RU2765212C2

RU2765212C2 - Гистоны и/или proadm в качестве маркеров, свидетельствующих о неблагоприятном событии

Info

Publication number: RU2765212C2
Application number: RU2019106324A
Authority: RU
Inventors: Тим ЦИРА; Андре ШЕНИХЕН; Анн ЭНКАМ; Манне КРОП; Инго КУРДТ; Пьер-Эмманюэль ШАРЛЬ
Original assignee: Б.Р.А.Х.М.С. Гмбх
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2022-01-26
Also published as: WO2018029214A1; JP7104689B2; CN109564225B; CA3033094A1; RU2019106324A; CN109564225A; RU2019106324A3; EP3497451A1; EP3497451B1; US20190178894A1; JP2019531467A

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается способа прогнозирования смерти субъекта с критическим заболеванием, причем указанный способ включает (i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта; и (ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, при этом указанный уровень proADM свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта, и где указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный уровень proADM свидетельствуют о смерти в течение следующих 28 дней, при этом указанный образец представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу. Группа изобретений также касается набора для реализации указанного способа, причем указанный набор включает (i) реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта и контрольные данные, включая контрольный уровень по меньшей мере одного гистона; и (ii) реагенты для определения уровня proADM в указанном образце указанного субъекта и контрольные данные, включая контрольный уровень proADM; применения набора для прогнозирования смерти субъекта. Группа изобретений обеспечивает прогнозирование смерти субъекта. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 пр., 6 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к диагностике, прогнозированию, оценке риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности смерти, у субъекта. Изобретение относится к способу, который включает определение уровня по меньшей мере одного гистона, в частности гистона H2B, H4, H2A и/или H3, в образце от субъекта и при этом уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от субъекта, и при этом уровень proADM свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта. Изобретение дополнительно относится к наборам для реализации способов по изобретению.

Уровень техники

Отделение интенсивной терапии (ОИТ) в больнице, как правило, является отделением, в котором находятся наиболее тяжелые больные в критическом состоянии, с самыми высокими показателями смертности (Kaneko-Wada Fde, Dominguez-Cherit et al. 2015). Это очень дорогой компонент для любой системы здравоохранения главным образом из-за длительного пребывания в ОИТ, современных и дорогостоящих технологий и общей сложности интенсивной терапии (Halpern and Pastores 2010). Несмотря на большие усилия в области интенсивной терапии, показатели смертности в ОИТ варьируются от 6,4% до 40%, в зависимости от анализируемой популяции пациентов и степени их тяжести (Mayr, Dunser et al. 2006). Основные причины неблагоприятного исхода и смерти в ОИТ связаны с отказом органов, например синдромом полиорганной дисфункции (MODS) и сепсисом (Vincent 2008; Ferreira and Sakr 2011). Для подгруппы пациентов с сепсисом уровень смертности в Европе даже выше и варьируется от 27% до 54% (Vincent2008).

Для выявления пациентов с высоким риском неблагоприятных или фатальных событий/исходов (i), помощи клиницистам в принятии ранних решений после поступления в ОИТ (ii), оптимизации клинического лечения и ресурсов (iii) и, наконец, снижения смертности в ОИТ (iv), большое значение имеет информация об определяющих параметрах, таких как краткосрочные и долгосрочные исходы (Mayr, Dunser et al. 2006). До настоящего времени для оценки риска и степени тяжести, а также для прогнозирования исходов у пациентов в критическом состоянии в основном использовались шкалы оценки степени тяжести. Преобладающими оценочными системами в ОИТ являются Система оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья (APACHE), Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств (SAPS) и Динамическая оценка органной недостаточности (SOFA), использующие 17, 14 или 6 физиологических или орган-специфических параметров соответственно (Bouch and Thompson 2008). Несмотря на их способность прогнозировать исход у пациента, такие шкалы также имеют различные недостатки. Например, должен быть оценен каждый отдельный параметр шкалы. Таким образом, определение результатов оценки занимает много времени (≥1 дня), что особенно невыгодно в лечении в ОИТ, где важны быстрые тесты. Кроме того, такие оценки зависят от субъективности каждого оценивающего врача, их необходимо часто калибровать повторно и учитывать на несколько параметров, которые определяются индивидуально.

Соответственно, существует потребность в простых, быстрых и объективных критериях для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, особенно у субъекта в критическом состоянии.

Таким образом, технической задачей, лежащей в основе изобретения, является обеспечение средств и способов для обеспечения быстрого и надежного способа прогнозирования неблагоприятного события, в частности фатального события, например смерти субъекта.

Эта техническая задача решается путем обеспечения вариантов реализации, описанных в настоящей заявке ниже и охарактеризованных в прилагаемой формуле изобретения.

Описание изобретения

Изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона или его фрагмента свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень proADM или его фрагмента свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня по меньшей мере одного гистона и уровня проадреномедуллина (proADM) и/или его фрагмента(-ов) в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный уровень proADM и/или его фрагмента (фрагментов) свидетельствуют об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Настоящее изобретение решает описанную выше техническую задачу. Как описано в настоящей заявке ниже и в прилагаемых примерах, в клиническом исследовании неожиданно было обнаружено, что уровни по меньшей мере одного гистона, в частности гистона H2B, H4, H2A и H3, и/или уровень proADM, демонстрируют сильную статистическую связь с неблагоприятным событием, например смертью субъектов; см. иллюстративный пример 1. Соответственно, в настоящей заявке документально подтверждено, что указанный по меньшей мере один гистоновый белок и/или указанный proADM, в частности MR-proADM, можно использовать в качестве маркера для прогнозирования неблагоприятного события. В частности, примеры показывают, что такие маркеры могут быть использованы для прогнозирования выживания или невыживания, то есть вероятности смерти субъекта.

В прилагаемых примерах также неожиданно было продемонстрировано, что уровень по меньшей мере одного гистона, в частности H2B, H4, H2A и H3, сильно ассоциирован с неблагоприятным событием, например смертью субъекта. В частности, прилагаемые примеры демонстрируют, что уровни гистонов статистически коррелируют с неблагоприятным событием, например смертью в течение следующих приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. В прилагаемых примерах показано, что повышение уровня маркера указывает на то, что неблагоприятное событие, например, смерть, наступает у субъекта; см. прилагаемый пример 1, например, Таблицу 1-6. Кроме того, уровни гистонов, как было показано, особенно коррелируют с краткосрочными неблагоприятными событиями, например происходящими в течение следующих 7 дней или 3 дней. Кроме того, было обнаружено, что уровень этого по меньшей мере одного гистона в образце субъектов, страдающих респираторным заболеванием, коррелирует с неблагоприятным событием, например смертью в течение 7 дней; см. например Таблицу 4. Кроме того, было обнаружено, что уровень этого по меньшей мере одного гистона в образце субъектов, страдающих инфекцией мочевыводящих путей, коррелирует с неблагоприятным событием, например смертью, наступающей в течение 28 дней; см. например Таблицу 5. Кроме того, было обнаружено, что уровень по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, страдающего от злокачественных новообразований, коррелирует с неблагоприятным событием, например смертью в течение 28 дней; см. например Таблицу 6.

Кроме того, в прилагаемых примерах также неожиданно продемонстрировано, что уровень proADM, например уровень фрагмента MR-proADM тесно коррелирует с неблагоприятным событием, например, смертью субъекта. В частности, прилагаемые примеры демонстрируют, что уровень proADM статистически коррелирует с неблагоприятным событием, например, смертью в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней; см. например Таблицы 2 и 3. В частности, в прилагаемых примерах показано, что уровень proADM свидетельствует о неблагоприятном событии, например, смертью в течение 28 дней или в течение 7 дней; см. например Таблицы 2 и 3.

Кроме того, в прилагаемых примерах документально подтверждено, что прогнозирование дополнительно улучшается, если определяют комбинацию уровней маркеров. В частности, определение уровня по меньшей мере одного гистона в дополнение к уровню proADM дополнительно улучшало прогнозирование неблагоприятного события, например смерти; см. таблицы с 1 по 3. В прилагаемых примерах документально подтверждено, что определение уровня дополнительного маркера и/или параметра в дополнение к уровню, по меньшей мере, одного гистона или proADM еще больше улучшает прогнозирование неблагоприятного события, например, смерти; см. иллюстративные таблицы с 1 по 3. Например, в прилагаемых примерах показано, что определение клинической оценки также улучшает прогнозирование на основании уровня proADM или гистонов. Кроме того, определение уровня биомаркера, такого как альдолаза B, улучшает прогнозирование на основании уровня proADM или гистонов. Соответственно, изобретение также относится к способу, включающему определение уровня дополнительного маркера и/или параметра, то есть использование панелей маркеров.

Настоящее изобретение имеет, среди прочего, следующие преимущества по сравнению с традиционными способами: способы и наборы по изобретению являются быстрыми, объективными, простыми в использовании и точными для прогнозирования неблагоприятного события. Способы и наборы по изобретению относятся к маркерам, которые легко измеримы в обычных условиях в больницах, потому что уровни гистонов и proADM могут быть определены в получаемых по стандартной методике образцах крови или других биологических жидкостях, полученных от субъекта. Кроме того, определение уровней гистонов или proADM выполняется очень быстро. Следовательно, способы и наборы по изобретению пригодны для быстрой оценки, а также для диагностики и прогнозирования неблагоприятного события, например смерти. Соответственно, такое быстрое определение также пригодно для быстрого принятия решения о лечении, позволяющего избежать или снизить риск возникновения неблагоприятного события. Кроме того, благодаря простому результату измерения биомаркера, представляющего собой одно конкретное значение, отсутствует субъективная систематическая погрешность медицинского персонала при применении этого способа или наборов изобретения. Воспроизводимость, таким образом, будет выше по сравнению с субъективной оценкой физиологических параметров, которые используются, например, в шкале SOFA. Уровень гистона или proADM также может быть объединен с дополнительным маркером(-ами) и/или параметром(-ами), например, клиническими оценками, такими как шкала SOFA, для дальнейшего улучшения прогнозирования и адаптации анализа к специфической чувствительности и специфичности для оценки общего статуса пациентов в критическом состоянии.

Соответственно, представленные в настоящей заявке способы и наборы являются полезными для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска возникающего неблагоприятного события, например, смерти субъекта.

Как документально подтверждено в настоящей заявке выше и в прилагаемых примерах, было неожиданно обнаружено, что уровень гистонов и уровень proADM коррелирует с неблагоприятным событием, таким как смерть, у субъектов. Соответственно, изобретение относится к способам и наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности смерти, у субъекта.

Кроме того, изобретение относится к способам и наборам для мониторинга, руководства по лечению и/или контроля лечения субъектов, когда уровень этого по меньшей мере одного гистона и/или proADM свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности о смерти. Определения, приведенные выше и ниже, также применимы к таким аспектам.

В частности, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события, в частности смерти, у субъекта, причем указанный способ включает

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности смерти, для указанного субъекта; и/или

(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности, смерти, для указанного субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза относится к определению уровня гистона или его фрагмента в образце субъекта или определению уровня более одного гистона или их фрагментов в образце субъекта. В частности, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, когда предпочтительно гистон выбран из группы, состоящей из гистона H2B, H4, H2A и H3. В частности, определяют уровень гистона H2B. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, когда, в частности, определяют уровень гистона Н4. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня двух гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B и H4. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня трех гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4 и H2A. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня четырех гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4, H2A и H3.

Соответственно, в контексте настоящего изобретения "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня гистона H2B, уровня гистона H4, уровня гистона H2A и/или уровня гистона Н3.

В частности, термин "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта. Соответственно, изобретение также относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга неблагоприятного события субъекта, причем указанный способ включает определение уровня гистона или его фрагмента в образце от указанного субъекта, и причем указанный уровень гистона или его фрагмента свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности смерти, у субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин "гистон" или "гистоновый белок" или "гистоны" или "гистоновые белки" относится к каноническому гистону(-ам), таким как H1, H2A, H2B, H3 или H4, а также к варианту(-ам) гистона, таким как H3.3, H2A.Z и т. д. или их фрагменту(-ам). Гистоны образуют октамер, вокруг которого оборачивается ДНК, собирая структуру хроматина (Luger, Nature. 1997 Sep 18; 389 (6648): 251-60). Например, гистоновые белки H2A, H2B, H3 и H4 (по два каждого) образуют октамер, который оборачивается 165 парами оснований ДНК, образуя фундаментальную субъединицу хроматина - нуклеосому. Гистоны также обнаруживаются вне ядра при множественных патофизиологических процессах (WO 2009/061918). Наличие внеклеточных гистонов было описано в крови пациентов, страдающих от различных этиологий, включая воспалительные процессы. Высвобождение гистонов из активированных иммунных клеток может быть опосредовано внеклеточными ловушками. Активированные нейтрофилы, как основной механизм контроля и устранения инфекции, могут высвобождать внеклеточные волокна, так называемые нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) (Brinkmann V., et al. Science 2004; 303 (5663): p. 1532-5). Другие механизмы, с помощью которых гистоны могут высвобождаться в кровоток пациента, включают апоптоз, некроз, пироптоз или некроптоз клеток.

В частности, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Соответственно, уровень гистона, который должен быть определен способами и наборами по изобретению, представляет собой, в частности, уровень гистона(-ов) H2B, H4, H2A и/или H3. Последовательности этих гистонов известны специалисту в данной области. Иллюстративные последовательности гистонов приведены в SEQ ID NO: 1-4. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H4 приведена в SEQ ID NO: 1. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H2A приведена в SEQ ID NO: 2. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона Н3 приведена в SEQ ID NO: 3. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H2B приведена в SEQ ID NO: 4. В частности, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4 и H2A. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон представляет собой H2B и H4. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон представляет собой H2B или H4.

Предполагается, что "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза относится к определению уровня по меньшей мере одного гистона или фрагмента этого по меньшей мере одного гистона в образце. В частности, в образце определяют уровень гистонов H2B, H3, H2A и/или H4. Соответственно, этот по меньшей мере, один гистон, определяемый в образце, может представлять собой свободный гистон, или этот по меньшей мере один гистон, определяемый в образце, может встречаться и может быть собран в макромолекулярный комплекс, например, в октамер, нуклеосому и/или NET. Следовательно, уровень этого по меньшей мере одного гистона в образце может включать уровень свободного гистонового белка и/или гистонового белка, собранного в макромолекулярном комплексе.

В конкретных аспектах изобретения уровень гистона или его фрагмента может быть определен в образце, который не собран в макромолекулярном комплексе, таком как нуклеосома, октамер или нейтрофильная внеклеточная ловушка (NET). Такой гистон (ы) в настоящей заявке будет (будут) называться "свободным гистоном(-ами)". Соответственно, уровень упомянутого по меньшей мере одного гистона может, в частности, представлять собой уровень по меньшей мере одного свободного гистона.

Уровень таких свободных гистонов может быть определен путем обнаружения аминокислотных последовательностей или структурных эпитопов гистонов, которые недоступны в собранном стехиометрическом макромолекулярном комплексе, таком как мононуклеосома или октамер. В таких структурах отдельные области гистонов являются укрытыми и, таким образом, стерически недоступны, как показано для нейтрофильной внеклеточной ловушки ("NET") (Brinkmann V., et al. Science 303 (5663): p. 1532-5, 2004). Кроме того, в октамере или нуклеосоме области гистонов также участвуют во внутримолекулярных взаимодействиях, например, между отдельными гистонами. Соответственно, область/пептид/эпитоп гистона, который определяется в контексте изобретения, может определять, является ли гистон свободным гистоном или гистоном, который собран в макромолекулярном комплексе. Например, в способе, основанном на иммуноанализе, используемые антитела могут не обнаруживать гистоны, например Н4, когда они являются частью октамерного ядра нуклеосом, так как эти эпитопы структурно недоступны. Ниже в настоящей заявке приведены примеры областей/пептидов/эпитопов гистона, которые можно использовать для определения свободного гистона. Например, области/пептиды/эпитопы N-концевого или С-концевого хвоста гистонов можно использовать для определения гистонов независимо от того, собраны ли они в макромолекулярный комплекс или являются свободными гистонами согласно настоящему изобретению.

Предполагается, что определение гистонов может включать посттрансляционно модифицированные гистоновые белки. Соответственно, посттрансляционные модификации могут включать деацетилирование или ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитилирование и цитруллинирование аминокислот.

В данном контексте понятие "стехиометрический" относится к нативным комплексам, например мононуклеосоме или октамеру. "Свободные гистоновые белки" могут также включать не связанные с хроматином гистоны. Например, "свободные гистоновые белки" могут также включать отдельные гистоновые белки или неоктамерные гистоновые комплексы. Свободные гистоны могут (например, временно) связываться с отдельными гистонами, например, гистоны могут образовывать гомо- или гетеродимеры. Свободные гистоны также могут образовывать гомо- или гетеротетрамеры. Гомо- или гетеротетрамер может состоять из четырех молекул гистонов, например H2A, H2B, H3 и/или H4. Типичный гетеротетрамер образован двумя гетеродимерами, причем каждый гетеродимер состоит из Н3 и Н4. В настоящей заявке также предполагается, что гетеротетрамер может быть образован H2A и H2B. В настоящей заявке также предполагается, что гетеротетрамер может быть образован одним гетеродимером, состоящим из H3 и H4, и одним гетеродимером, состоящим из H2A и H2B. Таким образом, в настоящей заявке свободные гистоны упоминаются как мономерные, гетеродимерные или тетрамерные гистоновые белки, которые не собраны в ("стехиометрический") макромолекулярный комплекс, состоящий из октамера гистона, связанного с нуклеиновой кислотой, например, нуклеосому. Кроме того, свободные гистоны также могут быть связаны с нуклеиновыми кислотами, причем указанные свободные гистоны не собраны в ("стехиометрический") макромолекулярный комплекс, например нативную нуклеосому. Предпочтительно свободный гистон(-ы) по существу не содержит (не содержат) нуклеиновых кислот.

