 г сухого порошка нативного (без модификаций и стабилизации) гиалуроната натрия бактериального происхождения, производство Китай.
Процесс проводили как описано в примере 1.
В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 2,5 ⋅ 105 нм.
Раствор сконцентрировали до 1,5%, что по объему составило 645 мл.
Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 637 мл. Выход целевого продукта составил 95,5%.
В таблице 4 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.
Таблица 4
| Показатель | Образец гиалуроната до очистки (бактериальный препарат, стабилизированный BDDE) |
Образец гиалуроната после очистки |
| Содержание гиалуроната натрия | 98,20 | 99,77 |
| Молекулярная масса | 2,5 ⋅ 105 Да | 2,5 ⋅ 105 Да |
| Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) | 320 | 325 |
| Содержание эндотоксинов(EU/мг) | 950 | Не обнаруживаются |
Пример 5.
Взяли 10,0 г сухого порошка стабилизированного BDDE гиалуроната натрия животного происхождения.
Процесс проводили как описано в примере 1.
В тангенцальной системе обратного осмоса использовали мембрану с размером пор 25 ⋅ 106 нм.
Раствор сконцентрировали до 0,5%, что по объему составило 1880 мл.
Раствор из системы тангенцальной фильтрации профильтровали в асептических условиях через стерилизационную мембрану 0,2 мкм. Объем раствора составил 1874 мл. Выход целевого продукта составил 93,7%.
В таблице 5 приведены показатели содержания эндотоксинов, молекулярная масса, вязкость в образцах гиалуроната натрия до и после очистки.
Таблица 5
| Показатель | Образец гиалуроната до очистки (препарат животного происхождения, стабилизированный BDDE) |
Образец гиалуроната после очистки |
| Содержание гиалуроната натрия | 99,40 | 99,80 |
| Молекулярная масса | 12,63 ⋅ 106 Да | 12,63 ⋅ 106 Да |
| Вязкость 1% раствора (мПа⋅с) | 5320 | 5320 |
| Содержание эндотоксинов (EU/мг) | 17 | Не обнаруживаются |
Claims (3)
1. Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов, заключающийся в том, что готовят раствор, содержащий гиалуронат натрия и хлорид натрия, и осаждают гиалуронат центрифугированием, отличающийся тем, что приготовление раствора осуществляют путем растворения гиалуроната натрия в 0,45-0,5 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора с концентрацией гиалуроната 0,25-0,5 %, добавляют в раствор при перемешивании 0,5-0,75 %-ный раствор хлорида цетилпиридиния при количестве хлорида цетилпиридиния эквимолярном количеству гиалуроната по карбоксильным группам, оставляют полученный раствор до созревания и коагуляции осадка, после чего осуществляют осаждение гиалуроната путем центрифугирования смеси и собирают сырой осадок гиалуроната цетилпиридиния, после этого готовят 0,3-0,5 %-ный раствор гиалуроната цетилпиридиния в диметилсульфоксиде, предварительно охдажденном до температуры 5-7 °С, при перемешивании, после полного растворения осадка на раствор действуют 1,25-1,5 %-ным раствором хлорида натрия при количестве хлорида натрия эквимолярном количеству гиалуроната, образовавшийся осадок гиалуроната собирают и растворяют в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия с получением раствора гиалуроната с концентрацией 0,1-0,15 %, подают раствор гиалуроната натрия в тангенцальную систему обратного осмоса с мембраной, соответствующей молекулярной массе исходного гиалуроната, при этом в систему постепенно вливают 10-кратный объем 0,9 %-ного раствора хлорида натрия по отношению к объему раствора гиалуроната, прошедший через систему раствор гиалуроната натрия в 0,9 %-ном растворе хлорида натрия концентрируют до 1-2 %, фильтруют через стерилизационную мембрану и получают очищенный гиалуронат.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный гиалуронат получают в виде раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный гиалуронат получают путем осаждения его 96 %-ным этанолом из раствора, прошедшего через стерилизационную мембрану, и высушивания осадка.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021113781A RU2765951C1 (ru) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021113781A RU2765951C1 (ru) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2765951C1 true RU2765951C1 (ru) | 2022-02-07 |
