RU2754276C2 - Композиция кормовой добавки - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к кормовым добавкам. Композиция кормовой добавки, по сути состоящая из микробного препарата для приема в пищу, содержащего штаммы Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510), 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) в комбинации с по меньшей мере одной протеазой, представляющей собой субтилизин, где композиция кормовой добавки не содержит каких-либо дополнительных ферментов, кроме протеазы, представляющей собой субтилизин. Композиция кормовой добавки используется в способе улучшения усвояемости сырья в корме. Предлагаемая композиция кормовой добавки позволяет обеспечить прирост веса животного, иммунную стимуляцию желудочно-кишечного тракта, сокращение популяции патогенов в желудочно-кишечном тракте, а также снизить выделение питательных веществ в навозе и уменьшить образование аммиака в навозе. 6 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 ил., 31 табл., 8 пр.

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/253089, поданной 9 ноября 2015 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область настоящего изобретения относится к композиции кормовой добавки, содержащей микробные препараты для приема в пищу, которые содержат один или несколько бактериальных штаммов в комбинации с одной или несколькими протеазами, а также к способам, наборам и путям их применения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Микробные препараты для приема в пищу (DFM) или пробиотики представляют собой биологически активные добавки, которые подавляют желудочно-кишечную инфекцию и обеспечивают оптимально отрегулированную микробную среду в пищеварительном тракте. Обеспокоенность в отношении применения антибиотиков в отрасли кормов для животных привела к изучению альтернатив для предупреждения заболевания. DFM можно применять в качестве противомикробных заменителей и, таким образом, сократить потребность в антибиотиках в корме для животных. DFM могут также соперничать с патогенами и подавлять их рост, стимулировать иммунную функцию и модулировать баланс микробиоты в желудочно-кишечном тракте. DFM включают бактерии для приема в пищу и продукты на основе дрожжей. Было обнаружено, что комбинация DFM с одним или несколькими ферментами может улучшать характеристики продуктивности использования питательных веществ у животных.

В патентной публикации США 2013/0330307, опубликованной 12 декабря 2013 г., раскрывается композиция кормовой добавки, содержащая микробный препарат для приема в пищу в комбинации с протеазой и фитазой, а также способ улучшения характеристик продуктивности у животных.

В патентной публикации США 2014/0234279, опубликованной 21 августа 2014 г., раскрывается композиция кормовой добавки, содержащая микробный препарат для приема в пищу в комбинации с протеазой, ксиланазой, амилазой и фитазой, а также способ улучшения характеристик продуктивности у животных.

В патенте США № 8722058, выданном Rehberger et al. 13 мая 2014 г., описывается способ кормления животного одним или несколькими штаммами Bacilllus, выбранными из группы, состоящей из 3A-P4 ATCC PTA-6506, 15A-P4 ATTC PTA-6507 и 22C-P1 ATCC PTA-6508.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте раскрывается композиция кормовой добавки, по сути, состоящая из микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой.

Во втором аспекте микробный препарат для приема в пищу представляет собой антипатогенный микробный препарат для приема в пищу.

В третьем аспекте микробный препарат для приема в пищу содержит по меньшей мере три бактериальных штамма, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium и Megasphaera и их комбинаций.

В четвертом аспекте микробный препарат для приема в пищу содержит по меньшей мере три бактериальных штамма, выбранных из группы, состоящей из Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus, Enterococcus spp и Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp и их комбинаций.

В пятом аспекте микробный препарат для приема в пищу содержит штаммы 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) Bacillus subtilis.

В шестом аспекте микробный препарат для приема в пищу может находиться в форме эндоспоры.

В седьмом аспекте композиция кормовой добавки также содержит по меньшей мере одну протеазу, которая представляет собой субтилизин, бациллолизин, щелочную сериновую протеазу, кератиназу или протеазуNocardiopsis.

В восьмом аспекте по меньшей мере одна протеаза представляет собой субтилизин из Bacillus amyloliquefaciens.

В девятом аспекте по меньшей мере одна протеаза в композиции кормовой добавки присутствует в дозировке от 1000 PU/г композиции кормовой добавки до 200000 PU/г композиции кормовой добавки.

В десятом аспекте DFM в композиции кормовой добавки присутствует в дозировке от 1×10³ КОЕ/г композиции кормовой добавки до 1×10¹³ КОЕ/г композиции кормовой добавки.

В одиннадцатом аспекте раскрывается способ улучшения продуктивности субъекта, или улучшения усвояемости сырья в корме (например, усвояемость питательных веществ, такая как усвояемость аминокислот), или улучшения удержания азота, или улучшения резистентности субъекта к некротическому энтериту, или улучшения коэффициента кормоотдачи (FCR), или повышения выхода туши или мяса, или улучшения прироста веса тела у субъекта, или улучшения эффективности использования корма у субъекта, или модулирования (например, улучшения) иммунного ответа субъекта, или содействия росту полезных бактерий в желудочно-кишечном тракте субъекта, или сокращения популяций патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте субъекта, или уменьшения выделения питательных веществ с навозом, или уменьшения образования аммиака в навозе, или улучшения усвояемости или использования гемицеллюлозы и клетчатки из рациона, при этом способ предусматривает введение микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой.

В двенадцатом аспекте раскрывается набор, содержащий любую из композиций кормовой добавки, описанных в данном документе и инструкции по введению.

В тринадцатом аспекте раскрывается способ получения композиции кормовой добавки, предусматривающий получение смеси на основе микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой и упаковывание.

В четырнадцатом аспекте раскрывается корм, содержащий любую из композиций кормовой добавки, описанных в данном документе.

В пятнадцатом аспекте раскрывается премикс, содержащий любую из композиций кормовой добавки, описанных в данном документе, и по меньшей мере один минерал, и/или по меньшей мере один витамин.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фигуре 1 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы (P3000) при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста свиньи.

На фигуре 2 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста свиньи.

На фигуре 3 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на выделение аммиака с фекалиями.

На фигуре 4 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста свиньи.

На фигуре 5 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на концентрацию аммиака в фекалиях.

На фигуре 6 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу в комбинации или отдельно DFM на показатель роста свиньи.

На фигуре 7 показаны эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста свиньи.

На фигуре 8.1 показаны эффекты DFM на основе 3 штаммов Bacillus в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе соевой муки.

На фигуре 8.2 показаны эффекты DFM на основе одного штамма Bacillus licheniformis в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе соевой муки.

На фигуре 8.3 показаны эффекты DFM на основе одного штамма Bacillus pumilis в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе соевой муки.

На фигуре 8.4 показаны эффекты DFM на основе одного штамма Bacillus pumilis в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы.

На фигуре 8.5 показаны эффекты DFM на основе одного штамма Bacillus licheniformis в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы.

На фигуре 8.6 показаны эффекты DFM на основе одного штамма Lactobacillus reuteri в комбинации с протеазой на растворение белка in-vitro из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Все цитируемые патенты, заявки на патенты и публикации включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

В данном раскрытии используют ряд терминов и сокращений. Если четко не указано иное, то применяют следующие определения.

Подразумевается, что формы единственного числа элемента или компонента являются неограничивающими в отношении числа примеров (т.е. случаев) элемента или компонента. Поэтому формы единственного числа следует понимать как включающие одно или по меньшей мере одно, а форма единственного числа для обозначения элемента или компонента также включает множественное число, за исключением случаев, когда явно подразумевается единственное число.

Термин "включающий" означает наличие установленных признаков, целых чисел, стадий или компонентов, которые изложены в вариантах осуществления, но так, чтобы он не исключал наличие или добавление одного или нескольких признаков, целых чисел, стадий, компонентов или их групп. Термин "включающий" подразумевают как включающий варианты осуществления, охватываемые терминами "по сути состоящий из" и "состоящий из". Подобным образом, термин "по сути состоящий из" подразумевают как включающий варианты осуществления, охватываемые термином "состоящий из".

Все диапазоны, при наличии таковых, являются включающими и комбинируемыми. Например, при упоминании диапазона "от 1 до 5" упомянутый диапазон следует рассматривать как включающий диапазоны "от 1 до 4", "от 1 до 3", "1-2", "1-2 и 4-5", "1-3 и 5" и т. п.

Используемый в данном документе в отношении числового значения термин "приблизительно" относится к диапазону +/- 0,5 от числового значения, если указанный термин иным образом конкретно не определен в контексте. Например, фраза "значение pH, составляющее приблизительно 6" относится к значениям pH от 5,5 до 6,5, если конкретно не определено иное значение pH.

Подразумевается, что каждая максимальная числовая граница, раскрываемая в настоящем описании, включает каждую нижнюю числовую границу, как если бы такие нижние числовые границы были бы явно приведены в данном документе. Каждая минимальная числовая граница, раскрываемая в настоящем описании, будет включать каждую верхнюю числовую границу, как если бы такие верхние числовые границы были бы явно приведены в данном документе. Каждый числовой диапазон, приведенный в настоящем описании, будет включать каждый более узкий числовой диапазон, который находится в пределах такого более широкого числового диапазона, как если бы такие более узкие числовые диапазоны были явно приведены в данном документе.

Термины "животное" и "субъект" применяются в данном документе взаимозаменяемо. Животное включает всех нежвачных (включая людей) и жвачных животных. В конкретном варианте осуществления животное представляет собой нежвачное животное, такое как лошадь и животное с однокамерным желудком. Примеры животных с однокамерным желудком включают без ограничения свиней и домашних свиней, таких как поросята, выращиваемые свиньи, свиноматки; птицу, такую как индюшки, утки, куры, бройлерные цыплята, несушки; рыбу, такую как лосось, форель, тилапия, сомы и карпы; и ракообразные, такие как мелкие креветки и крупные креветки. В дополнительном варианте осуществления животное представляет собой жвачное животное, в том числе без ограничения крупный рогатый скот, молодых телят, коз, овец, жирафов, бизонов, лосей, вапити, яков, индийских буйволов, оленей, верблюдов, альпак, лам, антилоп, вилорогов и антилоп-нилгау.

Используемый в данном документе термин "патоген" означает любого возбудителя заболевания. Такие возбудители могут включать без ограничения бактериальных, вирусных, грибковых возбудителей и т. п.

"Корм" и "пищевой продукт", соответственно, означают любой натуральный или искусственный рацион, еду или подобное или компоненты такой еды, предназначенные или пригодные для употребления в пищу, принятия, переваривания животным, отличным от человека, и человеком, соответственно.

Используемый в данном документе термин "пищевой продукт" применяется в широком смысле и охватывает пищевой продукт и продукты питания для людей, а также пищевой продукт для животных, отличных от человека (т.е. корм).

Термин "корм" используется в отношении продуктов, которыми кормят животных при выращивании сельскохозяйственных животных. Термины "корм" и "корм для животных" используются взаимозаменяемо.

Используемый в данном документе термин "микробный препарат для приема в пищу" ("DFM") представляет собой источник живых (жизнеспособных) встречающихся в природе микроорганизмов. DFM может содержать один или несколько таких встречающихся в природе микроорганизмов, таких как бактериальные штаммы. Категории DFM включают Bacillus, молочнокислые бактерии и дрожжи. Бациллы представляют собой уникальные грамположительные палочки, которые образуют споры. Эти споры очень стабильны и могут выдерживать такие условия окружающей среды, как тепло, влагу и определенный диапазон рН. Эти споры прорастают в активные вегетативные клетки при проглатывании животным и могут быть использованы в тонкоизмельченных и гранулированных рационах. Молочнокислые бактерии представляют собой грамположительные кокки, продуцирующие молочную кислоту, которые являются антагонистами патогенов. Поскольку молочнокислые бактерии, по-видимому, до некоторой степени являются чувствительными к нагреванию, их не используют в гранулированных рационах. Молочнокислые бактерии включают род Bifidobacterium, Lactobacillus и Streptococcus. Дрожжи не являются бактериями. Эти микроорганизмы относятся к растительной группе грибов. Таким образом, термин DFM охватывает одно или несколько из следующего: бактерии для приема в пищу, дрожжи для приема в пищу, дрожжи для приема в пищу и их комбинации.

Термин "пребиотик" обозначает неперевариваемый ингредиент пищевого продукта, который благоприятно воздействует на хозяина путем избирательного стимулирования роста и/или активности одной или ограниченного числа полезных бактерий.

Используемый в данном документе термин "пробиотическая культура" определяет живые микроорганизмы (в том числе, например, бактерии или дрожжи), которые, например, при приеме внутрь или местном применении в достаточных количествах благоприятно воздействуют на организм-хозяин, т.е. предоставляя одно или несколько очевидных преимуществ для здоровья организма-хозяина. Пробиотики могут улучшать баланс микробиоты на поверхностях одной или нескольких слизистых оболочек. Например, поверхность слизистой оболочки может находиться в кишечнике, мочевыводящих путях, дыхательных путях или на коже. Используемый в данном документе термин "пробиотик" также охватывает живые микроорганизмы, которые могут стимулировать значимые ветви иммунной системы и в то же время уменьшать воспалительные реакции на поверхности слизистой оболочки, например, кишечника. Хотя не существует верхних или нижних пределов для приема пробиотиков, было высказано предположение, что по меньшей мере 10⁶-10¹², предпочтительно по меньшей мере 10⁶-10¹⁰, предпочтительно 10⁸-10⁹ КОЕ в качестве суточной дозы будет эффективно для достижения благоприятных эффектов для здоровья субъекта.

Используемый в данном документе термин "КОЕ" обозначает "колониеобразующие единицы" и является мерой жизнеспособных клеток, где колония представляет совокупность клеток, полученную из одной клетки-предшественника.

Используемый в данном документе термин "протеаза" относится к ферменту, способному расщеплять пептидную связь. Термины "протеаза", "пептидаза" и "протеиназа" могут использоваться взаимозаменяемо. Протеазы могут быть обнаружены у животных, растений, бактерий, архей и вирусов. Протеолиз может обеспечиваться с помощью ферментов, которые в настоящее время разделены на шесть широких групп: аспарагиновые протеазы, цистеиновые протеазы, сериновые протеазы, треониновые протеазы, глутаминовые протеазы и металлопротеазы.

Термин "выделенный" означает вещество в форме или окружении, которые не встречаются в природе. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают (1) любое не встречающееся в природе вещество, (2) любое вещество, включая без ограничения любую клетку-хозяина, фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которое по меньшей мере частично отделено от одного или нескольких или всех встречающихся в природе компонентов, с которыми оно связано в природе; (3) любое вещество, модифицированное человеком относительно такого же вещества, обнаруженного в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в природе. Термины "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", "выделенный полинуклеотид" и "выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты" будут использоваться взаимозаменяемо и относятся к полимеру РНК или ДНК, который является одно- или двухцепочечным, необязательно содержащим синтетические, отличные от природных или измененные нуклеотидные основания. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты в форме полимера ДНК может состоять из одного или нескольких сегментов кДНК, геномной ДНК или синтетической ДНК.

Термин "очищенный" применительно к нуклеиновым кислотам или полипептидам, как правило, обозначает нуклеиновую кислоту или полипептид, которые фактически не содержат других компонентов, что определяют с помощью аналитических методик, хорошо известных из уровня техники (например, очищенный полипептид или полинуклеотид образуют отдельную полосу в электрофоретическом геле, хроматографическом элюате и/или средах, подвергаемых центрифугированию в градиенте плотности). Например, нуклеиновая кислота или полипептид, которые дают фактически одну полосу в электрофоретическом геле, являются "очищенными". Чистота очищенных нуклеиновой кислоты или полипептида составляет по меньшей мере приблизительно 50%, обычно по меньшей мере приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8% или больше (например, весовой процент в молях). Иными словами, композиция обогащена молекулой, если имеет место значительное увеличение концентрации молекулы после применения методики очистки или обогащения. Термин "обогащенный" относится к соединению, полипептиду, клетке, нуклеиновой кислоте, аминокислоте или другому определенному материалу или компоненту, который присутствует в композиции в относительной или абсолютной концентрации, которая выше, чем в исходной композиции.

Используемый в данном документе термин "трансформация" относится к переносу или введению молекулы нуклеиновой кислоты в организм-хозяин. Молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в виде линейной или кольцевой формы ДНК. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой плазмиду, которая реплицируется автономно, или она может интегрироваться в геном продуцирующего хозяина. Продуцирующие хозяева, содержащие трансформированную нуклеиновую кислоту, называются "трансформированными", или "рекомбинантными", или "трансгенными" организмами, или "трансформантами".

Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к искусственной комбинации двух в ином случае отделенных друг от друга сегментов последовательностей нуклеиновых кислот, например, путем химического синтеза или манипуляции выделенными сегментами нуклеиновых кислот с помощью методик генной инженерии. Например, ДНК, в которой один или несколько сегментов или генов были вставлены, естественным образом либо с помощью лабораторной манипуляции, из другой молекулы, из другой части той же молекулы или из искусственной последовательности, что привело к введению новой последовательности в ген и соответственно в организм. Термины "рекомбинантный", "трансгенный", "трансформированный", "сконструированный" или "модифицированный для экспрессии экзогенного гена" используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термин "микробный" в данном документе используется взаимозаменяемо с термином "микроорганизм". Жизнеспособный микроорганизм является метаболически активным или способным к дифференциации микроорганизмом.

DFM, описанные в данном документе, содержат по меньшей мере один жизнеспособный микроорганизм, такой как жизнеспособный бактериальный штамм или жизнеспособные дрожжи или жизнеспособные грибы. Предпочтительно DFM содержит по меньшей мере одну жизнеспособную бактерию.

В одном варианте осуществления DFM может представлять собой спорообразующий бактериальный штамм и, следовательно, термин DFM может состоять из или содержать споры, например, бактериальные споры. Таким образом, используемый в данном документе термин "жизнеспособный микроорганизм", может включать споры микроорганизмов, такие как эндоспоры или конидии. В качестве альтернативы, DFM в композиции кормовой добавки, описанной в данном документе, может не состоять из или может не содержать споры микроорганизмов, например, эндоспоры или конидии.

Микроорганизм может представлять собой встречающийся в природе микроорганизм или он может представлять собой трансформированный микроорганизм. Предпочтительно микроорганизм представляет собой комбинацию по меньшей мере трех подходящих микроорганизмов, таких как бактерии, которые могут быть выделенными.

Описанный в данном документе DFM может содержать микроорганизмы из одного или нескольких следующих родов: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium и Megasphaera и их комбинаций.

Предпочтительно DFM содержит один или несколько бактериальных штаммов выбранных из следующих Bacillus spp: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Используемый в данном документе род "Bacillus" включает все виды в пределах рода "Bacillus", известные специалистам в данной области техники, в том числе без ограничения B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. gibsonii и B. thuringiensis. Следует признать, что род Bacillus продолжает проходить таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что этот род включает виды, которые были переклассифицированы, в том числе без ограничения такие организмы, как Bacillus stearothermophilus, который в настоящее время называется "Geobacillus stearothermophilus", или Bacillus polymyxa, который в настоящее время называется "Paenibacillus polymyxa". Образование устойчивых эндоспор в стрессовых условиях окружающей среды считается определяющей чертой рода Bacillus, хотя эта характеристика также присуща недавно названным Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus.

