RU2760937C1 - Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva - Google Patents
Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva Download PDFInfo
- Publication number
- RU2760937C1 RU2760937C1 RU2020141366A RU2020141366A RU2760937C1 RU 2760937 C1 RU2760937 C1 RU 2760937C1 RU 2020141366 A RU2020141366 A RU 2020141366A RU 2020141366 A RU2020141366 A RU 2020141366A RU 2760937 C1 RU2760937 C1 RU 2760937C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mirna
- hepatocellular carcinoma
- microrna
- development
- mirnas
- Prior art date
Links
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 55
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 title claims abstract description 45
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 title claims abstract description 9
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims description 38
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title abstract description 17
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 51
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 13
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 8
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 5
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 3
- 108091091807 let-7a stem-loop Proteins 0.000 claims 2
- 108091057746 let-7a-4 stem-loop Proteins 0.000 claims 2
- 108091028376 let-7a-5 stem-loop Proteins 0.000 claims 2
- 108091024393 let-7a-6 stem-loop Proteins 0.000 claims 2
- 108091091174 let-7a-7 stem-loop Proteins 0.000 claims 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 abstract description 29
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 108091007777 MIR106B Proteins 0.000 abstract 1
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 abstract 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 17
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000037007 arousal Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002996 emotional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005741 malignant process Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С.The invention relates to the field of biotechnology, namely to diagnostic methods that allow diagnosing the development of hepatocellular carcinoma in patients with cirrhosis of the liver due to hepatitis C.
Из уровня техники известен способ определения риска развития гепатоцеллюлярной карциномы, описанный в патенте «Применение микроРНК (микрорибонуклеиновой кислоты) в качестве прогностического маркера развития гепатоцеллюлярной карциномы» [CN 103616518, 25.11.2013]. Данный способ включает в себя получение образца опухолевой ткани от пациента с раком печени, выделение и определение уровня экспрессии микроРНК-1269а и методику применения данной микроРНК в качестве прогностического маркера развития гепатоцеллюлярной карциномы.From the prior art, a method is known for determining the risk of developing hepatocellular carcinoma, described in the patent "The use of microRNA (microribonucleic acid) as a prognostic marker for the development of hepatocellular carcinoma" [CN 103616518, 25.11.2013]. This method includes obtaining a sample of tumor tissue from a patient with liver cancer, isolating and determining the expression level of miRNA-1269a, and a technique for using this miRNA as a prognostic marker for the development of hepatocellular carcinoma.
Недостатком данного метода является, во-первых, включение в список одной молекулы микроРНК, во-вторых, использование в качестве аналита для исследования только опухолевой ткани, полученной после резекции печени, и, в-третьих, отсутствие указаний о заболевании гепатитом С в анамнезе у пациентов, среди которых планируется применение теста. Другим недостатком метода является использование в качестве показателя риска развития гепатоцеллюлярной карциномы уровня экспрессии свободных микроРНК, которые в сравнении с экзосомальными микроРНК в более значительной степени подвержены изменениям на фоне воздействия различных внешних стимулов (диета, эмоциональное возбуждение, физическая активность и проч.), что может отрицательным образом сказываться на воспроизводимости результатов теста. В свою очередь, гепатит С или цирроз печени, резвившийся вследствие инфицирования вирусом гепатита С или иной этиологии, могут изменять уровень экспрессии микроРНК и таким образом влиять на результаты исследования, что требует дополнительных указаний для интерпретации полученных результатов исследования, которые не приведены в данном методе.The disadvantage of this method is, firstly, the inclusion in the list of one microRNA molecule, secondly, the use of only tumor tissue obtained after liver resection as an analyte for the study, and, thirdly, the absence of indications of a history of hepatitis C disease in patients among whom the test is planned. Another disadvantage of the method is the use of the level of expression of free microRNAs as an indicator of the risk of developing hepatocellular carcinoma, which, in comparison with exosomal microRNAs, are more susceptible to changes under the influence of various external stimuli (diet, emotional arousal, physical activity, etc.), which can adversely affect the reproducibility of test results. In turn, hepatitis C or cirrhosis of the liver, frolicking due to infection with the hepatitis C virus or other etiology, can change the level of microRNA expression and thus affect the study results, which requires additional instructions for the interpretation of the study results, which are not given in this method.