Фрагмент по меньшей мере одного гистона может иметь любую длину, например по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что этот фрагмент позволяет однозначно определить уровень данного конкретного гистона. Фрагмент этого по меньшей мере одного гистона относится к независимому фрагменту гистонов, например гистонов H2B, H4, H2A и H3. В настоящей заявке ниже раскрыты различные иллюстративные фрагменты этих гистонов, которые подходят для определения уровня гистона в образце субъекта. В настоящей заявке также подразумевается, что уровень гистонов может быть определен путем определения фрагмента, охватывающего N-концевой или С-концевой хвост гистонов. Кроме того, гистон или его фрагмент, который должен быть определен в контексте настоящего изобретения, также может быть модифицирован, например, посттрансляционной модификацией. Иллюстративными посттрансляционными модификациями могут быть ацетилирование, цитруллинирование, деацетилирование, метилирование, деметилирование, деиминирование, изомеризация, фосфорилирование и убиквитинирование.

Используемый в настоящей заявке термин "проадреномедуллин" или "proADM" относится к проадреномедуллину или его фрагменту, в частности, MR-proADM. Подразумевается, что "определение уровня proADM" или тому подобное относится к определению уровня proADM или его фрагмента в образце. Фрагмент может иметь любую длину, например по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что этот фрагмент позволяет однозначно определить уровень proADM. В конкретных предпочтительных аспектах изобретения "определение уровня proADM" относится к определению уровня среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM). MR-proADM является фрагментом proADM. Пептид адреномедуллин (ADM) был открыт как гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, выделенный из человеческого фенохромоцитома (Kitamura et al., 1993). Адреномедуллин (ADM) кодируется как пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот ("препроадреномедуллин" или "pre-proADM"). Иллюстративная аминокислотная последовательность ADM приведена в SEQ ID NO: 5. ADM содержит положения 95-146 аминокислотной последовательности pre-proADM и является ее продуктом сплайсинга. "Проадреномедуллин" ("proADM") относится к pre-proADM без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 21), то есть к аминокислотным остаткам с 22 по 285 pre-proADM. "Среднерегиональный проадреномедуллин" ("MR-proADM") относится к аминокислотам 42-95 pre-proADM. Иллюстративная аминокислотная последовательность MR-proADM приведена в SEQ ID NO: 6. В настоящей заявке также предполагается, что для описанных в настоящей заявке способов могут быть использованы пептид и его фрагмент pre-proADM или MR-proADM. Например, такой пептид или его фрагмент может содержать аминокислоты 22-41 pre-proADM (пептид РАМР) или аминокислоты 95-146 pre-proADM (зрелый адреномедуллин). С-концевой фрагмент proADM (аминокислоты от 153 до 185 preproADM) называется адренотензином. Фрагменты пептидов proADM или фрагменты MR-proADM могут содержать, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30 или более аминокислот. Соответственно, фрагмент proADM может, например, быть выбран из группы, состоящей из MR-proADM, PAMP, адренотензина и зрелого адреномедуллина, предпочтительно в данном документе этот фрагмент представляет собой MR-proADM.

В настоящей заявке также предполагается, что могут быть определены полипептиды, имеющие некоторую идентичность последовательности с proADM или по меньшей мере с одним гистоном. Например, с помощью способов и наборов по изобретению могут быть определены полипептиды, идентичные по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью SEQ ID NO: 5 или 6 или соответственно с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, причем предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательности. В соответствии с настоящим изобретением термины "идентичность последовательности", "гомология" или "процентная гомология" или "идентичность" или "процент идентичности" или "процентная идентичность" в контексте двух или более аминокислотных последовательностей относятся к двум или большему числу последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислот, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия по окну сравнения (предпочтительно по всей длине) или по определенной области, при использовании алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области техники, или путем ручного выравнивания и визуального просмотра. Последовательности, имеющие, например, идентичность от 70% до 90% или более (предпочтительно, 95% или более), можно считать по существу идентичными. Такое определение также применимо к комплементу тестовой последовательности. Предпочтительно, описанная идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 15 аминокислот, более предпочтительно, в области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 20 до приблизительно 35 аминокислот, наиболее предпочтительно, по всей длине. Специалисты в данной области техники знают, как определить процент идентичности между последовательностями/среди последовательностей, используя, например, алгоритмы, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), известными в данной области техники.

Используемый в настоящей заявке термин "уровень" маркера относится к количеству молекул маркера в образце. Другими словами, в образце определяют концентрацию маркера. Например, в образце субъекта определяют концентрацию proADM или его фрагмента, предпочтительно MR-proADM, и/или концентрацию гистона(-ов) H2B, H4, H3 и/или H2A или их фрагмента(-ов).

Используемый в настоящей заявке термин "уровень по меньшей мере одного гистона" относится к количеству молекул по меньшей мере гистона, например, количество H2B, H4, H2A и/или H3 или их фрагмента в образце, полученном от субъекта. Другими словами, в образце определяют концентрацию по меньшей мере одного гистонового белка или его фрагмента.

Используемый в настоящей заявке термин "уровень маркера проадреномедуллина (proADM)" или "уровень маркера проадреномедуллина (proADM) или его фрагмента" относится к количеству молекул маркера проадреномедуллина или его фрагментов в образце, полученном от субъекта. Другими словами, определяют концентрацию маркера в образце. Следовательно, термин "уровень маркера среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM)" относится к количеству молекул маркера среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM) в образце, полученном от субъекта. Как описано выше, в настоящей заявке также предполагается, что фрагмент проадреномедуллина (proADM), предпочтительно MR-proADM, может быть обнаружен и количественно определен. Также могут быть обнаружены и количественно определены фрагменты MR-proADM. Подходящие способы определения уровня proADM или его фрагмента (предпочтительно MR-proADM) или определения уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента описаны в настоящей заявке ниже.

Используемый в настоящей заявке термин "неблагоприятное событие" означает заболевание/состояние здоровья субъекта, который является или будет угрожающим жизни. Таким образом, понятие "неблагоприятное событие" относится к критическому ухудшению заболевания/состояния здоровья субъекта по сравнению с более ранним состоянием здоровья того же субъекта, например которое диагностировано и подтверждено, например, за приблизительно 28 дней, 14 дней, 7 дней, 3 дня, 1 дня, 12 часов, 5 часов, 1 час или менее до ухудшения состояния; или по сравнению с состоянием здоровья субъектов, страдающих сходным заболеванием(-ями) или медицинским состоянием(-ями), то есть это прогрессирование заболевания (ей) или медицинского расстройства (а) является или становится у испытуемого субъекта опасным для жизни. Неблагоприятное событие также может относиться к критическому ухудшению заболевания/состояния здоровья субъекта по сравнению с состоянием здоровья здоровых субъектов. В настоящей заявке подразумевается, что критическое ухудшение заболевания/состояния здоровья, угрожающее жизни заболевания/состояние субъекта или угрожающее жизни прогрессирование может означать, что субъект рискует умереть, то для субъекта вероятен летальный исход. Критическое ухудшение, критическое заболевание/состояние здоровья или угрожающее жизни заболевание/состояние также могут оцениваться/диагностироваться по клиническим показателям, например, оценкой по шкале SOFA. Например, оценка SOFA выше 14 баллов указывает на очень тяжелое состояние здоровья, свидетельствующее о критическом состоянии субъекта. Оценка SOFA от 0 до 6 баллов указывает на менее тяжелое состояние здоровья, а оценка SOFA от 7 до 14 баллов указывает на тяжелое состояние здоровья. Например, состояние здоровья субъекта может критически ухудшаться из-за органной дисфункции, полиорганных дисфункций, заболеваний или медицинских расстройств, таких как инфекция. Соответственно, термин "неблагоприятное событие" может относиться к органной дисфункции, полиорганным дисфункциям, заболеванию или медицинскому состоянию, например инфекции, которые являются или будут угрожающими жизни. Например, к такому критическому ухудшению может привести органная дисфункция или полиорганная дисфункция, и таким образом термин "неблагоприятное событие" может также относиться к органной дисфункции или полиорганным дисфункциям, в частности к органной недостаточности или полиорганной недостаточности. Например, заболевание или медицинское расстройство или может привести к такому критическому ухудшению, и, таким образом, термин "неблагоприятное событие" может также относиться к заболеванию(-ям) или медицинскому расстройству(-ам), причем указанное заболевание(-я) или медицинское расстройство(-а) могут обозначать заболевание(-я) или медицинское расстройство(-а), которые угрожают жизни. Субъект также может страдать заболеванием(-ями) и/или медицинским расстройством(-ами), и неблагоприятным событием в таком сценарии является состояние, когда прогрессирование заболевания(-й) или медицинского расстройства (расстройств) становятся угрожающими жизни, то есть неблагоприятное событие может также относиться к угрожающему жизни прогрессированию заболевания или расстройства. Заболевание или расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из респираторного заболевания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной недостаточности, сердечнососудистого заболевания, гематологического заболевания, диссеминированного свертывания крови, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек и/или иммунодепрессии. Болезнь также может представлять собой инфекцию (инфекции).

В конкретных аспектах изобретения неблагоприятным событием является смерть. Другими словами, в конкретных аспектах изобретения неблагоприятным событием является смерть субъекта. Соответственно, термин "неблагоприятное событие", в частности, означает "летальный исход" или "смерть". Используемый в настоящей заявке термин "смерть" означает, что субъект умирает, то есть летальный исход. Соответственно, способы и наборы по изобретению определяют/предсказывают, умрет ли субъект и/или рискует ли субъект умереть.

Используемый в настоящей заявке общий термин "органная дисфункция" может также означать, что имеет место дисфункция более чем одного органа, то есть он также может относиться к органным дисфункциям, если не указано иное. Термин "органная дисфункция" или "органные дисфункции" относится к состоянию субъекта, когда орган или несколько органов не выполняют свою нормальную функцию по сравнению с непораженным органом, таким как, например, орган (ы) хотя бы одного здорового субъекта. Например, орган(-ы) может иметь пониженную активность, или орган(-ы) у субъекта с дисфункцией органа может быть аномально активным по сравнению с органом(-ами) по меньшей мере одного здорового субъекта. Предпочтительно орган(-ы) с дисфункцией(-ями) органа может (могут) обладать нарушенной (пониженной или повышенной) активностью величиной по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100% или 200% по сравнению с непораженным органом(-ами), например по меньшей мере одного здорового субъекта. В частности, дисфункция(-и) органа(-ов) может (могут) привести к органной недостаточности(-ям). Соответственно, "дисфункция (и) органа" предпочтительно может также относиться к органной недостаточности(-ям). "Органная недостаточность(-и)" относится к органной дисфункции(-ям) до такой степени, что нормальный гомеостаз не может поддерживаться, например без внешнего клинического вмешательства. "Органная недостаточность(-и)" может также относиться к органной дисфункции(-ям), выраженной до такой степени, что нормальный гомеостаз органа(-ов) не может поддерживаться, например без внешнего клинического вмешательства. "Органная недостаточность" может также относиться к органной дисфункции(-ям) до такой степени, что нормальный гомеостаз субъекта не может поддерживаться, например, без внешнего клинического вмешательства. В конкретных аспектах изобретения дисфункция органа представляет собой органную недостаточность, или по меньшей мере одну органную недостаточность. Общий термин "органная недостаточность" также может означать, что недостаточность имеется у более чем одного органа, то есть он также может относиться к недостаточностям нескольких органов, если не указано иное. В настоящей заявке подразумевается, что понятие "органные дисфункции" также может обозначать полиорганную дисфункцию. В настоящей заявке подразумевается, что понятие "органные недостаточности" может также обозначать полиорганную недостаточность. Иллюстративными органными дисфункциями или органными недостаточностями являются циркуляторный шок, гематологическая недостаточность, печеночная недостаточность, неврологическая недостаточность, почечная недостаточность, дыхательная недостаточность и метаболический ацидоз. Соответственно, в контексте изобретения органная дисфункция или по меньшей мере одна дисфункция предпочтительно может быть выбрана из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза. В настоящей заявке подразумевается, что субъект также может иметь более одной дисфункции или недостаточности органа, например, комбинацию двух, трех, четырех органных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза.

В частных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события в течение следующих приблизительно 28 дней. Используемый в настоящей заявке термин "возникновение неблагоприятного события в течение следующих" означает, что субъект будет, вероятно, испытывать/иметь/страдать от неблагоприятного события в течение этого конкретного будущего периода времени.

Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также о возникновении указанного неблагоприятного события в течение следующих приблизительно 28 дней, приблизительно 25 дней, приблизительно 20 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может свидетельствовать о возникновении указанного неблагоприятного события в течение следующих 14 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может свидетельствовать о возникновении указанного неблагоприятного события в течение следующих 7 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может свидетельствовать о возникновении указанного неблагоприятного события в течение следующих 3 дней.

В конкретных предпочтительных аспектах изобретения уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует о смерти субъекта в течение приблизительно 28 дней. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может указывать на смерть в течение приблизительно 28 дней, приблизительно 25 дней, приблизительно 20 дней, приблизительно 15 дней, приблизительно 14 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 2 дней или приблизительно 1 дня. Уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может указывать на смерть в течение 14 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может указывать на смерть в течение 7 дней. В частности, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM, также может указывать на смерть, в течение 3 дней.

В предпочтительных аспектах изобретения указанный уровень MR-proADM указанного субъекта свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности, смерть указанного субъекта в течение приблизительно 28 дней или в течение приблизительно 7 дней.

В предпочтительных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности смерти, в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней. В частности, уровень H2B свидетельствует о неблагоприятном событии в течение приблизительно 7 или предпочтительно в течение приблизительно 3 дней.

В предпочтительных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона является показателем возникновения неблагоприятного события, в частности смерти, в течение приблизительно 7 или, предпочтительно, в течение приблизительно 3 дней. В частности, уровень H4 свидетельствует о возникновении неблагоприятного события в течение приблизительно 7 или предпочтительно в течение приблизительно 3 дней.

В предпочтительных аспектах изобретения уровень по меньшей мере одного гистона и уровень proADM свидетельствует о возникновении неблагоприятного события, в частности, смерти указанного субъекта в течение 28 дней.

Термин "свидетельствующий об указанном неблагоприятном событии" означает, что субъект имеет или испытывал или, вероятно будет, испытывать/иметь/страдать от указанного неблагоприятного события, например, смерти. Следовательно, уровень этого по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM у субъекта свидетельствуют о неблагоприятном событии, например смерти субъекта.

Способ по изобретению также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии.

Изобретение также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень проадреномедуллина (proADM), в частности MR-proADM, причем указанный уровень proADM, в частности MR-proADM, сравнивают с контрольным уровнем proADM, и при этом указанный уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует об указанном неблагоприятном событии.

Данный способ также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона и уровень проадреномедуллина (proADM), в частности MR-proADM, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM, и на основании этого этапа сравнения у указанного субъекта выявляют указанное неблагоприятное событие.

Используемый в настоящей заявке термин "сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона" или его грамматическими варианты означают, что уровень этого по меньшей мере одного гистона субъекта сравнивается с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона. Таким образом, уровень гистона субъекта сравнивают с соответствующим контрольным уровнем того же гистона. Например, уровень гистона H2B, определенный в образце субъекта, сравнивают с контрольным уровнем гистона H2B. Это применимо с соответствующими изменениями к другим гистонам. Контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона является, в частности, уровень гистона H2B, уровень гистона H4, уровень гистона H2A и/или уровень гистона H3.

Используемый здесь термин "сравнивают с контрольным уровнем proADM" или его грамматическими варианты означают, что уровень proADM субъекта сравнивают с контрольным уровнем proADM. Если определяют уровень фрагмента(-ов) по меньшей мере одного гистона и/или proADM, контрольным уровнем также может быть уровень соответствующего фрагмента(-ов).

Используемый в настоящей заявке термин "контрольный уровень" может отражать нормальный уровень соответствующего маркера, который указывает на отсутствие неблагоприятного события в предпочтительных аспектах изобретения. Соответственно, такой контрольный уровень отражает нормальный уровень соответствующего маркера, который не указывает на угрожающее жизни состояние или, в частности, на смерть субъекта. Соответственно, контрольный уровень может представлять собой уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, и при этом контрольный субъект(-ы) не имеет/не имеют неблагоприятных событий в течение следующих приблизительно 28 дней, предпочтительно в течение приблизительно 14 дней, более предпочтительно в течение приблизительно 7 дней или особенно предпочтительно в течение приблизительно 3 дней. Этот контрольный уровень может представлять уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM группы здоровых субъектов (например, когорты). Соответственно, контрольный уровень предпочтительно представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, в частности MR-proADM здоровых субъектов. Здоровый субъект - это субъект без диагностированного (и подтвержденного) заболевания и/или расстройства. Здоровые субъекты предпочтительно могут иметь нормально функционирующие органы, то есть не иметь органной дисфункции(-ий) или не иметь органной(-ых) недостаточности(-ей), и/или не иметь диагностированного заболевания(-ий) или медицинского(-их) расстройства (расстройств), таких как описанные выше. Соответственно, контрольный уровень (уровни) может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, который определен в образцах здоровых субъектов. Контрольные субъекты или здоровые субъекты в данном описании предпочтительно определяются как группа субъектов или группа здоровых субъектов, например когорта субъектов. У здоровых контрольных субъектов нет органной дисфункции или органной недостаточности. Соответственно, контрольный уровень может представлять собой уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM субъектов, не имеющих органной дисфункции или недостаточности. Соответственно, контрольный уровень может быть уровнем, указывающим на отсутствие органной дисфункции или недостаточности.

Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, и при этом прогрессирование заболевания или расстройства не угрожает жизни. Другими словами, контрольный уровень также может представлять собой уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, и при этом данное неблагоприятное событие, в частности смерть, не возникает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней.

Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства и инфекции (такой как сепсис или септические расстройства), и при этом неблагоприятное событие, в частности смерть, не возникает в течение следующих 28 дней, 7 дней или 3 дней. Другими словами, неблагоприятное событие у контрольного субъекта не возникает в течение следующих 28 дней, 7 дней или 3 дней. В частности, контрольный субъект страдает тем же заболеванием или медицинским состоянием/расстройством, что и субъект, подлежащий тестированию.

Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный(-е) субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, но не от инфекции, и при этом неблагоприятное событие, в частности смерть, не возникает в течение следующих 28 дней, 7 дней или 3 дней.

Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, и при этом указанный контрольный(-е) субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, включая SIRS, причем указанный субъект(-ы) не страдают от инфекции, и при этом неблагоприятное событие, в частности смерть, не возникает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней.

Используемый в данном документе термин "по меньшей мере один контрольный субъект" обозначает более одного контрольного субъекта. В частности, по меньшей мере один контрольный субъект представляет собой группу или когорту контрольных субъектов. Как описано в настоящей заявке ниже, средства и способы для определения уровней маркеров описаны, например, в ссылках.

Контрольный уровень, используемый в данном документе, обычно представляет собой заранее определенный уровень, то есть он был определен заранее в качестве эталона для последующего использования в месте оказания медицинской помощи, например, ОИТ.

В предпочтительных аспектах изобретения неблагоприятным событием является смерть. В этих аспектах контрольным уровнем также может быть уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровнем proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, при котором контрольный субъект(-ы) не умирает(-ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах контрольным уровнем также может быть уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, при котором указанный контрольный(-е) субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, и при этом этот контрольный субъект (ы) не умирает(-ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах контрольным уровнем также может быть уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, при котором указанный контрольный(-е) субъект(-ы) страдает (страдают)от заболевания и/или медицинского расстройства и инфекции, и при этом контрольный субъект (ы) не умирает(-ют) в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах контрольным уровнем также может быть уровень, по меньшей мере, одного гистона и/или уровень proADM, по меньшей мере, одного контрольного субъекта, при котором указанный контрольный (е) субъект (ы) страдают от заболевания и/или медицинского расстройства, но не от инфекции, и при этом контрольный субъект (ы) не умирает в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней. Кроме того, в этих аспектах контрольным уровнем также может быть уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, и при этом указанный контрольный(-ые) субъект(-ы) страдают от заболевания и/или медицинского расстройства, включая SIRS, причем указанный субъект(-ы) не страдают от инфекции, и при этом контрольный субъект -(ы) не умирает в течение приблизительно 28 дней, в течение приблизительно 14 дней, в течение приблизительно 7 дней или в течение приблизительно 3 дней.

Как документально подтверждено в настоящей заявке, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона (или увеличение уровня по меньшей мере одного гистона) и/или повышенный уровень proADM (или увеличение уровня proADM), в частности MR-proADM, по сравнению с контрольным уровнем свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности, смерти. В частности, это неблагоприятное событие возникает в течение 28 дней, 7 дней или 3 дней, как описано выше. Соответственно, указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или указанный уровень proADM, указывающий на указанное неблагоприятное событие, может представлять собой повышенный уровень по сравнению с контрольным уровнем.

Соответственно, способ по изобретению включает в себя способ, который включает определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, и при этом котором повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности, смерти указанного субъекта.

Кроме того, изобретение включает в себя способ, который включает определение уровня proADM, в частности MR-proADM, в образце от указанного субъекта, и при этом повышенный уровень указанного proADM, в частности MR-proADM, указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем указанного proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности, на смерть указанного субъекта.

Кроме того, изобретение включает в себя способ, который включает определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта и определение уровня proADM, в частности MR-proADM, в образце от указанного субъекта, и при этом повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта и повышенный уровень указанного proADM, в частности MR-proADM, указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона и контрольным уровнем указанного proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует об указанном неблагоприятном событии, в частности, смерти указанного субъекта.

Изобретение также относится к способу, включающему

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта,

причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона,

и при этом повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта,

причем уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM

и при этом повышенный уровень proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у субъекта.

Другими словами, изобретение также относится к способу, включающему

и при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

причем указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM,

и при этом увеличение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Изобретение также может относиться к способу, включающему

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта,

причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона того же субъекта, полученным из предшествующего анализа,

и при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

причем указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM того же субъекта, полученным из предшествующего анализа,

и при этом увеличение уровня proADM по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин "полученный из предварительного анализа" относится к определению уровня маркера в образце того же субъекта в предшествующее время, например, за 28 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или 1 день до следующего анализа, и при этом в таких аспектах указанный определенный ранее уровень маркера рассматривается в качестве контрольного уровня.

Используемый в настоящей заявке термин "повышение уровня маркера" означает, что уровень маркера повышен, то есть этот термин относится к повышенному уровню маркера. Соответственно, термин "повышение уровня маркера" в настоящей заявке используется взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень маркера". Повышенный уровень маркера или повышение уровня маркера субъекта означает, что уровень маркера составляет, по меньшей мере, приблизительно на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30% выше контрольного уровня маркера.

В контексте изобретения термин "повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем" или тому подобное используется в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем" или термином "повышенный уровень по меньшей мере одного гистона по сравнению с указанным контрольным уровнем" или тому подобным выражением. Такие термины означают, что уровень по меньшей мере одного гистона, например уровень H2B, уровень H4, уровень H2A и/или уровень H3 у субъекта составляет, по меньшей мере, приблизительно на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 25%, более предпочтительно при по меньшей мере приблизительно на 30%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 100% выше, чем контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона. Другими словами, в наиболее предпочтительных аспектах повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона (или повышение уровня) может быть приблизительно в два раза выше указанного контрольного уровня по меньшей мере одного гистона. Повышение уровня приблизительно в два раза увеличивает риск неблагоприятного события, например, смерти. Например, отношение рисков 1,45 для H4, как документально подтверждено в таблице 1, означает, что риск неблагоприятного события дополнительно увеличивается на 45%. Следовательно, такие значения также являются показателем сильной корреляции и оптимальных маркеров для диагностики.

Используемый в настоящей заявке термин "повышение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем" или тому подобное используется в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем" или термином "повышенный уровень proADM по сравнению с указанным контрольным уровнем" или тому подобным выражением. Такие термины означают, что уровень proADM, в частности уровень MR- proADM, у субъекта составляет, по меньшей мере, приблизительно на 15%, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 20%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 25% или даже более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 30%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно на 100% выше, чем контрольный уровень proADM, особенно MR-proADM. Другими словами, в наиболее предпочтительных аспектах повышенный уровень указанного proADM может быть приблизительно в два раза выше, чем указанный контрольный уровень proADM.

В настоящей заявке подразумевается, что контрольные уровни и определенные уровни маркеров (то есть уровни, которые определены для отдельного субъекта в месте оказания медицинской помощи, например, ОИТ) могут варьироваться в зависимости от анализа/метода, с помощью которого определяются эти уровни. Например, контрольный уровень и определенный уровень маркера, определенные методами масс-спектрометрии, могут отличаться от соответствующих уровней, определенных иммуноанализом. Прилагаемые примеры демонстрируют, что уровни маркеров могут быть определены несколькими способами, например, методами иммуноанализа и масс-спектрометрии. Контрольные уровни могут быть оптимизированы статистическими методами, как показано в прилагаемых примерах, с помощью регрессионного анализа Кокса. Также могут быть рассчитаны соотношения рисков. Например, как показано в прилагаемых примерах, отношения рисков выше 0 (HR>0) указывают на худший прогноз, то есть, что неблагоприятное событие вероятно произойдет, а соотношения рисков меньше 0 указывают на хороший прогноз, т.е. неблагоприятное событие вероятно не произойдет. Соответственно, специалист в данной области техники знает, как определять контрольные уровни. Например, эти уровни (включая контрольные уровни) могут быть определены с помощью иммуноанализа, например, путем определения уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM, например MR-proADM, в образцах субъектов (или контрольных субъектов).

Контрольный уровень данного по меньшей мере одного гистона может составлять приблизительно 100 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 80 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 70 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 50 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 45 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл. Контрольный уровень по меньшей мере одного гистона может составлять приблизительно 10 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 15 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 20 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 25 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 30 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл.

Контрольный уровень данного по меньшей мере одного гистона может составлять от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл.

Контрольный уровень proADM может составлять приблизительно 4 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 5 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 7 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 8 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 9 нмоль/л или особенно предпочтительно приблизительно 6 нмоль/л.

Кроме того, эти уровни (включая контрольные уровни) могут быть определены с помощью масс-спектрометрических методов, таких как методы, определяющие относительную количественную оценку или определяющие абсолютную количественную оценку данного белка или его рассматриваемого фрагмента.

Относительная количественная оценка "rSRM" может быть получена следующими способами:

1. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM (контроль селективных реакций) от данного целевого пептидного фрагмента, обнаруженного в образце, с той же площадью пика сигнатуры SRM целевого пептидного фрагмента во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.

2. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного целевого пептида, обнаруженного в образце, с площадями пиков сигнатуры SRM, полученными от пептидных фрагментов из других белков, в других образцах, полученных из разных и отдельных биологических источников, когда сравнение площадей пика сигнатуры SRM между двумя образцами для пептидного фрагмента нормировано, например, на количество анализируемого белка в каждом образце.

3. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM для данного целевого пептида с площадями пиков сигнатуры SRM от других пептидных фрагментов, полученных из разных белков в том же биологическом образце, с целью нормировать изменяющиеся уровни белка гистонов до уровня других белков, которые не изменяют свои уровни экспрессии при различных клеточных условиях.

4. Такие анализы могут применяться как к немодифицированным пептидным фрагментам, так и к модифицированным пептидным фрагментам целевых белков, когда такие модификации включают, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяют таким же образом, как и при определении относительных количеств немодифицированных пептидов.

Абсолютная количественная оценка данного пептида может быть получена следующими способами:

1. Сравнение площади пика сигнатуры SRM/MRM (мониторинг множественных реакций) для данного пептидного фрагмента из целевых белков в отдельном биологическом образце с площадью пика сигнатуры SRM/MRM внутреннего стандарта пептидного фрагмента, введенного в известном количестве в лизат белка из биологического образца. Внутренним стандартом может быть меченая синтетическая версия пептидного фрагмента из исследуемого целевого белка или меченого рекомбинантного белка. Этот стандарт добавляют в образец в известных количествах перед (обязательно для рекомбинантного белка) или после расщепления, и площадь пика сигнатуры SRM/MRM может быть определена как для внутреннего стандарта пептидного фрагмента, так и для нативного пептидного фрагмента в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков. Это может применяться к немодифицированным пептидным фрагментам и модифицированным пептидным фрагментам, когда такие модификации включают, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (например, моно-, ди- или триметилирование), цитруилинирование, убиквитинилирование и при этом абсолютные уровни модифицированных пептидов могут быть определены таким же образом, как и при определении абсолютных уровней немодифицированных пептидов.

2. Пептиды также могут быть определены количественно с использованием внешних калибровочных кривых. В подходе с нормальной кривой используют постоянное количество тяжелого пептида в качестве внутреннего стандарта и варьирующееся количество легкого синтетического пептида, добавленного в образец. Для построения стандартных кривых для учета эффекта матрицы необходимо использовать репрезентативную матрицу, аналогичную матрице тестовых образцов. Кроме того, метод обратной кривой позволяет обойти проблему эндогенного аналита в матрице, когда для создания внутреннего стандарта добавляют постоянное количество легкого пептида к эндогенному аналиту, а для создания набора концентрационных стандартов добавляют варьирующиеся количества тяжелого пептида. В тестируемые образцы для сравнения с нормальными или обратными кривыми добавляли то же количество стандартного пептида, что и внутреннего стандарта, добавленного в матрицу, используемую для создания калибровочной кривой.

Соответственно, специалист в данной области техники знает, как определять уровни маркеров и, в частности, соответствующие контрольные уровни, что также проиллюстрировано в прилагаемых примерах.

Чувствительность и специфичность предлагаемых способов зависят не только от аналитического качества теста. Чувствительность и специфичность также зависят от определения того, что представляет собой анормальный (например, смерть) или нормальный результат. Распределение уровней по меньшей мере одного гистона и/или proADM, предпочтительно уровня MR-proADM, для субъектов с неблагоприятным событием и без него может перекрываться. При таких условиях, тест не способен абсолютно различить нормальное состояние от дисфункционального со 100% точностью. Специалисту в данной области известно, что само по себе состояние субъекта или по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра субъекта может помочь в интерпретации данных, и что эта дополнительная информация позволяет сделать более надежный прогноз в областях перекрытия. Соответственно, определяют уровень (уровни) по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра (например, пол, группа и возраст). Уровни по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра также можно сравнивать с контрольными уровнями, причем близкие или идентичные значения/уровни указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра субъекта по сравнению с соответствующими уровнями указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра указанных контрольных уровней свидетельствует, что риск для субъекта испытать/иметь/страдать от неблагоприятного события, уменьшается, и/или где более высокие или более низкие уровни/значения указанного, по меньшей мере, одного дополнительного маркера и/или параметра по сравнению с соответствующими уровнями указанного, по меньшей мере, одного дополнительного маркера и/или параметра указанных контрольных уровней свидетельствуют, что риск испытать/иметь/страдать от неблагоприятного события увеличивается.

Соответственно, способы и наборы по настоящему изобретению могут также включать определение по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра в дополнение к данному по меньшей мере одному гистону и/или proADM.

Используемый в данном документе термин "параметр" представляет собой характеристику, признак или измеримый фактор, которые могут помочь в определении конкретной системы. Параметр является важным элементом для связанных со здоровьем и физиологией оценок, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно, неблагоприятного события. Кроме того, параметр определяется как характеристика, которая объективно измеряется и оценивается как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Иллюстративный параметр может быть выбран из группы, состоящей из Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья (APACHE, шкала I-IV), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS, шкала I-III), Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (шкала SOFA), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (шкала SAPSII), Вероятностной модели смертности (MPM I-III), Шкалы полиорганной дисфункции (MODS), Шкалы оценки терапевтического вмешательства (TISS), Шкалы девяти эквивалентов оценки использования среднего медицинского персонала по уходу (NEMS), Шкалы Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и Шкалы комы Глазго (GCS), возраста, пола, семейной истории, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), отчета цистоскопии, количества лейкоцитов, компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, гипотензивного лечения, потребления жидкости, одышки, температуры тела, наличия сахарного диабета и существующей привычки курения.

Используемые в настоящей заявке такие термины, как "маркер", "суррогат", "прогностический маркер", "фактор" или "биомаркер" или "биологический маркер", используются взаимозаменяемо и относятся к поддающимся измерению и количественной оценке биологическим маркерам (например, концентрации специфического белка или фермента или его фрагмент или их фрагмента, концентрации специфического гормона или его фрагмента или наличия биологических веществ или их фрагмента), которые служат показателями для связанных со здоровьем и физиологией оценок, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно, неблагоприятного события. Маркер определяется как характеристика, которая может быть объективно измерена и оценена как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут быть измерены в образце (как анализ крови, плазмы, мочи или ткани). По меньшей мере, один дополнительный маркер указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, натрийуретического пептида головного мозга (BNP), C-реактивного белка (CRP), белка поджелудочной железы (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (IL-24), других IL, пресепсина (sCD14-ST), липополисахаридсвязывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP9), хромогранина А, белка S100A, белка S100B и фактора некроза опухоли α (TNFα) или их фрагментов.

В конкретных аспектах изобретения, по меньшей мере, один дополнительный маркер и/или параметр указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из уровня альдолазы B в указанном образце, уровня копептина в указанном образце, уровня проэндотелин- 1 в указанном образце, уровень лактата в указанном образце, уровня прокальцитонина (PCT) в указанном образце, Шкалы динамической оценки оценка выраженности органной недостаточности (шкала SOFA) указанного субъекта, Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (шкала SAPSII), Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II) указанного субъекта и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) в указанном образце.