Предпочтительно DFM может представлять собой комбинацию трех или более штаммов Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509).

Штаммы 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) находятся в открытом доступе в коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований (NRRL). Эти штаммы показаны в WO2013029013.

В другом аспекте DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Lactococcus spp: Lactococcus cremoris и Lactococcus lactis, и их комбинациями.

DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Lactobacillus spp: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbreuckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus jensenii, и комбинациями любых из них.

В еще одном аспекте DFM можно дополнительно комбинировать со следующими Bifidobacteria spp: Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium bifidium, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium angulatum, и комбинациями любых из них.

Можно упомянуть бактерии следующих видов: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilis, Enterococcus, Enterococcus spp, и Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus rhamnosus, Megasphaera elsdenii, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. Salivarius, Propionibacteria sp и их комбинации.

Микробный препарат для приема в пищу, описанный в данном документе, содержащий один или несколько бактериальных штаммов, может содержать один тип (род, вид и штамм) или может содержать смесь родов, видов и/или штаммов.

Соответственно, композицию в соответствии с настоящим изобретением можно комбинировать с одним или несколькими из продуктов или микроорганизмов, содержащихся в таких продуктах, раскрытых в WO2012110778, и обобщенных следующим образом:

Bacillus subtilis штамм 2084 № доступа NRRl B-50013, Bacillus subtilis штамм LSSAO1 № доступа NRRL B-50104 и Bacillus subtilis штамм 15A-P4 ATCC № доступа PTA-6507 (от Enviva Pro®. (ранее известный как Avicorr®); Bacillus subtilis штамм C3102 (от Calsporin®); Bacillus subtilis штамм PB6 (от Clostat®); Bacillus pumilis (8G-134); Enterococcus NCIMB 10415 (SF68) (от Cylactin®); Bacillus subtilis штамм C3102 (от Gallipro® & GalliproMax®); Bacillus licheniformis (от Gallipro®Tect®); Enterococcus и Pediococcus (от Poultry star®); Lactobacillus, Bifidobacterium и/или Enterococcus от Protexin®); Bacillus subtilis штамм QST 713 (от Proflora®); Bacillus amyloliquefaciens CECT-5940 (от Ecobiol® & Ecobiol® Plus); Enterococcus faecium SF68 (от Fortiflora®); Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (от BioPlus2B®); молочнокислые бактерии 7 Enterococcus faecium (от Lactiferm®); штамм Bacillus (от CSI®); Saccharomyces cerevisiae (от Yea-Sacc®); Enterococcus (от Biomin IMB52®); Pediococcus acidilactici, Enterococcus, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (от Biomin C5®); Lactobacillus farciminis (от Biacton®); Enterococcus (от Oralin E1707®); Enterococcus (2 штамма), Lactococcus lactis DSM 1103 (от Probios-pioneer PDFM®); Lactobacillus rhamnosus и Lactobacillus farciminis (от Sorbiflore®); Bacillus subtilis (от Animavit®); Enterococcus (от Bonvital®); Saccharomyces cerevisiae (от Levucell SB 20®); Saccharomyces cerevisiae (от Levucell SC 0 & SC10® ME); Pediococcus acidilacti (от Bactocell); Saccharomyces cerevisiae (от ActiSaf® (ранее BioSaf®)); Saccharomyces cerevisiae NCYC Sc47 (от Actisaf® SC47); Clostridium butyricum (от Miya-Gold®); Enterococcus (от Fecinor и Fecinor Plus®); Saccharomyces cerevisiae NCYC R-625 (от InteSwine®); Saccharomyces cerevisia (от BioSprint®); Enterococcus и Lactobacillus rhamnosus (от Provita®); Bacillus subtilis и Aspergillus oryzae (от PepSoyGen-C®); Bacillus cereus (от Toyocerin®); Bacillus cereus var. toyoi NCIMB 40112/CNCM I-1012 (от TOYOCERIN®), или другие DFM, такие как Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis (от BioPlus® YC) и Bacillus subtilis (от GalliPro®).

DFM можно комбинировать с Enviva Pro®, который является коммерчески доступным от Danisco A/S. Enviva Pro® представляет собой комбинацию Bacillus штамм 2084 № доступа NRRl B-50013, Bacillus штамм LSSAO1 № доступа NRRL B-50104 и Bacillus штамм 15A-P4 ATCC № доступа PTA-6507 (как показано в US 7754469 B, включенном в данный документ посредством ссылки).

Также возможно комбинировать DFM, описанный в данном документе, с дрожжами рода Saccharomyces spp.

Предпочтительно DFM, описанный в данном документе, содержит микроорганизмы, которые в целом признаны безопасными (GRAS) и предпочтительно имеют подтвержденный статус GRAS.

Средний специалист в данной области безо всяких сложностей будет имеет представление о конкретных видах и/или штаммах микроорганизмов из родов, описанных в данном документе, которые применяются в пищевой и/или сельскохозяйственной промышленностях, и которые в целом считаются подходящими для употребления животными.

Предпочтительно, если продукт представляет собой корм или композицию кормовой добавки, DFM должен сохранить эффективность в течение нормального срока "реализации" или "хранения" продукта, в течение которого корм или композиция кормовой добавки выставляется на продажу розничным торговцем. Требуемые промежутки времени и нормальный срок хранения будут варьировать в зависимости от кормового продукта, и специалистам в данной области техники будет понятно, что периоды срока хранения будут варьировать в зависимости от типа кормового продукта, размера кормового продукта, значений температуры хранения, условий обработки, упаковочного материала и упаковочного оборудования.

В некоторых вариантах осуществления важно, чтобы DFM был устойчив к нагреванию, т.е. являлся термостойким. Это особенно актуально, если корм сформирован в пеллеты. Таким образом, в другом варианте осуществления DFM может представлять собой термостойкий микроорганизм, такой как термостойкие бактерии, включая, например, Bacillus spp.

В других аспектах может быть предпочтительно, чтобы DFM содержал спорообразующие бактерии, такие как Bacilli, например, Bacillus spp. Бациллы способны формировать стабильные эндоспоры, когда условия для роста неблагоприятны и являются очень устойчивыми к высоким температурам, pH, влажности и дезинфицирующим средствам.

DFM, описанный в данном документе, может снижать или предотвращать установление в кишечнике патогенных микроорганизмов (таких как Clostridium perfringens и/или E. coli, и/или Salmonella spp, и/или Campylobacter spp.). Другими словами, DFM может быть антипатогенным. Используемый в данном документе термин "антипатогенный" означает, что DFM компенсирует эффект (отрицательный эффект) патогена.

Как описано выше, DFM может представлять собой любой подходящий DFM. Например, следующий анализ "АНАЛИЗ DFM" можно применять для определения того, подходит ли микроорганизм для того, чтобы являться DFM. Анализ DFM, используемый в данном документе, более детально объясняется в US2009/0280090. Для избежания сомнений DFM, выбранный в качестве ингибирующего штамма (или антипатогенного DFM) в соответствии с "АНАЛИЗОМ DFM", показанным в данном документе, является подходящим DFM для применения в соответствии с настоящим изобретением, т.е. в композиции кормовой добавки в соответствии с настоящим изобретением.

Каждую пробирку засевали иллюстративным патогеном (например, бактериями) из иллюстративного кластера.

Супернатант из потенциального DFM, выращенного аэробным или анаэробным путем, добавляют в засеянные пробирки (за исключением контроля, к которому не добавляют супернатант) и инкубируют. После инкубации измеряют оптическую плотность (OD) контрольных и обработанных супернатантом пробирок для каждого патогена.

Колонии (потенциальные DFM) штаммов, которые обеспечивали сниженное значение OD по сравнению с контролем (который не содержал супернатанта), затем можно классифицировать как ингибирующий штамм (или антипатогенный DFM). Таким образом, анализ DFM, используемый в данном документе, более детально объясняется в US2009/0280090.

Предпочтительно иллюстративный патоген, применяемый в данном анализе DFM, может представлять собой одно (или несколько) из следующего: Clostridium, такой как Clostridium perfringens и/или Clostridium difficile, и/или E. coli, и/или Salmonella spp, и/или Campylobacter spp. В одном предпочтительном варианте осуществления анализ проводят с одним или несколькими Clostridium perfringens и/или Clostridium difficile, и/или E. coli, предпочтительно Clostridium perfringens и/или Clostridium difficile, более предпочтительно Clostridium perfringens.

Антипатогенные DFM включают одну или несколько из следующих бактерий и описаны в WO2013029013:

Bacillus subtilis штамм 3BP5 № доступа NRRL B-50510,

Bacillus subtilis штамм 918 ATCC № доступа NRRL B-50508 и

Bacillus subtilis штамм 1013 ATCC № доступа NRRL B-50509.

DFM можно получать в виде культуры (культур) и носителя (носителей) (если применимо) и можно вносить в ленточную или лопастную мешалку и смешивать в течение приблизительно 15 минут, однако время можно увеличивать или уменьшать. Компоненты смешивают таким образом, что в результате получают однородную смесь культур и носителей. Конечный продукт предпочтительно представляет собой сухой сыпучий порошок. DFM, содержащие один или несколько бактериальных штаммов можно затем добавлять в корм для животных или кормовой премикс, добавлять в воду для животных или вводить другими путями известными из уровня техники (предпочтительно одновременно с ферментами, описанными в данном документе.

Включение отдельных штаммов в смесь DFM можно производить в пропорциях в диапазоне от 1% до 99% и, предпочтительно, от 25% до 75%.

Подходящие дозировки DFM в корме для животных могут варьировать от приблизительно 1×10³ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г корма, соответственно от приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10⁸ КОЕ/г корма, соответственно от приблизительно 7,5×10⁴ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10⁷ КОЕ/г корма.

В другом аспекте DFM можно дозировать в кормовом продукте в концентрации более приблизительно 1×10³ КОЕ/г корма, соответственно более приблизительно 1×10⁴ КОЕ/г корма, соответственно более приблизительно 5×10⁴ КОЕ/г корма или соответственно более приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г корма.

DFM можно дозировать в композиции кормовой добавки от приблизительно 1×10³ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹³ КОЕ/г композиции, предпочтительно от 1×10⁵ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹³ КОЕ/г композиции, более предпочтительно от приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹² КОЕ/г композиции и наиболее предпочтительно от приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ/г композиции. В другом аспекте DFM можно дозировать в композиции кормовой добавки в концентрации более приблизительно 1×10⁵ КОЕ/г композиции, предпочтительно более приблизительно 1×10⁶ КОЕ/г композиции и наиболее предпочтительно более приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции. В одном варианте осуществления DFM дозируют в композиции кормовой добавки в концентрации более приблизительно 2×10⁵ КОЕ/г композиции, соответственно более приблизительно 2×10⁶ КОЕ/г композиции, соответственно более приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г композиции.

Композиция кормовой добавки, описанная в данном документе, по сути состоит из DFM, содержащего один или несколько бактериальных штаммов и по меньшей мере одну протеазу. Протеаза может представлять собой субтилизин (E.C. 3.4.21.62), или бацилолизин (E.C. 3.4.24.28), или щелочную сериновую протеазу (E.C. 3.4.21.x), или кератиназу (E.C. 3.4.x.x). Предпочтительно протеаза представляет собой субтилизин. Протеаза может быть получена из B. subtilis или протеаза может представлять собой протеазу Nocardiopsis, доступную от Novozymes A/S.

Другие подходящие протеазы включают протеазы животного, растительного или микробного происхождения. Также можно применять химически модифицированные или полученные с помощью белковой инженерии мутантные протеазы. Протеазой может быть сериновая протеаза или металлопротеаза, например, щелочная микробная протеаза или трипсин-подобная протеаза. Примерами щелочных протеаз являются субтилизины, особенно те, которые получены из Bacillus sp., например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309 (см., например, патент США № 6287841), субтилизин 147 и субтилизин 168 (см., например, WO 89/06279). Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеазы Fusarium (см., например, WO 89/06270 и WO 94/25583). Примеры полезных протеаз также включают без ограничения варианты, описанные в WO 92/19729 и WO 98/20115.

Одну или несколько из протеаз в одном или нескольких из коммерческих продуктов ниже можно применять в комбинации с микробным препаратом для приема в пищу с тремя штаммами, описанным в данном документе.

Коммерческий продукт®	Компания	Тип протеазы	Источник протеазы
Avizyme 1100	Danisco A/S	Субтилизин	Bacillus subtilis
Avizyme 1202	Danisco A/S	Субтилизин	Bacillus subtilis
Avizyme 1302	Danisco A/S	Субтилизин	Bacillus subtilis
Avizyme 1500	Danisco A/S	Субтилизин	Bacillus subtilis
Avizyme 1505	Danisco A/S	Субтилизин	Bacillus subtilis
Multifect P3000
Kemzyme Plus Dry	Kemin	Бациллолизин	Bacillus amyloliquefaciens
Kemzyme W dry	Kemin	Бациллолизин	Bacillus amyloliquefaciens
Natuzyme	Bioproton	Протеаза	Trichoderma longibrachiatum /Trichoderma reesei
Porzyme 8300	Danisco	Субтилизин	Bacillus subtilis
Ronozyme ProAct	DSM/Novozymes	Щелочная сериновая протеаза	Ген Nocardiopsis prasina, экспрессируемый в Bacillus licheniformis
Versazyme/Cibenza DP100	Novus	Кератиназа	Bacillus licheniformis

Предпочтительно протеаза присутствует в кормовом продукте в диапазоне от приблизительно 1000 PU/кг до приблизительно 200000 PU/кг корма, более предпочтительно от приблизительно 1500 PU/кг корма до приблизительно 100000 PU/кг корма, более предпочтительно от приблизительно 2000 PU/кг корма до приблизительно 60000 PU/кг корма. Более определенно протеаза присутствует в кормовом продукте в концентрации более приблизительно 1000 PU/кг корма или более приблизительно 1500 PU/кг корма, или более приблизительно 2000 PU/кг корма. В другом аспекте протеаза присутствует в кормовом продукте в концентрации менее приблизительно 200000 PU/кг корма или менее приблизительно 100000 PU/кг корма, или менее приблизительно 70000 PU/кг корма, или менее приблизительно 60000 PU/кг корма.

Протеаза может присутствовать в композиции кормовой добавки в диапазоне от приблизительно 200 PU/г до приблизительно 400000 PU/г композиции, более предпочтительно от приблизительно 300 PU/г композиции до приблизительно 200000 PU/г композиции и еще более предпочтительно от приблизительно 5000 PU/г композиции до приблизительно 100000 PU/г композиции, и еще более предпочтительно от приблизительно 700 PU/г композиции до приблизительно 70000 PU/г композиции, и еще более предпочтительно от приблизительно 1000 PU/г композиции до приблизительно 60000 PU/г композиции.

В другом аспекте протеаза присутствует в композиции кормовой добавки в концентрации более приблизительно 200 PU/г композиции или более приблизительно 300 PU/г композиции, или более приблизительно 400 PU/г композиции, или приблизительно 500 PU/г композиции или более приблизительно 750 PU/г композиции или более приблизительно 1000 PU/г композиции.

В еще одном аспекте протеаза присутствует в композиции кормовой добавки в концентрации менее приблизительно 400000 PU/г композиции или менее приблизительно 200000 PU/г композиции, или менее приблизительно 100000 PU/г композиции, или менее приблизительно 80000 PU/г композиции, или менее приблизительно 70000 PU/г композиции, или менее приблизительно 60000 PU/г композиции.

Следует понимать, что одна протеазная единица (PU) представляет собой количество фермента, которое высвобождает 2,3 микрограмма фенольного соединения (выраженного в эквивалентах тирозина) из казеинового субстрата в минуту при рН 10,0 при 50°С. Это можно назвать анализом для определения 1 PU.

Не вдаваясь в теорию, протеазы вызывают неспецифический гидролиз белка рациона, приводящий к появлению разнообразных полипептидов в просвете кишечника. Животные завершают гидролиз белка и поглощают такие аминокислоты. Однако в случае наличия кишечных патогенных заболеваний патогенные бактерии могут воспользоваться большей доступностью пептида в просвете тонкой кишки и подвздошной кишки. DFM подавляют рост энтеропатогенов, например, конкурируя за источники N, а также посредством прямого подавления.

Конкретная комбинация DFM, содержащая одну или несколько бактерий и по меньшей мере одну протеазу, описанную в данном документе, может преимущественно приводить к уменьшенной секреции муцина. Считается, что такая уменьшенная секреция муцина может приводить в результате к уменьшению потерь эндогенной аминокислоты и/или может отвечать за улучшенные характеристики.

Конкретная комбинация DFM, содержащая одну или несколько бактерий и по меньшей мере одну протеазу, описанную в данном документе, может преимущественно уменьшать воспаление в подвздошной кишке. Это можно обнаружить по подавлению экспрессии гамма-интерферона (IFN-гамма) в подвздошной кишке.

Композицию кормовой добавки, описанную в данном документе, можно вводить в пищу животному в качестве микробного препарата для приема в пищу (DFM). Один или несколько носителей или других ингредиентов можно добавлять к DFM. DFM может быть представлен в разных физических формах, например, в качестве подкормки, в качестве водорастворимого концентрата для применения в качестве жидкой пропитки или для добавления в заменитель молока, желатиновой капсулы или геля. В одном варианте осуществления в форме подкормки лиофилизированный продукт ферментации добавляют к носителю, такому как молочная сыворотка, мальтодекстрин, сахароза, декстроза, известняк (карбонат кальция), рисовая шелуха, дрожжевая культура, высушенный крахмал и/или натриевокремниевый алюминат. В одном варианте осуществления в виде водорастворимого концентрата для жидкой пропитки или добавки в заменитель молока лиофилизированный продукт ферментации добавляют к водорастворимому носителю, такому как молочная сыворотка, мальтодекстрин, сахароза, декстроза, высушенный крахмал, натриевокремниевый алюминат, и добавляют жидкость для получения пропитки или добавляют добавку в молоко или заменитель молока. В одном варианте осуществления в форме желатиновой капсулы лиофилизированный продукт ферментации добавляют к носителю, такому как молочная сыворотка, мальтодекстрин, сахар, известняк (карбонат кальция), рисовая шелуха, дрожжевая культура, высушенный крахмал и/или натриевокремниевый алюминат. В одном варианте осуществления бактерии и носитель заключены в разлагаемую желатиновую капсулу. В одном варианте осуществления в форме геля лиофилизированный продукт ферментации добавляют к носителю, такому как растительное масло, сахароза, диоксид кремния, полисорбат 80, пропиленгликоль, бутилированный гидроксианизол, лимонная кислота, этоксихин и/или искусственный краситель для получения геля.