Помимо этого, известен способ диагностики первичной гепатоцеллюлярной карциномы на основе панели нескольких микроРНК «Применение комбинации нескольких молекул микроРНК для диагностики первичной гепатоцеллюлярной карциномы» [CN 104293914, 5.09.2014]. Метод включает в себя забор биологического материала от пациента, выделение микроРНК и определение профиля уровней экспрессии в плазме 8 микроРНК в качестве диагностического маркера ранней стадии гепатоцеллюлярной карциномы: микроРНК-206, микроРНК-141-3р, микроРНК-433-3р, микроРНК-1228-5р, микроРНК-199а-5р, микроРНК-122-5р, микроРНК-192-5р и микроРНК-26а-5р. Основным недостатком метода является применение уровней экспрессии свободных микроРНК, воспроизводимость которых ниже воспроизводимости экзосомальных микроРНК.In addition, there is a known method for the diagnosis of primary hepatocellular carcinoma based on a panel of several miRNAs "Use of a combination of several miRNA molecules for the diagnosis of primary hepatocellular carcinoma" [CN 104293914, 5.09.2014]. The method includes the collection of biological material from the patient, isolation of microRNA and determination of the profile of expression levels in plasma of 8 microRNAs as a diagnostic marker of the early stage of hepatocellular carcinoma: microRNA-206, microRNA-141-3p, microRNA-433-3p, microRNA-1228- 5p, miRNA-199a-5p, miRNA-122-5p, miRNA-192-5p, and miRNA-26a-5p. The main disadvantage of the method is the use of expression levels of free miRNAs, the reproducibility of which is lower than that of exosomal miRNAs.
Наиболее близким аналогом по отношению к предлагаемому изобретению является способ диагностики гепатоцеллюлярной карциномы при помощи анализа экзосомальной микро-РНК в плазме крови [US 20110223607 A1, 15.09.2011], включающий стадии забора биологического материала (описана периферическая венозная кровь), выделение экзосом из полученного материала, выделение из экзосом микроРНК и определение уровней экспрессии микроРНК, выбранной из группы микроРНК-16, микроРНК-195 и микроРНК-199а в образце, и диагностику гепатоцеллюлярной карциномы путем сравнения полученных значений содержания микроРНК с референсными значениями. Экзосомальные микроРНК выделяют из плазмы крови, полученной путем центрифугирования образца цельной крови (в способе предлагается использование любой биологической жидкости, фактически в описании фигурирует плазма периферической венозной крови).The closest analogue in relation to the present invention is a method for the diagnosis of hepatocellular carcinoma using the analysis of exosomal micro-RNA in blood plasma [US 20110223607 A1, 09/15/2011], including the stages of sampling biological material (described peripheral venous blood), the isolation of exosomes from the material obtained , isolation of miRNA from exosomes and determination of expression levels of miRNA selected from the group of miRNA-16, miRNA-195 and miRNA-199a in a sample, and diagnostics of hepatocellular carcinoma by comparing the obtained values of the content of miRNA with reference values. Exosomal microRNAs are isolated from blood plasma obtained by centrifuging a whole blood sample (the method suggests the use of any biological fluid, in fact, the description refers to the plasma of peripheral venous blood).
Способ имеет следующие недостатки: требует проведения инвазивной процедуры забора крови с дальнейшим немедленным (в течение часа после забора) центрифугированием. Описанная в патенте технология также не указывает, как следует выделять наряду с экзосомальной фракцией микроРНК свободные молекулы микроРНК, которые служат дополнительным источником информации по развитию злокачественного процесса. Наряду с этим не указаны показатели уровней экспрессии данных микроРНК в группе пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С.The method has the following disadvantages: it requires an invasive blood sampling procedure with further immediate (within an hour after sampling) centrifugation. The technology described in the patent also does not indicate how, along with the exosomal microRNA fraction, free microRNA molecules should be isolated, which serve as an additional source of information on the development of a malignant process. At the same time, indicators of the expression levels of these microRNAs in the group of patients with liver cirrhosis due to hepatitis C were not indicated.
