RU2764020C1 - Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях - Google Patents
Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2764020C1 RU2764020C1 RU2021128589A RU2021128589A RU2764020C1 RU 2764020 C1 RU2764020 C1 RU 2764020C1 RU 2021128589 A RU2021128589 A RU 2021128589A RU 2021128589 A RU2021128589 A RU 2021128589A RU 2764020 C1 RU2764020 C1 RU 2764020C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rna
- virus
- crispr
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 201
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims description 33
- 241000617156 archaeon Species 0.000 claims description 23
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 13
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 65
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 51
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 abstract description 13
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 10
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000202362 uncultured archaeon Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101800000509 Non-structural protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101500025257 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к направляющим РНК, рибонуклеопротеиновым комплексам системы CRISPR/Cas, содержащим направляющие РНК, и наборам, содержащим рибонуклеопротеиновые комплексы системы CRISPR/Cas и специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации высококонсервативного участка генома вируса SARS-CoV-2. Изобретения позволяют эффективно выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 после проведения специфической амплификации фрагмента генома этого вируса. Изобретения обеспечивают выявление единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. 4 н. и 3 з. п. ф-лы, 16 ил., 5 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas14 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса SARS-CoV-2.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 после проведения специфической амплификации фрагментов генома SARS-CoV-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для разработки методов диагностики вновь возникающих инфекций.
Уровень техники
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma Ε., Harrington L.B., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi: 10.1126/science.aar6245).
He менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh О.О., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh О.О., Kellner Μ.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179).
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold С, Freije С.Α., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836).
Также в 2018 году были описаны CRISPR-Cas некультивируемых архей, которые содержат белки Cas14 - семейство исключительно компактных РНК-управляемых нуклеаз (от 400 до 700 аминокислот). Несмотря на свой небольшой размер, белки Cas14 способны к целевому расщеплению одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК. Более того, распознавание мишени с помощью Cas14 запускает неспецифический гидролиз (расщепление) флуоресцентной репортерной молекулы - активности, которая делает возможным применение Cas14 для выявления возбудителя/ей инфекции у человека, их генотипирования, а также для высокоточное выявления однонуклеотидных полиморфизмов. Предложенная платформа получила название Cas14-DETECTR (Harrington L.B., Burstein D., Chen J.S., Paez-Espino D., Ma E., Witte LP., Cofsky J.C., Kyrpides N.C., Banfield J.F., Doudna J.A. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018; 362(6416):839-842. doi: 10.1126/science.aav4294).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку технологий для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro, основанных на применении белков систем направленного редактирования генома.
J.P. Broughton и соавторы описали технологию DETECTR для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где в качестве мишени для амплификации методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), служили гены N и Ε SARS-CoV-2, а детекция проходила с помощью Cas12a в формате тест-полоски. Чувствительность описанного метода варьировала от 70 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4].
Cas12a также был использован для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в методе, названном AIOD-CRISPR. В качестве мишени был выбран ген N, амплификация фрагмента которого проводилась в ходе изотермической реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA). Чувствительность AIOD-CRISPR составляла 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [X. Ding, К. Yin, Ζ. Li, R. Lalla, Ε. Ballesteros, Μ Sfeir, С.Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Nat. Commun. 2020 (18) (2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6].
Кроме того, была разработана технология ENHANCE, позволяющая выявлять от 3 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию, в которой предварительная амплификация фрагмента гена N осуществлялась методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью модифицированного Cas12a [L.T. Nguyen, В.Μ. Smith, Р.K. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. Commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-l].
L.U. Guo и соавторы в совей работе описали технологию CASdetec, которая позволяла выявлять 100-500 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию. В основе технологии лежала изотермическая амплификация с помощью рекомбиназы, совмещенная с обратной транскрипцией (RT-RAA). Мишенью для амплификации служил фрагмент гена RdRp SARS-CoV-2. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью Cas12b [L.u. Guo, X. Sun, Χ. Wang, С.Liang, Η. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https://doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y].
При использовании платформы SHERLOCK для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в качестве мишени были описаны гены S и Orflab. Предварительная амплификация проводилась с применением изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA), перед детекцией с помощью Cas13a проводили дополнительный этап in vitro транскрипции. Технология SHERLOCK позволяла выявить 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [F. Zhang, О.О. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, С.Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1 8].