DFM необязательно можно смешивать с сухим составом добавок, включая без ограничения субстраты для роста, ферменты, сахара, углеводы, экстракты и стимулирующие рост микроингредиенты. Сахара могут включать следующие: лактозу; мальтозу; декстрозу; мальто-декстрин; глюкозу; фруктозу; маннозу; тагатозу; сорбозу; рафинозу и галактозу. Сахара могут варьировать в диапазоне от 50 до 95%, либо по отдельности, либо в комбинации. Экстракты могут включать дрожжи или сухие дрожжевые растворимые продукты ферментации в диапазоне от 5 до 50%. Субстраты для роста могут включать триптиказу в диапазоне от 5 до 25%; лактат натрия в диапазоне от 5 до 30%; и Tween 80 диапазоне от 1 до 5%. Углеводы могут включать маннит, сорбит, адонит и арабит. Углеводы могут варьировать в диапазоне от 5 до 50%, по отдельности или в комбинации. Микроингредиенты могут включать следующее: карбонат кальция в диапазоне от 0,5 до 5,0%; хлорид кальция в диапазоне от 0,5 до 5,0%; дикалийфосфат в диапазоне от 0,5 до 5,0%; фосфат кальция в диапазоне от 0,5 до 5,0%; протеинат марганца в диапазоне от 0,25 до 1,00% и марганец в диапазоне от 0,25 до 1,0%.

DFM, содержащий один или несколько бактериальных штаммов и по меньшей мере одну протеазу, может быть составлен любым подходящим путем, обеспечивающим, что состав содержит жизнеспособные DFM и по меньшей мере одну активную протеазу. В одном варианте осуществления DFM, содержащий один или несколько бактериальных штаммов и по меньшей мере одну протеазу, можно составлять в виде жидкости, сухого порошка или гранулы.

Сухой порошок или гранулы можно получить с помощью средств, известных специалистам в данной области техники, таких как в глазировочной машине с псевдоожиженным слоем и распылением в верхней части, в Wurster с распылением в нижней части или путем барабанной грануляции (например, грануляции с высокой скоростью сдвига), экструзия, дражирование или в мешалке с микроингредиентами.

Для некоторых вариантов осуществления DFM и/или по меньшей мере одна протеаза могут иметь покрытие, например, находиться в капсуле. Соответственно, DFM и по меньшей мере одну протеазу можно составлять под одним покрытием или инкапсулировать в одну капсулу. В качестве альтернативы, один, или два, или три, или четыре фермента можно составлять под одним покрытием или инкапсулировать в одну капсулу и DFM можно составлять с покрытием отдельно от одного или нескольких, или всех ферментов.

В некоторых вариантах осуществления, таких где DFM способен к образованию энодоспор, DFM может быть обеспечен без какого-либо покрытия. В таких обстоятельствах эндоспоры DFM могут быть просто смешаны по меньшей мере с одной протеазой. В последнем случае по меньшей мере одна протеаза может иметь покрытие, например, находиться в капсуле.

В одном варианте осуществления покрытие защищает ферменты, такие как по меньшей мере одна протеаза, от воздействия тепла и может считаться термозащитным средством.

В другом аспекте композицию кормовой составляют в виде сухого порошка или гранул, как описано в WO2007/044968 (называемых гранулами TPT) или WO1997/016076, или WO1992/012645, (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки).

Композиция кормовой добавки может быть составлена в виде гранулы, которую затем добавляют в корм, при этом гранула содержит ядро; активное средство и по меньшей мере одно покрытие, при этом активное средство гранулы сохраняет по меньшей мере 50% активность, по меньшей мере 60% активность, по меньшей мере 70% активность, по меньшей мере 80% активность после воздействия условий, выбранных из одного или нескольких из а) способа гранулирования корма, b) способа предварительной обработки корма с паровым нагревом, c) хранения, d) хранения в виде ингредиента в негранулированной смеси и e) хранения в виде ингредиента в исходной кормовой смеси или кормовом премиксе, содержащем по меньшей мере одно соединение, выбранное из микроэлементов, органических кислот, восстанавливающих сахаров, витаминов, хлорида холина и соединений, которые обеспечивают кислотность или основность исходной кормовой смеси или кормовому премиксу.

Что касается гранулы, по меньшей мере одно покрытие может содержать увлажняющий гидратирующий материал, который составляет по меньшей мере 55% вес/вес гранулы; и/или по меньшей мере одно покрытие может содержать два покрытия. Эти два покрытия могут представлять собой увлажняющее гидратирующее покрытие и влагоудерживающее покрытие. В некоторых вариантах осуществления увлажняющее гидратирующее покрытие может составлять от 25% до 60% вес/вес гранулы, а влагоудерживающее покрытие может составлять от 2% до 15% вес/вес гранулы. Увлажняющее гидратирующее покрытие может быть выбрано из неорганических солей, сахарозы, крахмала и мальтодекстрина, а влагоудерживающее покрытие может быть выбрано из полимеров, смол, молочной сыворотки и крахмала.

Корм, содержащий композицию кормовой добавки, может быть получен с помощью способа гранулирования корма, и способ предварительной обработки корма может осуществляться в диапазоне от 70°C до 95°C в течение от по меньшей мере 30 секунд до нескольких минут при температуре от 85°C до 95°C.

Корм, содержащий композицию кормовой добавки, может быть получен с помощью способа гранулирования с паровым нагревом, который может осуществляться в диапазоне от 85 до 95°C в течение от примерно 30 секунд до нескольких минут.

В некоторых вариантах осуществления DFM (например, эндоспоры DFM) может быть разбавлен с использованием разбавителя, такого как крахмальный порошок, известняк или т.п.

В одном варианте осуществления композиция находится в виде жидкого состава, подходящего для потребления, предпочтительно, такая потребляемая жидкость содержит одно или несколько из следующего: буфер, соль, сорбит и/или глицерин.

В другом варианте осуществления композиция кормовой добавки может быть составлена путем нанесения, например распыления, фермента (ферментов) на подложку-носитель, такую как, например, молотая пшеница.

В одном варианте осуществления композиция кормовой добавки может быть составлена в виде премикса. Только в качестве примера премикс может содержать один или несколько кормовых компонентов, таких как один или несколько минералов и/или один или несколько витаминов.

В другом варианте осуществления DFM, содержащий один или несколько бактериальных штаммов и/или по меньшей мере одну протеазу, может быть составлен с по меньшей мере одним физиологически приемлемым носителем, выбранным из по меньшей мере одного из мальтодекстрина, известняка (карбоната кальция), циклодекстрина, пшеницы или компонента пшеницы, сахарозы, крахмала, Na₂SO₄, талька, PVA, сорбита, бензоата, сорбата, глицерина, сахарозы, пропиленгликоля, 1,3-пропандиола, глюкозы, парабенов, хлорида натрия, цитрата, ацетата, фосфата, кальция, метабисульфита, формиата и их смесей.

В одном варианте осуществления композиция кормовой добавки, и/или премикс, и/или корм, или кормовой продукт являются упакованными.

В одном предпочтительном варианте осуществления композиция кормовой добавки, и/или премикс, и/или корм, или кормовой продукт упакованы в пакет, такой как бумажный пакет.

В альтернативном варианте осуществления композиция кормовой добавки, и/или премикс, и/или корм, или кормовой продукт могут быть герметично упакованы в контейнер. Можно использовать любой подходящий контейнер.

Композицию кормовой добавки, описанную в данном документе, можно применять в качестве корма или при его получении.

Термин "корм" применяется взаимозаменяемо с термином "кормовой продукт". Используемый в данном документе термин "кормовой продукт" относится к кормовому материалу, к которому добавили одну или несколько композиций кормовой добавки.

Корм может находиться в форме раствора или в твердом виде в зависимости от использования, и/или способа применения, и/или способа введения.

В случае применения в качестве корма или при получении корма, такого как функциональный корм, композицию кормовой добавки, описанную в данном документе, можно применять в сочетании с одним или несколькими из приемлемого в пищевом отношении носителя, приемлемого в пищевом отношении разбавителя, приемлемого в пищевом отношении наполнителя, приемлемого в пищевом отношении вспомогательного вещества, активного в пищевом отношении ингредиента.

В предпочтительном варианте осуществления композицию кормовой добавки можно смешивать с кормовым компонентом с образованием кормового продукта.

Используемый в данном документе термин "кормовой компонент" означает весь кормовой продукт или его часть. Часть кормового продукта может означать одну составляющую кормового продукта или более чем одну составляющую кормового продукта, например, 2, или 3, или 4. В одном варианте осуществления термин "кормовой компонент" охватывает премикс или составляющие компоненты премикса.

Предпочтительно корм может представлять собой фураж или его премикс, комбикорм или его премикс. В одном варианте осуществления композицию кормовой добавки можно смешивать с комбикормом, компонентом комбикорма, или премиксом комбикорма, или фуражом, компонентом фуража, или премиксом фуража.

Термин фураж, используемый в данном документе, означает любую пищу, которая предоставляется животному (в отличие от пищи, которую животное добывает самостоятельно). Фураж охватывает растения, которые были срезаны.

Термин фураж включает сено, солому, силос, прессованные и гранулированные корма, масла и смешанные рационы, а также проросшие зерновые и бобовые.

Фураж можно получить из одного или нескольких растений, выбранных из люцерны (люцерны посевной), ячменя, ледвенца рогатого, представителей рода капусты, Chau moellier, кормовой капусты, семени рапса (канолы), репы (брюквы), турнепса, клевера, гибридного клевера, красного клевера, подземного клевера, белого клевера, травы, травы французского райграса высокого, овсяницы, бермудской травы, костра, трехзубки, видов мятлика (из смешанных в природе пастбищных трав), ежи сборной, райграса многолетнего, тимофеевки луговой, кукурузы (маиса), проса, овса, сорго, соевых бобов, деревьев (всходов подстриженных деревьев для сена из деревьев), пшеницы и бобовых.

Термин "комбикорм" означает промышленный корм в форме муки, гранулы, орешков, жмыха или крошки. Комбикорма можно смешивать с различным сырьем и добавками. Эти смеси составляют в соответствии с конкретными требованиями для целевого животного.

Комбикорма могут быть полными кормами, которые обеспечивают все суточно необходимые питательные вещества, концентратами, которые обеспечивают часть рациона (белковую, энергетическую), или добавками, которые обеспечивают только дополнительные питательные микроэлементы, такие как минералы и витамины

Основными ингредиентами, применяемыми в комбикорме, являются кормовые зерновые, которые включают кукурузу, соевые бобы, сорго, овес и ячмень.

Соответственно, премиксом, как обозначается в данном документе, может быть композиция, состоящая из микроингредиентов, таких как витамины, минералы, химические консерванты, антибиотики, продукты ферментации и другие необходимые ингредиенты. Премиксами обычно являются композиции, подходящие для смешивания в промышленных рационах.

Любой кормовой продукт, описанный в данном документе, может содержать один или несколько кормовых материалов, выбранных из группы, состоящей из a) злаков, таких как мелкозерновые (например, пшеница, ячмень, рожь, овес и их комбинации) и/или крупнозерновые, такие как маис или сорго; b) отходы от переработки зерновых, такие как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществами (DDGS), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничные мелкие отруби, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом; c) белок, полученный из таких источников, как соя, подсолнечник, арахис, люпин, виды гороха, конские бобы, хлопчатник, канола, рыбная мука, сухой белок плазмы, мясо-костная мука, картофельный белок, молочная сыворотка, копра, кунжут; d) масла и жиры, полученные из растительных и животных источников; e) минералы и витамины.

Более того такой кормовой продукт может содержать по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% по весу кукурузной и соевой муки или кукурузы и необезжиренной сои, или пшеничной муки, или кормовой муки из жмыха семян подсолнечника.

Дополнительно или в качестве альтернативы кормовой продукт может содержать по меньшей мере один кормовой материал с высоким содержанием клетчатки и/или по меньшей мере один продукт переработки по меньшей мере одного кормового материала c высоким содержанием клетчатки для получения кормового продукта с высоким содержанием клетчатки. Примеры кормовых материалов с высоким содержанием клетчатки включают пшеницу, ячмень, рожь, овес, отходы от переработки зерновых, такие как кукурузная глютеновая мука, сушеная барда с растворимыми веществам (DDGS), пшеничные отруби, пшеничная крупка, пшеничные мелкие отруби, рисовые отруби, рисовая шелуха, овсяная шелуха, ядро кокосового ореха и цитрусовый жом. Некоторые источники белка также можно рассматривать как источники с высоким содержанием клетчатки: белок, полученный из таких источников, как подсолнечник, люпин, конские бобы и хлопчатник.

Как описано в данном документе, корм может представлять собой одно или несколько из следующего: комбикорм и премикс, включая гранулы, орешки или (кормовой) жмых; сельскохозяйственная культура или остаток сельскохозяйственной культуры: кукурузы, соевых бобов, сорго, овса, ячменя, кукурузной соломы, копры, соломы, соломенной сечки, остатков сахарной свеклы; рыбной муки; свежесрезанной травы и других кормовых растений; мясо-костной муки; кормовой патоки; шрота и фильтрпрессного осадка; олигосахаридов; консервированных кормовых растений: сена и силоса; морских водорослей; семян и зерен, либо цельных, либо подготовленных дроблением, помолом и т. д.; проросших зерновых и бобовых; дрожжевого экстракта.

Используемый в данном документе термин корм также охватывает в некоторых вариантах осуществления корм для домашних животных. Корм для домашних животных представляет собой материал растительного или животного происхождения, предназначенный для потребления домашними животными, такой как корм для собак или корм для кошек. Корм для домашних животных, такой как корм для собак и кошек, может быть либо в сухой форме, такой как гранулированный корм для собак, либо во влажной консервированной форме. Корм для кошек может содержать аминокислоту таурин.

Термин корм может также охватывать в некоторых вариантах осуществления корм для рыб. Корм для рыб в норме содержит питательные макроэлементы, микроэлементы и витамины, необходимые для поддержания здоровыми рыб, содержащихся в неволе. Корм для рыб может быть в форме хлопьевидной частицы, гранулы или таблетки. Гранулированные формы, некоторые из которых быстро тонут в воде, часто используют для более крупных видов рыбы или видов, питающихся на дне. Некоторые корма для рыб также содержат добавки, такие как бета-каротин или половые гормоны для искусственного усиления окраски и узора рыб.

Термин "корм" также охватывает корм для птиц, включая корм, применяемый как в кормушках для птиц, так и для кормления домашних птиц. Обычно корм для птиц содержит разные семена, но также может включать нутряное сало (говяжий или бараний жир).

Используемый в данном документе термин "приведенный в контакт" относится к опосредованному или непосредственному применению композиции кормовой добавки в отношении продукта (например, корма). Примеры способов применения, которые можно использовать, включают без ограничения обработку продукта в материале, содержащем композицию кормовой добавки, непосредственное воздействие путем смешивания композиции кормовой добавки с продуктом, нанесение распылением композиции кормовой добавки на поверхность продукта или погружение продукта в препарат на основе композиции кормовой добавки.

Данную композицию кормовой добавки предпочтительно смешивают с продуктом (например, кормовым продуктом). В качестве альтернативы композицию кормовой добавки можно включать в эмульсию или сырьевые ингредиенты кормового продукта.

Для некоторых применений важно, чтобы композиция была доступна на или по отношению к поверхности продукта, подлежащего воздействию/обработке. Это позволяет композиции придавать одну или несколько из следующих положительных характеристик: благоприятное воздействие на продуктивность.

Композиции кормовой добавки можно применять для вкрапления, покрытия и/или пропитывания продукта (например, кормового продукта или сырьевых ингредиентов кормового продукта) контролируемым количеством DFM и ферментов.

DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и по меньшей мере одну протеазу, можно применять одновременно (например, если их смешивают вместе, или даже если их доставляют с помощью различных путей) или последовательно (например, их можно доставлять с помощью различных путей). В одном варианте осуществления предпочтительно DFM и ферменты применяют одновременно. Предпочтительно DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и по меньшей мере одну протеазу, смешивают перед добавлением в кормовой продукт или в сырьевой ингредиент кормового продукта.

DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и по меньшей мере одну протеазу, можно добавлять в подходящих концентрациях, например, в концентрациях в конечном кормовом продукте, которые предполагают суточную дозу от приблизительно 2×10³ КОЕ/г корма до приблизительно 2×10¹¹ КОЕ/г корма, соответственно от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 1×10¹⁰, соответственно от приблизительно 3,75×10⁷ КОЕ/г корма до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/г корма.

Предпочтительно, композиция кормовой добавки будет термостабильной в отношении термической обработки до приблизительно 70°C; до приблизительно 85°C; или до приблизительно 95°C. Термическую обработку можно проводить в течение от приблизительно 30 секунд до нескольких минут. Термин термостабильный означает, что по меньшей мере приблизительно 50% ферментных компонентов и/или DFM, которые присутствовали/были активны в добавке перед нагреванием до определенной температуры, по-прежнему присутствуют/являются активными после ее охлаждения до комнатной температуры. В особенно предпочтительном варианте осуществления композицию кормовой добавки гомогенизируют с получением порошка.

В качестве альтернативы, композицию кормовой добавки составляют в виде гранул, как описано в WO2007/044968 (называемых гранулами TPT), включенной в данный документ посредством ссылки.

В другом предпочтительном варианте осуществления, когда композицию кормовой добавки составляют в виде гранул, эти гранулы содержат гидратированную барьерную соль, покрывающую белковое ядро. Преимуществом такого солевого покрытия является улучшенная термоустойчивость, улучшенная стабильность при хранении и защита от других кормовых добавок, в противном случае неблагоприятно воздействующих на по меньшей мере одну протеазу и/или DFM, содержащий один или несколько бактериальных штаммов. Предпочтительно соль, используемая для солевого покрытия, имеет водную активность более 0,25 или постоянную влажность более 60% при 20°C. Предпочтительно солевое покрытие содержит Na₂SO₄.

Корм, содержащий композицию кормовой добавки, можно получать с применением способа гранулирования корма. Необязательно стадия гранулирования может включать обработку паром или стадию кондиционирования перед образованием гранул. Смесь, содержащую порошок, можно поместить в кондиционирующее устройство, например, смеситель со впрыском пара. Смесь нагревают в кондиционере до определенной температуры, такой как 60-100°С, как правило, значения температуры составляют 70°С, 80°С, 85°С, 90°С или 95°С. Время выдерживания можно варьировать от секунд до минут и даже часов. Например, 5 секунд, 10 секунд, 15 секунд, 30 секунд, 1 минута, 2 минуты, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут и 1 час.

Будет понятно, что раскрываемая в данном документе композиция кормовой добавки является подходящей для добавления в любой соответствующий кормовой материал.

Используемый в данном документе термин кормовой материал означает основной кормовой материал, потребляемый животным. Далее будет понятно, что он может содержать, например, по меньшей мере одно или несколько необработанных зерновых, и/или обработанный растительный материал, и/или материал животного происхождения, такой как соевая мука или костная мука.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что разные животные нуждаются в разных кормовых продуктах, и даже одному и тому же животному могут требоваться различные кормовые продукты в зависимости от цели, ради которой выращивают животное.