Техническим результатом заявленного способа является возможность диагностики гепатоцеллюлярной карциномы среди пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С по изменению профиля уровней экспрессии следующих микроРНК в плазме крови или слюне: микроРНК-let-7а, микроРНК-18, микроРНК-21, микроРНК-22, микроРНК-26а, микроРНК-34а, микроРНК-101, микроРНК-103, микроРНК-106b, микроРНК-122, микроРНК-221, микроРНК-145, микроРНК-222, микроРНК-223, микроРНК-224, микроРНК-1246.The technical result of the claimed method is the possibility of diagnosing hepatocellular carcinoma among patients with liver cirrhosis due to hepatitis C by changing the profile of the expression levels of the following miRNAs in blood plasma or saliva: miRNA-let-7a, miRNA-18, miRNA-21, miRNA-22, miRNA -26a, miRNA-34a, miRNA-101, miRNA-103, miRNA-106b, miRNA-122, miRNA-221, miRNA-145, miRNA-222, miRNA-223, miRNA-224, miRNA-1246.
Результат достигается за счет того, что заявленный способ включает следующие стадии: забор материала (слюна или кровь); выделение из одного образца экзосом методом ультрацентрифугирования и экзосомальных микроРНК и свободных микроРНК; постановка реакции ПЦР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием гепатоцеллюлярной карциномы: микроРНК-let-7а, микроРНК-18, микроРНК-21, микроРНК-22, микроРНК-26а, микроРНК-34а, микроРНК-101, микроРНК-103, микроРНК-106b, микроРНК-122, микроРНК-221, микроРНК-145, микроРНК-222, микроРНК-223, микроРНК-224, микроРНК-1246; расчет коэффициента, диагностирующего развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С по формуле (1) «Расчет коэффициента вероятности развития у пациента гепатоцеллюлярной карциномы»; диагностику развития гепатоцеллюлярной карциномы у пациента в соответствии с полученными числовыми значениями.The result is achieved due to the fact that the claimed method includes the following stages: sampling of material (saliva or blood); isolation of exosomes from one sample by ultracentrifugation of both exosomal miRNAs and free miRNAs; setting up a real-time PCR reaction with primers for certain types of miRNAs associated with the development of hepatocellular carcinoma: miRNA-let-7a, miRNA-18, miRNA-21, miRNA-22, miRNA-26a, miRNA-34a, miRNA-101, miRNA -103, miRNA-106b, miRNA-122, miRNA-221, miRNA-145, miRNA-222, miRNA-223, miRNA-224, miRNA-1246; calculation of the coefficient for diagnosing the development of hepatocellular carcinoma in patients with liver cirrhosis due to hepatitis C by the formula (1) “Calculation of the coefficient of the probability of developing hepatocellular carcinoma in a patient”; diagnostics of the development of hepatocellular carcinoma in a patient in accordance with the obtained numerical values.
Перерасчет концентраций микроРНК, включаемый в расчет, осуществляется в соответствии с поправочными коэффициентами (см. таблицу 1)The recalculation of microRNA concentrations included in the calculation is carried out in accordance with the correction factors (see table 1)
Диагностика вероятности развития ГЦК осуществляется по цифровому показателю коэффициента R, когда R в диапазоне от 0 до 0,99 - низкий риск развития ГЦК, если показатель находится в интервале от 1 до 1,99 - средний риск развития ГЦР, если показатель выше 2 - высокая вероятность ГЦК.Diagnostics of the likelihood of developing HCC is carried out using the digital indicator of the coefficient R, when R is in the range from 0 to 0.99 - low risk of developing HCC, if the indicator is in the range from 1 to 1.99 - the average risk of developing HCC, if the indicator is higher than 2 - high HCC probability.
Формула 1 «Расчет коэффициента вероятности развития у пациента гепатоцеллюлярной карциномы», описывающая способ расчета коэффициента, в соответствии с которым возможно диагностировать развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с гепатитом С в анамнезе.
Табл. 1 «Значения поправочных коэффициентов микроРНК», содержащая в себе значение поправочных коэффициентов для каждой микроРНК.Tab. 1 "Values of microRNA correction factors", containing the value of the correction factors for each microRNA.
Табл. 2 «Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови в различных группах пациентов», содержащая в себе значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови здоровых доноров, пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой с гепатитом С в анамнезе.Tab. 2 "Levels of expression of exosomal miRNAs in blood plasma in different groups of patients", containing the values of the levels of expression of exosomal miRNAs in blood plasma of healthy donors, patients with cirrhosis of the liver due to previous hepatitis C and patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis C in history.