Кроме методов, перечисленных выше, для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 была предложена диагностическая платформа FELUDA. Выявление РНК вируса SARS-CoV-2 (гены NSP8 и N) происходило после обратной транскрипции с помощью Cas9. Чувствительность метода оценивалась в 3,16-10 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [S.M. Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167].
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий РНК на реакцию) РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro с помощью Cas14.
Раскрытие сущности
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
• высокая чувствительность;
• возможность проведения диагностики у постели больного;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
• скорость и простота анализа;
• сниженная стоимость анализа;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas14 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Cas14 с белками Cas14, например, Cas14a1 из некультивируемого археона, для ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до единичных (1,64) копий РНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до 10 раз.
Технический результат достигается за счет:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRTSPR-Cas14 для ультра чувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками РНК вируса SARS-CoV-2, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14a1 из не культивируемо го археона, с обеспечением выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2.
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы Cas14a1 из не культивируемо го археона, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/Cas, пригодных для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях (единичные копии).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5-8, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции РНК вируса SARS-CoV-2 и установления последовательности стадий метода.
Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR/Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса SARS-CoV-2. Нуклеотидная последовательность раскрытой в настоящей заявке направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14al из некультивируемого археона.
Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2.
Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14a1 из некультивируемого археона, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 1;
• SEQ ID NO: 2;
• SEQ ID NO: 3;
• SEQ ID NO: 4;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/Cas (Cas14a1 из некультивируемого археона), пригодные для использования для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, сформированный из одной из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы (Cas14a1 из некультивируемого археона), и по меньшей мере одной направляющей РНК.
Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas пригоден для выявления единичных копий РНК вируса S ARS-CoV-2.
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-4, объединенную с белком системы CRISPR/Cas (Cas14a1 из некультивируемого археона) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, с инструкцией по применению.
Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/Cas (Cas14a1 из некультивируемого археона) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса SARS-CoV-2, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5-8.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса SARS-CoV-2, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 5;
• SEQ ID NO: 6;
• SEQ ID NO: 7;
• SEQ ID NO: 8;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус SARS-CoV-2. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса SARS-CoV-2.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
2 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
4 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
6 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,0002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;
Μ - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и белок Cas14a.
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157 и белок Cas14a1.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166 и белок Cas14a1.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и белок Cas14a1.
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157 и белок Cas14a1.
Фиг. 8. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166 и белок Cas14a1.
Фиг. 9. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Cas14al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно.
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Cas14al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно.
Фиг. 12. Сравнение значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 37°С и 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок CasHal и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 (A), crRNA SARS-CoV-2 №157 (Б), crRNA SARS-CoV-2 №166 (В), crRNA SARS-CoV-2 №215 (Г) соответственно.
Фиг. 13. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием 10 клинических образцов, где Μ - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 14. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Cas14a1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно.
Фиг. 15. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием десятикратных разведений препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента, где Μ - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 16. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок CasHal и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно.
Примеры осуществления изобретения
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА SARS-COV-2 ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса SARS-CoV-2 для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления Cas14a1 из некультивируемого археона).
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса SARS-CoV-2, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-4.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
Подготовку материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 проводят методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В качестве модельной матрицы фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 биологического образца используют синтетическую РНК, полученную методом in vitro транскрипции. В качестве матрицы для синтеза модельной РНК используют плазмидную ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащую в своем составе фрагмент гена, кодирующего Ε белок вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п.о.).
Синтез кДНК фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят методом обратной транскрипции с использованием специфического олигонуклеотида E-pr Revl с SEQ ID NO: 6 (Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2) и обратной транскриптазы Superscript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°С.
Предварительную амплификацию фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят с использованием специфических олигонуклеотидов E-pr_For1 и E-pr Rev1 с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Продукты амплификации, кодирующие фрагмент генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Размер амплифицированных фрагментов составляет 260 пар нуклеотидов. Температурный профиль амплификации:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, проводят титрование модельной РНК, синтезированной на матрице pGEM-T-SARS-CoV-2, путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей фрагмент генома вируса S ARS-CoV-2).
Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной РНК-матрицы, содержащей фрагмент генома вируса SARS-CoV-2
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).