Предпочтительно кормовой продукт может содержать кормовые материалы, содержащие маис или кукурузу, пшеницу, ячмень, тритикале, рожь, рис, тапиоку, сорго и/или любые продукты переработки, а также богатые белком компоненты, такие как соевая мука, мука из рапсового семени, мука канолы, мука из семян хлопчатника, мука из семян подсолнечника, мука из продуктов переработки животных, и их смеси. Более предпочтительно кормовой продукт может содержать животные жиры и/или растительные масла.

Необязательно кормовой продукт может также содержать дополнительные минералы, такие как, например, кальций и/или дополнительные витамины. Предпочтительно кормовой продукт представляет собой смесь кукурузной и соевой муки.

В другом аспекте предлагается способ получения кормового продукта. Кормовой продукт обычно получают в кормодробилках, в которых сырье сначала измельчают до подходящего размера частиц, а затем смешивают с соответствующими добавками. Затем кормовой продукт можно получить в виде кашицы или гранул; последние, как правило, предполагают способ, с помощью которого температуру поднимают до заданного уровня, а затем корм пропускают через форму с получением гранул конкретного размера. Обеспечивают остывание гранул. Впоследствии можно добавлять жидкие добавки, такие как жир и фермент. Получение кормового продукта также может включать дополнительную стадию, которая до гранулирования включает экструзию или разбухание, в частности с помощью подходящих методик, которые могут включать по меньшей мере применение пара.

Кормовой продукт может быть кормовым продуктом для животного с однокамерным желудком, такого как cельскохозяйственная птица (например, бройлер, несушка, племенные бройлеры, индейка, утка, гуси, водоплавающая птица), свинья (все возрастные категории), домашние питомцы (например, собаки, кошки) или рыба, предпочтительно кормовой продукт предназначен для домашней птицы.

В одном варианте осуществления кормовой продукт не предназначен для несушек.

В качестве примера, только в кормовом продукте для цыплят, например цыплят-бройлеров, может содержаться один или несколько ингредиентов, указанных далее в таблице, например, в %, приведенных далее в таблице.

Ингредиенты	Рацион для начального периода откорма (%)	Рацион для заключительного периода откорма (%)
Маис	46,2	46,7
Пшеничная крупка	6,7	10,0
DDGS маиса	7,0	7,0
Соевая мука, 48% СР	32,8	26,2
Смесь раст./жив. жиров	3,0	5,8
L-лизин HCl	0,3	0,3
DL-метионин	0,3	0,3
L-треонин	0,1	0,1
Соль	0,3	0,4
Известняк	1,1	1,1
Дикальцийфосфат	1,2	1,2
Витамины и микроминералы для cельскохозяйственной птицы	0,3	0,3

Исключительно в качестве примера, описание рациона для цыплят, таких как цыплята-бройлеры, может быть таким, как представлено далее в таблице.

Описание рациона
Неочищенный белок (%)	23,00	20,40
Обменная энергия сельскохозяйственной птицы (ккал/кг)	2950	3100
Кальций (%)	0,85	0,85
Доступный фосфор (%)	0,38	0,38
Натрий (%)	0,18	0,19
Усв. лизин (%)	1,21	1,07
Усв. метионин (%)	0,62	0,57
Усв. метионин+цистеин (%)	0,86	0,78
Усв. треонин (%)	0,76	0,68

Исключительно в качестве примера, кормовой продукт для кур-несушек может содержать один или несколько ингредиентов, указанных далее в таблице, например, в %, приведенных далее в таблице.

Ингредиент	Фаза несения яиц (%)
Маис	10,0
Пшеница	53,6
DDGS маиса	5,0
Соевая мука, 48% СР	14,9
Пшеничная крупка	3,0
Соевое масло	1,8
L-лизин HCl	0,2
DL-метионин	0,2
L-треонин	0,1
Соль	0,3
Дикальцийфосфат	1,6
Известняк	8,9
Витамины и микроминералы для cельскохозяйственной птицы	0,6

Исключительно в качестве примера, описание рациона для кур-несушек может быть таким, как представлено далее в таблице.

Описание рациона
Неочищенный белок (%)	16,10
Обменная энергия сельскохозяйственной птицы (ккал/кг)	2700
Лизин (%)	0,85
Метионин (%)	0,42
Метионин+цистеин (%)	0,71
Треонин (%)	0,60
Кальций (%)	3,85
Доступный фосфор (%)	0,42
Натрий (%)	0,16

В качестве примера, кормовой продукт для индеек может содержать один или несколько ингредиентов, указанных далее в таблице, например, в %, приведенных далее в таблице.

Ингредиент	Фаза 1 (%)	Фаза 2 (%)	Фаза 3 (%)	Фаза 4 (%)
Пшеница	33,6	42,3	52,4	61,6
DDGS маиса	7,0	7,0	7,0	7,0
Соевая мука, 48% СР	44,6	36,6	27,2	19,2
Рапсовая мука	4,0	4,0	4,0	4,0
Соевое масло	4,4	4,2	3,9	3,6
L-лизин HCl	0,5	0,5	0,4	0,4
DL-метионин	0,4	0,4	0,3	0,2
L-треонин	0,2	0,2	0,1	0,1
Соль	0,3	0,3	0,3	0,3
Известняк	1,0	1,1	1,1	1,0
Дикальцийфосфат	3,5	3,0	2,7	2,0
Витамины и микроминералы для cельскохозяйственной птицы	0,4	0,4	0,4	0,4

Исключительно в качестве примера, описание рациона для индеек может быть таким, как представлено далее в таблице.

Описание рациона
Неочищенный белок (%)	29,35	26,37	22,93	20,00
Обменная энергия сельскохозяйственной птицы (ккал/кг)	2,850	2,900	2,950	3,001
Кальций (%)	1,43	1,33	1,22	1,02
Доступный фосфор (%)	0,80	0,71	0,65	0,53
Натрий (%)	0,16	0,17	0,17	0,17
Усв. лизин (%)	1,77	1,53	1,27	1,04
Усв. метионин (%)	0,79	0,71	0,62	0,48
Усв. метионин+цистеин (%)	1,12	1,02	0,90	0,74
Усв. треонин (%)	1,03	0,89	0,73	0,59

В качестве примера, кормовой продукт для поросят может содержать один или несколько ингредиентов, указанных далее в таблице, например, в %, приведенных далее в таблице.

Ингредиент	Фаза 1 (%)	Фаза 2 (%)
Маис	20,0	7,0
Пшеница	25,9	46,6
Рожь	4,0	10,0
Пшеничная крупка	4,0	4,0
DDGS маиса	6,0	8,0
Соевая мука, 48% СР	25,7	19,9
Сухая молочная сыворотка	10,0	0,0
Соевое масло	1,0	0,7
L-лизин HCl	0,4	0,5
DL-метионин	0,2	0,2
L-треонин	0,1	0,2
L-триптофан	0,03	0,04
Известняк	0,6	0,7
Дикальцийфосфат	1,6	1,6
Витамины и микроминералы для свиней	0,2	0,2
Соль	0,2	0,4

Исключительно в качестве примера, описание рациона для поросят может быть таким, как представлено далее в таблице.

Описание рациона
Неочищенный белок (%)	21,50	20,00
Усваиваемая энергия свиньи (ккал/кг)	3380	3320
Чистая энергия свиньи (ккал/кг)	2270	2230
Кальций (%)	0,80	0,75
Усваиваемый фосфор (%)	0,40	0,35
Натрий (%)	0,20	0,20
Усв. лизин (%)	1,23	1,14
Усв. метионин (%)	0,49	0,44
Усв. метионин+цистеин (%)	0,74	0,68
Усв. треонин (%)	0,80	0,74

Исключительно в качестве примера, кормовой продукт для молодняка/свиней на завершающей стадии откорма может содержать один или несколько ингредиентов, указанных далее в таблице, например, в %, приведенных далее в таблице.

Ингредиент	Ростовой рацион/рацион для заключительного периода откорма (%)
Маис	27,5
Соевая мука, 48% СР	15,4
DDGS маиса	20,0
Пшеничные отруби	11,1
Рисовые отруби	12,0
Мука из семян канолы	10,0
Известняк	1,6
Дикальцийфосфат	0,01
Соль	0,4
Витамины и микроминералы для свиней	0,3
Лизин-HCl	0,2
Растительное масло	0,5

Исключительно в качестве примера, описание рациона для молодняка/свиней на откорме может быть таким, как представлено далее в таблице.

Описание рациона
Неочищенный белок (%)	22,60
Обменная энергия свиньи (ккал/кг)	3030
Кальций (%)	0,75
Доступный фосфор (%)	0,29
Усваиваемый лизин (%)	1,01
Усв. метионин+цистеин (%)	0,73
Усваиваемый треонин (%)	0,66

Композицию кормовой добавки, описанную в данном документе, и другие компоненты и/или кормовой продукт, содержащий их, можно применять в любой подходящей форме, такой как твердые или жидкие препараты или их альтернативы. Примеры твердых препаратов включают порошки, пасты, болюсы, капсулы, драже, таблетки, присыпки и гранулы, которые могут быть смачиваемыми, высушенными распылительной сушкой или лиофилизированными. Примеры жидких препаратов включают без ограничения водные, органические или водно-органические растворы, суспензии и эмульсии.

В некоторых вариантах применения композиции кормовой добавки можно смешивать с кормом или вводить в питьевую воду. В одном варианте осуществления диапазон дозировки для введения в воду составляет от приблизительно 1×10³ КОЕ/животное/день до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ/животное/день и более предпочтительно приблизительно 1×10⁷ КОЕ/животное/день.

Подходящие примеры форм включают одно или несколько из порошков, паст, болюсов, гранул, таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, растворов или суспензий, которые могут содержать вкусовые или красящие вещества, для применений с немедленным, отсроченным, модифицированным, длительным, прерывистым или контролируемым высвобождением.

В качестве примера, если композиция кормовой добавки, описанная в данном документе, применяется в твердой форме, она также может содержать один или несколько из наполнителей, таких как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин; разрыхлителей, таких как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоковый крахмал), крахмалгликолят натрия, кроскармеллоза натрия и определенные комплексные силикаты; связующих для гранулирования, таких как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), гидроксипропилцеллюлоза (HPC), сахароза, желатин и гуммиарабик; смазывающих веществ, таких как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк, которые могут быть включены.

Примеры приемлемых в пищевом отношении носителей для применения в получении форм включают, например, воду, солевые растворы, спирт, силикон, воски, вазелиновое масло, растительные масла, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль, липосомы, сахара, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, поверхностно-активные вещества, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры нефтяных жирных кислот, гидроксиметиллцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п.

Предпочтительные наполнители для форм включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли с высокой молекулярной массой.

Для водных суспензий и/или настоек композицию кормовой добавки можно комбинировать с различными подсластителями или вкусовыми веществами, красящим веществом или красителями, с эмульгирующими и/или суспендирующими средствами и с разбавителями, такими как вода, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинациями.

Негигроскопичная молочная сыворотка часто используется в качестве носителя для DFM (особенно бактериальных DFM) и является хорошей средой для инициирования роста.

Бактериальные DFM, содержащие пасты, могут быть составлены с растительным маслом и инертными желатинизирующими ингредиентами.

Грибные продукты могут быть составлены с зерновыми побочными продуктами в качестве носителей.

В одном варианте осуществления предпочтительно композиция кормовой добавки не находится в форме системы микрочастиц, такой как система микрочастиц, показанная в WO2005/123034.

DFM и/или композиция кормовой добавки могут быть предназначены для однократной дозы или могут быть предназначены для ежедневного кормления.

Оптимальное количество композиции кормовой добавки (и каждого ее компонента) для применения в комбинации будет зависеть от продукта, подлежащего обработке, и/или способа приведения в контакт продукта с композицией, и/или предполагаемого применения такового.

Количество DFM и ферментов, используемых в композициях, должно быть достаточным количеством, чтобы быть эффективным и оставаться достаточно эффективным для улучшения характеристик кормовых продуктов для животных, содержащих указанную композицию. Такая длительность эффективности должна достигать по меньшей мере срока применения продукта (например, композиции кормовой добавки или корма, содержащего ее).

Композиция кормовой добавки, описанная в данном документе, может быть комбинирована с (или одним, или несколькими из его составляющих) и другим компонентом, пригодным для употребления животным и способным обеспечивать медицинский или физиологический положительный эффект для потребителя.

В одном варианте осуществления предпочтительно "другой компонент" не является дополнительным ферментом или дополнительным DFM.

Компоненты могут представлять собой пребиотики. Пребиотики, как правило, представляют собой неперевариваемые углеводы (олиго- или полисахариды) или сахароспирт, которые не разрушаются или не всасываются в верхней части пищеварительного тракта. Известные пребиотики, применяемые в коммерческих продуктах и являющиеся полезными, включают инулин (фруктоолигосахарид или FOS) и трансгалактоолигосахариды (GOS или TOS). Подходящие пребиотики включают олигосахарид палатинозу, олигосахарид сои, альгинат, ксантан, пектин, камедь бобов рожкового дерева (LBG), инулин, гуаровую камедь, галактоолигосахарид (GOS), фруктоолигосахарид (FOS), нерастворимый крахмал, лактосахарозу, лактулозу, лактит, мальтитол, мальтодекстрин, полидекстроза (т.е. Litesse®), лактит, лактосахарозу, олигосахариды сои, палатинозу, изомальтоолигосахариды, гликоолигосахариды и ксилоолигосахариды, фрагменты пектина, пищевые волокна, маннанолигосахариды.

Пищевые волокна могут включать некрахмальные полисахариды, такие как арабиноксиланы, целлюлозу и многие другие растительные компоненты, такие как устойчивые декстрины, инулин, лигнин, воски, хитины, пектины, бета-глюканы и олигосахариды.

В одном варианте осуществления в данном документе раскрывается комбинация композиции кормовой добавки (или одного или нескольких ее составляющих) с пребиотиком. Пребиотик можно вводить одновременно (например, совместно в смеси или доставляя одновременно с помощью одинаковых или различных путей) или последовательно (например, с помощью одинаковых или различных путей) с композицией кормовой добавки (или ее составляющими).

Другие компоненты комбинаций включают полидекстрозу, такую как Litesse® и/или мальтодекстрин, и/или лактит. Эти другие компоненты можно необязательно добавлять к композиции кормовой добавки для содействия процессу высушивания и способствования выживанию DFM.

Дополнительные примеры других подходящий компонентов включают одно или несколько из загустителей, желатинирующих средств, эмульгаторов, связующих, модификаторов кристаллов, подсластителей (в том числе искусственных подсластителей), модификаторов реологии, стабилизаторов, антиоксидантов, красителей, ферментов, носителей, сред-носителей, наполнителей, разбавителей, смазывающих веществ, вкусовых веществ, красящих веществ, суспендирующих средств, разрыхлителей, связующих для гранулирования и т.д. Эти другие компоненты могут быть натуральными. Эти другие компоненты можно получать с помощью химических и/или ферментативных методик.

В одном варианте осуществления DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и/или по меньшей мере одну протеазу, может быть заключен в капсулу. В одном варианте осуществления композиция кормовой добавки и/или DFM, и/или ферменты составляют в виде сухого порошка или гранулы, как описано в WO2007/044968 (называемые гранулами TPT) - источник включен в данный документ посредством ссылки.

В одном предпочтительном варианте осуществления DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и/или по меньшей мере одну протеазу, можно применять в комбинации с одним или несколькими липидами.

Например, DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм и/или по меньшей мере одну протеазу, можно применять в комбинации с одним или несколькими липидными мицеллами. Липидная мицелла может представлять собой простую липидную мицеллу или сложную липидную мицеллу. Липидная мицелла может представлять собой совокупность ориентированных молекул амфипатических веществ, такую как липид и/или масло.

Используемый в данном документе термин "загуститель или желатинирующее средство" относится к продукту, который предотвращает разделение путем замедления или предотвращения перемещения частиц, будь то капельки несмешиваемых жидкостей, воздух или нерастворимые твердые вещества. Загустение происходит, когда отдельные гидратированные молекулы вызывают повышение вязкости, замедляя разделение. Желатинирование происходит, когда гидратированные молекулы связываются с образованием трехмерной сетки, которая захватывает частицы, за счет чего иммобилизируя их.

Используемый в данном документе термин "стабилизатор" определяется как ингредиент или комбинация ингредиентов, которые препятствуют изменению продукта (например, кормового продукта) с течением времени.

Используемый в данном документе термин "эмульгатор" относится к ингредиенту (например, ингредиенту корма), который предотвращает разделение эмульсий. Эмульсии представляют собой два несмешиваемых вещества, причем одно, присутствующее в форме капель, содержится внутри другого. Эмульсии могут представлять собой масло-в-воде, где капельной или дисперсной фазой является масло, а непрерывной фазой является вода; или воду-в-масле, где вода становится дисперсной фазой, а непрерывной фазой является масло. Пены, которые представляют собой газ-в-жидкости, и суспензии, которые представляют собой твердое вещество-в-жидкости, также можно стабилизировать посредством применения эмульгаторов.

Используемый в данном документе термин "связующее" относится к ингредиенту (например, ингредиенту корма), который связывает продукт вместе посредством физической или химической реакции. Например, во время "желатинирования" вода абсорбируется, обеспечивая эффект связывания. Однако связующие могут абсорбировать другие жидкости, такие как масла, удерживая их внутри продукта. Связующие, как правило, используются в твердых продуктах или в продуктах с низким содержанием влаги, например, в выпекаемых продуктах, мучных изделиях, пончиках, хлебе и других.

"Носители" или "среды-носители" означают материалы, подходящие для введения DFM и/или ферментов, и включают любой такой материал, известный из уровня техники, например, любую жидкость, гель, растворитель, жидкий разбавитель, солюбилизатор или подобное, который является нетоксичным и который не взаимодействует с какими-либо компонентами композиции с разрушительным характером.

Примеры наполнителей включают одно или несколько из микрокристаллической целлюлозы или других видов целлюлозы, лактозы, цитрата натрия, карбоната кальция, двухосновного фосфата кальция, глицина, крахмала, молочного сахара и полиэтиленгликолей с высокой молекулярной массой.

Примеры разрыхлителей включают одно или несколько из крахмала (предпочтительно кукурузного, картофельного или тапиокового крахмала), крахмалгликолята натрия, кроскармеллозы натрия и определенных комплексных силикатов.

Примеры связующих для гранулирования включают одно или несколько из поливинилпирролидона, гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC), гидроксипропилцеллюлозы (HPC), сахарозы, мальтозы, желатина и гуммиарабика.

Примеры смазывающих веществ включают одно или несколько из стеарата магния, стеариновой кислоты, глицерилбегената и талька.

Примеры разбавителей включают одно или несколько из воды, этанола, пропиленгликоля и глицерина и их комбинаций.

Другие компоненты можно применять одновременно (например, если их смешивают вместе, или даже если их доставляют с помощью различных путей) или последовательно (например, их можно доставлять с помощью различных путей).