Табл. 3 «Коэффициенты развития гепатоцеллюлярной карциномы, полученные по значениям уровней экспрессии микроРНК из плазмы крови для пациентов различных групп», содержащая в себе числовые коэффициента вероятности развития гепатоцеллюлярной карциномы у здоровых доноров, пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой с гепатитом С в анамнезе.Tab. 3 "Coefficients of the development of hepatocellular carcinoma obtained from the values of the expression levels of microRNA from blood plasma for patients of various groups", containing the numerical coefficients of the likelihood of developing hepatocellular carcinoma in healthy donors, patients with cirrhosis of the liver due to hepatitis C and patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis C in anamnesis.
Табл. 4 «Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК в слюне в различных группах пациентов», содержащая в себе значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови здоровых доноров, пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой с гепатитом С в анамнезе.Tab. 4 "Expression levels of exosomal miRNAs in saliva in different groups of patients", which contains the values of the levels of expression of exosomal miRNAs in blood plasma of healthy donors, patients with cirrhosis of the liver due to previous hepatitis C and patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis C in history.
Табл. 5 «Коэффициенты развития гепатоцеллюлярной карциномы, полученные по значениям уровней экспрессии микроРНК из слюны для пациентов различных групп», содержащая в себе числовые коэффициента вероятности развития гепатоцеллюлярной карциномы у здоровых доноров, пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой с гепатитом С в анамнезе.Tab. 5 "Coefficients of the development of hepatocellular carcinoma obtained from the values of the expression levels of microRNA from saliva for patients of different groups", containing the numerical coefficients of the likelihood of developing hepatocellular carcinoma in healthy donors, patients with liver cirrhosis due to previous hepatitis C and patients with hepatocellular carcinoma with hepatitis C history.
Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.The inventive method can be illustrated by the following examples.
Пример 1. Определение уровней экспрессии микроРНК в плазме крови различных групп пациентов и у здоровых доноровExample 1. Determination of microRNA expression levels in blood plasma of various groups of patients and in healthy donors
У 10 здоровых доноров (возраст 35-55 лет, 5 мужчин, 5 женщин) в амбулаторных условиях производят забор 2 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА). Кровь в течение 2 часов после забора центрифугирует в течение 10 минут на 3000 g, отбирают в чистую пробирку плазму, готовят несколько аликвот по 250 мкл и замораживают при -80°С. Аналогичным образом производят забор материала у 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщины, возраст 35-55 лет) с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и у 9 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (5 мужчин, 4 женщины, возраст 45-55 лет).From 10 healthy donors (age 35-55 years, 5 men, 5 women) on an outpatient basis, 2 ml of blood is taken into an EDTA K2 tube (it can be taken into any tube where EDTA is used as an anticoagulant). Blood within 2 hours after sampling is centrifuged for 10 minutes at 3000 g, plasma is taken into a clean test tube, several aliquots of 250 μl are prepared and frozen at -80 ° C. Similarly, material is collected from 10 patients (6 men, 4 women, age 35-55 years) with liver cirrhosis due to previous hepatitis C and from 9 patients with hepatocellular carcinoma (5 men, 4 women, age 45-55 years).
Затем следует этап выделения экзосомальной фракции микроРНК, для чего необходимы следующие действия: 1) проведение центрифугирования в режиме 2000 g в течение 20 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 2) проведение центрифугирования в режиме 10000 g в течение 30 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 3) проведение ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов при +4С.This is followed by the stage of isolation of the exosomal fraction of microRNA, for which the following steps are required: 1) centrifugation in the 2000 g mode for 20 minutes at room temperature and the supernatant is taken; 2) centrifugation at 10,000 g for 30 minutes at room temperature and the supernatant is collected; 3) ultracentrifugation in an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) at 100,000 g for 2 hours at + 4C.
Далее приступают к выделению свободных микроРНК: к надосадочной жидкости, образовавшейся на последнем (третьем) этапе выделения экзосом, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy serum/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.Next, the isolation of free microRNAs is started: 5 μl of proteinase K is added to the supernatant formed at the last (third) stage of exosome isolation, incubated at 56 ° C for 1 hour, then miRNeasy serum / plasma advanced kit "(Qiagen Q-217004) according to the standard protocol: applied to an Exiqon column, followed by centrifugation at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each wash, centrifugation is carried out at 2000 g on an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then 20 μl of nuclease-free water is applied to the column and the column is left for 10 minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3000 g on an Eppendorf 5104 centrifuge for 10 minutes at room temperature, after which carry out the reverse transcription reaction using the reverse transcription kit "miR CURY LNA RT Kit "(Qiagen-339340) by standard protocol.