В определенных аспектах изобретения этот по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, натрийуретического пептида головного мозга (BNP), C-реактивного белка (CRP), белка поджелудочной железы (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (IL-24), других IL, пресепсина (sCD14-ST), липополисахаридсвязывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP7), хромогранина А, белка S100A, белка S100B и фактора некроза опухоли α (TNFα), возраста, пола, семейной истории, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), отчета цистоскопии, количества лейкоцитов, компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, гипотензивного лечения, потребления жидкости, одышки, температуры тела, наличия сахарного диабета и существующей привычки курения, Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья (APACHE, шкала I-IV), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS шкала I-III), Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (шкала SOFA), Вероятностной модели смертности (MPM I-III), Шкалы полиорганной дисфункции (MODS), Шкалы оценки терапевтического вмешательства (TISS), Шкалы девяти эквивалентов оценки использования среднего медицинского персонала по уходу (NEMS), Шкалы Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и Шкалы комы Глазго (GCS).

Используемый в настоящей заявке термин "альдолаза B" относится к фруктозо-бисфосфат-альдолазе В или альдолазе печеночного типа, которая является одним из трех изоферментов (А, В и С) фермента 1,6-бисфосфат-альдолазы фруктозы класса I. Уровень альдолазы B в образце субъекта может быть определен методами масс-спектрометрии.

"Копептин" также называют "CT-proAVP" или "С-концевая часть вазопрессина". Вазопрессин является мощным вазоконстриктором. Уровень CT-proAVP может быть измерен в плазме или сыворотке субъекта с помощью иммуноанализа, как описано ниже.

Используемый в настоящей заявке термин "лактат" относится к максимальной концентрации лактата, измеренной в крови. Обычно концентрацию лактата оценивают ежедневно или даже чаще. Концентрация лактата в крови может быть определена спектрофотометрическими методами с помощью лактатоксидазы.

Используемый в настоящей заявке термин "прокальцитонин" или "РСТ" относится к пептидным аминокислотным остаткам 1-116, 2-116, 3-116 или их фрагментам. Таким образом, длина фрагментов прокальцитонина составляет по меньшей мере 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно более 110 аминокислот. РСТ может включать посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, липосидирование или дериватизацию. Прокальцитонин является предшественником кальцитонина и катакальцина. Таким образом, в нормальных условиях уровни РСТ в кровотоке очень низкие (< приблизительно 0,05 нг/мл). Уровень РСТ в образце субъекта можно определить с помощью иммуноанализа, как описано ниже.

Используемый в настоящей заявке термин "Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности" или "Шкала SOFA" представляет собой оценку, используемую для отслеживания статуса пациента во время пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ). Шкала SOFA - это система подсчета баллов, определяющая степень функционирования органов или уровень органной недостаточности пациента. Эта оценка основана на шести различных баллах, по одному для дыхательной, сердечнососудистой, печеночной, коагуляционной, почечной и нервной систем. Как средние, так и высшие баллы SOFA являются предикторами исхода. Увеличение оценки SOFA в течение первых 24-48 часов в отделении интенсивной терапии прогнозирует уровень смертности от 50% до 95%. Оценки менее 9 дают прогнозируемую смертность на уровне 33%, а выше 14 - смертность, близкую к 95% или выше.

Используемый в настоящей заявке термин "SAPS II" или "Упрощенная шкала оценки острых физиологических расстройств II" относится к системе классификации тяжести заболевания или расстройства (см. Le Gall JR et al., A new Simplified acute physiology score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. JAMA. 1993; 270 (24): 2957-63.). Шкала SAPS II состоит из 12 обычных физиологических переменных и 3 связанных с болезнью переменных. Балльная оценка рассчитывается на основе этих 12 обычных физиологических измерений, информации о предыдущем состоянии здоровья и некоторой информации, полученной при поступлении в ОИТ. Оценка SAPS II может быть определена в любое время, предпочтительно, на 2-й день. "Наихудшее" измерение определяется как измерение, которое соответствует наибольшему количеству баллов. Оценка SAPS II варьируется от 0 до 163 баллов. Система классификации включает следующие параметры: возраст, частота сердечных сокращений, систолическое артериальное давление, температура, шкала комы Глазго, механическая вентиляция легких или CPAP, PaО₂, FiО₂, выход мочи, азот мочевины крови, натрий, калий, бикарбонат, билирубин, лейкоциты, хронические заболевания и тип поступления в ОИТ. Имеется сигмоидальная зависимость между смертностью и суммарной оценкой SAPS II. Смертность субъекта составляет 10% при оценке SAPSII 29 баллов, 25% при оценке SAPSII 40 баллов, 50% при оценке SAPSII 52 балла, 75% при оценке SAPSII 64 балла и 90% при оценке SAPSII 77 баллов (Le Gall loc. cit.).

Используемый в настоящей заявке термин "APACHE II" или "Шкала оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II" представляет собой систему оценки тяжести заболевания (Knaus et al., 1985). Она может быть применена в течение 24 часов после поступления пациента в отделение интенсивной терапии (ОИТ) и может быть определена на основании, например, 12 или 14 разных физиологических параметров.

Используемый в настоящей заявке термин "растворимая fms-подобная тирозинкиназа-1" или "sFlt-1" представляет собой белок тирозинкиназы, который блокирует белки, вызывающие рост кровеносных сосудов. Растворимый Flt-1 (sFlt-1) представляет собой сплайс-вариант рецептора 1 VEGF (Flt-1), который продуцируется различными тканями. Уровень sFLT1 в образце субъекта можно определить с помощью масс-спектрометрических анализов или с помощью иммуноанализа.

Способы или наборы по изобретению могут включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM и уровня дополнительного маркера и/или параметра, как описано выше.

Способы и используемые наборы по настоящему изобретению также могут включать определение по меньшей мере одного дополнительного параметра, такого как оценка SAPS II, оценка SOFA и/или оценка APACHE II. Например, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и оценки SAPS II субъекта. Предпочтительно, способ включает определение указанного уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта и указанной оценки SAPSII указанного субъекта. Уровень по меньшей мере одного гистона и оценка SAPSII могут указывать на неблагоприятное событие, в частности, смерть указанного субъекта в течение 28 дней.

Предпочтительно, способ включает определение уровня proADM в указанном образце указанного субъекта и указанной оценки SAPSII указанного субъекта. Уровень proADM и оценка SAPSII могут указывать на неблагоприятное событие, в частности, смерть указанного субъекта, в течение 28 дней или в течение 7 дней.

Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и оценки SOFA субъекта.

Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня РСТ в образце субъекта. Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня альдолазы B в образце субъекта.

Используемый в настоящей заявке "субъект" (или "пациент") может представлять собой позвоночное. В контексте настоящего изобретения термин "субъект" включает как людей, так и животных, в частности млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, представленные в настоящей заявке способы применимы как к людям, так и к животным. Соответственно, указанным субъектом может быть животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик, морская свинка, хорек, кошка, собака, курица, овца, крупный рогатый скот, лошадь, верблюд или примат. Предпочтительно субъектом является млекопитающее. Наиболее предпочтительно субъектом является человек.

Способ, предоставленный в данном документе, может быть использован для любого субъекта, который является здоровым субъектом или субъектом, страдающим от каких-либо заболеваний или расстройств. В предпочтительных аспектах субъект страдает от заболевания, расстройства или состояния. Субъектом, подлежащим тестированию, может быть больной в критическом состоянии, предпочтительно когда указанный пациент помещен в отделение интенсивной терапии. Используемый в настоящей заявке термин "критическое заболевание" означает, что субъект или пациент находится в угрожающей жизни ситуации.

Субъект или контрольный субъект (ы) могут страдать от заболевания или медицинского состояния/расстройства, и при этом указанное заболевание или медицинское состояние/расстройство могут быть выбраны из группы, состоящей из респираторного заболевания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдромом системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной недостаточности(-ей), сердечнососудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек и/или иммунодепрессии.

В частности, субъект страдает от респираторных заболеваний, инфекции мочевыводящих путей и/или злокачественного новообразования(-й).

"Систематическое воспаление" в контексте изобретения предпочтительно относится к состоянию, характеризующемуся выделением провоспалительных цитокинов и активированной врожденной иммунной системы, которое может быть вызвано биологическими факторами, химическими факторами или генетическими факторами.

Тяжелое "системное воспаление" может привести к органной недостаточности и смерти.

"SIRS" в контексте изобретения представляет собой синдром системного воспалительного ответа без признаков инфекции. Он включает, среди прочего, более одного из следующих клинических проявлений: (1) температура тела выше 38°С или ниже 36°С; (2) частота сердечных сокращений более 90 ударов в минуту; (3) тахипноэ, проявляющееся частотой дыхания, превышающей 20 вдохов в минуту, или гипервентиляцией, на что указывает PaCO₂ менее 32 мм рт.ст. и (4) изменение количества лейкоцитов, такое как более 12000/мм³, менее 4000/мм³ или наличие более 10% незрелых нейтрофилов (Bone et al., CHEST 101 (6): 1644-55, 1992).

"Сепсис" в контексте изобретения обозначает системный ответ на инфекцию. В качестве альтернативы, сепсис может рассматриваться как комбинация SIRS с подтвержденным инфекционным процессом или инфекцией. Сепсис можно охарактеризовать как клинический синдром, определяемый наличием как инфекции, так и системного воспалительного ответа (Levy MM et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med. 2003 Apr;31(4):1250-6): Используемый в настоящей заявке термин "сепсис" включает, помимо прочего, сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. Тяжелый сепсис в данном контексте означает сепсис, ассоциированный с органной дисфункцией, абнормальной гипоперфузией или гипотензией, вызванной сепсисом. Гипоперфузионные нарушения включают лактоацидоз, олигурию и острое изменение психического статуса. Гипотензия, вызванная сепсисом, определяется наличием систолического артериального давления менее 90 мм рт.ст. или его снижением приблизительно на 40 мм рт.ст. или более, относительно исходного уровня в отсутствие других причин гипотонии (например, кардиогенного шока). Септический шок определяется как тяжелый сепсис с вызванной сепсисом гипотензией, сохраняющейся, несмотря на адекватную инфузионную терапию, наряду с наличием абнормальной гипоперфузии или органной дисфункции (Bone et al., CHEST 101(6): 1644-55, 1992).

Используемый в настоящей заявке термин "сепсис" относится ко всем возможным стадиям развития сепсиса.

Используемый в настоящей заявке термин "инфекция" в контексте изобретения означает патологический процесс, вызванный проникновением в нормальную стерильную ткань или жидкость патогенных или потенциально патогенных микроорганизмов, и относится к инфекции (инфекциям) бактериями, вирусами, грибами и/или паразитами. Соответственно, инфекция может представлять собой бактериальную инфекцию, вирусную инфекцию и/или грибковую инфекцию. Инфекция может быть локальной или системной инфекцией. Кроме того, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от более чем одного источника(-ов) инфекции одновременно. Например, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от бактериальной инфекции и вирусной инфекции; от вирусной инфекции и грибковой инфекции; от бактериальной и грибковой инфекции, а также от бактериальной инфекции, грибковой инфекции и вирусной инфекции.

В частности, субъект страдает от сепсиса. Кроме того, субъект может предпочтительно страдать от респираторного заболевания, предпочтительно инфекции нижних дыхательных путей. Используемый в настоящей заявке термин "респираторное заболевание" включает патологические состояния, поражающие органы и ткани, которые делают возможным газообмен у высших организмов, а также включает состояния верхних дыхательных путей, трахеи, бронхов, бронхиол, альвеол, плевры и плевральной полости, а также нервов и дыхательных мышц.

В частности, в способах и наборах по изобретению уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанным респираторным заболеванием, свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности смерти в течение 7 дней.

В частности, в способах и наборах по изобретению субъект страдает инфекцией мочевыводящих путей, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанной инфекцией мочевыводящих путей, свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности, смерти в течение 28 дней.

В частности, в способах и наборах по изобретению субъект страдает злокачественным новообразованием, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанным злокачественным новообразованием, свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности, смерти в течение 7 дней.

Используемый в настоящей заявке термин "образец" означает биологический образец, который получают от субъекта. Используемый в настоящей заявке термин "образец" может, например, относиться к образцу жидкости или ткани организма, полученному с целью диагностики, прогнозирования или оценки рассматриваемого субъекта, такого как пациент. Предпочтительно в настоящей заявке образец представляет собой образец жидкости организма, такой как кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, мокрота и плевральные выпоты. В частности, образец представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу. Образцы могут быть подготовлены (предварительно обработаны), например, путем фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты сыворотки или плазмы. Такая предварительная обработка также может включать, помимо прочего, разбавление, фильтрацию, центрифугирование, концентрирование, отстаивание, осаждение или диализ. Предварительная обработка может также включать добавление к раствору химических или биохимических веществ, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, химически активные красители, моющие средства, эмульгаторы, хелаторы. Предпочтительно образец представляет собой образец крови, более предпочтительно образец сыворотки или образец плазмы.

"Плазма" в контексте настоящего изобретения представляет собой практически бесклеточный супернатант крови, содержащий антикоагулянт, полученный после центрифугирования. Иллюстративные антикоагулянты включают соединения, связывающие ионы кальция, такие как ЭДТА или цитрат, и ингибиторы тромбина, такие как гепаринаты или гирудин. Бесклеточная плазма может быть получена центрифугированием антикоагулированной крови (например, обработанной цитратом, ЭДТА или гепаринизированной крови), например, в течение по меньшей мере 15 минут при 2000-3000 g.

"Сыворотка" в контексте настоящего изобретения представляет собой жидкую фракцию цельной крови, которую собирают после свертывания крови. Когда коагулированная кровь (свернутая кровь) подвергнута центрифугированию, сыворотка может быть получена в качестве супернатанта.

Используемый в настоящей заявке термин "моча" представляет собой жидкий продукт организма, выделяемый почками в процессе, называемом мочеиспусканием, через мочеиспускательный канал.

Как описано выше, в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM. Специалист в данной области осведомлен о способах/анализах, которые можно использовать для определения уровня биомаркеров в образце.

Как описано выше, определяют уровень по меньшей мере одного гистона, в частности, определяют уровень (уровни) гистонов H2B, H4, H2A и/или H3. В частности, можно определить гистон или фрагмент гистона. Такие фрагменты приведены ниже в качестве примера.

Такой гистон или его фрагмент также может представлять собой свободный гистон. Например, способы, наборы и антитела по настоящему изобретению могут, в частности, обнаруживать пептиды или эпитопы свободных гистонов. Такие участки аминокислот также называются в настоящей заявке центральными областями или частями гистонов. Далее описаны пептиды или эпитопы, которые также могут быть использованы для обнаружения свободных гистонов с применением способов, представленных в настоящей заявке.

В частности, по меньшей мере один гистон может представлять собой гистон H4, и в нем определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки 46-56 последовательности SEQ ID NO: 1, остатки 67-78 последовательности SEQ ID NO: 1, остатки с 60 по 67 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 из SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 из SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 из SEQ ID NO: 1, и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1. Например, могут быть определены два пептида.

В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, причем определяют пептиды из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки 46-56 последовательности SEQ ID NO: 1 и остатки 67-78 последовательности SEQ ID NO: 1.

Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, причем определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2. В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, причем определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, охватывающих остатки с 21 по 53 последовательности SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 последовательности SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 из SEQ ID NO: 2, остатки 89 до 95 из SEQ ID NO: 2 и остатки от 100 до 118 из SEQ ID NO: 2.

Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, причем определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3. Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 последовательности SEQ ID NO: 3 и/или охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 последовательности SEQ ID NO: 3.

Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, причем определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.

Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, причем определяют по меньшей мере один пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.

Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, причем определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.

В настоящей заявке подразумевается, что могут быть определены один, два, три, четыре или более пептидов.

Уровень маркеров, например по меньшей мере одного гистона или его фрагмента и/или proADM или его фрагмента могут быть определены любым анализом, который надежно определяет концентрацию маркера. В частности, могут быть использованы масс-спектрометрия (МС) и/или иммуноанализы, как показано в прилагаемых примерах. Используемый в настоящей заявке иммуноанализ представляет собой биохимический тест, который измеряет присутствие или концентрацию макромолекулы/полипептида в растворе с использованием антитела или связывающего антитело фрагмента или иммуноглобулина.

В качестве альтернативы, в объем настоящего изобретения вместо антител могут быть включены другие молекулы захвата или молекулярные каркасы, которые специфически и/или селективно распознают последовательности гистонов, эпитопы гистонов и структурные конформации гистонов. В настоящей заявке термин "молекулы захвата" или "молекулярные каркасы" включает молекулы, которые могут использоваться для связывания целевых молекул или рассматриваемых молекул, то есть аналитов (например, гистона(-ов) и/или proADM), из образца. Таким образом, молекулы захвата должны иметь адекватную форму, как пространственно, так и с точки зрения поверхностных характеристик, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие льюис-доноров и/или -акцепторов, чтобы специфически связывать целевые молекулы или рассматриваемые молекулы. Таким образом, связывание может, например, быть опосредовано ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или водородными взаимодействиями или комбинацией двух или более вышеупомянутых взаимодействий или ковалентных взаимодействий между молекулами захвата или молекулярными каркасами и целевыми молекулами или рассматриваемыми молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы захвата или молекулярные каркасы могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы углевода, молекулы ПНК, белка, пептида и гликопротеина. Молекулы захвата или молекулярные каркасы включают, например, аптамеры, дарпины (сконструированные белки с анкириновым повтором), аффимеры и тому подобное.

