RU2753996C1 - Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии - Google Patents
Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2753996C1 RU2753996C1 RU2020132710A RU2020132710A RU2753996C1 RU 2753996 C1 RU2753996 C1 RU 2753996C1 RU 2020132710 A RU2020132710 A RU 2020132710A RU 2020132710 A RU2020132710 A RU 2020132710A RU 2753996 C1 RU2753996 C1 RU 2753996C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- valine
- corynebacterium glutamicum
- bacterium
- strain
- mutation
- Prior art date
Links
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 59
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims abstract description 53
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims abstract description 41
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 26
- 101150033780 ilvB gene Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims abstract description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 30
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 102100030840 AT-rich interactive domain-containing protein 4B Human genes 0.000 description 13
- 101000792935 Homo sapiens AT-rich interactive domain-containing protein 4B Proteins 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 2-oxobutanoate Chemical compound CCC(=O)C([O-])=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100242924 Bacillus subtilis (strain 168) pbpF gene Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 101100242909 Streptococcus pneumoniae (strain ATCC BAA-255 / R6) pbpA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100125907 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) ilvC1 gene Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000001486 biosynthesis of amino acids Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150090497 ilvC gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- -1 monosubstituted potassium phosphate Chemical class 0.000 description 2
- 101150058012 mrcA gene Proteins 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 101150105325 ponA gene Proteins 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 2
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 2
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 3-methyl-2-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C(=O)C(O)=O QHKABHOOEWYVLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- 108010088278 Branched-chain-amino-acid transaminase Proteins 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108700016168 Dihydroxy-acid dehydratases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010000200 Ketol-acid reductoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 101150043028 ilvD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105723 ilvD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150099953 ilvE gene Proteins 0.000 description 1
- 101150077793 ilvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060643 ilvN gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- KPZYAGQLBFUTMA-UHFFFAOYSA-K tripotassium;phosphate;trihydrate Chemical class O.O.O.[K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O KPZYAGQLBFUTMA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена бактерия Corynebacterium glutamicum, являющаяся продуцентом аминокислоты с разветвленной боковой цепью - L-валина. Батекрия содержит мутацию, представляющую собой замену гуанина на аденин в положении -183 в нуклеотидной последовательности перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона ilvBNC. Также предложен способ получения L-валина, предусматривающий культивирование указанной бактерии в подходящих условиях до оптимального накопления целевого продукта и выделение целевой аминокислоты из культуральной жидкости. Группа изобретений позволяет повысить выход L-валина по сравнению с родительским штаммом. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, получению L-аминокислот с разветвленной боковой цепью (ВСАА от англ. branched-chain amino acids), преимущественно, L-валина, с помощью модифицированной бактерии Corynebacterium glutamicum, содержащей мутацию в регуляторной области оперона генов биосинтеза аминокислот ilvBNC.
ВСАА (L-валин, L-лейцин, L-изолейцин, далее - валин, лейцин, изолейцин) относят к группе незаменимых аминокислот, которые не синтезируются в организме человека и животных, а поступают в организм с пищей. Получение ВСАА, широко используемых в качестве кормовых добавок в животноводстве и птицеводстве, обычно осуществляют путем ферментации Сахаров при помощи кишечной палочки Escherichia coli (US 5658766А) или коринеформных бактерий, таких как Corynebacterium или Brevibacterium (US 5521074А, US 7632663 В1, US 9290770 B2, US 10457919 B2). Пути биосинтеза изолейцина, валина и лейцина тесно связаны. Четыре фермента -ацетолактатсинтаза, изомероредуктаза, дегидратаза дигидроксикислот и трансаминаза В (кодируемые генами ilvBN, ilvC, ilvD и ilvE, соответственно) катализируют стадии превращения двух молекул пирувата в валин и, параллельно, этапы превращения 2-кетобутирата и пирувата в изолейцин.
2-кетобутират образуется из треонина в реакции, катализируемой треониндегидратазой (кодируемой геном ilvA), специфичной для пути изолейцина. Лейцин-специфический путь начинается с 2-кетоизовалерата, который также является прямым предшественником валина. Участие одних и тех же ферментов в синтезе различных ВСАА затрудняет создание штаммов, продуцирующих одну из этих аминокислот без дополнительного образования в качестве побочного продукта других ВСАА.
Современные штаммы-продуценты, используемые для промышленного производства ВСАА, содержат комплекс изменений в геноме, обеспечивающих сверхпродукцию ВСАА при росте на средах с сахарами. Для получения штаммов-продуцентов используют различные селекционные и генетические подходы, включая мутагенез (US 5521074 А, ЕР 0477000 А2), амплификацию отдельных или нескольких генов (US 7632663 B1), усиление активности отдельных генов или их инактивацию (Wada М. et al.) (7).