Предпочтительно, если композицию кормовой добавки смешивают с другим компонентом (компонентами), DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм, остается жизнеспособным.

В одном варианте осуществления предпочтительно композиция кормовой добавки не содержит хром или органический хром.

В одном варианте осуществления предпочтительно кормовая добавка не содержит глюканазу.

В другом варианте осуществления предпочтительно кормовая добавка не содержит сорбиновую кислоту.

DFM, содержащий(содержащие) по меньшей мере один бактериальный штамм, могут находиться в форме концентратов. Как правило, такие концентраты содержат существенно высокую концентрацию DFM.

Композиции кормовой добавки, описанные в данном документе, могут содержать жизнеспособные клетки (колониеобразующие единицы, CFU), находящиеся в диапазоне от по меньшей мере 10³ КОЕ/г (соответственно, включая по меньшей мере 10⁵ КОЕ/г, например, по меньшей мере 10⁶ КОЕ/г, например, по меньшей мере 10⁷ КОЕ/г, по меньшей мере 10⁸ КОЕ/г, например, от по меньшей мере 10⁹ КОЕ/г) до приблизительно 10¹⁰ КОЕ/г (или даже приблизительно 10¹¹ КОЕ/г или приблизительно 10¹² КОЕ/г).

Если DFM находится в форме концентрата, композиции кормовой добавки могут содержать жизнеспособные клетки в диапазоне от по меньшей мере 10⁹ КОЕ/г до приблизительно 10¹² КОЕ/г, предпочтительно от по меньшей мере 10¹⁰ КОЕ/г до приблизительно 10¹² КОЕ/г.

Порошки, гранулы и жидкие композиции в форме концентратов можно разбавлять водой или ресуспендировать в воде или других подходящих разбавителях, например, подходящей ростовой среде, такой как молоко или минеральные или растительные масла, с получением композиций, готовых к применению.

Композиция кормовой добавки в форме концентратов можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники. Композиции кормовой добавки, описанные в данном документе, могут быть высушены распылением или лиофилизированы с помощью способов, известных из уровня техники.

Типичные способы получения частиц с применением способа сушки распылением предусматривают растворение твердого материала в подходящем растворителе (например, культуры DFM в ферментационной среде). В качестве альтернативы, материал можно суспендировать или эмульгировать в жидкости, не являющейся растворителем, с образованием суспензии или эмульсии. Другие ингредиенты (обсуждаемые выше) или компоненты, такие как противомикробные средства, стабилизирующие средства, красители и средства, способствующие процессу высушивания, можно необязательно добавлять на этой стадии.

Затем раствор распыляют с образованием мелкодисперсного тумана из капель. Капли сразу же попадают в сушильную камеру, где они вступают в контакт с сушильным газом. Растворитель испаряется из капель в сушильный газ с затвердеванием капель, за счет чего образуются частицы. Затем частицы отделяют от сушильного газа и собирают.

Термин "субъект", применяемый в данном документе, обозначает животное, которому должны вводить или ввели композицию кормовой добавки или кормовой продукт, содержащий указанную композицию кормовой добавки.

Используемый в данном документе термин "субъект" означает животное. Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее, птицу, рыбу или ракообразное, включая, например, сельскохозяйственное животное или одомашненное животное (например, домашнего питомца).

В одном варианте осуществления субъект может быть заражен кишечным патогеном.

В качестве примера субъект может иметь один или несколько кишечных патогенов в своем кишечнике или пищеварительном тракте. Например, субъект может иметь один или несколько кишечных патогенов в своем кишечнике или пищеварительном тракте при уровне, который

i) приводит в результате к потере продуктивности животного; и/или

ii) представляет собой клинически значимый уровень; или

iii) представляет собой субклинические уровни.

Кишечный патоген может представлять собой, например, Clostridium perfringens.

Используемое в данном документе выражение "продуктивность животного" может определяться эффективностью корма, и/или приростом веса тела животного, и/или коэффициентом кормоотдачи, и/или усвояемостью питательных веществ в корме (например, усвояемостью аминокислот), и/или усвояемой энергией или метаболизируемой энергией в корме, и/или удержанием азота, и/или способностью животных избегать отрицательных эффектов некротического энтерита, и/или иммунным ответом субъекта.

Предпочтительно "продуктивность животного" определяется эффективностью корма и/или приростом веса тела животного, и/или коэффициентом кормоотдачи.

Под "улучшенной продуктивностью животного" подразумевается, что наблюдается увеличенная эффективность корма и/или увеличенный прирост веса тела, и/или уменьшенный коэффициент кормоотдачи, и/или улучшенная усвояемость питательных веществ или энергии в корме, и/или улучшенное удержание азота, и/или улучшенная способность избегать отрицательных эффектов некротического энтерита, и/или улучшенный иммунный ответ у субъекта в результате применения композиции кормовой добавки в корме по сравнению с кормом, который не содержит указанной композиции кормовой добавки.

Предпочтительно под "улучшенной продуктивностью животного" подразумевается, что имеет место повышенная эффективность корма, и/или повышенный прирост веса тела, и/или сниженный коэффициент кормоотдачи.

Используемый в данном документе термин "эффективность корма" относится к величине прироста веса тела у животного, которая возникает, когда животное питается ad-libitum или поедает определенное количество пищи в течение определенного периода времени.

Под "увеличенной эффективностью корма" подразумевается, что применение композиции кормовой добавки в корме приводит в результате к повышенному приросту веса тела на единицу потребляемого корма по сравнению с животным, питающегося без использования композиции кормовой добавки.

Используемый в данном документе термин "коэффициент кормоотдачи" означает количество корма, cкармливаемого животному для увеличения веса животного на определенную величину.

Улучшенный коэффициент кормоотдачи означает более низкий коэффициент кормоотдачи.

Под "более низким коэффициентом кормоотдачи" или "улучшенным коэффициента кормоотдачи" подразумевается, что применение композиции кормовой добавки в корме приводит в результате к меньшему количеству корма, которое требуется для скармливания животному, чтобы повысить вес животного на определенную величину, по сравнению с количеством корма, необходимым для повышения веса животного на ту же величину, если корм не содержит указанной композиции кормовой добавки.

Используемый в данном документе термин "усвояемость питательных веществ" означает долю питательных веществ, которая исчезает из желудочно-кишечного тракта или определенного участка желудочно-кишечного тракта, например, тонкого кишечника. Усвояемость питательных веществ можно измерить как разницу между тем, что вводят субъекту, и тем, что выходит с фекалиями субъекта, или между тем, что вводят субъекту, и тем, что остается в содержимом определенного участка желудочно-кишечного тракта, например, в подвздошной кишке.

Усвояемость питательных веществ, используемую в данном документе, можно измерить по разнице между поглощением питательного вещества и выделенным питательным веществом с помощью полного сбора экскрементов в течение определенного периода времени; или с использованием инертного маркера, который не абсорбируется животным и позволяет исследователю рассчитывать количество питательного вещества, которое исчезло во всем желудочно-кишечном тракте или в участке желудочно-кишечного тракта. Такой инертный маркер может представлять собой диоксид титана, оксид хрома или нерастворимую в кислоте золу. Усвояемость можно выразить в виде процентного содержания питательного вещества в корме, или в виде единиц массы усваиваемого питательного вещества на единицы массы питательного вещества в корме.

Усвояемость питательных веществ, используемая в данном документе, охватывает усвояемость крахмала, усвояемость жиров, усвояемость белка и усвояемость аминокислот.

Выражение усвояемость энергии, используемое в данном документе, означает валовую энергию потребляемого корма за вычетом валовой энергии фекалий, или валовую энергию потребляемого корма за вычетом валовой энергии оставшегося содержимого в определенном участке желудочно-кишечного тракта животного, например, в подвздошной кишке.

Выражение обменная энергия, используемое в данном документе, относится к кажущейся обменной энергии и означает валовую энергию потребляемого корма за вычетом валовой энергии, содержащейся в фекалиях, моче и газообразных продуктах пищеварения. Усвояемость энергии и обменную энергию можно измерить как разницу между потреблением валовой энергии и валовой энергией, выделенной с фекалиями или содержимым, присутствующим в определенном участке желудочно-кишечного тракта, с использованием тех же способов, что и для измерения усвояемости питательных веществ, с соответствующими поправками на выведение азота для расчета обменной энергии корма. В некоторых вариантах осуществления композиции кормовой добавки могут улучшать усвояемость или переработку гемицеллюлозы из рациона или клетчатки у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект является свиньей.

Выражение удержание азота, используемое в данном документе, означает способность субъекта удерживать азот из рациона, что обуславливает прирост массы тела. Отрицательный баланс азота встречается тогда, когда выведение азота превышает суточное потребление, и часто наблюдается при потере мышечной массы. Положительный баланс азота часто ассоциируется с ростом мышц, особенно у растущих животных. Удержание азота можно измерить как разницу между потреблением азота и выделенным азотом посредством полного сбора экскрементов и мочи в течение определенного периода времени. Понятно, что выделяемый азот включает непереваренный белок корма, эндогенные белковые выделения, микробный белок и азот мочи.

Используемый в данном документе термин "выживание" означает количество субъектов, остающихся живыми. Термин "улучшенное выживание" может служить вариантом выражения "сокращенная смертность".

Используемый в данном документе термин "выход туши" означает величину туши, пропорционально живому весу тела после процесса убоя с коммерческой или экспериментальной целью. Термин туша означает тело животного, которое забито c пищевой целью, с удалением головы, внутренностей, части конечностей и перьев или кожи. Используемый в данном документе термин "выход мяса" означает количество съедобного мяса, пропорционально живому весу тела, или количество определенного мяса, вырезанного пропорционально живому весу тела.

В данном варианте осуществления дополнительно предусматривается способ повышения прироста веса тела у субъекта, например, у сельскохозяйственной птицы или свиньи, предусматривающий скармливание указанному субъекту кормового продукта, содержащего композицию кормовой добавки.

"Повышенный прирост веса" относится к животному с увеличенным весом тела при использовании корма, содержащего композицию кормовой добавки, по сравнению животным при кормлении без использования указанной композиции кормовой добавки.

Используемый в данном документе термин иммунный ответ означает один из многочисленных способов, с помощью которых DFM модулируют иммунную систему животных, включая увеличение продуцирования антител, активацию клеточно-опосредованного иммунитета, активацию провоспалительных цитокинов и усиление передачи сигналов toll-подобных рецепторов. Понятно, что иммунная стимуляция желудочно-кишечного тракта с помощью DFM может предоставлять преимущество для защиты хозяина от заболеваний и что иммуносупрессия желудочно-кишечного тракта может предоставлять преимущество хозяину, поскольку меньшее количество питательных веществ и энергии используется для поддержания иммунной функции.

Предпочтительно иммунный ответ представляет собой клеточный иммунный ответ, который можно измерить путем оценки иммунных маркеров. В другом аспекте популяции патогенов в желудочно-кишечном тракте субъекта могут быть сокращены.

В одном варианте осуществления можно достичь уменьшения выделения питательных веществ в навозе или уменьшения образования аммиака в навозе. Это оказывает положительное влияние на снижение неблагоприятных воздействий для окружающую среду. Например, в предпочтительном варианте осуществления раскрывается способ снижения содержания азота и/или фосфора в навозе субъекта. Таким образом, это уменьшает количество азота и/или фосфора в окружающей среде, что может быть полезным. Для некоторых вариантов применения считается, что DFM, содержащий по меньшей мере один бактериальный штамм в композиции кормовой добавки, описанной в данном документе, может производить эффект пробиотической культуры. Также возможно добавление к композиции кормовой добавки дополнительного пробиотика и/или пребиотиков.

Неограничивающие примеры композиций и способов, раскрытых в данном документе, включают следующие.

1. Композиция кормовой добавки, по сути, состоящая из микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой.

2. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 1, где микробный препарат для приема в пищу представляет собой антипатогенный микробный препарат для приема в пищу.

3. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантами осуществления 1 или 2, где микробный препарат для приема в пищу содержит по меньшей мере три бактериальных штамма, выбранных из группы, состоящей из Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium и Megasphaera и их комбинаций.

4. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 3, где микробный препарат для приема в пищу содержит по меньшей мере три бактериальных штамма, выбранных из группы, состоящей из Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus, Enterococcus spp и Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp и их комбинаций.

5. Композиция кормовой добавки в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2 или 4, где микробный препарат для приема в пищу содержит штаммы 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) Bacillus subtilis.

6. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантами осуществления 1, 2 или 4, где микробный препарат для приема в пищу находится в форме эндоспоры.

7. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 5, где микробный препарат для приема в пищу находится в форме эндоспоры.

8. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантами осуществления 1, 2, 4 или 7, где протеаза представляет собой субтилизин, бациллолизин, щелочную сериновую протеазу, кератиназу или протеазу Nocardiopsis.

9. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 6, где протеаза представляет собой субтилизин, бациллолизин, щелочную сериновую протеазу, кератиназу или протеазу Nocardiopsis.

10. Композиция кормовой добавки, имеющая состав в соответствии с любым из пунктов 1, 2, 4 или 7, где протеаза представляет собой субтилизин из Bacillus amyloliquefaciens.

11. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 6, где протеаза представляет собой субтилизин из Bacillus amyloliquefaciens.

12. Композиция кормовой добавки в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 4 или 7, где протеаза присутствует в дозировке от 1000 PU/г композиции кормовой добавки до 200000 PU/г композиции кормовой добавки.

13. Композиция кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 6, где протеаза присутствует в дозировке от 1000 PU/г композиции кормовой добавки до 200000 PU/г композиции кормовой добавки.

14. Композиция кормовой добавки в соответствии с любым из вариантов осуществления 1, 2, 4 или 7, где DFM присутствует в дозировке от 1×10³ КОЕ/г композиции кормовой добавки до 1×10¹³ КОЕ/г композиции кормовой добавки.

15. Композиция кормовой добавки в соответствии с любым из вариантов осуществления 6, где DFM присутствует в дозировке от 1×10³ КОЕ/г композиции кормовой добавки до 1×10¹³ КОЕ/г композиции кормовой добавки.

16. Способ улучшения продуктивности субъекта, или улучшения усвояемости сырья в корме (например, усвояемость питательных веществ, такая как усвояемость аминокислот), или улучшения удержания азота, или улучшения резистентности субъекта к некротическому энтериту, или улучшения коэффициента кормоотдачи (FCR), или повышения выхода туши или мяса, или улучшения прироста веса тела у субъекта, или улучшения эффективности использования корма у субъекта, или модулирования (например, улучшения) иммунного ответа субъекта, или содействия росту полезных бактерий в желудочно-кишечном тракте субъекта, или сокращения популяций патогенных бактерий в желудочно-кишечном тракте субъекта, или сокращения выделения питательных веществ с навозом, или уменьшения образования аммиака в навозе, или улучшения усвояемости или использования гемицеллюлозы и клетчатки из рациона, при этом способ предусматривает введение микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой.

17. Набор, содержащий композицию кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 1 и инструкции по введению.

18. Способ получения композиции кормовой добавки, предусматривающий получение смеси на основе микробного препарата для приема в пищу, содержащего один или несколько бактериальных штаммов, в комбинации с по меньшей мере одной протеазой и упаковывание.

19. Корм, содержащий композицию кормовой добавки в соответствии с вариантами осуществления 1, 2, 4 или 7.

20. Корм, содержащий композицию кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 6.

21. Премикс, содержащий композицию кормовой добавки в соответствии с вариантом осуществления 1, и по меньшей мере один минерал, и/или по меньшей мере один витамин.

ПРИМЕРЫ

Если в данном документе не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) предоставляют для специалиста общий словарь для многих терминов, используемых в данном раскрытии.

Настоящее изобретение дополнительно определено в следующих примерах. Следует понимать, что примеры, хотя и показывают определенные варианты осуществления, приводятся исключительно в целях иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и примеров специалист в данной области техники сможет установить существенные характеристики настоящего изобретения, и не отклоняясь от его идеи и объема, сможет осуществить различные изменения и модификации для его адаптации к различным областям применения и условиям.

Пример 1

Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста и общую усвояемость питательных веществ в тракте у свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА

Использование животных и экспериментальный протокол одобрены Комитетом по экспериментам на животных. Применяемый для кормления основной рацион составляли с соблюдением баланса в отношении энергии и белка и чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012). Распространенный маркер усвояемости (оксид хрома) добавляли в количестве 0,30% для обеспечения возможности определения усвояемости компонентов рациона.

Основной рацион разделяли на порции которые впоследствии обрабатывали ферментами или микробными препаратами для приема в пищу (DFM) или комбинацией и того и другого, как определено в таблице 2. Во время смешивания корма мешалку промывали для предотвращения перекрестного загрязнения рациона. Образцы собирали из каждого рациона для обработки в начале, в середине и в конце каждой партии и смешивали вместе для подтверждения ферментативной активности и количества DFM в корме. Образцы из каждого рациона для обработки отбирали во время смешивания и хранили при -20°C до того, как они потребуются.

Таблица 1. Примеры композиции основного рациона для свиней с весом тела от 20 до 50 кг (%, как кормили)
Наименования	Основной рацион
Ингредиенты, %
Кукуруза	42,33
Сушеная кукурузная барда с растворимыми веществами	20,00
Соевая мука	19,88
Рапсовая мука	2,00
Пшеница	5,00
Рисовые отруби	3,00
Сало	2,00
Меласса	3,00
L-лизин HCl	0,24
DL-метионин	0,02
Соль	0,30
Известняк	1,18
Дикальцийфосфат	0,45
Витамины1 и премикс минералов2	0,30
Оксид хрома	0,30
Всего	100,00
Расчетная композиция
Сухое вещество, %	87,55
Неочищенный белок, %	19,24
Усвояемая энергия, МДж/кг	14,61
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке лизин, %	0,91
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке метионин, %	0,30
Стандартизированные усвояемые в подвздошной кишке метионин и цистеин, %	0,55
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке треонин, %	0,54
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке триптофан, %	0,16
Нейтральная очищающая клетчатка, %	17,59
Кислая очищающая клетчатка, %	5,97
Кальций, %	0,72
Усвояемый фосфор, %	0,33
Анализируемая композиция
Сухое вещество, %	88,23
Неочищенный белок, %	19,56
Нейтральная очищающая клетчатка, %	17,16
Кислая очищающая клетчатка, %	5,75
1Обеспеченные на килограмм рациона: 10000 МЕ витамина A; 1300 МЕ витамина D3; 40 МЕ витамина E; 3,0 мг витамина K (комплекс менадион бисульфата); 5,2 мг витамина B2; 2,6 мг витамина B6; 26 мкг витамина B12; 32 мг ниацина и 20 мг d-пантотеновой кислоты (в виде d-кальция пантотената). 2Обеспеченный на килограмм рациона: 19 мг Cu (в виде CuSO4⋅5H2O); 70 мг Fe (в виде FeSO4•7H2O); 50 мг Zn (в виде ZnSO4); 50 мг Mn (в виде MnO2); 0,5 мг I (в виде KI); 0,3 мг Co (в виде CoSO4⋅7H2O) и 0,2 мг Se (в виде Na2SeO3•5H2O). 3ME рациона рассчитывали в соответствии с NRC (2012).