Используемый в настоящей заявке термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина (Ig), то есть молекулам, которые содержат антигенсвязывающий сайт, специфически связывающий антиген (иммуннореагирует с антигеном). Согласно изобретению антитела могут быть как моноклональными, так и поликлональными антителами. В частности, используют антитела, которые специфически связываются с данным по меньшей мере одним гистоном и/или которые специфически связываются с proADM. Антитело считается специфичным, если его сродство к рассматриваемой молекуле, например, с данным по меньшей мере одним гистоном и/или proADM или его фрагментом по меньшей мере в 50 раз выше, предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем с другими молекулами, содержащимися в образце, содержащем рассматриваемую молекулу. В данной области техники хорошо известно, как разрабатывать и отбирать антитела с заданной специфичностью. В контексте изобретения предпочтительными являются моноклональные антитела. Антитело или связывающий фрагмент антитела специфически связывается с определенными в настоящей заявке маркерами или их фрагментами. В частности, антитело или связывающий фрагмент антитела связывается с определенными в настоящей заявке пептидами данного по меньшей мере одного гистонового белка. Таким образом, определенные в настоящей заявке пептиды также могут быть эпитопами, с которыми специфически связываются антитела. Кроме того, в способах и наборах по изобретению используют антитело или связывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с proADM, в частности с MR-proADM. Примером иммуноанализа может быть люминесцентный иммуноанализ (LIA), радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ, ферментный иммуноанализ (EIA), иммуноферментный анализ (ELISA), анализ на гранулах на основе люминесценции, анализ на основе магнитных гранул, анализ на основе белковых микрочипов, форматы экспресс-методов тестирования или анализ на основе криптатов редкоземельных металлов. Кроме того, могут использоваться анализы, пригодные для тестирования в местах оказания медицинской помощи, и форматы экспресс-методов тестирования, такие как, например, тесты с иммунохроматографическими полосками.

В определенных аспектах изобретения способ представляет собой способ диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, причем указанный способ включает

(i) получение образца субъекта;

(ii) определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта путем контактирования образца с антителом (антителами) или антигенсвязывающим фрагментом (фрагментами) или его производным(-и), специфичными к эпитопу указанного по меньшей мере одного гистона и/или указанного proADM и обнаружение связывания между этим антителом (антителами) или его антигенсвязывающим фрагментом (фрагментами) или его производным(-и) и указанным по меньшей мере одним гистоном и/или указанным proADM; и

(iii) при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или указанный уровень проадреномедуллина (proADM) свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

В определенных аспектах изобретения способ представляет собой иммуноанализ, включающий стадии:

a) контактирования образца с

(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным к первому эпитопу гистона или proADM, и

(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным ко второму эпитопу гистона или proADM; и

b) обнаружения связывания первого и второго антител или антигенсвязывающих фрагментов или их производных с гистоном или с proADM.

Предпочтительно одно из антител может быть меченым, а другое антитело может быть связано с твердой фазой или может быть селективно связано с твердой фазой. В особенно предпочтительном аспекте анализа одно из антител помечено, в то время как другое либо связано с твердой фазой, либо может быть селективно связано с твердой фазой. Первое антитело и второе антитело могут присутствовать в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения, который является частью системы мечения на основе флуоресцентного или хемилюминесцентного ослабления или амплификации, связан с первым антителом, а второй компонент мечения указанной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с указанным по меньшей мере одним гистоном и/или с указанным proADM, подлежащим обнаружению, генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаруживать полученные сэндвич-комплексы в измерительном растворе. Система мечения может содержать криптат или хелат редкоземельного металла в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.

В предпочтительном варианте реализации способ выполняют в виде гетерогенного сэндвич-иммуноанализа, причем одно из антител иммобилизовано на произвольно выбранной твердой фазе, например на стенках пробирок с покрытием (например, полистирольных пробирок; пробирок с покрытием; СТ) или пластин микротитратора, например, состоящих из полистирола, или на частицах, таких как, например, магнитные частицы, причем другое антитело имеет группу, напоминающую обнаруживаемую метку или позволяющую избирательно прикрепляться к этой метке, и которая служит для обнаружения сформированных многослойных структур. Также возможна временно задержанная или последующая иммобилизация с использованием подходящих твердых фаз.

Способ согласно настоящему изобретению может, кроме того, быть реализован как гомогенный способ, при котором сэндвич-комплексы, образованные антителом/антителами и маркером, например гистоном или proADM или их фрагментом, который должен быть обнаружен, остаются суспендированными в жидкой фазе. В этом случае предпочтительно, чтобы при использовании двух антител оба антитела были помечены частями системы обнаружения, что приводит к генерации сигнала или инициации сигнала, если оба антитела интегрированы в один сэндвич. Такие методики должны быть реализованы, в частности, как способы усиления флуоресценции или обнаружения гашения флуоресценции. Особенно предпочтительный аспект относится к применению детектирующих реагентов, которые должны использоваться попарно, таких как, например, описанные в заявках на патент US 4882733 A, EP-B1 0 180 492 или EP-B1 0 539 477 и известный уровень техники, цитируемый в этих заявках. Таким образом, становятся возможными измерения, при которых обнаруживаются только продукты реакции, включающие оба метящих компонента в одном иммунном комплексе непосредственно в реакционной смеси. Например, идеи вышеупомянутых заявок реализованы в таких технологиях, как предлагаемые под торговыми марками TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission - усиленное излучение криптата с временным разрешением) или KRYPTOR^®. Поэтому в конкретных предпочтительных аспектах для реализации предложенного в настоящей заявке способа используют устройство обнаружения. Например, определяют уровень гистона или proADM или их фрагмента и/или уровень любого другого маркера предлагаемого в настоящей заявке способа. В особенно предпочтительных аспектах таким устройством обнаружения является KRYPTOR^®.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(-ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа (эпитопов) по меньшей мере одного гистона. и/или proADM. В качестве примера, ниже и выше в настоящей заявке описаны иллюстративные пептиды, которые могут быть пригодными для определения уровня proADM и/или данного по меньшей мере одного гистона.

Например, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(-ы) или их производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H4, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона Н4, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 22-102 из SEQ ID NO: 1.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, специфичные для эпитопа гистона H4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 46-56 из SEQ ID NO: 1, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичные для эпитопа гистона Н4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 67-78 из SEQ ID NO: 1.

Например, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H2B, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2B, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 из SEQ ID NO: 4.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (ы) или его производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H2A, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(-ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона Н2А, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, с 20 по 118 или со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа (ов) гистона H3, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона Н3, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 из SEQ ID NO: 3.

Более предпочтительно в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона Н4, причем эпитоп(-ы) выбран/выбраны из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 56 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 из SEQ ID NO: 1 и остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона Н2А, причем эпитоп(-ы) выбран/выбраны из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2 и остатки от 120 до 129 из SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H2B, охватывающего остатки с 41 по 69 из SEQ ID NO: 4.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент (ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H3, охватывающего остатки с 27 по 37 из SEQ ID NO: 3 и/или остатки с 52 по 62 из SEQ ID NO: 3.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2A, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, и/или от 120 до 129 последовательности гистона H2A, представленной SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона Н4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 из SEQ ID NO: 1, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2A, H2B или предпочтительно H3.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 из SEQ ID NO: 4, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2A, H4 или H3.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2B, H4 или H3.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 из SEQ ID NO: 3, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2B, H4 или H2A.

Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2A, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, с 120 по 129 или с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2 и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H3, H4 или предпочтительно H2B.

Изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или его производному, которые специфичны для эпитопа белка гистона или его фрагмента, как подробно описано выше.

Иллюстративные антитела, которые успешно применяются для обнаружения гистонов или proADM, предпочтительно MR-proADM, приведены в прилагаемых примерах. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу(-ам), его антигенсвязывающему фрагменту(-ам) или его производному (производным), специфичным для эпитопа гистона H2B, H4, H2A, H3 и/или proADM, предпочтительно MR-proADM. Иллюстративные эпитопы или пептиды, с которыми специфически связываются эти антитела, документально подтверждены в данной заявке выше и ниже.

Уровень маркера, например данного по меньшей мере одного гистона и/или proADM также можно определить с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа, как описано в приложенных примерах. Такой способ может включать обнаружение присутствия, количества или концентрации одного или нескольких модифицированных или немодифицированных фрагментов пептидов, например, proADM и/или гистона в указанном биологическом образце или лизате белка (например, триптическом лизате) из указанного образца и, возможно, разделение образца хроматографическими методами и исследование подготовленного и необязательно разделенного образца МС-анализом. Например, в анализе МС можно использовать масс-спектрометрию с контролем селективных реакций (SRM), контролем множественных реакций (MRM) или контролем параллельных реакций (PRM), в частности, для определения количества по меньшей мере одного гистонового пептида. В настоящей заявке термин "масс-спектрометрия" или "МС" относится к аналитическому методу, позволяющему идентифицировать соединения по их массе. Чтобы улучшить возможности масс-спектрометрии по разрешению и определению массы, перед анализом МС образцы могут быть подготовлены. Соответственно, изобретение относится к способам обнаружения МС, которые можно комбинировать с технологиями иммунообогащения, способами, связанными с подготовкой образца и/или хроматографическими методами, предпочтительно с жидкостной хроматографией (ЖХ), более предпочтительно с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или ультра высокоэффективной жидкостной хроматографией (УВЭЖХ). Способы подготовки образца включают способы лизиса, фракционирования, расщепления образца на пептиды, истощения, обогащения, диализа, обессоливания, алкилирования и/или восстановления пептидов. Однако эти шаги не являются обязательными. Селективное обнаружение ионов аналита можно проводить с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Тандемная масс-спектрометрия характеризуется стадией отбора по массе (в настоящей заявке термин "отбор по массе" обозначает выделение ионов, имеющих определенное m/z или узкий диапазон m/z), с последующей фрагментацией отобранных ионов и массовым анализом полученного продукта (фрагмента) ионов.

Специалистам известно, как количественно определить уровень маркера в образце масс-спектрометрическими методами. Например, можно использовать относительное количественное определение "rSRM" или абсолютное количественное определение, как описано выше.

Используемый в настоящей заявке термин "диагностика" в контексте настоящего изобретения относится к распознаванию и (раннему) обнаружению неблагоприятного события, в частности смерти, у субъекта и может также включать дифференциальную диагностику. Также термин "диагностика" может охватывать оценку тяжести неблагоприятного события. Например, оценку того, насколько критическим является состояние и насколько вероятно возникновение неблагоприятного события. Кроме того, диагностика означает, что может быть предсказано время наступления неблагоприятного события у субъекта, например в течение приблизительно 28, 7 или 3 дней.

"Прогнозирование" относится к предсказанию исхода или специфического риска для субъекта испытывать/иметь/страдать от неблагоприятного события, в частности, смерти. Это может также включать оценку вероятности выздоровления или вероятности неблагоприятного исхода для указанного субъекта.

Изобретение также относится к способам и наборам для мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии субъектов, причем этот способ включает

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Способы и наборы изобретения также могут быть использованы для мониторинга. "Мониторинг" относится к отслеживанию уже диагностированного заболевания или медицинского состояния, например, с целью анализировать прогрессирование заболевания или состояния или влияние конкретного лечения на прогрессирование и прогнозировать неблагоприятный исход, например, угрожающее жизни состояние здоровья или даже смерть.

Термин "контроль терапии" в контексте настоящего изобретения относится к мониторингу и/или корректировке терапевтического лечения субъекта.

В настоящем изобретении термины "оценка риска" и "стратификация риска" относятся к группированию субъектов в различные группы риска в соответствии с их дальнейшим прогнозом. Оценка риска также относится к стратификации для применения профилактических и/или терапевтических мер.

Используемый в настоящей заявке термин "руководство по терапии" относится к применению определенных методов лечения или медицинских вмешательств на основании величины одного или нескольких биомаркеров и/или клинических параметров, и/или клинических оценок.

Изобретение, кроме того, относится к наборам, применению этих наборов и способам, в которых используются такие наборы. Изобретение относится к наборам для реализации описанных в настоящей заявке выше и ниже способов. Приведенные в настоящей заявке определения, например приведенные в связи с этими способами, также применимы к наборам по изобретению. В частности, изобретение относится к наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска, причем указанный набор содержит

(i) реагенты для определения указанного уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта и

контрольные данные, включающие указанный контрольный уровень по меньшей мере одного гистона, и причем повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона указывают на неблагоприятное событие у указанного субъекта; и/или

(ii) реагенты для определения уровня proADM в образце от указанного субъекта и

контрольные данные, включающие указанный контрольный уровень proADM, и

при этом повышенный уровень proADM в указанном образце указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Изобретение также относится к набору для и его применению для диагностики, прогнозировании, оценке риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,

(i) причем в образце от указанного субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона, при этом уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и

причем неблагоприятное событие указанного субъекта выявляют на основании сравнения уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в образце, с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или

(ii) при этом в образце субъекта определяют уровень proADM,

причем уровень proADM сравнивается с контрольным уровнем proADM, и

при этом неблагоприятное событие субъекта выявляют на основании сравнения уровня proADM, определенного в образце, с контрольным уровнем proADM.

Изобретение также относится к набору и его применению для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,

(i) причем набор содержит реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта и

при этом уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) при этом набор содержит реагенты для определения уровня proADM в образце субъекта и

при этом указанный уровень указанного proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии указанного субъекта.

Используемый в настоящей заявке термин "контрольные данные" включают контрольный уровень (уровни) по меньшей мере одного гистона и/или proADM, в частности MR-proADM. Уровни этого по меньшей мере одного гистона и/или proADM в образце субъекта можно сравнивать с контрольными уровнями, содержащимися в контрольных данных набора. Повышенный уровень определяемого маркера (маркеров) свидетельствует о неблагоприятном событии, в частности, смерти. Контрольные уровни описаны выше. Контрольные данные также могут включать контрольный образец, с которым сравнивают уровень этого по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM. Контрольные данные также могут включать в себя инструкцию по применению данных наборов по изобретению.

Используемый в настоящей заявке термин "реагент для обнаружения" или подобное выражение обозначает реагенты, которые пригодны для определения описанного в настоящей заявке маркера(-ов), например, данного по меньшей мере одного гистона и/или proADM. Такими иллюстративными реагентами для обнаружения являются, например, лиганды, например, антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с пептидом или эпитопами описанного в настоящей заявке маркера(-ов). Такие лиганды могут быть использованы в иммуноанализах, как описано выше. В набор также могут быть включены дополнительные реагенты, которые используются в иммуноанализах для определения уровня маркера(-ов), и в настоящей заявке рассматриваются в качестве реагентов для обнаружения. Реагенты для обнаружения также могут относиться к реагентам, которые используются для обнаружения маркеров или их фрагментов методами на основе МС. Таким образом, таким реагентом для обнаружения также могут быть реагенты, например ферменты, химические вещества, буферы и т. д., которые используются для подготовки образца для МС анализа. Масс-спектрометр также можно рассматривать в качестве реагента для обнаружения. Реагенты для обнаружения согласно изобретению также могут представлять собой калибровочный раствор(-ы), например те, которые могут быть использованы для определения и сравнения уровня маркера(-ов).

Данные определения и пояснения также применимы с соответствующими изменениями к следующим пунктам. Настоящее изобретение также относится к следующим объектам в определенных вариантах реализации.

1. Способ для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта, причем указанный способ включает

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

2. Способ по абзацу 1, отличающийся тем, что указанное неблагоприятное событие возникает в течение 28 дней.

3. Способ по абзацу 1 или 2, отличающийся тем, что

(i1) указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или

(ii1) указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM; и

(iii) при этом у указанного субъекта выявляют указанное неблагоприятное событие на основании сравнения на этапе (i1) и/или (ii1) соответственно.

4. Способ по любому из абзацев 1-3, отличающийся тем, что

(i) повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) повышение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

5. Способ по любому из абзацев 1-4, отличающийся тем, что указанное неблагоприятное событие выбрано из группы, состоящей из смерти, органной дисфункции, полиорганной дисфункции и заболевания или медицинского расстройства, такого как инфекция.

6. Способ по любому из абзацев 1-5, отличающийся тем, что указанное неблагоприятное событие представляет собой смерть.

7. Способ по любому одному из абзацев 1-6, отличающийся тем, что

(i) повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона приблизительно в два раза выше указанного контрольного уровня по меньшей мере одного гистона; и/или

(ii) повышенный уровень указанного proADM приблизительно в два раза выше указанного контрольного уровня proADM.

8. Способ по любому из абзацев 3-4, отличающийся тем, что указанный контрольный уровень по меньшей мере одного гистона и/или контрольный уровень proADM представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта.

6. Способ по абзацу 4, отличающийся тем, что контрольный субъект(-ы) является/являются здоровым(-и) субъектом(-ами) и/или субъектом(-ами), не имеющим(-и) неблагоприятного события.

7. Способ по любому из абзацев 2-4, отличающийся тем, что указанный контрольный уровень по меньшей мере одного гистона и/или контрольный уровень proADM представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM, полученный из предшествующего анализа указанного субъекта.

8. Способ по любому из абзацев 1-7, отличающийся тем, что указанный proADM представляет собой среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM).

9. Способ по любому из абзацев 1-8, отличающийся тем, что указанный уровень proADM указанного субъекта свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно смерти указанного субъекта в течение 28 дней.

10. Способ по любому из абзацев 1-9, отличающийся тем, что указанный уровень proADM указанного субъекта свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно смерти указанного субъекта в течение 7 дней.

11. Способ по любому из абзацев 1-10, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, гистон H2A, гистон H3 и/или гистон H4.

12. Способ по любому из абзацев 1-11, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B.