Подготовленный описанным способом материал без предварительной очистки используют для экспериментов по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов Cas14a1 из некультивируемого археона, содержащих направляющие РНК с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-4.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2
Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса SARS-CoV-2, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14a1 из некультивируемого археона;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Cas14a, tailCas14a#2, tailCas14a#3, tailCas14a#4, tailCas14a#5 и tailCas14a#6-crRNA#135 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №135, составляет 247 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Cas14a, tailCas14a#2, tailCas14a#3, tailCas14a#4, tailCas14a#5 и tailCas14a#6-crRNA#157 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №157, составляет 247 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Cas14a, tailCas14a#2, tailCas14a#3, tailCas14a#4, tailCas14a#5 и tailCas14a#6-crRNA#166 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №166, составляет 247 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Cas14a, tailCas14a#2, tailCas14a#3, tailCas14a#4, tailCas14a#5 и tailCas14a#6-crRNA#215 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №215, составляет 247 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, содержащие РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14a1 из некультивируемого археона:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации: 95°С - 15 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса вируса SARS-CoV-2, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих белок семейства CRISPR/Cas Cas14a1 из некультивируемого археона, и соответствующую направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка Cas14a1 из некультивируемого археона и подготовленную соответствующую направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, содержащих Cas14a1 из некультивируемого археона, готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
• 10х буфер (200 mM HEPES рН 7,0, 250 Μ NaCl, 100 mM MgC12, 10 mM DTT);
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215);
• 10 pmol флуоресцентный зонд (FAM-TTT-TTT-TTT-TTT-BHQ1);
• Мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса вируса SARS-CoV-2);
• вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции:
60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции; или
60 циклов:
46°С - 35 сек,
46°С - 25 сек, съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Cas14a1 из некультивируемого археона, с использованием в качестве мишени модельной РНК, синтезированной на основе плазмидной ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащей в своем составе фрагмент геном вируса SARS-CoV-2 размером 260 п. о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2. Типичные результаты анализа, проведенного при 37°С, приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1, на Фиг. 2-5 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 7-м цикле анализа (7 минут).
Типичные результаты анализа, проведенного при 46°С, приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1, на Фиг. 6-9 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 9-ом цикле анализа (9 минут).
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК при 37°С (Фиг. 10). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215>crRNA SARS-CoV-2 №166>crRNA SARS-CoV-2 №135>crRNA SARS-CoV-2 №157.
В ходе работ также была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК при 46°С (Фиг. 11). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215>crRNA SARS-CoV-2 №166>crRNA SARS-CoV-2 №135>crRNA SARS-CoV-2 №157.
Также в ходе проведенных экспериментов было показано, что выявление единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК, проходит эффективнее при температуре 46°С (Фиг. 12).
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт. ), содержащих вирус SARS-CoV-2 (ранее подтверждено с помощью ПЦР в реальном времени).
Для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, была проведена предварительная амплификация фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК.
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 13).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью ультра чувствительно выявлять фрагменты вируса SARS-CoV-2 в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. При этом рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК, обладают различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215>crRNA SARS-CoV-2 №166>crRNA SARS-CoV-2 №135>crRNA SARS-CoV-2 №157. Стоит отметить, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и crRNA SARS-CoV-2 №157, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 30-м цикле анализа (30 минут). Значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и crRNA SARS-CoV-2 №166, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 5-м цикле анализа (5 минут) и более чем в 50 раз в среднем на 42-м цикле (42 минуты). На Фиг. 14 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1 из некультивируемого археона.
В заключение были проведены эксперименты по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в последовательных разведениях препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента. Для этого были подготовлены серийные десятикратные разведения препарата РНК от 1:10 до 1:100000000 (Таблица 5. Серийные разведения РНК вируса SARS-CoV-2, выделенной из клинического образца).
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 15).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Cas14a1 из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препарате РНК, разведенном в 100000000 раз. При этом при использовании направляющей РНК crRNA SARS-CoV-2 №215, обладающей наибольшей эффективностью, значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 9 раз. На Фиг. 16 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Cas14a1 из некультивируемого археона.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas системы CRISPR-Cas14 ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2 в реакции после предварительной амплификации в препаратах РНК (в том числе разведенных в 100000000 раз), выделенных из клинических образцов, содержащих вирус SARS-CoV-2.
