RU2755392C1 - Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах - Google Patents
Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2755392C1 RU2755392C1 RU2021105108A RU2021105108A RU2755392C1 RU 2755392 C1 RU2755392 C1 RU 2755392C1 RU 2021105108 A RU2021105108 A RU 2021105108A RU 2021105108 A RU2021105108 A RU 2021105108A RU 2755392 C1 RU2755392 C1 RU 2755392C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cats
- dogs
- fgfr1
- hybridization
- minutes
- Prior art date
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 title description 5
- 101100227089 Danio rerio fgfr1a gene Proteins 0.000 title 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 23
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims abstract description 17
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 15
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 claims abstract description 9
- 101150016624 fgfr1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims abstract description 5
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 3
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims description 5
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003973 Fibroblast growth factor 21 Human genes 0.000 description 2
- 108090000376 Fibroblast growth factor 21 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009595 pap smear Methods 0.000 description 2
- 208000004019 papillary adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000037396 Intraductal Noninfiltrating Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010073094 Intraductal proliferative breast lesion Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000028715 ductal breast carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 201000007273 ductal carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Предложен способ флюоресцентной гибридизации in situ на цитологических препаратах собак и кошек. Осуществляют забор цитологического материала из опухолей молочных желез собак и кошек при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии. Проводится фиксация живых клеток в 96% спирте с последующей сушкой при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее наносится ДНК-зонд FGFR1 с последующей денатурацией в автоматической FISH-системе в течение 5 мин при 80°С и гибридизацией при 37°С в течение 18 ч у собак и 16 ч у кошек. Предметные стекла помещают в термостат при температуре 25°С, где время выдержки предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 мин, для кошек составляет 15 мин. Количество клеток со свечением исследуемого гена FGFR1 у собак занимают более 10% от общей площади, в них количество флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 составляет от 2 до 5. Количество клеток со свечением флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 у кошек составляет от 3 до 4. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностики при определении онкологического процесса. 4 ил., 5 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к лабораторной диагностике и может быть использовано для получения цитогенетических препаратов, материал которого отобран от тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ). Это основано на применении тест-системы из специальных ДНК-зондов с меткой FGFR1 для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization - FISH).
Уровень техники
Известен способ выполнения комбинированного иммунологического и генетического исследования клеток, получивший название M-FICTION анализа (multicolor fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for the investigation of neoplasms), взятый в качестве прототипа, (см., например, J.I. Martin-Subero, I. Chudoba, L. Harder, S. Gesk, W. Grote, F.J. Novo, M. J. Calasanz, and R. Siebert "Multicolor-FICTION Expanding the Possibilities of Combined Morphologic, Immunophenotypic, and Genetic Single Cell Analyses" / Am J Pathol. 2002 August; 161(2): 413-420.) Данный способ заключается в том, что клетки (находящиеся на поверхности предметного стекла) обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными антителами, специфичными к их антигенам, отмывают, фиксируют, дегидратируют (с помощью растворов этилового спирта с возрастающими концентрациями) и высушивают. Затем те же клетки обрабатывают одним или несколькими флуоресцентно-меченными ДНК-зондами, комплиментарными к известным нуклеотидным последовательностям. Осуществляют денатурацию ДНК и гибридизацию, в результате которой каждый меченный зонд связывается с комплементарным ему участком гена. Затем выполняют отмывку. Проводят исследование препарата с помощью флуоресцентного микроскопа с наборами светофильтров, позволяющих определить флуоресценцию каждой используемой метки, а также при необходимости определить взаимное расположение меток. Может быть также получено трехмерное изображение каждой клетки. Для этого получают серию последовательных изображений, при разных расстояниях объектива микроскопа и осуществляют их компьютерную обработку. Проведение подобного анализа дает возможность одновременного обнаружения морфологических, иммунофенотипических, и генетических особенностей одних и тех же клеток.