Для выделения фракции экзосомальных микроРНК полученный на последнем (третьем) этапе выделения экзосом осадок разводят в 100 мкл безнуклеазной воды. К полученному раствору добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy serum/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.To isolate the fraction of exosomal miRNAs, the sediment obtained at the last (third) stage of exosome isolation is diluted in 100 μl of nuclease-free water. 5 μl of proteinase K is added to the resulting solution, incubated at 56 ° C for 1 hour, then miRNeasy serum / plasma advanced kit (Qiagen Q-217004) is isolated, then applied to an Exiqon column, after which centrifugation is carried out at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each wash, centrifugation is carried out at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then 20 μl of nuclease-free water and the column is left for 10 minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 10 minutes at room temperature, after which a reverse transcription reaction is carried out using a reverse transcription kit "miRCURY LNA RT Kit" ( Qiagen-339340) using the standard protocol.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием гепатоцеллюлярной карциномы: микроPHK-let-7a, микроРНК-18, микроРНК-21, микроРНК-22, микроРНК-26а, микроРНК-34а, микроРНК-101, микроРНК-103, микроРНК-106b, микроРНК-122, микроРНК-221, микроРНК-145, микроРНК-222, микроРНК-223, микроРНК-224, микроРНК-1246.Further, in order to identify individual types of microRNAs, a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection using the "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) on a 7500 Applied Biosystems device with primers for certain types of microRNAs associated with the development of hepatocellular carcinoma : microRNA-let-7a, miRNA-18, miRNA-21, miRNA-22, miRNA-26a, miRNA-34a, miRNA-101, miRNA-103, miRNA-106b, miRNA-122, miRNA-221, miRNA-145 , miRNA-222, miRNA-223, miRNA-224, miRNA-1246.
Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.Then, using the software supplied by the equipment manufacturer (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 02/29/2016), the amount of each of the studied microRNAs isolated from each fraction is calculated, the data obtained are presented in table format.
Затем проводят расчет поправочных коэфициентов для каждой микроРНК. Значения поправочных коэффициентов отображены в табл.№1.Then, the correction factors are calculated for each microRNA. The values of the correction factors are shown in table No. 1.
Расчет коэффициента, отражающего развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С происходит по формуле 1, приведенной выше.The calculation of the coefficient reflecting the development of hepatocellular carcinoma in patients with liver cirrhosis due to hepatitis C is carried out according to formula 1 above.
Значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК отражены в табл. №2.The values of the expression levels of exosomal miRNAs are shown in table. # 2.
Полученные коэффициенты отражены в табл. №3The obtained coefficients are reflected in table. No. 3
Пример 2. Определение уровней экспрессии микроРНК в слюне различных групп пациентов и здоровых доноров.Example 2. Determination of the levels of expression of miRNA in saliva of various groups of patients and healthy donors.
У 10 здоровых доноров (возраст 35-55 лет, 5 мужчин, 5 женщин) в амбулаторных условиях производят забор слюны следующим образом: ватную палочку держат в ротовой полости в течение 45-60 с в районе выхода протоков поднижнечелюстной слюнной железы, после чего палочку вытаскивают и помещают в чистый бумажный конверт. Аналогичным образом производят забор материала у 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщины, возраст 35-55 лет) с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С и у 9 пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (5 мужчин, 4 женщины, возраст 45-55 лет).Saliva is collected from 10 healthy donors (age 35-55 years, 5 men, 5 women) on an outpatient basis as follows: a cotton swab is held in the oral cavity for 45-60 s in the region of the outlet of the ducts of the submandibular salivary gland, after which the stick is pulled out and placed in a clean paper envelope. Similarly, material is collected from 10 patients (6 men, 4 women, age 35-55 years) with liver cirrhosis due to previous hepatitis C and from 9 patients with hepatocellular carcinoma (5 men, 4 women, age 45-55 years).