13. Способ по любому из абзацев 1-12, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона указанного субъекта о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно, смерти указанного субъекта в течение 7 дней или в течение 3 дней.

14. Способ по любому из абзацев 1-13, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает определение, по меньшей мере, одного маркера и/или параметра указанного субъекта, выбранного из группы, состоящей из уровня альдолазы B в указанном образце, уровня копептина в указанном образце, уровня лактата в указанном образце, уровня прокальцитонина (PCT) в указанном образце, балла Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (оценка SOFA) указанного субъекта, балла Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (SAPSII), Системы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II) указанного субъекта и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) в указанном образце.

15. Способ по любому из абзацев 1-14, отличающийся тем, что указанный способ включает определение указанного уровня по меньшей мере одного гистона и указанного уровня proADM в указанном образце указанного субъекта.

16. Способ по абзацу 15, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный уровень proADM свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно смерти указанного субъекта в течение 28 дней.

17. Способ по любому из абзацев 1-16, отличающийся тем, что указанный способ включает определение указанного уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта и указанной оценки SAPSII указанного субъекта.

18. Способ по абзацу 17, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанная оценка SAPSII свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно смерти, указанного субъекта в течение 28 дней.

19. Способ по любому из абзацев 1-18, отличающийся тем, что указанный способ включает определение указанного уровня proADM в указанном образце указанного субъекта и указанной оценки SAPSII указанного субъекта.

20. Способ по абзацу 19, отличающийся тем, что указанный уровень proADM и указанная оценка SAPSII свидетельствует о возникновении указанного неблагоприятного события, предпочтительно смерти, у указанного субъекта в течение 28 дней или в течение 7 дней.

21. Способ по любому из абзацев 1-20, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния.

22. Способ по любому из абзацев 1-21, отличающийся тем, что указанный субъект является пациентом в критическом состоянии, предпочтительно, когда указанный субъект помещен в отделение интенсивной терапии.

23. Способ по любому из абзацев 1-22, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния и при этом указанное заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из респираторного заболевания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной недостаточности(-ей), сердечнососудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек и/или иммунодепрессии.

24. Способ по любому из абзацев 1-23, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от сепсиса.

25. Способ по любому из абзацев 1-26, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от респираторного заболевания, предпочтительно инфекции нижних дыхательных путей.

26. Способ по абзацу 27, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанным респираторным заболеванием, свидетельствует о возникновении смерти в течение 7 дней.

27. Способ по любому из абзацев 1-26, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от инфекции мочевыводящих путей

28. Способ по абзацу 27, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанной инфекцией мочевыводящих путей, свидетельствует о возникновении смерти в течение 28 дней.

29. Способ по любому из абзацев 1-28, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от злокачественного новообразования.

30. Способ по абзацу 29, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта, страдающего указанным злокачественным новообразованием, свидетельствует о возникновении смерти в течение 7 дней.

31. Способ по любому из абзацев 1-30, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой жидкость организма, кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу.

32. Способ по любому из абзацев 1-31, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM определяют с применением метода, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (МС), люминесцентного иммуноанализа (LIA), радиоиммуноанализа (RIA), хемилюминесцентного и флуоресцентного иммуноанализа, ферментного иммуноанализа (EIA), иммуноферментного анализа (ELISA), анализа на гранулах на основе люминесценции, анализа на основе магнитных гранул, анализа на основе белковых микрочипов, форматов экспресс-методов тестирования или анализа на основе криптатов редкоземельных металлов.

33. Способ по абзацу 32, отличающийся тем, что этот способ представляет собой иммуноанализ, и при этом анализ проводят в гомогенной фазе или в гетерогенной фазе.

34. Способ по абзацу 32, отличающийся тем, что этот способ представляет собой иммуноанализ, включающий стадии:

a) контактирования образца с

b) обнаружения связывания первого и второго антител или антигенсвязывающих фрагментов или их производных с указанным гистоном или proADM.

35. Способ по абзацу 34, отличающийся тем, что одно из первого или второго антител является меченым, а другое антитело связано с или способно селективно связываться с твердой фазой.

36. Способ по абзацу 34 или 35, отличающийся тем, что первое антитело и второе антитело присутствуют в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения, который является частью системы мечения на основе флуоресцентного или хемилюминесцентного ослабления или амплификации, связан с первым антителом, а второй компонент мечения указанной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с указанным по меньшей мере одним гистоном и/или с указанным proADM, подлежащим обнаружению, генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаруживать полученные сэндвич-комплексы в измерительном растворе.

37. Способ по абзацу 36, отличающийся тем, что система мечения содержит криптат или хелат редкоземельного металла в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.

38. Способ по абзацу 32, отличающийся тем, что метод анализа МС представляет собой контроль селективных реакций (SRM), контроль множественных реакций (MRM) или контроль параллельных реакций (PRM).

39. Способ по любому из абзацев 1-38, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1.

40. Способ по любому из абзацев 1-39, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 47 по 59 из SEQ ID NO:1, остатки с 68 по 79 из SEQ ID NO: 1, остатки с 60 по 67 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 из SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 из SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 SEQ ID NO: 1 и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1.

41. Способ по любому из абзацев 1-40, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2.

42. Способ по любому из абзацев 1-41, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 из SEQ ID NO: 2, остатки с 89 по 95 из SEQ ID NO: 2 и остатки с 100 по 118 из SEQ ID NO: 2.

43. Способ по любому из абзацев 1-42, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3.

44. Способ по любому из абзацев 1-43, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3 и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 из SEQ ID NO: 3 и/или последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 из SEQ ID NO: 3.

45. Способ по любому из абзацев 1-44, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.

46. Способ по любому из абзацев 1-45, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A и при этом определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.

47. Способ по любому из абзацев 1-46, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4 и при этом определяют по меньшей мере один пептид или его фрагмент выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.

48. Набор для реализации способа по любому из абзацев 1-47, отличающийся тем, что указанный набор содержит

(i) реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта и

контрольные данные, включая контрольный уровень по меньшей мере одного гистона, и при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) реагенты для определения указанного уровня proADM в указанном образце указанного субъекта и контрольные данные, включая контрольный уровень proADM, и

при этом повышение уровня proADM в указанном образце указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует о неблагоприятном событии у указанного субъекта.

49. Применение набора согласно абзацу 48 в способе по любому из абзацев 1-47.

50. Применение набора согласно абзацу 49 для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,

(i) причем определяют указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта,

причем указанный уровень указанного по меньшей мере одного гистона сравнивают с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и

при этом указанное неблагоприятное событие у указанного субъекта выявляют на основании сравнения указанного уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в указанном образце с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или

(ii) причем определяют указанный уровень proADM в указанном образце указанного субъекта, причем указанный уровень proADM сравнивают с указанным контрольным уровнем proADM, и при этом указанное неблагоприятное событие у указанного субъекта выявляют на основании сравнения указанного уровня proADM, определенного в указанном образце с указанным контрольным уровнем proADM.

51. Применение набора для диагностики, прогнозирования, оценки риска и/или стратификации риска неблагоприятного события у субъекта,

(i) причем указанный набор содержит реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта, и

при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта; и/или

(ii) причем указанный набор содержит реагенты для определения уровня proADM в образце субъекта и

при этом указанный уровень указанного proADM свидетельствует об указанном неблагоприятном событии у указанного субъекта.

Используемые в настоящей заявке термины "содержащий" и "включающий" или их грамматические варианты следует понимать как детализирующие по меньшей мере перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающие добавления одного или нескольких дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп. Этот термин включает в себя термины "состоящий из" и "состоящий по существу из", которые, как подразумевается, определяют только конкретно перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, исключая любые дополнительные признаки.

Таким образом, термины "содержащий"/"включающий"/"имеющий" означают, что может присутствовать также любой дополнительный компонент (или аналогично признаки, целые числа, этапы и тому подобное.

Термин "состоящий из" означает, что никаких дополнительных компонентов (или, аналогично, признаков, целых чисел, шагов и тому подобного) не имеется.

Термин "состоящий по существу из" или его грамматические варианты при использовании в данном документе следует понимать как детализирующий перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающий добавления одного или нескольких дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп, но только если эти дополнительные признаки, целые числа, этапы, компоненты или их группы существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции, устройства или способа.

Таким образом, термин "состоящий по существу из" означает, что могут присутствовать конкретные дополнительные компоненты (или аналогичным образом признаки, целые числа, этапы и тому подобное), а именно те, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики композиции, устройства или способа. Другими словами, термин "состоящий по существу из" (который может использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином "содержащий по существу"), допускает присутствие других компонентов в композиции, устройстве или способе в дополнение к обязательным компонентам (или, аналогично, признакам, целым числам, этапам и т.п.), при условии, что наличие других компонентов не оказывает существенного влияния на основные характеристики устройства или способа.

Термин "способ" относится к приемам, средствам, методам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, помимо прочего, приемы, средства, методики и процедуры, известные или без труда разрабатываемые на основе известных приемов, средств, методов и процедур специалистами-практиками из химической, биологической и биофизической областей техники.

Термин "приблизительно" предпочтительно обозначает ±10% указанного числового значения, более предпочтительно ±5% указанного числового значения и, в частности, точное указанное числовое значение.

Используемый в настоящей заявке термин "приблизительно" обозначает ±10% указанного числового значения и, в частности, ±5% указанного числового значения. Всякий раз, когда используется термин "приблизительно", также конкретно указывается точное числовое значение. Если термин "приблизительно" используется в связи с параметром, который количественно определяется в целых числах, таким как число нуклеотидов в данной нуклеиновой кислоте, числа, соответствующие ±10% или ±5% от указанного числового значения, должны округляться до ближайшего целого числа. Например, выражение "приблизительно 25 аминокислот" относится к диапазону от 23 до 28 аминокислот, в частности к диапазону от 24 до 26 аминокислот, и предпочтительно относится к конкретному значению 25 аминокислот.

Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависит не только от аналитического "качества" теста. Чувствительность и специфичность также зависят от определения того, что считается аномальным результатом. На практике кривые операционных характеристик приемника (кривые ROC) обычно рассчитывают путем построения графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в "нормальных" (то есть у, очевидно, здоровых лиц, не имеющих пренатальных расстройств или состояний) и в "больных" популяциях, например, у субъектов испытывающих/имеющих/страдающих от неблагоприятного события, в частности смерти. Для любого конкретного маркера (например, MR-proADM) распределение уровней маркеров для субъектов с заболеванием/состоянием или без него, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях тест не позволяет абсолютно точно отличить норму от заболевания со 100% точностью, и область перекрытия может указывать, где этот тест не способен отличить норму от заболевания. Выбирается пороговое значение, ниже которого результат теста считается анормальным, и выше которого результат теста считается нормальным, или ниже или выше которого тест указывает на особое состояние, например, анормальное событие. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что выполняемое измерение позволит правильно распознать состояние. Кривые ROC могут применяться, даже если результаты тестов не обязательно дают точные цифры. При условии, что можно ранжировать результаты, можно построить кривую ROC. Например, результаты теста на образцах "больных" (или имеющих неблагоприятное событие) могут быть ранжированы в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Это ранжирование может быть сопоставлено с результатами в "нормальной" популяции, и построена кривая ROC. Эти методы хорошо известны в данной области; см., например, Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36. Предпочтительно, пороговое значение выбирают так, чтобы получить площадь кривой ROC более приблизительно 0,5, более предпочтительно более приблизительно 0,7, еще более предпочтительно более приблизительно 0,8, еще более предпочтительно более приблизительно 0,85 и наиболее предпочтительно более приблизительно 0,9. Термин "приблизительно" в данном контексте означает +/- 5% данного измерения.

По горизонтальной оси кривой ROC откладываются значение (1-специфичность), которое увеличивается с частотой ложноположительных результатов. По вертикальной оси кривой откладываются чувствительность, которая увеличивается со скоростью с частотой истинных положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного отсечения может быть определено значение (1-специфичность) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера позволит правильно распознать неблагоприятное событие, в частности, смерть. Таким образом, площадь под кривой ROC может использоваться для определения эффективности теста.

В других вариантах реализации в качестве меры способности теста прогнозировать риск или диагностировать расстройство или состояние ("больная группа") используют отношение правдоподобия положительного результата, отношение правдоподобия отрицательного результата, отношение шансов или отношение рисков. В случае отношения правдоподобия положительного результата значение 1 указывает, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; а значение меньше 1 указывает, что положительный результат более вероятен в контрольной группе. В случае отношения правдоподобия отрицательного результата значение 1 указывает, что отрицательный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в тестируемой группе; а значение меньше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в контрольной группе.

В случае отношения шансов, значение 1 указывает, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; а значение меньше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в контрольной группе.

В случае отношения рисков, значение 1 указывает, что относительный риск конечной точки (например, смерти) одинаков как в "больной", так и в "контрольной" группах; значение больше 1 указывает, что риск выше в больной группе; а значение меньше 1 указывает, что риск выше в контрольной группе.

Специалист в данной области поймет, что сопоставление диагностического или прогностического показателя с диагнозом или с прогностическим риском будущего клинического исхода является статистическим анализом. Например, уровень маркера ниже, чем X, может сигнализировать о том, что пациент с большей вероятностью будет страдать от неблагоприятного события/ исхода, чем пациенты с уровнем, превышающим или равным X, что определяется уровнем статистической значимости. Кроме того, изменение концентрации маркера по сравнению с исходными уровнями может отражать прогноз пациента, а степень изменения уровня маркера может быть связана с тяжестью неблагоприятных событий. Статистическую значимость часто определяют путем сравнения двух или более популяций и определения доверительного интервала и/или p-значения; см, например, Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Предпочтительные доверительные интервалы по изобретению составляют 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% и 99,99%, а предпочтительные p-значения составляют 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01,0,005, 0,001, и 0,0001.

Если не указано иное, установленные методы рекомбинантной генной технологии использовали, как описано, например, в монографии Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), которая включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.

Настоящее изобретение далее описано ссылкой на следующие неограничивающие фигуры и примеры.

Настоящее изобретение далее описано ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

Пример 1

СПОСОБЫ:

Исследуемая популяция

В клиническое исследование были последовательно включены 237 пациентов в критическом состоянии, поступивших в отделение интенсивной терапии Университетского больничного центра (CHU) Дижона Бургундии с 1 июня 2013 года по 14 июня 2014 года. Пациенты моложе 18 лет были исключены. Исследование было одобрено местным экспертным советом организации. До включения было получено письменное информированное согласие от самих пациентов или от их ближайших родственников. Все пациенты имели широкий спектр заболеваний, включая сердечнососудистые заболевания, сахарный диабет, злокачественные новообразования, респираторные заболевания, заболевания печени, почек и иммунодепрессию, и находились под наблюдением до выписки или смерти в больнице. На основании ретроспективного обзора медицинских карт, результатов визуализации и микробиологии два независимых врача классифицировали пациентов в день поступления как не имеющих сепсиса (синдром системного воспалительного ответа (SIRS) или не имеющих SIRS, с тяжелым сепсисом или септическим шоком в соответствии с международными стандартизированными критериями (Bone, Balk et al. 1992). Образец крови брали в день поступления, то есть в течение первых 24 часов. Регистрировали исходные демографические и клинические данные, включая историю болезни, результаты физикального осмотра, рутинный анализ крови (например, посев крови), нелабораторные диагностические исследования (например, критерии SIRS, критерии органной недостаточности), терапевтические вмешательства (например, искусственная вентиляция легких (MV), вазопрессоры и заместительную почечную терапию (RRT)), а также параметры исхода (например, продолжительность пребывания, смертность от всех причин). При поступлении рассчитывали балл Динамической оценки выраженности органной недостаточности (SOFA), основанной на шести параметрах органов, и балл Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS II), основанной на 17 преимущественно физиологических переменных (LeGall,Lemeshowetal.1993;Vincent,Morenoetal.1996).

Биомаркеры

Уровни лактата в сыворотке измеряли колориметрическим анализом с использованием модульного анализатора e501 производства Roche Diagnostics, Мейлан, Франция. Контрольный предел для лактата составлял 0,5-2,2 ммоль/л.

Уровни MR-proADM (среднерегиональный проадреномедуллин), копептина и PCT (прокальцитонин) определяли в образцах плазмы с использованием сверхчувствительных анализов, таких как анализатор произвольного доступа KRYPTOR (Thermo Scientific B.R.A.H.M.S). Уровни гистона H2A, H2B, H3 и H4, а также уровень альдолазы B определяли в образцах плазмы, например анализы с контролем селективных реакций или с контролем множественных реакций (SRM/MRM), как описано ниже. Специфические пептиды, полученные из маркеров, измеряли с помощью технологии ЖХ/МС/МС (масс-спектрометр TSQ Quantiva (MS); ThermoFisher Scientific). Было обнаружено, что идентифицированные пептидные последовательности и их фрагментирующие ионы, так называемые "транзиции", для каждого пептида являются полезными суррогатами для мониторинга уровней маркерных белков в образце крови. Оптимизацию проводили на синтетических пептидах, которые могут быть снабжены тяжелыми метками с использованием изотопов. Выбирали лучшие пептиды по соотношению сигнал-шум. Для каждого пептида были установлены оптимальное время удерживания и по меньшей мере 4 лучших транзиции.