Недостатком способа является большой расход дорогостоящих флуоресцентно- меченных антител при определении антигенов клеток, имеющих поверхностную локализацию. При этом невозможно проведение исследования с использованием немеченых антител, имеющих меньшую стоимость. Кроме того, вследствие ограниченного числа одновременно используемых флуоресцентных меток на разных клетках может быть определено лишь небольшое число поверхностных антигенов, что ограничивает число одновременное определяемых иммунологических субпопуляций клеток.
Известен «Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации» (патент RU 2490635), при котором суспензии фиксированных клеток в объеме 5 мкл наносят на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично приклеенной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм2. Прилепляют полоску парафильма к предметному стеклу, нагревая стекло с парафильмом при температуре 60°С и одновременно раскатывая валиком в течение 3-5 сек. Впоследствии указанную полоску вместе с предметным стеклом нагревают при 95°С в течение 2 мин и затем сдирают ее со стекла.
Недостатком способа является трудоемкость, а также то, что в пределах одной лунки у исследователя нет возможности выбрать лучшую область для гибридизации.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ, при котором FISH-реакцию проводят на традиционном мазке из шейки матки (мазок Папаниколау), представленный в статье Heselmeyer-Haddad K. и соавт. (Heselmeyer-Haddad K., Sommerfeld K., White N.M. et al. Genomic amplification of the Human Telomerase Gene (TERC) in Pap smears predicts the evelopment of cervical cancer/American Journal of Pathology, 2005, Vol. 166, №. 4, p. 1229-1238, doi: 10.1016/S0002-9440(10)62341-3). В способе сначала выполняют цитологическое исследование, для чего все мазки фиксируют, окрашивают согласно стандартным процедурам и заливают специальным клеем под покровное стекло. Когда препараты подготавливают для выполнения FISH, то покровные стекла удаляют путем инкубации препаратов в ксилоле в течение 2-4 дней, затем препараты дважды промывают в ксилоле, дегидратируют и обесцвечивают в смеси 0,5% HCl и 70% этанола в течение 1-2 часов.
Недостатки способа заключаются в неравномерном распределении клеток на предметном стекле, многослойности, потере клеток при фиксации, наличии элементов, приводящих к высокой фоновой флуоресценции, а также длительному (в течение нескольких суток) обработки исследуемого материала.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемого изобретения является разработка тест-системы для исследования и определения редких злокачественных типов опухолей молочной железы.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого способа, сводится к повышению точности диагностики при определении онкологического процесса.
Технический результат достигается с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах, включающий забор при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) цитологического материала из опухолей молочных желез у животных, путем выдавливания живых клеток на предметное стекло, при этом проводится фиксация в 96% спирте с последующей сушкой при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe), с последующей денатурацией в автоматической FISH- системе в течение 5 минут при 80°С и гибридизацией при 37°С 16-18 часов, затем проводят отмывание буферными растворами в течение 3 минут, наносят флюоресцентный краситель DAPI;
Ген, кодирующий FGFR1, локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8р11.23), при наличии опухолевой патологии данный ген подвергается многообразным изменениям, в том числе амплификации и мутации в различных экзонах. FGF21 - циркулирующий белок, состоящий из 181 аминокислот.FGF21 принадлежит к суперсемейству факторов роста фибробластов (FGF), которое получило название в связи со способностью стимулировать пролиферацию фибробластов. Факторы роста фибробластов имеют широкий спектр биологических функций, включая клеточный рост, ангиогенез, процессы регенерации и обмен веществ.
В настоящее время в опубликованных источниках отсутствуют какие-либо данные о применении флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 при раке молочной железы у лабораторных (крысы) и домашних млекопитающих (кошка, собака) животных.
Краткое описание чертежей и иных материалов
На фиг. 1 ген, кодирующий FGFR1, который локализуется на хромосоме 8 в локусе p11.23 (8р11.23);
На фиг. 2 сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона. ТИАБ из новообразований молочной железы у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр FITC (зеленое свечение). Ок. 15, об. 100;
На фиг. 3 сигнал Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1) в клетке фибробластического дифферона у собаки. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Фильтр Texas Red (красное свечение). Ок. 15, об. 100;
На фиг. 4 Количество клеток с сигналами гена FGFR1.