Затем следует этап выделения экзосомальной фракции микроРНК, для чего необходимы следующие действия: 1) ватную палочку извлекают из контейнера, помещают в физиологический раствор объем 500 мкл на 1 час; 2) проводят центрифугирование в режиме 2000 g в течение 20 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 3) проводят центрифугирование в режиме 10000 g в течение 30 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 4) проводят ультрацентрифугирование на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 2-х часов при +4С.This is followed by the stage of isolation of the exosomal fraction of microRNA, for which the following actions are necessary: 1) the cotton swab is removed from the container, a volume of 500 μl is placed in physiological solution for 1 hour; 2) centrifugation is carried out in the mode of 2000 g for 20 minutes at room temperature and the supernatant is taken; 3) centrifugation is carried out in the mode of 10000 g for 30 minutes at room temperature and the supernatant is taken; 4) ultracentrifugation is carried out in an Avanti 301 centrifuge (JA-30.50 rotor) at 100,000 g for 2 hours at + 4C.
Далее приступают к выделению свободных микроРНК: к надосадочной жидкости, образовавшейся на последнем (четвертом) этапе выделения экзосом, добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy serum/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.Next, they begin to isolate free microRNAs: 5 μl of proteinase K is added to the supernatant formed at the last (fourth) stage of exosome isolation, incubated at 56 ° C for 1 hour, then miRNeasy serum / plasma advanced kit "(Qiagen Q-217004) according to the standard protocol: applied to an Exiqon column, followed by centrifugation at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each wash, centrifugation is carried out at 2000 g on an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then 20 μl of nuclease-free water is applied to the column and the column is left for 10 minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3000 g on an Eppendorf 5104 centrifuge for 10 minutes at room temperature, after which carry out the reverse transcription reaction using the reverse transcription kit "m iRCURY LNA RT Kit "(Qiagen-339340) by standard protocol.
Для выделения фракции экзосомальных микроРНК полученный на последнем (четвертом) этапе выделения экзосом осадок разводят в 100 мкл безнуклеазной воды. К полученному раствору добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy serum/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.To isolate the fraction of exosomal miRNAs, the sediment obtained at the last (fourth) stage of exosome isolation is diluted in 100 μl of nuclease-free water. 5 μl of proteinase K is added to the resulting solution, incubated at 56 ° C for 1 hour, then miRNeasy serum / plasma advanced kit (Qiagen Q-217004) is isolated, then applied to an Exiqon column, after which centrifugation is carried out at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then the column is washed 3 times with washing buffer, after each wash, centrifugation is carried out at 2000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 5 minutes at room temperature, then 20 μl of nuclease-free water and the column is left for 10 minutes at room temperature, then centrifugation is carried out at 3000 g in an Eppendorf 5104 centrifuge for 10 minutes at room temperature, after which a reverse transcription reaction is carried out using a reverse transcription kit "miRCURY LNA RT Kit" ( Qiagen-339340) using the standard protocol.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием гепатоцеллюлярной карциномы: микроPHK-let-7a, микроРНК-18, микроРНК-21, микроРНК-22, микроРНК-26а, микроРНК-34а, микроРНК-101, микроРНК-103, микроРНК-106b, микроРНК-122, микроРНК-221, микроРНК-145, микроРНК-222, микроРНК-223, микроРНК-224, микроРНК-1246.Further, in order to identify individual types of microRNAs, a polymerase chain reaction is carried out with real-time detection using the "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) on a 7500 Applied Biosystems device with primers for certain types of microRNAs associated with the development of hepatocellular carcinoma : microRNA-let-7a, miRNA-18, miRNA-21, miRNA-22, miRNA-26a, miRNA-34a, miRNA-101, miRNA-103, miRNA-106b, miRNA-122, miRNA-221, miRNA-145 , miRNA-222, miRNA-223, miRNA-224, miRNA-1246.
Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.Then, using the software supplied by the equipment manufacturer (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 02/29/2016), the amount of each of the studied microRNAs isolated from each fraction is calculated, the data obtained are presented in table format.
Расчет коэффициента, отражающего развитие гепатоцеллюлярной карциномы у пациентов с циррозом печени вследствие перенесенного гепатита С происходит по формуле 1.The calculation of the coefficient reflecting the development of hepatocellular carcinoma in patients with liver cirrhosis due to hepatitis C is carried out according to formula 1.
Значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК отражены в табл. №4.The values of the expression levels of exosomal miRNAs are shown in table. No. 4.