Таблица 2. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Контроль, основной (NC)	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1	1,5×105	Н/Д
3	NC+протеаза2	Н/Д	6000
4	NC+DFM+протеаза	1,5×105	6000

¹ 3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

²Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Эксперимент планируют и проводят в соответствии с фазой роста (от ≤25 до ~60 кг веса тела).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

В 42-дневном эксперименте использовали в общем 96 растущих свиней [(Yorkshire × Landrace) × Duroc] со средним BW 22,6±1,9 кг. Свиней случайным образом распределяли по 4 экспериментальным рационам в соответствии с их исходным BW. Имеется 8 повторяющихся загонов на обработку с 3 свиньями на загон. Боровов и свиней разделяли на четыре загона боровов и четыре загона свиней на каждую обработку. Всех свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum.

ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА, А ТАКЖЕ СБОР И АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ ФЕКАЛИЙ

Вес тела и потребление корма измеряли еженедельно для контроля среднего суточного прироста (ADG), среднего суточного потребления корма (ADFI) и коэффициента кормоотдачи (FCR). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте (ATTD, %) GE и N устанавливали путем добавления в рацион оксида хрома (0,3%) в качестве инертного индикатора. Свиньи питались рационом, смешанный с оксидом хрома, за одну неделю до окончания испытания (день 35). Случайные образцы свежих фекалий собирали от по меньшей мере 2 свиней на загон посредством ректального массажа (день 40, 41 и 42) и хранили в морозильной камере при -20°C до анализа. Перед химическим анализом образцы фекалий размораживали и сушили при 60°С в течение 72 ч., после чего их тонко измельчали до размера, который может проходить через сито в 1 мм. Все образцы корма и фекалий затем анализировали в отношении содержания сухого вещества, валовой энергии, азота, кислой очищающей клетчатки (ADF) и нейтральной очищающей клетчатки (NDF), следуя процедурам, описанным AOAC (2000). Хром анализировали посредством спектрометрии УФ-поглощения (Shimadzu, UV-1201, Шимадзу, Киото, Япония) в соответствии со способом, описанным Williams et al. (1962). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте неочищенного белка рассчитывали умножая значение азота на фактор конверсии 6,25. Улучшения в области усвояемой энергии (ккал) с добавлением каждой кормовой добавки по сравнению с отрицательным контролем рассчитывали с применением следующих уравнений:

1. Проанализированная GE рациона (ккал/кг)/100 * ATTD энергии=усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг),

2. Улучшение в области усвояемой энергии (ккал/кг)=средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) группы на NC - средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) повторности DFM+протеаза.

Все данные подвергали статистическому анализу в виде рандомизированной полной блок-схемы с использованием смешанных процедур SAS (SAS Inst. Inc., Кэри, Северная Каролина), и загон использовали в качестве статистической единицы. Исходный BW использовали в качестве ковариата для ADFI и ADG. Значимость показана при P<0,05.

Показатель роста. Добавление к рациону на основе кукурузы комбинации DFM (Bacillus) и протеазы существенно улучшает средний суточный прирост и коэффициент эффективности кормоотдачи (P<0,05) по сравнению с основным рационом в виде отрицательного контроля без каких-либо кормовых добавок (фигура 1). Добавление DFM (Bacillus) и протеазы отдельно к рационам на основе кукурузы не приводило к существенному улучшению среднего суточного прироста или коэффициента эффективности кормоотдачи по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля.

Наблюдаемая общая усвояемость питательных веществ в тракте. Все из наблюдаемой общей усвояемости в тракте сухого вещества, азота, усвояемой энергии, кислой очищающей клетчатки и нейтральной очищающей клетчатки существенно улучшаются при добавлении DFM в комбинации с протеазой по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля (таблица 3; P<0,05). Такое улучшение усвояемости питательных веществ в результате кормления с применением комбинации DFM+протеаза равнялось 3% для азота, 9% для ADF и 3,5% для NDF по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля. Однако при отдельном добавлении не отмечается различие в наблюдаемой общей усвояемости в тракте сухого вещества, азота, усвояемой энергии, кислой очищающей клетчатки и нейтральной очищающей клетчатки между рационом в виде отрицательного контроля и при обработке либо DFM, либо протеазой. Комбинация DFM и протеазы увеличивала усвояемую энергию рациона на 56,8 ккал/кг по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля (P<0,05), тогда как добавки при отдельном добавлении подавляли усвояемость энергии рациона.

Таблица 3. Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы (P3000) при приеме в пищу отдельно или в комбинации на наблюдаемую общую усвояемость питательных веществ в тракте

	NC	DFM	Протеаза	DFM+протеаза	SE
Сухое вещество, %	80,39a	80,21a	80,59a	82,07b	0,41
Азот, %	77,40a	78,11ab	77,74a	80,29c	0,51
DE, %	79,32ab	78,10a	76,56a	80,53bc	0,47
ADF1, %	44,17a	46,87a	48,64ab	53,30bc	1,65
NDF2, %	61,08a	61,73a	61,18a	64,80b	0,40
DE, ккал/кг 3		-128,3	-56,7	+56,8

^a,b,c Среднее значение в той же строке с различными верхними индексами отличается (P<0,05),

¹ADF: кислая очищающая клетчатка,

²NDF: нейтральная очищающая клетчатка,

³DE (усвояемая энергия): Различие в усвояемой энергии (ккал/кг) относительно рациона в виде отрицательного контроля.

Пример 2

Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста, общую усвояемость питательных веществ в тракте и выделение аммиака с фекалиями у свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА

Использование животных и экспериментальный протокол одобрены Комитетом по экспериментам на животных. Применяемый для кормления основной рацион составляли с соблюдением баланса в отношении энергии и белка и чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 2,1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012). Распространенный маркер усвояемости (оксид хрома) добавляли в количестве 3 г/кг для обеспечения возможности определения усвояемости компонентов рациона.

Основной рацион разделяли на порции которые впоследствии обрабатывали ферментами или микробными препаратами для приема в пищу (DFM) или комбинацией и того и другого, как определено в таблице 2.2. Во время смешивания корма мешалку промывали для предотвращения перекрестного загрязнения рациона. Образцы собирали из каждого рациона для обработки в начале, в середине и в конце каждой партии и смешивали вместе для подтверждения ферментативной активности и количества DFM в корме. Образцы из каждого рациона для обработки отбирали во время смешивания и хранили при -20°C до того, как они потребуются.

Таблица 2.1. Примеры композиции основного рациона для свиней с весом тела от 20 до 50 кг (%, как кормили)
Наименования	Основной рацион
Ингредиенты, %
Кукуруза	55,61
Пшеничный корм	11,06
Сушеная кукурузная барда с растворимыми веществами (DDGS)	5,00
Соевая мука	19,08
Рапсовая мука	2,00
Мука из жмыха семян хлопчатника	4,00
DL-метионин	0,05
L-треонин	0,05
Оксид хрома	0,30
Biolys 60	0,25
Бентонит	0,50
Бикарбонат натрия	0,10
Соль	0,30
Известняк	0,72
Дикальцийфосфат	0,42
Хлорид холина 50%	0,05
Премикс витамины1/микроэлементы2 для свиньи	0,50
Axtra PHY3 (0,12 P; 0,093 Ca)	0,01
Всего	100,00
Расчетная композиция
Сухое вещество, %	88,28
Неочищенный белок, %	19,03
Усвояемая энергия, МДж/кг	13,39
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке лизин, %	0,86
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке метионин, %	0,33
Стандартизированные усвояемые в подвздошной кишке метионин и цистеин, %	0,56
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке треонин, %	0,56
Стандартизированный усвояемый в подвздошной кишке триптофан, %	0,16
Нейтральная очищающая клетчатка, %	15,64
Кальций, %	0,66
Усвояемый фосфор, %	0,31

¹Обеспеченные на килограмм рациона: 10000 МЕ витамина A; 1300 МЕ витамина D₃; 40 МЕ витамина E; 3,0 мг витамина K (комплекс менадион бисульфата); 5,2 мг витамина B₂; 2,6 мг витамина B₆; 26 мкг витамина B₁₂; 32 мг ниацина и 20 мг d-пантотеновой кислоты (в виде d-кальция пантотената).

²Обеспеченные на килограмм рациона: 19 мг Cu (в виде CuSO₄⋅5H₂O); 70 мг Fe (в виде FeSO₄⋅7H₂O); 50 мг Zn (в виде ZnSO₄); 50 мг Mn (в виде MnO₂); 0,5 мг I (в виде KI); 0,3 мг Co (в виде CoSO₄⋅7H₂O) и 0,2 мг Se (в виде Na₂SeO₃⋅5H₂O).

³Дополнительная фитаза (Danisco UK Ltd).

Таблица 2.2. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Контроль, основной (NC)	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1	1,5×105	Н/Д
3	NC+протеаза2	Н/Д	5000
4	NC+DFM+протеаза	1,5×105	5000

¹ 3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

²Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Эксперимент планируют и проводят в соответствии с фазой роста (от ≤25 до ~60 кг веса тела).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

В 42-дневном эксперименте использовали в общем 128 растущих свиней [(Yorkshire × Landrace) × Duroc] со средним BW 24,99±1,84 кг. Свиней случайным образом распределяли по 4 экспериментальным рационам в соответствии с их исходным BW. Имеется 8 повторяющихся загонов на обработку с 4 свиньями на загон. Боровов и свиней разделяли на четыре загона боровов и четыре загона свиней на каждую обработку. Всех свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum.

ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА, А ТАКЖЕ СБОР И АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ ФЕКАЛИЙ

Вес тела и потребление корма измеряли еженедельно для контроля среднего суточного прироста (ADG), среднего суточного потребления корма (ADFI) и коэффициента кормоотдачи (FCR). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте (ATTD) GE и N устанавливали путем добавления в рацион оксида хрома (0,3%) в качестве инертного индикатора. В течение испытания свиньи питались рационом, смешанным с оксидом хрома. Случайные образцы свежих фекалий собирали от по меньшей мере 2 свиней на загон посредством ректального массажа (день 21 и 42) и хранили в морозильной камере при -20°C до анализа. Перед химическим анализом образцы фекалий размораживали и сушили при 60°С в течение 72 ч., после чего их тонко измельчали до размера, который может проходить через сито в 1 мм. Все образцы корма и фекалий затем анализировали в отношении содержания сухого вещества, валовой энергии, азота, кислой очищающей клетчатки (ADF) и нейтральной очищающей клетчатки (NDF), следуя процедурам, описанным AOAC (2000). Хром анализировали посредством спектрометрии УФ-поглощения (Shimadzu, UV-1201, Шимадзу, Киото, Япония) в соответствии со способом, описанным Williams et al. (1962). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте неочищенного белка рассчитывали умножая значение азота на фактор конверсии 6,25. Улучшения в области усвояемой энергии (ккал) с добавлением каждой кормовой добавки по сравнению с отрицательным контролем рассчитывали с применением следующих уравнений:

1. Проанализированная GE рациона (ккал/кг)/100 * ATTD энергии=усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг),

2. Улучшение в области усвояемой энергии (ккал/кг)=средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) группы на NC - средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) повторности DFM+протеаза.

ВЫДЕЛЕНИЕ АММИАКА С ФЕКАЛИЯМИ

Для анализа концентрации NH₃ в фекалиях 300 г образцов свежих фекалий собирали от по меньшей мере двух свиней на загон и переносили в герметичную коробку и ферментировали в инкубаторе (35°C). Концентрацию NH₃ затем анализировали с применением зонда для обнаружения газа (Gastec Corp., Канагава, Япония) на день 7.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Все данные подвергали статистическому анализу в виде рандомизированной полной блок-схемы с использованием смешанных процедур SAS (SAS Inst. Inc., Кэри, Северная Каролина), и загон использовали в качестве статистической единицы. Исходный BW использовали в качестве ковариата для ADFI и ADG. Значимость показана при P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатель роста. Добавление к рациону на основе кукурузы комбинации DFM (Bacillus) и протеазы существенно улучшает средний суточный прирост и коэффициент эффективности кормоотдачи (P<0,05) по сравнению с основным рационом в виде отрицательного контроля без каких-либо кормовых добавок (фигура 2). Добавление DFM (Bacillus) и протеазы отдельно к рационам на основе кукурузы также улучшает средний суточный прирост и коэффициент эффективности кормоотдачи (P<0,05) по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля, однако; величина улучшения была меньше, чем наблюдалась для комбинации протеаза+DFM.

Наблюдаемая общая усвояемость питательных веществ в тракте. Как в день 21, так и 42, наблюдаемая общая усвояемость в тракте сухого вещества и неочищенного белка улучшается при добавлении DFM в комбинации с протеазой по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля (таблица 2.3; P<0,05). Такое улучшение усвояемости питательных веществ в результате кормления с применением комбинации DFM+протеаза равнялось 5% для сухого вещества, 5% для азота, и 2% как для NDF, так и ADF по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля в день 21, и 5% для сухого вещества, 6% для азота, 6% для ADF и 2% для NDF по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля в день 42. Однако при отдельном добавлении не наблюдается различие в наблюдаемой общей усвояемости в тракте сухого вещества и азота между рационом в виде отрицательного контроля и при обработке либо DFM, либо протеазой (P>0,05). В день 21 обработка протеазой и DFM приводила в результате к численно более высокой наблюдаемой общей усвояемости в тракте усвояемой энергии, ADF и NDF, чем все другие обработки. В день 42, комбинация протеазы и DFM численно увеличивала наблюдаемую общую усвояемость в тракте усвояемой энергии, NDF и ADF. Реакцию синергизма по усвояемой энергии наблюдали между протеазой и DFM, где комбинация высвобождала дополнительные 181,3 ккал/кг по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля и данное значение было больше, чем сумма дополнительной усвояемой энергии, которая могла быть получена благодаря только DFM или протеазе.

Таблица 2.3. Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на наблюдаемую общую усвояемость питательных веществ в тракте.

	NC	DFM	Протеаза	DFM+протеаза	SE
День 21
Сухое вещество, %	76,70b	77,92ab	78,37ab	81,67a	1,26
Азот, %	75,85b	76,77b	76,54b	80,96a	1,06
Валовая энергия, %	77,94	75,14	76,09	79,39	1,40
ADF1, %	50,12	50,01	49,73	52,41	2,54
NDF2, %	59,29	58,71	58,64	61,05	1,93
День 42
Сухое вещество, %	73,54b	74,49ab	73,63b	78,84a	1,58
Азот, %	75,06b	75,72b	75,41b	81,38a	1,67
Валовая энергия, %	75,53	75,21	75,74	77,54	1,54
ADF1, %	47,48b	53,52a	54,39a	53,66a	2,54
NDF2, %	60,00	62,53	62,14	62,02	1,98
DE, ккал/кг 3		+101,7	+10,3	+181,3

^a,b,c Среднее значение в той же строке с различными верхними индексами отличается (P<0,05),

¹ADF: кислая очищающая клетчатка,

²NDF: нейтральная очищающая клетчатка,

³DE: Различие в усвояемой энергии (ккал/кг) относительно рациона в виде отрицательного контроля.

Выделение аммиака с фекалиями

Добавление только протеазы к рациону на основе кукурузы не уменьшало выделение аммиака с фекалиями по сравнению с отрицательным контролем или обработкой только DFM (фигура 3). По сравнению с обработкой отрицательного контроля кормление с применением только DFM уменьшало выделение аммиака (P<0,05). Однако, если свиней кормили с применением комбинации протеазы и DFM, реакция синергизма была очевидна, при этом величина уменьшения выделения аммиака была больше (уменьшение концентрации аммиака на 17% по сравнению с отрицательным контролем), чем сумма уменьшения, которая могла быть получена благодаря только отдельным обработкам (P<0,05).

Пример 3

Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста и общую усвояемость питательных веществ в тракте у свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ И ОКРУЖАЮЩАЯ СРЕДА

Использование животных и экспериментальный протокол одобрены Комитетом по экспериментам на животных. Применяемый для кормления основной рацион составляли с соблюдением баланса в отношении энергии и белка и чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 3.1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012). Распространенный маркер усвояемости (оксид хрома) добавляли в количестве 3 г/кг для обеспечения возможности определения усвояемости компонентов рациона.

Основной рацион разделяли на порции которые впоследствии обрабатывали ферментами или микробными препаратами для приема в пищу (DFM) или комбинацией и того и другого, как определено в таблице 3.2. Во время смешивания корма мешалку промывали для предотвращения перекрестного загрязнения рациона. Образцы собирали из каждого рациона для обработки в начале, в середине и в конце каждой партии и смешивали вместе для подтверждения ферментативной активности и количества DFM в корме.

Таблица 3.1. Примеры композиции основного рациона для свиней с весом тела от 20 до 50 кг (%, как кормили)
Наименования	Основной рацион
Ингредиенты, %
Кукуруза	52,94
Соевая мука,	18,20
Рисовые отруби,	12,50
Пшеничные отруби	7,83
Меласса,	2,50
Рыбная мука,	1,50
Жир рыб	1,00
Мясо-костная мука	1,00
Порошок карбоната кальция	0,75
Соль	0,68
Органическая кислота (фумаровая, лимонная, яблочная)	0,30
Премикс витаминов и микроэлементов1,2	0,25
Корм Klino (глина)	0,20
L-лизин HCL	0,17
DL-метионин	0,05
Дикальцийфосфат, 17%	0,05
Хлорид холина 60% veg-носитель	0,05
L-треонин, 95,8%	0,03
Всего	100,00
Расчетная композиция
Сухое вещество, %	86,56
Неочищенный белок, %	17,13
Наблюдаемый усвояемый в подвздошной кишке лизин, %	0,82
Наблюдаемый усвояемый в подвздошной кишке метионин, %	0,29
Наблюдаемые усвояемые в подвздошной кишке метионин и цистеин, %	0,50
Наблюдаемый усвояемый в подвздошной кишке треонин, %	0,49
Наблюдаемый усвояемый в подвздошной кишке триптофан, %	0,15
Кальций, %	0,89
Усвояемый фосфор, %	1,30
1Обеспеченные на килограмм рациона: 10000 МЕ витамина A; 1300 МЕ витамина D3; 40 МЕ витамина E; 3,0 мг витамина K (комплекс менадион бисульфата); 5,2 мг витамина B2; 2,6 мг витамина B6; 26 мкг витамина B12; 32 мг ниацина и 20 мг d-пантотеновой кислоты (в виде d-кальция пантотената). 2Обеспеченные на килограмм рациона: 19 мг Cu (в виде CuSO4⋅5H2O); 70 мг Fe (в виде FeSO4⋅7H2O); 50 мг Zn (в виде ZnSO4); 50 мг Mn (в виде MnO2); 0,5 мг I (в виде KI); 0,3 мг Co (в виде CoSO4⋅7H2O) и 0,2 мг Se (в виде Na2SeO3⋅5H2O).