Осуществление изобретения
Исследования проводят на базе Научно-диагностического и лечебного ветеринарного центра ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» в гистологической лаборатории.
Цитологическое исследование материла, отобранного от тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) из опухолей молочной железы, осуществляют следующим образом: при помощи шприца выдавливают живые клетки на предметное обезжиренное стекло, оставляют препараты сохнуть на воздухе в течение 20 минут. Фиксацию материала проводят путем протекания 96% этилового спирта по предметному стеклу, сушат стекло в вертикальном положении при комнатной температуре 10 минут. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят маркером местоположение материала. На каждое клеточное пятно наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) по 1,5 мкл гибридизационной смеси FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe). Такой объем полностью покрывает цитологический материал, что позволяет сократить используемую гибридизационную смесь FGFR1 (Breakapart/Amplification Probe) и получить больше образцов за одно исследование, по сравнению с указанным объемом в протоколе, в котором на предметное стекло наносится 10 мкл.
Далее накрывают каждый цитологический материал квадратным покровным 24×24 мм2 стеклом и наносят по краям покровного стекла универсальный резиновый клей Момент «Кристалл» для герметизации, который согласно проведенным исследованиям имеет высокую прочность склеивания, водостойкость клеевого соединения, теплостойкость и легкое снятие без повреждения исследуемого цитологического материала после проведения денатурации и гибридизации.
Проводят денатурацию на автоматической FISH-гибридизационной системе «ThermoBrite» (кампания StatSpin), устанавливают стекла на пластину и вставляют две увлажняющие полоски, смоченные в ультрачистой ионизированной воде, в держатели на внутренней стороне крышки. Далее устанавливают программу «Денатурация и Гибридизация». Денатурация - это когда молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. При реакции гибридизации происходит взаимодействие ДНК-зонда и комплементарным ему участком ядерной ДНК материала.
Денатурируют материал при 80°С - 5 минут. Потом происходит автоматическое охлаждение столика, на котором расположены предметные стекла, после чего происходит автоматическая гибридизация. При гибридизации инкубируют препараты в течение 18 часов при температуре 37°С у собак и 16 часов при температуре 37°С у кошек, в связи с разным сцеплением белков с ДНК-зондом.
После гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло. Затем следует отмывка, которая включает внесение предметных стекол в предварительно нагретый до 72°С отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 (0,4 × SSC / 0,3% lgepal) на 2 минуты. После чего стекла быстро (чтобы не высохли клетки) промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером (для предотвращения растекания реактивов). Далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 20 мкм буфера Wash Buffer 2 (2 × SSC / 0,1% lgepal) на 1 минуту. Промакивают препараты одноразовыми бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки (Eppendorf Reference 2, 0,5-10 мкл) 15 мкл контрастирующего красителя DAPI (Antifadec0.1), содержащий флюорохромом, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×24 мм2.
После этого помещают в термостат при температуре 25°С, что время выдержки в термостате предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 минут, для кошек составляет 15 минут. Затем предметные стекла с исследуемым цитологическим материалом помещают под темную светонепроницаемую пластину, после чего поочередно анализируют каждый препарат при помощи флюоресцентного микроскопа, остальные стекла с материалом остаются под темной светонепроницаемой пластиной для избежание попадания света, что влияет на экспрессию свечения.
Таким образом, время на проведение FISH-реакции составляет примерно 19 часов.
Результаты цитологического исследования. Материал, полученный от собак под номерами №1, 2, 5 показал, что количество клеток с свечением исследуемого гена FGFR1 занимают более 10% от общей площади. В них количество флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 регистрировалось от 2 до 5. Свечения сигналов имеют выраженную экспрессию, что является признаком амплификации гена в клетках фибробластического дифферона, их активной пролиферации и синтеза белка коллагена.