Family
ID=80214766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021113781A RU2765951C1 (ru) | 2021-05-14 | 2021-05-14 | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2765951C1 (ru) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984003302A1 (en) * | 1983-02-18 | 1984-08-30 | Diagnostic Inc | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| RU2128666C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1999-04-10 | ФИДИА С.п.А. | Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
| US20090162905A1 (en) * | 2006-06-07 | 2009-06-25 | Hideki Murata | Method for Purification of Hyaluronic Acid Salt |
| RU2477138C1 (ru) * | 2011-11-02 | 2013-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону |
-
2021
- 2021-05-14 RU RU2021113781A patent/RU2765951C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984003302A1 (en) * | 1983-02-18 | 1984-08-30 | Diagnostic Inc | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| RU2128666C1 (ru) * | 1991-04-19 | 1999-04-10 | ФИДИА С.п.А. | Фракция гиалуроновой кислоты или ее соли, способ очистки этой фракции, способы получения этой фракции, фармацевтический препарат и средства, используемые в офтальмологии |
| US20090162905A1 (en) * | 2006-06-07 | 2009-06-25 | Hideki Murata | Method for Purification of Hyaluronic Acid Salt |
| WO2008062998A1 (en) * | 2006-11-23 | 2008-05-29 | Lg Life Sciences Ltd. | Method for purifying hyaluronic acid |
| RU2477138C1 (ru) * | 2011-11-02 | 2013-03-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Тульская индустрия ЛТД" | Способ получения заполняющего материала для пластической хирургии и инструментальной косметологии, заполняющий материал и способ введения заполняющего материала в проблемную зону |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0353321B2 (ru) | ||
| SE452469B (sv) | Material bestaende av en tverbunden karboxylgrupphaltig polysackarid och forfarande vid framstellning av detsamma | |
| NL2013880B1 (en) | Gelatin purification. | |
| BRPI0809212A2 (pt) | Processo de purificação abreviado para a produção de polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae | |
| JP2002530440A (ja) | エンドトキシンレベルが低い生体高分子塩、その生体高分子組成物およびこれを製造する方法 | |
| CN102099379B (zh) | 用于从生物聚合物材料中去除杂质的方法 | |
| DE102006055558A1 (de) | Endotoxinadsorber und Verfahren zur Entfernung von Endotoxin unter dessen Verwendung | |
| US4029766A (en) | Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen | |
| JP6424343B2 (ja) | エンドトキシン吸着剤 | |
| KR101509139B1 (ko) | 히알루론산의 정제방법 | |
| CN116970095A (zh) | 一种肺炎球菌荚膜多糖的制备方法 | |
| RU2765951C1 (ru) | Способ очистки гиалуроната от эндотоксинов | |
| PL244350B1 (pl) | Sposób otrzymywania hialuronidazy ze zwierzęcych jąder oraz produkt otrzymany tym sposobem | |
| KR101639105B1 (ko) | 히알루론산의 정제 방법 및 제조 방법 | |
| KR101638662B1 (ko) | 히알루론산 및／또는 그의 염의 정제 방법 | |
| JP2792873B2 (ja) | 変性セルロース又は変性キチン | |
| CN110845636B (zh) | 一种去除细菌多糖中的内毒素的方法 | |
| US7002007B2 (en) | Production of high molecular weight hyaluronates | |
| AU2005212069B2 (en) | Process for producing lactoperoxidase | |
| CN110878129B (zh) | 一种氨基葡萄糖肝素盐及其应用 | |
| CN113789319A (zh) | 从蝇蛆中分离蛆激酶的方法及应用 | |
| KR0149793B1 (ko) | 고분자량 히알우론산의 정제방법 | |
| WO2025122009A1 (en) | A method for purifying a gelatin | |
| US20250075010A1 (en) | Method for purifying a sodium alginate powder from endotoxins and endogenous pyrogens | |
| JP6887480B1 (ja) | 高純度の未変性コラーゲン及びその製造方法 |