Таблица 3.2. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Контроль, основной (NC)	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1	1,5×105	Н/Д
3	NC+протеаза2	Н/Д	5000
4	NC+DFM+протеаза	1,5×105	5000

¹ 3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

²Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Эксперимент планируют и проводят в соответствии с фазой роста (от ≤25 до ~60 кг веса тела).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

В 42-дневном эксперименте использовали в общем 128 растущих свиней [(Yorkshire × Landrace) × Duroc]. Свиней случайным образом распределяли по 4 экспериментальным рационам в соответствии с их исходным BW. Имеется 8 повторяющихся загонов на обработку с 3 свиньями на загон. Боровов и свиней разделяли на четыре загона боровов и четыре загона свиней на каждую обработку. Всех свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum.

ПОКАЗАТЕЛЬ РОСТА, А ТАКЖЕ СБОР И АНАЛИЗ ОБРАЗЦОВ ФЕКАЛИЙ

Вес тела и потребление корма измеряли еженедельно для контроля среднего суточного прироста (ADG), среднего суточного потребления корма (ADFI) и коэффициента кормоотдачи (FCR). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте (ATTD) GE и N устанавливали путем добавления в рацион оксида хрома (0,3%) в качестве инертного индикатора. Свиньи питались рационом, смешанным с оксидом хрома на протяжении испытания. Случайные образцы свежих фекалий собирали от по меньшей мере 2 свиней на загон посредством ректального массажа (день 21 и 42) и хранили в морозильной камере при -20°C до анализа. Перед химическим анализом образцы фекалий размораживали и сушили при 60°С в течение 72 ч, после чего их тонко измельчали до размера, который может проходить через сито в 1 мм. Все образцы корма и фекалий затем анализировали в отношении содержания сухого вещества, валовой энергии, азота, кислой очищающей клетчатки (ADF) и нейтральной очищающей клетчатки (NDF), следуя процедурам, описанным AOAC (2000). Хром анализировали посредством спектрометрии УФ-поглощения (Shimadzu, UV-1201, Шимадзу, Киото, Япония) в соответствии со способом, описанным Williams et al. (1962). Наблюдаемую общую усвояемость в тракте неочищенного белка рассчитывали, умножая значение азота на фактор конверсии 6,25. Улучшения в области усвояемой энергии (ккал) с добавлением каждой кормовой добавки по сравнению с отрицательным контролем рассчитывали с применением следующих уравнений:

1. Проанализированная GE рациона (ккал/кг)/100 * ATTD энергии=усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг),

2. Улучшение в области усвояемой энергии (ккал/кг)=средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) группы на NC - средняя усвояемая энергия при кормлении (ккал/кг) повторности DFM+протеаза.

КОНЦЕНТРАЦИЯ АММИАКА В ФЕКАЛИЯХ

Для анализа концентрации NH₃ в фекалиях 300 г образцов свежих фекалий собирали от по меньшей мере двух свиней на загон и переносили в герметичную коробку и ферментировали в инкубаторе (35°C). Концентрацию NH₃ затем анализировали с применением зонда для обнаружения газа (Gastec Corp., Канагава, Япония) на день 7.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Все данные подвергали статистическому анализу в виде рандомизированной полной блок-схемы с использованием смешанных процедур SAS (SAS Inst. Inc., Кэри, Северная Каролина), и загон использовали в качестве статистической единицы. Исходный BW использовали в качестве ковариата для ADFI и ADG. Значимость показана при P < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатель роста. Добавление к рациону на основе кукурузы комбинации DFM (Bacillus) и протеазы существенно улучшает средний суточный прирост и коэффициент эффективности кормоотдачи (P < 0,05) по сравнению с основным рационом в виде отрицательного контроля без каких-либо кормовых добавок (фигура 4). Добавление DFM (Bacillus) и протеазы однократно к рационам на основе кукурузы также улучшает средний суточный прирост и коэффициент эффективности кормоотдачи (P < 0,05) по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля, однако; величина улучшения была значительно меньше (P < 0,05), чем наблюдалась для комбинации протеаза+DFM.

Наблюдаемая общая усвояемость питательных веществ в тракте. Как в день 21, так и 42 наблюдаемая общая усвояемость в тракте сухого вещества и азота улучшается при добавлении DFM в комбинации с протеазой по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля и добавками при приеме в пищу отдельно (таблица 3.3; P < 0,05). Такое улучшение усвояемости питательных веществ в результате кормления с применением комбинации DFM+протеаза равнялось 3% для сухого вещества, 5,5% для ADF и 4,5% как для NDF, так и азота по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля в день 21, и 3% для сухого вещества, 4% для азота, 6% для ADF и 3,5% для NDF по сравнению с рационом в виде отрицательного контроля в день 42. В день 21 обработка протеазой и DFM приводила в результате к численно более высокой наблюдаемой общей усвояемости в тракте усвояемой энергии и ADF, чем все другие обработки. Также в день 21 комбинация DFM+протеаза существенно увеличивала наблюдаемую общую усвояемость в тракте NDF по сравнению с отрицательным контролем и обработкой только протеазой. В день 42 комбинация протеазы и DFM численно увеличивала наблюдаемую общую усвояемость в тракте NDF и ADF, по сравнению со всеми другими обработками. Дополнительно, комбинация DFM+протеаза существенно увеличивает наблюдаемую общую усвояемость в тракте энергии по сравнению с отрицательным контролем и обработками только протеазой (P < 0,05). Дополнительная усвояемая энергия (ккал/кг), высвобожденная посредством обработки DFM+протеаза была больше, чем усвояемая энергия, высвобожденная посредством обработок только DFM или протеазой.

Таблица 3.3. Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на наблюдаемую общую усвояемость питательных веществ в тракте.

	NC	DFM	Протеаза	DFM+протеаза	SE
День 21
Сухое вещество, %	78,57b	80,31b	80,07b	81,52a	0,32
Азот, %	76,99c	79,02b	78,94b	81,64a	0,62
Валовая энергия, %	78,45	78,44	78,46	79,87	0,45
ADF1, %	48,56	51,55	50,91	53,94	2,09
NDF2, %	56,02c	58,44ab	57,23bc	60,43a	0,81
День 42
Сухое вещество, %	75,35c	76,88b	76,04bc	78,33a	0,46
Азот, %	72,56c	74,58b	73,88bc	76,34a	0,52
Валовая энергия, %	73,18c	75,77ab	74,58b	77,28a	0,59
ADF1, %	50,06	51,90	51,38	55,97	2,20
NDF2, %	57,10	59,81	58,16	60,60	0,17
DE, ккал/кг 3		+84	+203,5	+234,5

^a,b,c Среднее значение в той же строке с различными верхними индексами отличается (P<0,05),

¹ADF: кислая очищающая клетчатка,

²NDF: нейтральная очищающая клетчатка,

³DE: Различие в усвояемой энергии (ккал/кг) относительно рациона в виде отрицательного контроля.

Выделение аммиака с фекалиями. Добавление комбинации протеаза+DFM к рациону на основе кукурузы существенно уменьшало выделение аммиака с фекалиями по сравнению с отрицательным контролем (фигура 5). Хотя DFM и протеаза при приеме в пищу отдельно численно уменьшали выделение аммиака с фекалиями по сравнению с контролем, комбинирование протеазы и DFM вместе приводило в результате к наибольшему уменьшению (уменьшение на 11% по сравнению с отрицательным контролем) концентрации аммиака в фекалиях.

PKY1312 - Пример 4

Эффекты комбинации микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы на показатель роста свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

Всего 180 свиней (BW=23,15±2,66 кг) одинакового количества боровов и свиней отбирали для 1 из 3 вариантов рациона для обработки: 1) Отрицательный контроль (NC) 2) NC+DFM и 3) NC+протеаза+DFM (таблица 4.1). Присутствовало по 4 свиньи на загон при 15 загонах (8 загонов для свиней и 7 загонов для боровов) на каждую обработку. Свиньям обеспечивали доступ к корму и воде ad libitum. Рационы составляли так, чтобы они соответствовали или превосходили потребности в питательных веществах и энергии NRC 2012, и составляли 3 фазы (таблица 4.2). Расчетная химическая композиция рационов фазы 2 и 3 описана в таблице 4.3. Фазы 1, 2 и 3 вводили в пищу в течение 41, 45 и 23 дней, соответственно при общем периоде проведения эксперимента, составляющем 109 дней. Свиней и кормушки взвешивали еженедельно для подсчета среднего суточного прироста (ADG), среднего суточного потребления корма (ADFI) и коэффициента кормоотдачи (FCR).

Таблица 4.1. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Контроль, основной (NC)	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1	1,5×105	Н/Д
3	NC+DFM+протеаза2	1,5×105	6000

¹ 3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

² Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Таблица 4.2. Композиция ингредиентов (%) экспериментальных рационов на основании скормленного

	Фаза 1			Фаза 2			Фаза 3
Наименование, %	NC	DFM	DFM+P	NC	DFM	DFM+P	NC	DFM	DFM+P
Кукуруза	43,39	43,39	43,39	45,41	45,41	45,41	55,43	55,43	55,43
Кукурузный DDGS	25,00	25,00	25,00	45,22	45,22	45,22	15,00	15,00	15,00
Соевая мука	19,00	19,00	19,00	14,12	14,12	14,12	11,00	11,00	11,00
Соевое масло	0,50	0,50	0,50	0,50	0,50	0,50	1,00	1,00	1,00
Премикс винаминов1	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15
Премикс минералов2	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15	0,15
Соль	0,35	0,35	0,35	0,35	0,35	0,35	0,35	0,35	0,35
Известняк	1,10	1,10	1,10	0,81	0,81	0,81	0,66	0,66	0,66
L-лизин HCL	0,25	0,25	0,25	0,17	0,17	0,17	1,95	1,95	1,95
L-треонин	0,10	0,10	0,10	-	-	-	0,10	0,10	0,10
Соевая шелуха	5,00	5,00	5,00	5,04	5,04	5,04	8,00	8,00	8,00
Пшеничные отруби3	5,00	5,00	5,00	8,07	8,07	8,07	8,00	8,00	8,00
NC4	0,01	-	-	0,01	-	-	0,01	-	-
DFM4	-	0,01	-	-	0,01	-	-	0,01	-
DFM+ протеаза5	-	-	0,025	-	-	0,025	-	-	0,025
DFM6	-	0,006	0,006	-	0,006	0,006	-	0,006	0,006

¹Композиция: Обеспеченный на килограмм рациона: 6600 МЕ витамина A; 880 МЕ витамина D₃; 44 МЕ витамина E; 6,4 мг витамина K (комплекс менадион бисульфата); 4,0 мг тиамина; 8,8 мг рибофлавина; 4,4 мг пиридоксина; 33 мкг витамина B12; 1,3 мг фолиевой кислоты; 44 мг ниацина.

²Композиция: Обеспеченный на килограмм рациона 131 мг Zn в виде ZnO; 131 мг Fe в виде FeSO₄⋅H₂O; 45 мг Mn в виде MnO; 13 мг Cu в виде CuSO₄⋅5H₂O; 1,5 мг I в виде CaIO₆; 0,23 мг Co в виде CoCO₃; 0,28 мг Se в виде Na₂O₃Se.

²Обеспеченный на килограмм рациона: 131 мг Zn в виде ZnO; 131 мг Fe в виде FeSO₄⋅H₂O; 45 мг Mn в виде MnO; 13 мг Cu в виде CuSO₄⋅5H₂O; 1,5 мг I в виде CaIO₆; 0,23 мг Co в виде CoCO₃; 0,28 мг Se в виде Na₂O₃Se.

³Содержит менее 9,5% мелкозернистых частиц.

⁴Обеспеченный в количестве 100 г на метрическую тонну.

⁵Обеспеченный в количестве 250 г на метрическую тонну.

⁶DFM=микробный препарат для приема в пищу; добавленный в количестве 60 г на метрическую тонну.

Таблица 4.3. Расчетная химическая композиция (%) экспериментальных рационов в фазе 2 и 3, на основе DM¹

	Фаза 2			Фаза 3
Наименование, %	NC	DFM	DFM+P	NC	DFM	DFM+P
Сухое вещество, %	88,12	88,41	88,62	88,68	88,39	88,55
Валовая энергия, ккал/кг	4,558	4,539	4,532	4,490	4,494	4,524
Неочищенный белок, %	3,47	3,48	3,36	2,61	2,93	2,76
Углерод, %	45,98	45,93	45,78	45,40	45,46	45,76
Сера, %	0,36	0,36	0,35	0,27	0,28	0,25
NDF, %2	21,30	21,32	21,52	20,42	20,60	20,84

¹DM=сухое вещество,

²NDF=нейтральная очищающая клетчатка.

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Данные анализировали с применением процедуры MIXED SAS (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина). Для показателя роста загон использовали в качестве статистической единицы. Для всех данных модель включала обработку в качестве фиксированного эффекта и загон в качестве случайного эффекта. Выпадающие значения определяли с применением процедуры UNIVARIATE. Значимость устанавливали при P < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Свиньи, обеспеченные обработкой c помощью протеаза+DFM, как правило, имеют более высокий ADG по сравнению с контролем (P=0,09). По сравнению с кормлением только DFM, кормление DFM в комбинации приводило в результате к более высокому ADG и более низкому FCR (фигура 6).

Пример 5

Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу отдельно или в комбинации на показатель роста и общую усвояемость питательных веществ в тракте у свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Всего 64 свиньи (Danbred DB90, самки x Agroceres PIC 337, самцы) с исходным весом тела (BW) 25,96±0,57 кг использовали в 42-дневном исследовании. Животных распределяли по 32 загонам по 2 свиньи на каждый, которые состояли из равных половых соотношений при 8 повторений/обработка. Загон считали экспериментальной статистической единицей исследования. Свиньям обеспечивали доступ к корму и воде ad libitum. Рационы составляли так, чтобы они соответствовали или превосходили потребности в питательных веществах и энергии NRC 2012 (таблица 5.1), и загоны случайным образом отбирали для одной из четырех обработок (таблица 5.2).

Таблица 5.1 Питательная композиция основного корма.

Наименования	%
Кукуруза	64,70
Соевая мука	28,10
Соевое масло	3,38
Дикальцийфосфат	0,85
Известняк	1,05
Соль	0,47
Премикс минералов	0,10
Премикс витаминов	0,05
L-лизин HCL	0,415
DL-метионин	0,17
L-треонин	0,15
L-триптофан	0,015
Сульфат меди	0,05
Белый каолин	0,50
Всего	100,00
Расчетная композиция
CP (%)	18,40
ME (ккал/кг)	3400
Lys. усв. (%)	1,15

Таблица 5.2. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Контроль, основной (NC)	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1	1,5×105	Н/Д
3	NC+протеаза2	Н/Д	5000
4	NC+DFM+протеаза	1,5×105	5000

¹ 3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

²Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Показатель роста.

Вес тела и потребление корма измеряли еженедельно для контроля среднего суточного прироста (ADG), среднего суточного потребления корма (ADFI) и коэффициента кормоотдачи (FCR).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Показатель роста. Отмечалось улучшение ADG свиней, питающихся рационами на основе кукурузы при добавлении DFM+протеаза к рациону, по сравнению с кормлением DFM или протеазой отдельно (фигура 7).

Пример 6

Оценка in-vitro эффектов одинарных или множественных штаммов микробных препаратов для приема в пищу (DFM) и протеазы на их способность растворять белок из субстрата на основе пшеничной или соевой муки, вводимого в пищу свиней

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Всего 8 илеально канюлированных боровов (исходный вес тела 30 кг) кормили с применением 2 экспериментальных рационов с применением схемы латинских квадратов 8×2. Было два последовательных периода, каждый из которых состоял из 7 дней. Полуочищенные рационы, состоящие главным образом из пшеницы или SBM, вводили в пищу в течение 7 дней в течение каждого периода с 5 днями для адаптации и 2 днями для сбора илеального содержимого. Свиньям случайным образом определяли 1 из 2 экспериментальных рациона в начале первого периода (день 0) и заменяли на второй рацион в начале второго периода (день 7). Рационы содержали оксид хрома, который использовали для расчета наблюдаемой илеальной усвояемости неочищенного белка, и образцы от свиньи с наблюдаемой илеальной усвояемостью неочищенного белка, наиболее близкой к среднему показателю популяции, отбирали для исследования in-vitro. Свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон был оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum. Основной рацион составляли так, чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 6.1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012).

Таблица 6.1. Пример композиции основного рациона для свиней с весом тела 30 кг

	Пшеница	SBM, 46%
Пшеница	93,10	-
SBM, 46%	-	35,00
Соевое масло	4,00	4,00
Кукурузный крахмал	-	38,25
Сахароза	-	20,00
Известняк	1,05	0,70
Дикальций P	0,75	0,95
Соль	0,40	0,40
Оксид хрома	0,40	0,40
Премикс витаминов-мин.	0,30	0,30
Энергия и питательные вещества
NE, ккал/кг	2630	3064
CP, %	10,17	16,10
Ca, %	0,59	0,59
P, %	0,42	0,43
Усвояемый P, %	0,27	0,27

После сбора содержимого желудка у свиней его немедленно замораживали при -20°C и впоследствии лиофилизировали. Лиофилизированные образцы содержимого желудка затем использовали для инкубации in-vitro с DFM и протеазой либо отдельно, либо в комбинации. DFM, применяемые в исследовании, включали одиночные штаммы Bacillus pumilis (8G-134), Bacillus licheniformis (AEE3), Lactobacillus reuteri (ANC1) и комбинацию 3 штаммов Bacillus, состоящую из 3 штаммов B. subtilis (918, 1013 и 3BP5).

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

В течение ночи культуры Lactobacillus reuteri (ANC1) инокулировали путем переноса одной гранулы с криоконсервированными бактериями, прилипшими к поверхности, в пробирку объемом 13 мл (Sarstedt 62.515.006), содержащую 3 мл среды MRS (deMan, Rogosa и Sharpe) (OXOID, CMS359), приготовленной и стерилизованной в соответствии с инструкциями производителя. Пробирки помещали в герметичный анаэростат (Anaerocult®), содержащий два активированных саше, вырабатывающих анаэробный газ (Oxoid AnaeroGen 2,5 л, Thermo Scientific). Полоски Anaerotest (Merck 115112) помещали в банку и они показывали, что атмосфера была анаэробной (белый цвет) во время инкубации. Бактерии инкубировали в течение 18 часов при 37°C со встряхиванием при 50 об./мин.