--->
Перечень последовательностей
<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
<120>
<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 8
<210> SEQ ID NO: NO 1
<211> 225
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 1 (crRNA SARS-CoV-2 №135):
ggg cuu cac uga uaa agu gga gaa ccg cuu cac caa 36
aag cug ucc cuu agg gga uua gaa cuu gag uga agg 72
ugg gcu gcu ugc auc agc cua aug ucg aga agu gcu 108
uuc uuc gga aag uaa ccc ucg aaa caa auu cau uuu 144
ucc ucu cca auu cug cac aag aaa guu gca gaa ccc 180
gaa uag acg aau gaa gga aug caa cca aga cuc acg 216
uua aca aua 225
<210> SEQ ID NO: NO 2
<211> 225
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2 (crRNA SARS-CoV-2 №157):
ggg cuu cac uga uaa agu gga gaa ccg cuu cac caa 36
aag cug ucc cuu agg gga uua gaa cuu gag uga agg 72
ugg gcu gcu ugc auc agc cua aug ucg aga agu gcu 108
uuc uuc gga aag uaa ccc ucg aaa caa auu cau uuu 144
ucc ucu cca auu cug cac aag aaa guu gca gaa ccc 180
gaa uag acg aau gaa gga aug caa ccg uuu acu cuc 216
gug uua aaa 225
<210> SEQ ID NO: NO 3
<211> 225
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 3 (crRNA SARS-CoV-2 №166):
ggg cuu cac uga uaa agu gga gaa ccg cuu cac caa 36
aag cug ucc cuu agg gga uua gaa cuu gag uga agg 72
ugg gcu gcu ugc auc agc cua aug ucg aga agu gcu 108
uuc uuc gga aag uaa ccc ucg aaa caa auu cau uuu 144
ucc ucu cca auu cug cac aag aaa guu gca gaa ccc 180
gaa uag acg aau gaa gga aug caa cac acg aga gua 216
aac gua aaa 225
<210> SEQ ID NO: NO 4
<211> 225
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 4 (crRNA SARS-CoV-2 №215):
ggg cuu cac uga uaa agu gga gaa ccg cuu cac caa 36
aag cug ucc cuu agg gga uua gaa cuu gag uga agg 72
ugg gcu gcu ugc auc agc cua aug ucg aga agu gcu 108
uuc uuc gga aag uaa ccc ucg aaa caa auu cau uuu 144
ucc ucu cca auu cug cac aag aaa guu gca gaa ccc 180
gaa uag acg aau gaa gga aug caa cgu ucg uuu aga 216
cca gaa gau 225
<210> SEQ ID NO: NO 5
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 5 (E-pr_For1):
gga aga gac agg tac gtt aat agt taa tag cg 32
<210> SEQ ID NO: NO 6
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 6 (E-pr_Rev1):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat ata a 37
<210> SEQ ID NO: NO 7
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 7 (E-pr_For2):
cgt taa tag tta ata gcg tac ttc ttt ttc ttg c 34
<210> SEQ ID NO: NO 8
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 8 (E-pr_Rev2):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat a 34
<---
Claims (19)
1. Молекула направляющей РНК системы CRISPR/Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса SARS-CoV-2, где нуклеотидная последовательность направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
2. Молекула направляющей РНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Cas14a1 из некультивируемого археона.
3. Молекула направляющей РНК по пп.1, 2, отличающаяся тем, что обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2.
4. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы Cas14a1 из некультивируемого археона и по меньшей мере одной из направляющих РНК из пп. 1-3.
5. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas по п.4, пригодный для выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2.
6. Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, содержащий
(i) (a) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/Cas по любому из пп.1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу Cas14a1 из некультивируемого археона;
или
(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп.4, 5,
и
(ii) инструкцию по применению.
7. Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, содержащий
(i) (a) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/Cas по любому из пп.1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу Cas14a1 из некультивируемого археона;
или
(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из пп.4, 5;
и
(ii) один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8,
и
(iii) инструкцию по применению.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021128589A RU2764020C1 (ru) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях |
| PCT/RU2022/050165 WO2023055255A1 (ru) | 2021-09-30 | 2022-05-24 | Система crispr-cas14 для выявления рнк вируса sars-cov-2 в ультранизких концентрациях |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021128589A RU2764020C1 (ru) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2764020C1 true RU2764020C1 (ru) | 2022-01-12 |
Family
ID=80040285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021128589A RU2764020C1 (ru) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2764020C1 (ru) |
| WO (1) | WO2023055255A1 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (ru) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рекомбинантной нуклеазы CAS, по существу, свободного от бактериальных эндотоксинов, полученный данным способом препарат и содержащий его набор для использования в системе CRISPR/Cas |
-
2021
- 2021-09-30 RU RU2021128589A patent/RU2764020C1/ru active
-
2022
- 2022-05-24 WO PCT/RU2022/050165 patent/WO2023055255A1/ru not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (ru) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Способ получения препарата рекомбинантной нуклеазы CAS, по существу, свободного от бактериальных эндотоксинов, полученный данным способом препарат и содержащий его набор для использования в системе CRISPR/Cas |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BROUGHTON J.P. et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol 38, 870-874 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4 Найдено онлайн: https://www.nature.com/articles/s41587-020-0513-4 Дата обращения 15.12.2021. * |
| GUO L. et al. SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics. Cell Discov. 2020;6:34. Published 2020 May 19. doi:10.1038/s41421-020-0174-y Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7235268/ Дата обращения 15.12.2021. * |
| GUO L. et al. SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics. Cell Discov. 2020;6:34. Published 2020 May 19. doi:10.1038/s41421-020-0174-y Найдено онлайн: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7235268/ Дата обращения 15.12.2021. BROUGHTON J.P. et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol 38, 870-874 (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4 Найдено онлайн: https://www.nature.com/articles/s41587-020-0513-4 Дата обращения 15.12.2021. HARRINGTON L.B. et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018; 362(6416):839-842. doi: 10.1126/science.aav4294 Найдено онлайн: https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.aav4294 Дата обращения 15.12.2021. XIAO R. et al. Structural basis for substrate recognition and cleavage by the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease, Nucleic Acids Research, Volume 49, Issue 7, 19 April 2021, Pages 4120-4128, https://doi.org/10.1093/nar/gkab179 Найдено онлайн: https://academic.oup.com/nar/ * |
| HARRINGTON L.B. et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 2018; 362(6416):839-842. doi: 10.1126/science.aav4294 Найдено онлайн: https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.aav4294 Дата обращения 15.12.2021. * |
| XIAO R. et al. Structural basis for substrate recognition and cleavage by the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease, Nucleic Acids Research, Volume 49, Issue 7, 19 April 2021, Pages 4120-4128, https://doi.org/10.1093/nar/gkab179 Найдено онлайн: https://academic.oup.com/nar/article/49/7/4120/6188352 Дата обращения 15.12.2021. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023055255A1 (ru) | 2023-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2025072582A (ja) | 標的核酸を検出するためのループプライマー及びループ・デ・ループ方法 | |
| CN114214455B (zh) | 乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统 | |
| RU2745637C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления гена антибиотикоустойчивости bla VIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях | |
| RU2764020C1 (ru) | Система CRISPR-Cas14 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2764022C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2764024C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas14 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2764021C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2764023C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2764015C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas12 и препарат для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях | |
| RU2800421C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях | |
| RU2800420C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2802079C1 (ru) | Способ обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2802783C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях в ультранизких концентрациях | |
| RU2799430C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas и препарат для выявления РНК вируса гепатита С генотипов 1b и 3a в ультранизких концентрациях | |
| RU2782951C1 (ru) | Способ обнаружения ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2802781C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR-Cas12 и препарат для выявления РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в ультранизких концентрациях | |
| RU2782700C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях | |
| RU2747880C1 (ru) | Способ обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| RU2747819C1 (ru) | Способ получения препарата рибонуклеопротеинового комплекса CRISPR/Cas и препарат для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях | |
| RU2747820C1 (ru) | Система CRISPR-Cas для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях | |
| RU2791879C1 (ru) | Система CRISPR-Cas12 для выявления гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, в ультранизких концентрациях | |
| RU2743861C1 (ru) | Система CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях | |
| RU2734520C1 (ru) | Способ обнаружения гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 (металло-бета-лактамаза класс B VIM-2) Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе | |
| Mustafa et al. | SHERLOCK and DETECTR: CRISPR-Cas systems as potential rapid diagnostic tools for emerging infectious diseases and cancer-associated mutations | |
| RU2791880C1 (ru) | Способ обнаружения гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях и специфические олигонуклеотиды для использования в способе |