Для верификации предложенного способа было проведено патогистологическое исследование опухолей молочных желез у собак, при котором были диагностированы такие новообразования, как инфильтративный рак неспецифического типа (G3), папиллярная аденокарцинома, плеоморфная аденокарцинома.
Материал, полученный от кошек под номерами №6, 9 показал, что количество клеток с свечением флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 регистрировалось от 3 до 4. Свечения сигналов были выражены, что говорит об амплификации гена FGFR1 в клетках фибробластического дифферона.
Для верификации предложенного способа было проведено патогистологическое исследование опухолей молочных желез у кошек, при котором были диагностированы такие новообразования, как папиллярная аденокарцинома, протоковая карцинома in situ.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- непродолжительное время обработки материала;
-уменьшение количества артефактов, за счет сохранения целостности самой опухоли во время отбора материала;
- высокая оценка флюоресцентного сигнала в целых неповрежденных мембранах ядра клеточного материала;
- выполнение FISH на препаратах, полученных от ТИАБ при злокачественных опухолях молочной железы у лабораторных и домашних млекопитающих животных;
-снижение стоимости цитологического препарата за счет малого расхода жидких реактивов и буферов.
Claims (1)
- Способ флюоресцентной гибридизации in situ на цитологических препаратах собак и кошек, включающий забор при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ) цитологического материала из опухолей молочных желез у собак и кошек путем выдавливания живых клеток на предметное стекло, при этом проводится фиксация в 96% спирте с последующей сушкой при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего наносится ДНК-зонд FGFR1, с последующей денатурацией в автоматической FISH-системе в течение 5 мин при 80°С и гибридизацией при 37°С в течение 18 ч у собак и 16 ч у кошек, после гибридизации удаляют клей с краев покровного стекла и при помощи гистологической иглы снимают стекло; затем следует отмывка, которая включает внесение предметных стекол в предварительно нагретый до 72°С отмывочный буфер Prewarm Wash Buffer 1 на 2 мин; после чего стекла промакивают вокруг исследуемых зон одноразовыми бумажными полотенцами для создания сухого поля вокруг материала и наносят гидрофобный слой восковым маркером; далее наносят при помощи 1-канальной автоматической пипетки 20 мкл буфера Wash Buffer 2 на 1 мин; промакивают препараты одноразовыми бумажными полотенцами и наносят с помощью автоматической пипетки 15 мкл контрастирующего красителя DAPI, содержащего флюорохром, после чего накрывают каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×24 мм2; после этого предметные стекла помещают в термостат при температуре 25°С, где время выдержки предметных стекол с флюорохромом для собак составляет 10 мин, для кошек составляет 15 мин, количество клеток со свечением исследуемого гена FGFR1 у собак занимают более 10% от общей площади, в них количество флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 составляет от 2 до 5; количество клеток со свечением флюоресцирующих сигналов фильтров Texas Red красного и FITC зеленого свечений гена FGFR1 у кошек составляет от 3 до 4.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021105108A RU2755392C1 (ru) | 2021-02-25 | 2021-02-25 | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021105108A RU2755392C1 (ru) | 2021-02-25 | 2021-02-25 | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2755392C1 true RU2755392C1 (ru) | 2021-09-15 |
Family
ID=77745661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021105108A RU2755392C1 (ru) | 2021-02-25 | 2021-02-25 | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2755392C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777238C1 (ru) * | 2021-12-20 | 2022-08-01 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2410663C1 (ru) * | 2009-09-14 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации |
| RU2490635C1 (ru) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации |
| WO2014088744A1 (en) * | 2012-12-04 | 2014-06-12 | General Electric Company | Systems and methods for using an immunostaining mask to selectively refine ish analysis results |