Субкультуру получали путем переноса 30 мкл культуры, культивированной в течение ночи, в 3 мл свежей среды MRS в новые пробирки объемом 13 мл (Sarstedt 62.515.006). Пробирки помещали в герметичный анаэростат (Anaerocult®) вместе со свежим активированным саше, вырабатывающим анаэробный газ, (Oxoid AnaeroGen 2,5 л, Thermo Scientific). Субкультуру инкубировали при 37°C со встряхиванием при 50 об/мин пока культуры не достигали оптической плотности при 600 нм (OD600) от 0,2 до 0,4. Культуру разбавляли средой MRS до OD600=0,1 и впоследствии разбавляли 10 раз 100 мМ буфером MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), pH 6,2. Обработку илеальных образцов начинали немедленно после этого.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Культивированные в течение ночи культуры B. subtilis (3BP5, 918 и 1013), B. licheniformis (AEE3) и B. pumilis (8G-134) инокулировали путем переноса одной гранулы с криоконсервированными бактериями, прилипшими к поверхности, в пробирку объемом 13 мл (Sarstedt 62.515.006), содержащую 3 мл среды TSB (триптический соевый бульон) (Merck 1.05459), приготовленной и стерилизованной в соответствии с инструкциями производителя. Пробирки инкубировали в течение 18 часов со встряхиванием (200 об/мин). Штамм B. pumilis инкубировали при 32°C и оставшиеся штаммы инкубировали при 37°C.

Субкультуру получали путем переноса 300 мкл культуры, культивированной в течение ночи, в 30 мл свежей среды TSB в стеклянные колбы с тремя перегородками объемом 250 мл. При интенсивном встряхивании штамм B. pumilis инкубировали при 32°C и оставшиеся штаммы инкубировали при 37°C до достижения значения OD600 в диапазоне от 0,3 до 0,7. Культуру разбавляли средой TSB до OD600=0,1 и впоследствии разбавляли 10 раз 100 мМ буфером MES, pH 6,2. Обработку илеальных образцов начинали немедленно после этого.

ОБРАБОТКА ИЛЕАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ КОМБИНАЦИЕЙ БАКТЕРИЙ И ПРОТЕАЗЫ

Лиофилизированные илеальные образцы обрабатывали отдельными бактериальными культурами либо отдельно, либо в комбинации с протеазой. Все обработки исследовали в двукратной повторности. От 0,097 до 0,103 г лиофилизированных илеальных образцов переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл (Eppendorf). Добавляли 850 мкл 100 мМ буфера MES, pH 6,2 вместе с 20 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,0 или протеазы (B. amyloliquefaciens протеаза P3000, 55 Ед/мл) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0. Образцы тщательно смешивали, пока весь материал не был смочен. Добавляли 30 мкл 100 мМ буфера MES, pH 6,2 или бактериальную культуру, разведенную в буфере MES. Для комбинации 3 штаммов Bacillus (штамм 918, 1013 и 3BP5) добавляли 10 мкл для каждого из трех штаммов (при общем объеме 30 мкл). Все пробирки инкубировали в течение 2 часов при 37°C со встряхиванием (1150 об./мин.) в Thermomixer (Eppendorf). После 2 часов инкубирования образцы переносили на лед и оставляли отстаиваться в течение 5 мин. Пробирки центрифугировали при 17000 xg в течение 2 мин. Супернатант извлекали и фильтровали с применением фильтровальных пластин AcroPrep™ Advance (3 мкм стеклянное волокно/0,2 мкм мембрана Supor®) посредством центрифугирования. Образцы хранили при -20°C до дальнейшего анализа.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Белок в растворе определяли количественно с применением набора для анализа белка Quant-iT (молекулярные зонды Q33210) по стандартной кривой BSA (0-300 мкг/мл) с применением протокола, предоставленного производителем, с объемом образца 10 мкл.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Растворение белка. Комбинирование комбинации 3 штаммов Bacillus subtilis с протеазой повышало растворение белка из илеального содержимого свиней, питающихся рационом на основе соевой муки, по сравнению только с отдельными DFM или протеазным компонентом (фигура 8.1).

Комбинирование единичного штамма Bacillus licheniformis с протеазой также приводило в результате к более высокому растворению белка из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе соевой муки, чем только отдельные компоненты протеазы или DFM (фигура 8.2).

Комбинирование единичного штамма Bacillus pumilis с протеазой также приводило в результате к более высокому растворению белка из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе соевой муки, чем только отдельные компоненты протеазы или DFM (фигура 8.3).

Комбинирование единичного штамма Bacillus pumilis с протеазой приводило в результате к более высокому растворению белка из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы, чем только отдельные компоненты протеазы или DFM (фигура 8.4).

Комбинирование единичного штамма Bacillus licheniformis с протеазой приводило в результате к более высокому растворению белка из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы, чем только отдельные компоненты протеазы или DFM (фигура 8.5).

Комбинирование единичного штамма Lactobacillus reuteri с протеазой приводило в результате к более высокому растворению белка из содержимого кишечника свиней, питающихся рационом на основе пшеницы, чем только отдельные компоненты протеазы или DFM (фигура 8.6).

Пример 7

Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу в комбинации на характеристики туши свиней, питающихся рационами на основе кукурузы

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Эксперимент проводили в соответствии с положениями Комитета по экспериментальной и этической политике в отношении животных/лабораторной практики в Нидерландах. Применяемый для кормления основной рацион составляли таким образом, чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 7.1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012), кроме чистой энергии (NE), которую сокращали на примерно 200 ккал/кг. Основной рацион разделяли на порции, которые затем обрабатывали комбинацией фермента и микробного препарата для приема в пищу (DFM), как определено в таблице 7.2. Во время смешивания корма мешалку промывали для предотвращения перекрестного загрязнения рационов. Образцы собирали из каждого рациона для обработки в начале, в середине и в конце каждой партии и смешивали вместе для подтверждения ферментативной активности и количества DFM в корме.

Таблица 7.1. Пример композиции основного рациона для свиней с весом тела 23-116 кг

Ингредиенты (% скормленного)	Фаза 1 (23-50 кг)	Фаза 2 (50-82 кг)	Фаза 3 (82-116 кг)
Маис	62,67	63,66	63,57
Соевое масло	0,01	0,01	0,06
Пшеничная крупка	14,88	14,90	19,90
Премикс 0,4%	0,40	0,40	0,40
Соль	0,43	0,31	0,31
Прем. витамина AD3E	0,10	0,10	0,10
Соевая шелуха >36%CF	2,00	7,00	7,00
Витамины/микроэлементы	0,10	0,10	0,10
Лизин-HCl (L 79%)	0,40	0,31	0,27
Метионин (DL 99%)	0,05	0,01	0,00
Треонин (L 98%)	0,09	0,06	0,05
Известняк	1,09	0,94	0,70
SBM >48% CP	17,45	11,87	7,21
Фитаза	0,33	0,33	0,33
Влажность	128,37	128,69	129,51
Неочищенный белок	161,82	139,34	123,61
Зола	43,49	39,61	36,50
Неочищенная клетчатка	38,35	54,98	57,72
Сахар	28,02	25,37	25,23
Неочищенный жир_AH	35,54	35,24	36,48
STRCH_AM	424,54	430,94	440,10
NE_Свиньи	2282,07	2263,59	2258,34
SID_LYS	9,74	7,76	6,44
SID_MET	2,80	2,12	1,83
SID_M+C	5,14	4,18	3,72
SID_THR	5,77	4,70	4,01
SID_TRP	1,52	1,24	1,07
SID_ARG	9,34	7,70	6,57
SID_ILE	5,55	4,59	3,85
SID_VAL	6,52	5,55	4,88
SID_HIS	3,89	3,32	2,94
SID_ALA	7,21	6,34	5,74
SID_ASP	12,67	10,21	8,31
SID_GLU	25,89	21,88	19,44
SID_GLY	5,59	4,81	4,24
SID_LEU	12,17	10,63	9,47
SID_PHE	6,70	5,65	4,86
SID_PRO	9,00	7,91	7,26
SID_SER	6,88	5,80	5,02
SID_TYR	4,93	4,19	3,62
Ca	5,30	4,83	3,86
P	4,00	3,75	3,92
Na	1,81	1,34	1,34
Cl	3,91	3,01	2,94

Таблица 7.2. Определение экспериментальных рационов

Обработка	Описание	DFM, КОЕ или FU*/г корма	Фермент, Ед/кг корма
1	Основной отрицательный контроль	Н/Д	Н/Д
2	NC+DFM1+протеаза2	1,5×105	5000

¹3 штамма Bacillus: штаммы 3BP5, 918 и 1013 Bacillus,

²Протеаза: Протеаза Bacillus amyloliquefaciens P3000.

Эксперимент планируют и проводят в соответствии с фазой роста (от ≤23 до ~116 кг веса тела).

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

В 96-113-дневном эксперименте использовали в общем 180 растущих свиней [Great York x Landrace] со средним весом тела 23 кг. Свиней случайным образом распределяли по 2 экспериментальным рационам в соответствии с их исходным весом тела. Имелось 10 повторяющихся загонов на обработку по 9 свиней на загон. Боровов и свиней разделяли на пять загонов боровов и пять загонов свиней на каждую обработку. Всех свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum.

ИЗМЕРЕНИЕ И АНАЛИЗ ХАРАКТЕРИСТИК ТУШИ

В последний день эксперимента, когда свиньи весили приблизительно 116 кг (в день 96 или 116), свиней умерщвляли и определяли качество туши по данным убоя. Глубину спинного жира (мм) измеряли с помощью зонда в участке Р2, который расположен 65 мм от дорсальной средней линии на уровне последнего ребра. Процент мяса, меру, которую обычно используют для оценки постности туши, рассчитывали следующим образом:

% Мяса={8,588+(0,465 x вес туши)+(3,005 x зона поясничных мышц) - (21,896 x глубина жира)}/вес туши

СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Все данные подвергали статистическому анализу в виде рандомизированной полной блок-схемы с использованием

смешанных процедур SAS (SAS Inst. Inc., Кэри, Северная Каролина), и загон использовали в качестве статистической

единицы. Данные считали значимыми при P<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Добавление к рациону на основе кукурузы комбинации DFM (Bacillus) и протеазы существенно улучшало процент мяса и глубину спинного жира (P<0,05) по сравнению с основным рационом в виде отрицательного контроля без каких-либо добавок (таблица 7.3).

Таблица 7.3. Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при приеме в пищу в комбинации на характеристики туши

	NC	DFM+протеаза	SEM	P-значение
% мяса	60,5b	61,0a	0,15	0,030
Глубина спинного жира, мм	11,7a	10,9b	0,24	0,034

^a,b Среднее значение в той же строке с различными верхними индексами отличается (P<0,05).

Пример 8

Оценка in-vitro эффектов микробного препарат для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus (Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при применении отдельно или в комбинации на растворение белка из рационов на основе пшеничной или соевой муки при кормлении растущих свиней

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Всего 8 илеально канюлированных боровов (исходный вес тела 30 кг) кормили с применением 2 экспериментальных рационов с применением схемы латинских квадратов 8×2. Было два последовательных периода, каждый из которых состоял из 7 дней. Полуочищенные рационы, состоящие главным образом из пшеницы или SBM, вводили в пищу в течение 7 дней в течение каждого периода с 5 днями для адаптации и 2 днями для сбора илеального содержимого. Свиньям случайным образом определяли 1 из 2 экспериментальных рациона в начале первого периода (день 0) и заменяли на второй рацион в начале второго периода (день 7). Рационы содержали оксид хрома, который использовали для расчета наблюдаемой илеальной усвояемости неочищенного белка, и образцы от свиньи с наблюдаемой илеальной усвояемостью неочищенного белка, наиболее близкой к среднему показателю популяции, отбирали для исследования in-vitro. Свиней размещали в помещении с контролируемой окружающей средой. Каждый загон был оснащен односторонней автокормушкой из нержавеющей стали и капельной поилкой, поэтому свиньи обеспечены доступом к корму и воде ad libitum. Основной рацион составляли так, чтобы он соответствовал или превосходил потребности в питательных веществах для растущих свиней данного возраста (таблица 8.1) в соответствии с рекомендациями NRC (2012).

Таблица 8.1. Пример композиции основного рациона для свиней с весом тела 30 кг

	Пшеница	SBM, 46%
Пшеница	93,10	-
SBM, 46%	-	35,00
Соевое масло	4,00	4,00
Кукурузный крахмал	-	38,25
Сахароза	-	20,00
Известняк	1,05	0,70
Дикальций P	0,75	0,95
Соль	0,40	0,40
Оксид хрома	0,40	0,40
Премикс витаминов-мин.	0,30	0,30
Энергия и питательные вещества
NE, ккал/кг	2630	3064
CP, %	10,17	16,10
Ca, %	0,59	0,59
P, %	0,42	0,43
Усвояемый P, %	0,27	0,27

После сбора содержимого желудка у свиней его немедленно замораживали при -20°C и впоследствии лиофилизировали. Лиофилизированные образцы содержимого желудка затем использовали для инкубации in-vitro с DFM и протеазой либо отдельно, либо в комбинации. Применяемые в исследовании DFM включали комбинацию 3 штаммов Bacillus, состоящую из 3 штаммов B. subtilis (3BP5, 918 и 1013)().

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Культивированные в течение ночи культуры B. subtilis (3BP5, 918 и 1013) инокулировали путем переноса одной гранулы с криоконсервированными бактериями, прилипшими к поверхности, в пробирку объемом 13 мл (Sarstedt 62.515.006), содержащую 3 мл среды TSB (триптический соевый бульон) (Merck 1.05459), приготовленной и стерилизованной в соответствии с инструкциями производителя. Пробирки инкубировали в течение 18 часов со встряхиванием (200 об/мин). Все штаммы Bacillus инкубировали при 37°C.

Субкультуру получали путем переноса 300 мкл культуры, культивированной в течение ночи, в 30 мл свежей среды TSB в стеклянные колбы с тремя перегородками объемом 250 мл. При интенсивном встряхивании все штаммы Bacillus инкубировали при 37°C до достижения значения OD600 в диапазоне от 0,3 до 0,7. Культуру разбавляли средой TSB до OD600=0,1 и впоследствии разбавляли 10 раз 100 мМ буфером MES, pH 6,2. Обработку илеальных образцов начинали немедленно после этого.

ОБРАБОТКА ИДЕАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ КОМБИНАЦИЕЙ БАКТЕРИЙ И ПРОТЕАЗЫ

Лиофилизированные илеальные образцы обрабатывали отдельными бактериальными культурами либо отдельно, либо в комбинации с протеазой. Все обработки исследовали в двукратной повторности. От 0,097 до 0,103 г лиофилизированных илеальных образцов переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл (Eppendorf). Добавляли 850 мкл 100 мМ буфера MES, pH 6,2 вместе с 20 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера, pH 5,0 или протеазы (B. amyloliquefaciens протеаза P3000, 55 Ед/мл) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,0. Образцы тщательно смешивали, пока весь материал не был смочен. Добавляли 30 мкл 100 мМ буфера MES, pH 6,2 или бактериальную культуру, разведенную в буфере MES. Для комбинации 3 штаммов Bacillus (штамм 918, 1013 и 3BP5) добавляли 10 мкл для каждого из трех штаммов (при общем объеме 30 мкл). Все пробирки инкубировали в течение 2 часов при 37°C со встряхиванием (1150 об/мин) в Thermomixer (Eppendorf). После 2 часов инкубирования образцы переносили на лед и оставляли отстаиваться в течение 5 мин. Пробирки центрифугировали при 17000 xg в течение 2 мин. Супернатант извлекали и фильтровали с применением фильтровальных пластин AcroPrep™ Advance (3 мкм стеклянное волокно/0,2 мкм мембрана Supor®) посредством центрифугирования. Образцы хранили при -20°C до дальнейшего анализа.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Белок в растворе определяли количественно с применением набора для анализа белка Quant-iT (молекулярные зонды Q33210) по стандартной кривой BSA (0-300 мкг/мл) с применением протокола, предоставленного производителем, с объемом образца 10 мкл.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Отдельное применение протеазы или DFM численно увеличивало количество белка, растворенное из образцов пшеничной или соевой муки, по сравнению с отрицательным контролем без добавок. Однако, когда протеазу и DFM на основе 3 штаммов Bacillus комбинировали, наблюдалось увеличение количества растворенного белка из образцов пшеничной или соевой муки по сравнению с контролем и протеазой или DFM отдельно (таблица 8.3).

Таблица 8.3. Эффекты микробного препарата для приема в пищу на основе трех штаммов Bacillus ( Bacillus штаммы 3BP5, 918, 1013) и протеазы при применении отдельно или в комбинации на растворение белка из рационов на основе пшеничной или соевой муки при кормлении растущих свиней

Общий белок, мкг/мл	NC	Протеаза	DFM	DFM+протеаза
Пшеница	1063	1759,7	1408,7	2022,1
SBM 46	729,6	1554,9	840,5	1634,5

Claims (13)

1. Композиция кормовой добавки, по сути, состоящая из микробного препарата для приема в пищу, содержащего штаммы Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) в комбинации с по меньшей мере одной протеазой, представляющей собой субтилизин, где композиция кормовой добавки не содержит каких-либо дополнительных ферментов, кроме протеазы, представляющей собой субтилизин.

2. Композиция кормовой добавки по п. 1, где микробный препарат для приема в пищу представляет собой антипатогенный микробный препарат для приема в пищу.

3. Композиция кормовой добавки по п. 1 или 2, где микробный препарат для приема в пищу находится в форме эндоспоры.

4. Композиция кормовой добавки по п. 3, где микробный препарат для приема в пищу находится в форме эндоспоры.

5. Композиция кормовой добавки по любому из пп. 1, 2 или 4, где протеаза, представляющая собой субтилизин, присутствует в дозировке от 1000 PU/г композиции кормовой добавки до 200000 PU/г композиции кормовой добавки.

6. Композиция кормовой добавки по п. 3, где протеаза, представляющая собой субтилизин, присутствует в дозировке от 1000 PU/г композиции кормовой добавки до 200000 PU/г композиции кормовой добавки.

7. Композиция кормовой добавки по любому из пп. 1, 2 или 4, где микробный препарат для приема в пищу присутствует в дозировке от 1×10³ КОЕ/г композиции кормовой добавки до 1×10¹³ КОЕ/г композиции кормовой добавки.

8. Композиция кормовой добавки по любому из п. 3, где микробный препарат для приема в пищу присутствует в дозировке от 1×10³ КОЕ/г композиции кормовой добавки до 1×10¹³ КОЕ/г композиции кормовой добавки.

9. Способ улучшения усвояемости сырья в корме, при этом способ предусматривает введение композиции кормовой добавки по п. 1.

10. Способ получения композиции кормовой добавки по п. 1, предусматривающий получение смеси на основе микробного препарата для приема в пищу, содержащего штаммы Bacillus subtilis 3BP5 (NRRL B-50510); 918 (NRRL B-50508) и 1013 (NRRL B-50509) в комбинации с по меньшей мере одной протеазой, представляющей собой субтилизин, и упаковывание.

11. Корм, содержащий композицию кормовой добавки по любому из пп. 1, 2 или 4.

12. Корм, содержащий композицию кормовой добавки по п. 3.

13. Премикс, содержащий композицию кормовой добавки по п. 1 и по меньшей мере один минерал, и/или по меньшей мере один витамин.

Images