Иллюстративное количественное определение с помощью МС и выбор пептидов и транзиций

5 мкл каждого клинического образца плазмы добавляли к 20 мкл 8 М мочевины/2,5% н-пропанола/300 мМ Трис/10 мМ DTT, рН 8,5 и инкубировали при 37°С в течение одного часа. В каждую лунку образца добавляли 500 мМ йодоуксусной кислоты, приготовленной в 1 М бикарбонате аммония, и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. В каждую лунку добавляли 113 мкл 50 мМ Трис/5 мМ CaCl₂ рН 8,0. Трипсин (Thermo Fisher Scientific) регидратировали 150 мкл уксусной кислоты 25 мМ, добавляли в соотношении 1:10 (общее содержание белка: протеаза), и инкубировали при 37°С в течение 20 часов. Расщепление окончательно гасили добавлением 2 мкл муравьиной кислоты. Затем перед вводом добавляли глюкагон (1 нг/мкл) и стандартные тяжелые пептиды.

Анализы SRM выполняли на тройном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantiva в сочетании с ВЭЖХ Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Разделение обращенной фазы осуществляли в линейном градиенте 20 мин от 5 до 40% В с общим временем анализа 40 мин (Растворитель A: вода 0,2% FA (муравьиная кислота), Растворитель B: ACN 0,2% FA). Скорость потока во время линейного градиента была установлена равной 240 мкл/мин. Общий объем ввода составлял 160 мкл для всех образцов и точек на кривой. Колонку Accucore aQ 150 мм × 2,1 мм (ThermoFisher Scientific) эксплуатировали при температуре 50°С.

Оптимизацию проводили на тяжелых меченых синтетических пептидах, включая меченый ¹³C и ¹⁵N аргинин или лизин (ThermoFisher Scientific или New England Peptide). Отдельные параметры прибора, такие как энергия столкновения, линза тубуса и время измерения, тестировали автоматически для каждой транзиции. После нескольких итераций оптимизированный список пептидов и транзиций (то есть сигнал с наивысшей интенсивностью и наименьшее перекрытие с другими транзициями) и соответствующие времена удерживания финализировали с использованием по меньшей мере четырех транзиций фрагмента для каждого выбранного пептида.

Пептиды идентифицировали путем совместного элюирования легких и тяжелых меченых транзиций при хроматографическом разделении. Для выравнивания по времени, относительной количественной оценки транзиций и количественной оценки целевого белка использовали программное обеспечение Pinpoint (Thermo Fisher Scientific) и Skyline (MacCoss Lab).

Относительные и абсолютные количественные определения маркеров выполняли с применением иллюстративных способов, описанных ниже.

Относительная количественное определение:

1. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного пептида, обнаруженного в биологическом образце, с площадью того же пика сигнатуры SRM того же фрагмента пептида по меньшей мере во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.

2. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного пептида, обнаруженного в биологическом образце, с площадью пиков сигнатуры SRM, полученной от фрагментов пептидов из других белков, в других образцах, полученных от разных и отдельных биологических источников, когда сравнение площади пика сигнатуры SRM между двумя образцами пептидного фрагмента нормировано на количество белка, анализируемого в каждом образце.

3. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM для данного пептида с площадью пиков сигнатуры SRM от других фрагментов пептидов, полученных из разных белков в том же биологическом образце, с целью нормировать изменяющиеся уровни маркера на уровни других белков, которые не изменяют свои уровни экспрессии в различных клеточных условиях.

4. Эти анализы были применены как к немодифицированным фрагментным пептидам, так и к модифицированным фрагментным пептидам, например, белку гистонов, когда такие модификации включали, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и при определении относительных количеств немодифицированных пептидов.

Абсолютное количественное определение данного пептида:

Сравнение площади пика сигнатуры SRM/MRM для данного фрагмента пептида из маркера в отдельном биологическом образце с площадью пика сигнатуры SRM/MRM внутреннего стандарта фрагмента пептида, добавленного в известном количестве в лизат белка из биологического образца.

Внутренним стандартом была меченая синтетическая версия фрагмента пептида из исследуемого белка маркера или меченого рекомбинантного белка. Этот стандарт добавляли в образец в известных количествах до или после расщепления, и определяли площадь пика сигнатуры SRM/MRM как для внутреннего стандарта пептидного фрагмента, так и для нативного пептидного фрагмента в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков.

Такой анализ применяли к немодифицированным пептидным фрагментам и модифицированным пептидным фрагментам, когда модификации включали, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и при определении абсолютных уровней немодифицированных пептидов.

Уровни гистона Н4 также измеряли методами иммуноанализа. Набор для иммуноанализа гистона H4 (H4 IA) состоит из мышиного моноклонального антитела (mAb), созданного против синтетического пептида (аминокислоты 46-56 из SEQ ID NO: 1), связанного с микросферами MagPlex-C (Luminex, Остин, Техас) и биотинилированного поликлонального антитела овцы (pAb), созданного против синтетического пептида (аминокислоты 67-78 из SEQ ID NO 1). В качестве стандартного материала использовали синтетический пептид (аминокислоты 46-102 SEQ ID NO: 1). Образцы измеряли на микросферах MAgPix с помощью системы xPonent 4.2 (Luminex, Остин, Техас). Данные анализировали с использованием 5-параметрической логистической регрессии из программы JMP-12 (статистическое программное обеспечение SAS, Великобритания).

Статистический анализ

Все анализы выполняли с использованием программного обеспечения R 3.0.2.

Данные выражали в виде медианного значения с межквартильным диапазоном [IQR] в скобках.

Поскольку все анализируемые биомаркеры демонстрируют распределения с положительной асимметрией, перед включением значения были log₁₀-преобразованы в регрессионные модели для того, чтобы уменьшить влияние экстремальных значений на подгонку модели.

Значения ниже предела количественного определения (LoQ) заменяли малым значением ниже LoQ. Недостающие значения не заменяли. Каждая модель включает всех пациентов с полными данными по всем переменным в модели.

Значимыми считались результаты с p-значением <0,05.

Для анализа выживаемости последующее наблюдение пациентов цензурировали через 3, 7 или 28 дней после поступления в ОИТ (максимальный период наблюдения (FUP)), соответственно. Пациентов, потерянные для последующего наблюдения до оцениваемого FUP (то есть из-за ранней выписки или переведения в другое отделение) цензурировали на день их последнего посещения в ОИТ. Пациентов, живых на день максимального FUP, цензурировали в этот день. Для переменных, зависящих от времени, использовали модели регрессии Кокса. Отображаемые результаты представляют собой вложенный критерий отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и р-значение), С-индекс (Харрел) и стандартизированные соотношения риска (HR). Соотношения риска в настоящей заявке относятся к двукратному изменению уровня биомаркеров (верхний квартиль биомаркеров по сравнению с нижним). В скорректированных моделях в модель были включены корректирующие переменные для определения дополнительного влияния биомаркеров на качество работы модели.

Результаты:

Популяция исследования составила 237 пациентов. Двух пациентов (один пациент без SIRS, один пациент с сепсисом) пришлось исключить из анализа из-за противоречивых данных о смерти. Сто семьдесят два пациента (73%) были госпитализированы с тяжелым сепсисом или септическим шоком, 15 пациентов (6%) с SIRS и 49 пациентов (21%) без SIRS. Средний возраст составлял 67 лет [59-77 лет]. Большинство пациентов составляли мужчины (60%). Наиболее частыми сопутствующими заболеваниями были сердечнососудистые заболевания (35%), сахарный диабет (31%) и злокачественные новообразования (27%), за которыми следовали респираторные заболевания (16%), заболевания печени (12%), заболевания почек (12%) и иммунодепрессия (7%). Наиболее частым местом инфекции были нижние дыхательные пути (46%) и мочевыводящие пути (45%). Оценка SAPS II (например, медиана 56 [40-69] баллов) и оценка SOFA (например, медиана 9 [6-12] баллов) при поступлении были повышены. Наиболее часто наблюдаемой органной недостаточностью были дыхательная недостаточность (61%), циркуляторный шок (56%) и почечная недостаточность (41%). Соответственно, во время пребывания в ОИТ многим пациентам потребовалась искусственная вентиляция легких (ИВ) (78%), вазопрессоры (68%) и заместительная почечная терапия (ЗПТ) (37%). Смертность от всех причин в ОИТ составила 32%, средняя продолжительность пребывания в ОИТ составила 5,4 дня [2,5-10,6 дней].

Мы проанализировали краткосрочную (например, на 3 и 7 день, то есть 3- и 7-дневную) и долгосрочную (на 28 день, т.е. 28-дневную) смертность у всех 235 пациентов в критическом состоянии с использованием одно- и двумерных моделей регрессии Кокса с поправкой на возраст и пол. Двадцать три пациента (10%) умерли к 3 дню, 49 пациентов (21%) умерли к 7 дню и 74 пациента (32%) умерли к 28 дню после поступления в ОИТ. Кроме того, была проанализирована смертность в подгруппах пациентов с инфекцией нижних дыхательных путей, инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) и злокачественными новообразованиями с использованием однофакторных регрессионных моделей Кокса, с поправкой на возраст и пол. Двадцать семь пациентов (25%) из 109 пациентов с инфекцией нижних дыхательных путей умерли к 7 дню, 34 пациента (36%) из 94 пациентов с ИМП умерли к 28 дню и 16 пациентов (25%) из 64 пациентов со злокачественными новообразованиями умерли к 7 дню после поступления в ОИТ. Способность каждой модели регрессии Кокса различать выживших и не выживших, отражается C-индексом в диапазоне от 0 до 1, причем наилучшие прогностические модели регрессии Кокса приводят к C-индексу, близкому к 1. Кроме того, рассчитывали отношение рисков, причем отношение рисков ОР>1 указывает на худший прогноз, а ОР<1 указывает на защитный эффект данной переменной.

Среди всех проанализированных переменных оценка SAPS II при поступлении в ОИТ показывает наилучшее прогнозирование для 3-дневной (C-индекс 0,876, ОР [IQR] 8,42), 7-дневной (C-индекс 0,809, ОР [IQR] 5,15) и 28-дневной (C-индекс 0,776, ОР [IQR] 4,19) смертности, затем следует оценка SOFA при поступлении в ОИТ для прогнозирования 3-дневной (индекс C 0,866, ОР [IQR] 6,68) и 7-дневной смертности (C-индекс 0,778, ОР [IQR] 3,82) у всех 235 пациентов в критическом состоянии (Таблица 1 - Таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе пациентов с сепсисом и для прогнозирования 7-дневной смертности у пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей для оценки по шкале SAPS II (C-индекс 0,773, ОР [IQR] 3,47) (таблица 4).

Для сравнения, параметр MR-proADM способен различать выживших и не выживших лучше всех биомаркеров на 7-й день (C-индекс 0,769, ОР [IQR] 4,53) и 28-й день (C-индекс 0,765, ОР [IQR] 4,86) после поступления в ОИТ у пациентов в критическом состоянии (таблица 2, таблица 3). Он превосходит оценку SOFA при прогнозировании 28- дневной смертности у всех пациентов с критическим состоянием (таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе больных сепсисом. В двумерном анализе MR-proADM улучшает эффективность оценки SAPS II или SOFA для прогнозирования 7-дневной смертности (C-индекс 0,832 для комбинированной модели SAPS II и MR-proADM по сравнению с C-индексом 0,809 для одной SAPS II) и эффективность оценки SAPS II для прогнозирования 28-дневной смертности (C-индекс 0,810 для комбинированной модели SAPS II и MR-proADM по сравнению с C-индексом 0,776 для только SAPS II) у всех пациентов в критическом состоянии (таблица 2, таблица 3). Улучшенной прогностической ценности в комбинированной модели SAPS II или SOFA и MR-proADM для прогнозирования 3-дневной смертности у этих пациентов не наблюдается (Таблица 1).

По сравнению с другими биомаркерами и оценками, PCT (например, C-индекс 0,689, ОР [IQR] 1,90 для прогнозирования 28-дневной смертности у всех пациентов в критическом состоянии) и альдолаза B (например, C-индекс 0,667, ОР [IQR] 1,47 для предсказания 28-дневной смертности у всех пациентов в критическом состоянии) при поступлении в ОИТ показывают умеренную корреляцию со смертностью у всех пациентов в критическом состоянии или их подгрупп (например, таблица 1). Однако в двумерной модели регрессии Кокса PCT улучшает прогностическую ценность SAPS II или SOFA для прогнозирования 28-дневной смертности у всех пациентов с критическим состоянием (например, комбинированная модель SAPS II и PCT дает C-индекс 0,786 по сравнению с 0,776 для SAPS II в одномерном анализе) (например, таблица 3). Кроме того, двумерная модель регрессии Кокса, включающая альдолазу B, улучшает корреляцию MR-proADM с 7-дневной смертностью у всех пациентов в критическом состоянии (комбинированная модель MR-proADM и альдолазы B с C-индексом 0,780 по сравнению с одномерной моделью MR-proADM с C-индексом 0,769) (таблица 2). Прогноз не улучшался дополнительно с помощью учета PCT или альдолазы B в дополнение к учету SAPS II, MR-proADM или гистонов в других анализах смертности (Таблица 1 - Таблица 3).

Уровни гистонов H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении ОИТ показали сильную корреляцию с 3-дневной (например, для H2B C-индекс 0,793, ОР [IQR] 2,76), 7-дневной (например, для H2B C-индекс 0,768, ОР [IQR] 2.40) и 28-дневной (например, для H2B C-индекс 0,752, ОР [IQR] 2.40) смертностью у всех пациентов в критическом состоянии (Таблица 1 - Таблица 3). Аналогичные результаты получены в подгруппе пациентов с сепсисом. Среди всех гистонов лучше всего работает H2B, затем следуют H4, H2A и H3 (Таблица 1 - Таблица 6). При сравнении эффективности оценки гистонов H2A, H2B, H3 и H4 с другими биомаркерами, выявлена поразительная прогностическая ценность гистонов для краткосрочной (3- и 7-дневной) смертности, хотя H2B может уступать MR-proADM в прогнозировании 28-дневной смертности (для MR-proADM C-индекс 0,765 по сравнению с C-индексом 0,752 для H2B). H2B и MR-proADM коррелируют с 7-дневной смертностью сопоставимо (C-индекс 0,793 для H2B по сравнению с C-индексом 0,786 для MR-proADM), а H2B превосходит MR-proADM для прогнозирования 3-дневной смертности (C-индекс 0,768 для H2B по сравнению с C-индексом 0.769 для MR-proADM) у всех пациентов в критическом состоянии (Таблица 1 - Таблица 3).

В двумерных регрессионных моделях Кокса учет уровней гистонов H2A, H2B, H3 и H4 улучшает эффективность оценок SAPS II или SOFA (например, C-индекс 0,811 для комбинированной модели H2B и SAPS II по сравнению с C-индексом 0,776 для одномерной модели SAPS II при прогнозировании 28-дневной смертности) и MR-proADM (C-индекс 0,795 для комбинированной модели H2B и MR-proADM по сравнению с C-индексом 0,765 для одномерной модели MR-proADM при прогнозировании 28-дневной смертности) (Таблица 1 - Таблица 3). У пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей гистоны H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении в ОИТ являются наилучшим предиктором 7-дневной смертности среди биомаркеров (например, для H2B C-индекс 0,785, ОР [IQR] 2,56) (Таблица 4). У пациентов в критическом состоянии с инфекцией мочеполовых путей гистоны H2A, H2B, H3 и H4 наиболее сильно коррелируют с 28-дневной смертностью среди всех переменных при поступлении в ОИТ (например, для H2B C-индекс 0,764, ОР [IQR] 2,52) (таблица 5). Гистоны H2A, H2B, H3 и H4 при поступлении в ОИТ демонстрируют наиболее сильную корреляцию с 7-дневной смертностью (например, для H2B C-индекс 0,815, ОР [IQR] 4,79) среди всех переменных у пациентов в критическом состоянии, поступивших в ОИТ со злокачественными новообразованиями (таблица 6).

Таблица 1: Одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 3-дневной смертности у всех пациентов в критическом состоянии

Двадцать четыре пациента из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли на 3-й день после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA)).