-
2021
- 2021-02-25 RU RU2021105108A patent/RU2755392C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2410663C1 (ru) * | 2009-09-14 | 2011-01-27 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Способ приготовления препаратов клеток для флуоресцентной in situ гибридизации |
| RU2490635C1 (ru) * | 2012-04-12 | 2013-08-20 | Федеральное государственное учреждение "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" | Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации |
| WO2014088744A1 (en) * | 2012-12-04 | 2014-06-12 | General Electric Company | Systems and methods for using an immunostaining mask to selectively refine ish analysis results |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HESELMEYER-HADDAD K. et al. Genomic amplification of the Human Telomerase Gene (TERC) in Pap smears predicts the evelopment of cervical cancer. American Journal of Pathology. 2005; 166 (4): 1229-1238. * |
| HESELMEYER-HADDAD K. et al. Genomic amplification of the Human Telomerase Gene (TERC) in Pap smears predicts the evelopment of cervical cancer. American Journal of Pathology. 2005; 166 (4): 1229-1238. MARTIN-SUBERO J.I. et al. Multicolor-FICTION Expanding the Possibilities of Combined Morphologic, Immunophenotypic, and Genetic Single Cell Analyses. Am J Pathol. 2002 August; 161 (2): 413-420. * |
| MARTIN-SUBERO J.I. et al. Multicolor-FICTION Expanding the Possibilities of Combined Morphologic, Immunophenotypic, and Genetic Single Cell Analyses. Am J Pathol. 2002 August; 161 (2): 413-420. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2777238C1 (ru) * | 2021-12-20 | 2022-08-01 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ventura et al. | FISH analysis for the detection of lymphoma-associated chromosomal abnormalities in routine paraffin-embedded tissue | |
| JP7125418B2 (ja) | 蛍光画像における標的分子密度決定 | |
| US7660454B2 (en) | Process for identifying FISH signals | |
| JP2003510571A (ja) | 組織試料中の分子標的の臨床的有用性を評価するための高処理量システム | |
| KR20150090278A (ko) | 암 또는 고등급 과형성증 세포의 자동화된 스크리닝 방법 | |
| Zhang et al. | Application of immunohistochemistry technique in hydrobiological studies | |
| CA2620137A1 (en) | Method for detecting and quantitating multiple subcellular components | |
| Huber et al. | Micro fluorescence in situ hybridization (μFISH) for spatially multiplexed analysis of a cell monolayer | |
| CN106980018B (zh) | 一种应用cd45免疫荧光联合cep17探针鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒及其应用 | |
| US10718694B2 (en) | Counterstains for a biological sample | |
| CN103114128A (zh) | 一种新型高分辨定量多色荧光原位杂交方法及其应用 | |
| Weremowicz | Preparation of cells from formalin‐fixed, paraffin‐embedded tissue for use in fluorescence in situ hybridization (FISH) experiments | |
| WO2019005902A1 (en) | SYSTEM AND METHODS FOR DIAGNOSING QUANTITATIVE LIQUID BIOPSY | |
| RU2755392C1 (ru) | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда FGFR1 у разных видов млекопитающих на цитологических препаратах | |
| CN111004838A (zh) | 骨髓涂片荧光原位杂交技术在多发性骨髓瘤中的应用 | |
| Darnell et al. | Dynamic labeling techniques for fate mapping, testing cell commitment, and following living cells in avian embryos | |
| US20240375114A1 (en) | Biological sample holder and handler | |
| US6861218B2 (en) | Method for the targeted application of reagents onto immobilized biological material | |
| RU2777238C1 (ru) | Способ флюоресцентной гибридизации in situ при применении ДНК-зонда с меткой FGFR1 у разных видов млекопитающих на гистологических препаратах | |
| MacKinnon et al. | The use of M-FISH and M-BAND to define chromosome abnormalities | |
| US12181390B2 (en) | Substance labeling patch, method and apparatus for tissue diagnosis using the same | |
| RU2706220C1 (ru) | Способ получения цитогенетических препаратов клеток эпителия для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации | |
| Sharifah et al. | FISH analysis using PPAR γ-specific probes for detection of PAX8-PPAR γ translocation in follicular thyroid neoplasms | |
| Deng et al. | Histology Revolution: From Inefficient, Two-Dimensional, and Low-Resolution Techniques to High-Throughput, Three-Dimensional and High-Resolution Techniques | |
| Liu | Pathological Techniques |