Полученные коэффициенты отражены в табл. №5The obtained coefficients are reflected in table. # 5
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020141366A RU2760937C1 (en) | 2020-12-15 | 2020-12-15 | Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020141366A RU2760937C1 (en) | 2020-12-15 | 2020-12-15 | Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2760937C1 true RU2760937C1 (en) | 2021-12-01 |
Family
ID=79174101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020141366A RU2760937C1 (en) | 2020-12-15 | 2020-12-15 | Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2760937C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110223607A1 (en) * | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Circulating microrna as a marker for hepatocellular carcinoma |
| CN104293914A (en) * | 2014-09-05 | 2015-01-21 | 镇江市第三人民医院 | MiRNA marker combination for detecting primary hepatocellular carcinoma serum and application thereof |
-
2020
- 2020-12-15 RU RU2020141366A patent/RU2760937C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110223607A1 (en) * | 2010-03-12 | 2011-09-15 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Circulating microrna as a marker for hepatocellular carcinoma |
| CN104293914A (en) * | 2014-09-05 | 2015-01-21 | 镇江市第三人民医院 | MiRNA marker combination for detecting primary hepatocellular carcinoma serum and application thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КАРЕВ В.Е. Клинические и иммунологические аспекты патогенеза хронической HBV и HCV инфекции, авто диссертации, Санкт-Петербург, 2016, весь документ. * |
| КАРЕВ В.Е. Клинические и иммунологические аспекты патогенеза хронической HBV и HCV инфекции, автореферат диссертации, Санкт-Петербург, 2016, весь документ. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9909190B2 (en) | Method for assisting detection of pancreatic cancer | |
| CN108441552B (en) | One kind serum/plasma miRNA marker relevant to intrahepatic cholestasis of pregnancy auxiliary diagnosis and its application | |
| CN109735612B (en) | Biomolecular markers and kits for Kawasaki disease coronary artery aneurysm complications | |
| RU2760937C1 (en) | Method for diagnosing hepatocellular carcinoma by determining coefficient of development of hepatocellular carcinoma based on changes in t levels of microrna expression in human blood plasma and saliva | |
| KR102492149B1 (en) | MicroRNA-1246 for diagnosing of ovarian cancer and use thereof | |
| CN106987634B (en) | Application of plasma exogenic miRNAs in preparation of kit for early diagnosis of primary liver cancer | |
| CN120290726A (en) | A blood marker for diagnosing cervical cancer and its application | |
| CN111321224A (en) | miRNA biomarker combination for diagnosis or auxiliary diagnosis of gastric cancer and kit thereof | |
| CN102021169A (en) | Serum/plasma miRNA composition and use thereof | |
| CN114231626B (en) | Application of a miRNA combined marker in the preparation of a kit for diagnosing and detecting early liver cancer | |
| CN106636451B (en) | A biomarker for detecting coronary occlusion and stenosis, its preparation method and kit containing the same | |
| EP4010498B1 (en) | Method for diagnosing breast cancer | |
| CN116987779A (en) | Application of LLGL2 gene as biomarker in differential diagnosis of tuberculosis | |
| CN109266750A (en) | Biomarker for nasopharyngeal carcinoma diagnosis and application | |
| CN108384848B (en) | Application of circ _0021132 in serum as diagnostic marker of deep vein thrombosis | |
| CN107254522A (en) | Application of the miR 664a 5p detection reagent in diagnosing cancer of liver reagent/kit is prepared | |
| CN115109851A (en) | A miRNA quantitative PCR detection kit for early gastric cancer screening | |
| CN109266751B (en) | Biomarker combination for nasopharyngeal carcinoma diagnosis and application | |
| CN108424960B (en) | Application of a lncRNA as a diagnostic marker for deep vein thrombosis | |
| CN118006761B (en) | Exosome miRNA (micro ribonucleic acid) as molecular marker for diagnosing heart disease complicated with heart failure and application thereof | |
| CN113718028A (en) | micro-RNA based preeclampsia diagnostic application and composition | |
| CN119662833B (en) | Luminal type breast cancer bone metastasis marker based on circCCDC in tumor vesicle and predictive diagnosis kit | |
| CN116515995B (en) | Serum microRNA marker for detecting hemophagocytic lymphocytohyperplasia and application thereof | |
| CN111471762A (en) | Coronary heart disease nucleic acid molecular marker and primer and application thereof | |
| CN114657251B (en) | Application of exosome miRNA-485-3p and miRNA-885-5p as liver cancer diagnosis markers |