Таблица 1

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
SAPS II	235	24	55,11	3	<0,001	0,876	8,42 [4,38-16,19]
SOFA	235	24	41,78	3	<0,001	0,866	6,68 [3,33-13,39]
H2B	235	24	29,31	3	<0,001	0,793	2,76 [1,77-4,29]	1,47 [1,24-1,73]
H4	235	24	28,24	3	<0,001	0,786	2,70 [1,72-4,25]	1,45 [1,23-1,72]
H2A	235	24	28,14	3	<0,001	0,787	2,45 [1,63-3,66]	1,45 [1,23-1,72]
H4 IA	228	23	26,61	3	<0,001	0,779	14,35 [3,26-63,19]	1,39 [1,16-1,66]
MR-proADM	235	24	24,99	3	<0,001	0,786	4,82 [2,08-11,18]	2,05 [1,40-3,01]
H3	235	24	19,68	3	<0,001	0,740	3,45 [1,54-7,70]	1,23 [1,08-1,41]
Альдолаза B	235	24	14,65	3	0,002	0,721	1,65 [1,05-2,59]	1,16 [1,02-1,32]
PCT	235	24	12,08	3	0,007	0,705	1,49 [0,85-2,62]	1,09 [0,97-1,23]
H2B+SAPS II	235	24	61,95	4	<0,001	0,885
H4+SAPS II	235	24	61,83	4	<0,001	0,884
H2A+SAPS II	235	24	61,70	4	<0,001	0,884
H4 IA+SAPS II	228	23	61,51	4	<0,001	0,898
H3+SAPS II	235	24	57,02	4	<0,001	0,878
MR-proADM + SAPS II	235	24	56,79	4	<0,001	0,884
PCT+SAPS II	234	24	55,10	4	<0,001	0,875
Альдолаза B + SAPS II	234	24	54,97	4	<0,001	0,876
MR-proADM + H2B	235	24	36,15	4	<0,001	0,828
H4 IA+SOFA	228	23	50,05	4	<0,001	0,887
H2B+SOFA	235	24	47,98	4	<0,001	0,876
H4+SOFA	235	24	47,56	4	<0,001	0,876
H2A+SOFA	235	24	47,30	4	<0,001	0,874
H3+SOFA	235	24	43,63	4	<0,001	0,863
MR-proADM+ SOFA	235	24	42,27	4	<0,001	0,872
PCT+SOFA	234	24	42,04	4	<0,001	0,866
Альдолаза B+SOFA	234	24	41,60	4	<0,001	0,865
MR-proADM + H4	235	24	35,29	4	<0,001	0,826
MR-proADM + H2A	235	24	35,16	4	<0,001	0,825
MR-proADM + H4 IA	228	23	32,60	4	<0,001	0,809
MR-proADM + H3	235	24	29,15	4	<0,001	0,806
H2B + Альдолаза B	234	24	31,35	4	<0,001	0,799
PCT+H2B	234	24	29,29	4	<0,001	0,791

Таблица 2: Одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневной смертности у всех пациентов в критическом состоянии

Сорок девять пациентов из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли к 7 дню после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA)).

Таблица 2

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
SAPS II	235	49	68,07	3	<0,001	0,809	5,15 [3,26-8,13]
SOFA	235	49	50,64	3	<0,001	0,778	3,82 [2,39-6,09]
MR-proADM	235	49	45,88	3	<0,001	0,769	4,53 [2,55-8,04]	1,99 [1,53-2,59]
H2B	235	49	45,33	3	<0,001	0,768	2,40 [1,76-3,28]	1,39 [1,24-1,57]
H4	235	49	42,81	3	<0,001	0,761	2,32 [1,68-3,18]	1,37 [1,22-1,55]
H2A	235	49	40,91	3	<0,001	0,755	2,09 [1,57-2,78]	1,36 [1,21-1,54]
H3	235	49	38,22	3	<0,001	0,742	3,62 [2,07-6,34]	1,24 [1,13-1,37]
H4 IA	228	48	35,98	3	<0,001	0,741	5,57 [2,40-12,96]	1,23 [1,11-1,37]
Альдолаза B	235	49	26,66	3	<0,001	0,697	1,69 [1,22-2,33]	1,17 [1,06-1,28]
PCT	235	49	23,57	3	<0,001	0,698	1,66 [1,12-2,46]	1,12 [1,02-1,22]
H2B+SAPS II	235	49	83,39	4	<0,001	0,839
H4+SAPS II	235	49	82,29	4	<0,001	0,834
H2A+SAPS II	235	49	80,74	4	<0,001	0,830
H3+SAPS II	235	49	79,27	4	<0,001	0,835
MR-proADM + SAPS II	235	49	76,75	4	<0,001	0,832
H4 IA+SAPS II	228	48	75,64	4	<0,001	0,834
Альдолаза B + SAPS II	234	49	70,32	4	<0,001	0,809
PCT+SAPS II	234	49	68,47	4	<0,001	0,811
H2B+SOFA	235	49	61,45	4	<0,001	0,810
H4+SOFA	235	49	60,08	4	<0,001	0,804
H4 IA+SOFA	228	48	59,58	4	<0,001	0,803
MR-proADM+H2B	235	49	59,50	4	<0,001	0,804
H2A+SOFA	235	49	58,66	4	<0,001	0,800
H3+SOFA	235	49	58,44	4	<0,001	0,800
MR-proADM+H4	235	49	57,83	4	<0,001	0,801
MR-proADM+SOFA	235	49	57,26	4	<0,001	0,800
MR-proADM+H2A	235	49	56,25	4	<0,001	0,796
MR-proADM+H3	235	49	55,10	4	<0,001	0,795
MR-proADM+H4 IA	228	48	52,66	4	<0,001	0,780
Альдолаза B+SOFA	234	49	51,39	4	<0,001	0,781
PCT+SOFA	234	49	50,77	4	<0,001	0,778
MR-proADM+ Альдолаза B	234	49	49,84	4	<0,001	0,780
PCT+H2B	234	49	46,55	4	<0,001	0,769
MR-proADM+PCT	234	49	46,37	4	<0,001	0,768
H2B+Альдолаза B	234	49	46,13	4	<0,001	0,765

Таблица 3: Одно- и двумерный регрессионный анализ Кокса для 28-дневной смертности у всех пациентов в критическом состоянии

Семьдесят четыре пациента из общего числа (n) 235 пациентов в критическом состоянии умерли на 3-й день после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA))

Таблица 3

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
SAPS II	235	74	76,19	3	<0,001	0,776	4,19 [2,89-6,07]
MR-proADM	235	74	66,81	3	<0,001	0,765	4,86 [3,05-7,73]	2,06 [1,66-2,54]
SOFA	235	74	59,04	3	<0,001	0,753	3,33 [2,27-4,88]
H2B	235	74	58,04	3	<0,001	0,752	2,40 [1,84-3,11]	1,39 [1,26-1,54]
H4	235	74	53,89	3	<0,001	0,742	2,28 [1,75-2,99]	1,37 [1,23-1,51]
H2A	235	74	53,09	3	<0,001	0,742	2,11 [1,66-2,70]	1,37 [1,24-1,52]
H4 IA	228	70	48,71	3	<0,001	0,734	6,04 [2,97-12,27]	1,25 [1,14-1,36]
H3	235	74	45,95	3	<0,001	0,720	3,33 [2,10-5,29]	1,22 [1,13-1,32]
PCT	235	74	33,87	3	<0,001	0,689	1,90 [1,37-2,64]	1,15 [1,07-1,24]
Альдолаза B	235	74	25,91	3	<0,001	0,667	1,47 [1,11-1,95]	1,12 [1,03-1,22]
H2B+SAPS II	235	74	100,75	4	<0,001	0,811
H4+SAPS II	235	74	98,37	4	<0,001	0,806
H2A+SAPS II	235	74	97,64	4	<0,001	0,805
MR-proADM + SAPS II	235	74	97,47	4	<0,001	0,810
H3+SAPS II	235	74	93,05	4	<0,001	0,801
H4 IA+SAPS II	228	70	90,73	4	<0,001	0,804
MR-proADM+H2B	235	74	83,70	4	<0,001	0,795
PCT+SAPS II	234	74	81,63	4	<0,001	0,786
MR-proADM+H4	235	74	81,25	4	<0,001	0,792
MRproADM+H2A	235	74	80,39	4	<0,001	0,789
H2B+SOFA	235	74	77,41	4	<0,001	0,785
MR-proADM+SOFA	235	74	77,32	4	<0,001	0,783
Альдолаза B+SAPS II	234	74	77,24	4	<0,001	0,774
MR-proADM+H3	235	74	76,68	4	<0,001	0,786
MR-proADM+H4 IA	228	70	76,13	4	<0,001	0,784
H4+SOFA	235	74	74,89	4	<0,001	0,778
H2A+SOFA	235	74	74,08	4	<0,001	0,776
H4 IA+SOFA	228	70	72,78	4	<0,001	0,778
H3+SOFA	235	74	71,09	4	<0,001	0,770
MR-proADM+Альдолаза B	234	74	68,19	4	<0,001	0,771
MR-proADM+PCT	234	74	66,57	4	<0,001	0,766
PCT+SOFA	234	74	62,80	4	<0,001	0,756
PCT+H2B	234	74	62,73	4	<0,001	0,757
H2B+Альдолаза B	234	74	62,54	4	<0,001	0,753
Альдолаза B+SOFA	234	74	59,13	4	<0,001	0,753

Таблица 4: Одномерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневной смертности у пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей

Двадцать семь пациентов из общего числа (n) 109 пациентов в критическом состоянии с инфекцией нижних дыхательных путей умерли к 7 дню после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA))

Таблица 4

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
SAPS II	109	27	29,14	3	<0,001	0,773	3,47 [1,86-6,49]
H2B	109	27	27,70	3	<0,001	0,785	2,56 [1,59-4,12]	1,39 [1,18-1,64]
H4	109	27	26,36	3	<0,001	0,778	2,39 [1,49-3,84]	1,36 [1,15-1,61]
H2A	109	27	25,40	3	<0,001	0,774	2,16 [1,40-3,33]	1,35 [1,14-1,60]
H4 IA	105	26	22,06	3	<0,001	0,752	5,64 [1,66-19,13]	1,23 [1,06-1,41]
SOFA	109	27	21,84	3	<0,001	0,742	2,72 [1,38-5,36]	1,05 [1,02-1,09]
MR-proADM	109	27	21,54	3	<0,001	0,752	2,86 [1,37-5,94]	1,67 [1,17-2,39]
H3	109	27	21,48	3	<0,001	0,760	2,89 [1,36-6,13]	1,19 [1,05-1,35]
Альдолаза B	109	27	17,16	3	0,001	0,721	1,49 [1,00-2,22]	1,14 [1,00-1,29]
PCT	109	27	14,81	3	0,002	0,716	1,47 [0,77-2,80]	1,08 [0,95-1,22]

Таблица 5: Одномерный регрессионный анализ Кокса для 28-дневной смертности у пациентов в критическом состоянии с инфекцией мочевыводящих путей

Тридцать четыре пациента из общего числа (n) 94 пациентов в критическом состоянии с инфекцией мочевых путей умерли к 28 дню после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA))

Таблица 5

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
H2B	94	34	25,79	3	<0,001	0,764	2,52 [1,75-3,65]	1,39 [1,22-1,59]
H4	94	34	25,46	3	<0,001	0,761	2,47 [1,70-3,60]	1,38 [1,21-1,58]
H3	94	34	24,98	3	<0,001	0,756	4,52 [2,34-8,75]	1,29 [1,15-1,44]
H2A	94	34	24,65	3	<0,001	0,759	2,32 [1,64-3,28]	1,39 [1,21-1,59]
SAPS II	94	34	23,69	3	<0,001	0,737	3,00 [1,85-4,89]
H4 IA	90	31	22,52	3	<0,001	0,751	8,43 [2,79-25,45]	1,29 [1,13-1,47]
SOFA	94	34	16,07	3	0,001	0,696	2,28 [1,39-3,76]	1,05 [1,02-1,08]
MR-proADM	94	34	14,93	3	0,002	0,689	2,28 [1,36-3,81]	1,65 [1,21-2,25]
Альдолаза B	94	34	11,96	3	0,008	0,679	1,82 [1,19-2,78]	1,18 [1,05-1,33]
PCT	94	34	5,54	3	0,136	0,594	1,30 [0,74-2,29]	1,05 [0,94-1,17]

Таблица 6: Одномерный регрессионный анализ Кокса для 7-дневной смертности у больных в критическом состоянии со злокачественными новообразованиями

Шестнадцать пациентов из общего числа (n) из 64 пациентов в критическом состоянии со злокачественными новообразованиями умерли к 7 дню после поступления в ОИТ (число событий). В модели включены оценки шкал или биомаркеры, измеренные при поступлении в ОИТ. Все одномерные или двумерные модели скорректированы с учетом возраста и пола. Степени свободы (df) отражают количество включенных переменных и поправок. Отображаемые результаты: критерий отношения правдоподобия χ² (LR χ² и p-значение), C-индекс (Харрел) и стандартизированные отношения риска (ОР) плюс 95% доверительный интервал (ДИ), либо на межквартильный диапазон (IQR) либо на 2-кратное изменение. (SAPS II: Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств II; SOFA: Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности; MR-proADM: среднерегиональный проадреномедуллин; PCT: прокальцитонин; гистоны представлены гистонами H2A, H2B, H3 и H4; H4 также измеряли с помощью иммуноанализа (IA))

Таблица 6

							ОР [95% ДИ] на …
Модель	N	Число событий	L.R. χ²	df	p- значение	C-индекс	… IQR	… 2-кратное изменение
H2B	64	16	22,32	3	<0,001	0,815	4,79 [2,44-9,43]	1,60 [1,31-1,96]
H2A	64	16	22,28	3	<0,001	0,811	4,35 [2,31-8,20]	1,61 [1,31-1,98]
H4	64	16	21,99	3	<0,001	0,812	4,53 [2,33-8,81]	1,60 [1,30-1,97]
H4 IA	61	16	21,95	3	<0,001	0,803	5,52 [2,24-13,58]	1,64 [1,26-2,13]
H3	64	16	17,59	3	0,001	0,767	7,95 [2,70-23,45]	1,40 [1,17-1,67]
SAPS II	64	16	15,16	3	0,002	0,755	4,76 [1,99-11,38]	1,02 [1,01-1,03]
MR-proADM	64	16	10,20	3	0,017	0,737	3,15 [1,38-7,17]	1,88 [1,20-2,96]
SOFA	64	16	9,84	3	0,020	0,722	3,36 [1,42-7,95]	1,06 [1,02-1,11]
Альдолаза B	64	16	7,30	3	0,063	0,644	2,05 [1,15-3,64]	1,25 [1,05-1,50]
PCT	64	16	4,75	3	0,191	0,661	1,95 [0,92-4,14]	1,15 [0,98-1,34]

Все ссылки, приведенные в настоящей заявке, полностью включены в качестве ссылки.

Albrich, W.C. and S.Harbarth (2015). "Intensive Care Med 41 (10): 1739-1751. Bone,R.C., R.A.Balk, etal.(1992). Chest 101 (6): 1644-1655. Bouch,D.C. and J.P.Thompson (2008). Continuing Educationin Anaesthesia, Critical Care & Pain 8(5):181-185. Breslow, M.J. and O.Badawi (2012). Chest 141(1):245-252. Ferreira, A.M. and Y.Sakr (2011). Semin Respir Crit Care Med 32(5):543-551. Halpern, N.A. and S.M.Pastores(2010). Crit Care Med 38 (1):65-71. Kaneko-Wada Fde, J., G. Dominguez-Cherit, etal. (2015). Gac Med Mex 151(5):628-634. Le Gall, J.R., S.Lemeshow, etal. (1993). JAMA 270(24):2957-2963. Mayr, V.D., M.W.Dunser, etal. (2006). Crit Care 10 (6):R154. Vincent, J.L. (2008). Langenbecks Arch Surg 393 (6):817-824. Vincent, J.L., R.Moreno, etal. (1996). Intensive Care Med 22(7):707-710.

Claims

1. Способ прогнозирования смерти субъекта с критическим заболеванием, которое выбрано из группы, состоящей из респираторного заболевания, инфекции мочевыводящих путей, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса, септического шока, органной(ых) недостаточности(ей), сердечно-сосудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, заболевания печени, заболевания почек и иммунодепрессии,

причем указанный способ включает

(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта; и

(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, при этом указанный уровень proADM свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта, где

(i1) указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта; и

(ii1) указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM, при этом повышение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об указанной смерти у указанного субъекта; и

(iii) при этом смерть у указанного субъекта прогнозируют на основании сравнения на этапе (i1) и/или (ii1) соответственно, где указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный уровень proADM свидетельствуют о смерти в течение следующих 28 дней, при этом указанный образец представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу.

2. Способ по п. 1, в котором указанный контрольный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный контрольный уровень proADM представляют собой уровень по меньшей мере одного гистона и уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, и при этом контрольный субъект (-ы) является/являются здоровым (-и) субъектом (-ами) и/или субъектом (-ами), выжившими через 28 дней.

3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный proADM представляет собой среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM) и/или указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, гистон H4, гистон H2A, и/или гистон H3.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором указанный способ дополнительно включает определение по меньшей мере одного маркера и/или параметра указанного субъекта, выбранного из группы, состоящей из уровня альдолазы B в указанном образце, уровня копептина в указанном образце, уровня лактата в указанном образце, уровня прокальцитонина (PCT) в указанном образце, балла Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (оценка SOFA) указанного субъекта, балла Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (SAPSII), Системы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II) указанного субъекта и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) в указанном образце.

5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором указанный субъект помещен в отделение интенсивной терапии.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM определяют с применением метода, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (МС), люминесцентного иммуноанализа (LIA), радиоиммуноанализа (RIA), хемилюминесцентного и флуоресцентного иммуноанализа, ферментного иммуноанализа (EIA), иммуноферментного анализа (ELISA), анализа на гранулах на основе люминесценции, анализа на основе магнитных гранул, анализа на основе белковых микрочипов, форматов экспресс-методов тестирования или анализа на основе криптатов редкоземельных металлов.

7. Способ по любому из пп. 1-6,

(i) в котором указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4;

(ii) в котором указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 22-102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1;

(iii) в котором указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 20-118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2; и/или

(iv) в котором указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 27-62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3.

8. Набор для реализации способа по любому из пп. 1-7, причем указанный набор включает

(i) реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце указанного субъекта и контрольные данные, включая контрольный уровень по меньшей мере одного гистона; и

(ii) реагенты для определения уровня proADM в указанном образце указанного субъекта и контрольные данные, включая контрольный уровень proADM.

9. Применение набора по п. 8 для прогнозирования смерти субъекта.