Известно, что гены биосинтеза ВСАА (ilB, ilvN и ilvC) в клетках Corynebacterium составляют единый оперон, активность которого подавляется валином, лейцином или изолейцином. Экспрессия генов оперона ilvBNC контролируется с участием регуляторной области - 292 нуклеотида, расположенной перед первым геном оперона. Она кодирует лидерный пептид из 15 аминокислот и район, где возможно формирование вторичных структур - терминатора и антитерминатора. Замена 3 валиновых остатков на аланиновые в лидерном пептиде ведет к потери зависимой от концентрации валина экспрессии оперона (S. Morbach). Удаление, частичное удаление или мутации, приводящие к инактивации лидерного пептида, ведут к повышенной продукции валина (US 20160108444 A1). Внесение делеции 211 п.о. в аттенюаторный район промоторной области гена ilvB, находящийся в составе автономной векторной плазмиды pECKAilvBNC, также ведет к увеличению продукции валина (ЕР 1860193А1).
Значительное число известных штаммов-продуцентов аминокислот на основе бактерий Corynebacterium glutamicum, не снижает потребности в разработке новых подходов к созданию таких продуцентов и усовершенствованию существующих способов синтеза ВСАА.
Задачами настоящего изобретения являются:
- повышение продуктивности штаммов-продуцентов ВСАА, принадлежащих к Corynebacterium glutamicum,
- разработка способа получения валина с использованием этих штаммов.
Поставленные задачи решены путем:
- получения бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - продуцента аминокислоты с разветвленной боковой цепью: L-валина или L-лейцина.
- разработки способа получения L-валина путем культивирования бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением целевой аминокислоты из культуральной жидкости.
В основу заявляемого изобретения положен обнаруженный факт, что штаммы Corynebacterium glutamicum, имеющие специфическую мутацию в регуляторной области перед старт-кодоном структурного гена ilvB, обладают повышенной способностью продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью. Эта мутация является заменой гуанина на аденин в положении -183 п. о. (G183A) в нуклеотидной последовательности перед первым структурным геном ilvB оперона ilvBNC (в последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 это нуклеотид номер 110) и не затрагивает последовательности, кодирующей лидерный пептид.
В соответствии с описанием изобретения в качестве продуцента ВСАА используют бактерию Corynebacterium glutamicum, содержащую мутацию PilvB (G183A), приводящую к замене нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин в регуляторной области оперона ilvBNC в положении -183 п.о. перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона.
В качестве исходной бактерии Corynebacterium glutamicum используют, в частности, штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (депонированы в коллекции типовых культур USA).
Термин «бактерия, способная продуцировать аминокислоты с разветвленной боковой цепью» означает бактерию, способную накапливать валин или лейцин в больших количествах, чем родительские штаммы Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.
Термин «бактерия с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC» означает, что бактерия модифицирована таким образом, что нуклеотидная последовательность регуляторной области оперона ilvBNC из Corynebacterium glutamicum АТСС 13032 или из Corynebacterium glutamicum АТСС 13869 (SEQ ID NO: 1) содержит замену нуклеотида гуанин на нуклеотид аденин (мутация G183A) в положении -183 перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона с образованием последовательности SEQ ID NO: 2.
Направленное введение мутации PilvB (G183A) в хромосому родительского штамма Corynebacterium glutamicum осуществляют с помощью известных методов генной инженерии, в частности, метода замещения, основанного на гомологичной рекомбинации (Schafer A. et al, 1994) (12).
ДНК-фрагмент регуляторной области оперона ilvBNC, содержащий мутацию PilvB(G183A), получают с помощью метода ПЦР (Sambrook et al.) (13). Затем исходную последовательность в хромосоме родительского штамма замещают на мутантную последовательность с помощью гомологичной рекомбинации, которую проводят, в частности, с использованием плазмиды, не способной к автономному поддержанию в клетке хозяина.
Способ получения валина в общем виде
Способ получения аминокислоты валина включает культивирование валин-продуцирующей бактерии Corynebacterium glutamicum с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC в подходящих условиях с последующим выделением синтезированного валина из культуральной жидкости традиционными способами с кристаллизацией из раствора соляной кислоты (14).
В качестве питательной среды для культивирования используют минеральную среду, включающую фосфаты натрия или калия, соли магния, а при необходимости соли марганца и железа, и содержащую в качестве источника углерода глюкозу или глюкозные сиропы, в качестве источника азота - аммонийные соли или мочевину, а также необходимые для роста аминокислоты и витамины. В качестве компонентов, ускоряющих рост бактерий, дополнительно добавляют кукурузный экстракт или гидролизаты глютена или сои. Культивирование бактерий проводят при 24-42°С, преимущественно при 30-32°С и рН среды в интервале 6,0-8,5, преимущественно в интервале 6,8-7,2.
Культивирование бактерий осуществляют в пробирках, колбах или специальных реакторах при аэробных условиях.
Заявляемый способ позволяет обеспечить уровень продукции валина до 15-25 г/л, что в превосходит исходный уровень родительского штамма на 50-400% (в зависимости от штамма).
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.
Штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675, являющегося производным штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13032, у которого гены ponA и ilvA делегированы, путем замены нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC (SEQ ID NO: 1) мутантной копией (SEQ ID NO: 2). Для этого с помощью ПЦР получена мутантная копия регуляторной области оперона ilvBNC с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB, которая затем вставлена в плазмиду pIKA-sac13, полученную путем клонирования на векторе pUC19 ("Thermoscientific") гена sacB из Bacillus subtilis 168 (NC_000964, Accession Number X02730) и гена KmR (Tarutina) (15). С учетом того, что плазмида pIKA-sac13 не способна автономно поддерживаться в клетках Corynebacterium glutamicum после введения плазмиды с помощью электропорации в клетки Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675, отобраны клоны, в хромосоме которых в результате двух циклов гомологичной рекомбинации произошло замещение нативной последовательности регуляторной области оперона ilvBNC на мутантную копию. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VC3 с заменой нуклеотида гуанин на аденин в позиции -183 перед старт-кодоном структурного гена ilvB депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676.
Пример 2. Конструирование штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC.
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 (VB3) сконструирован на основе штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674 (VB2), имеющего делеции в генах ponA и ilvA в хромосоме штамма Corynebacterium glutamicum АТСС 13869, путем замены нативной последовательности регуляторной области гена ilvB (SEQ ID NO: 1) на их мутантную копию (SEQ ID NO: 2). Конструирование мутантной копии регуляторной области оперона ilvBNC и замена нативной последовательности на мутантную копию проведены как описано в Примере 1. Наличие замены в регуляторной области подтверждено с помощью анализа методом ПЦР и секвенирования. Полученный штамм Corynebacterium glutamicum VB3 с мутацией в регуляторной области оперона ilvBNC депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика как Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677.
Пример 3. Оценка влияния мутации PilvB (G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC у штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 на активность ацетолактатсинтазы -ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепью
Штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13676 или штамм Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13677 выращивают в колбах на питательной среде, содержащей (г/л): фосфат калия однозамещенный - 2,5, фосфат калия двузамещенный трехводный - 19,7, сульфат магния семиводный - 1,0, глюкоза - 20,0, биотин - 0,0001, тиамин - 0,0002, кукурузный экстракт - 5,0, сульфат аммония - 15,0, изолейцин - 0,25, вода до 1 л, рН 7,0-7,2 в течение 7 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, используя в качестве посевного материала ночные культуры штаммов, выращенные при тех же условиях. Затем клетки собирают с помощью центрифугирования, осадок промывают фосфатным буфером (0,2 М, рН7,4), клетки суспендируют в том же буфере с добавлением MgCl2 (5 мМ) и β-меркаптоэтанола (1 мкл/мл) и разрушают ультразвуком в течение 15 минут. По окончании обработки ультразвуком образцы центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. В качестве контроля используют родительские штаммы Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13675 и Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-13674, выращенные при тех же условиях, что и мутантные штаммы.
Активность ацетолактатсинтазы в полученных бесклеточных экстрактах штаммов определяют при 30°С согласно методике, описанной Guo et al. 2015 (16) с некоторыми модификациями.
Удельную активность ацетолактатсинтазы рассчитывают как нмоль α-ацетолактата, образующегося в минуту в расчете на 1 мг общего белка. Количество общего белка в экстрактах определяют по методу Лоури (17).
Из результатов, представленных в таблице 1, следует, что введение мутации PilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в геном штамма Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674 или Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675 приводит к увеличению активности ацетолактатсинтазы - ключевого фермента биосинтеза аминокислот с разветвленной боковой цепью в 6,5 раз по сравнению с родительскими штаммами.
Пример 4. Оценка влияния мутации PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину или лейцину у штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677
Оценку проводят в пробирочных тестах. Для этого 0,3 мл культуры штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677, предварительно выращенной в течение 22 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С, вносят в пробирки с 3 мл среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 10,0 хлорид аммония - 2,5, фосфат калия однозамещенный - 0,1, сульфат магния семиводный - 0,1, мел - 2,5, биотин - 0,00001, тиамин - 0,00002 с добавлением кислотного гидролизата пшеничного глютена 50,0 мл/л, вода - остальное. Гидролизат пшеничного глютена получают путем гидролиза пшеничного глютена серной кислотой согласно известным способам гидролиза различного сырья с целью получения источника ростовых факторов при микробиологическом производстве аминокислот (18). Перед внесением в среду гидролизат нейтрализуют концентрированным аммиаком. В качестве контрольного штамма используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.
Пробирки с культурами инкубируют в течение 36 ч с перемешиванием (300 об/мин) при 30°С и затем в культуральной жидкости определяют содержание валина или лейцина методом тонкослойной хроматографии.
Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC продуцирует на 50% больше валина и в 2 раза больше лейцина по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum VB2 ВКПМ В-13674.
Пример 5. Оценка влияния мутации PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC на продуктивность по валину у штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676
Оценку продуктивности проводят в пробирочных тестах также как описано в примере 4. В качестве штамма сравнения используют родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 ВКПМ В-13675.
Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 с мутацией PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC, продуцирует в 4 раза больше валина, чем родительский штамм Corynebacterium glutamicum VC2 В-13675.
Из результатов, представленных в таблицах 1, 2 и 3, следует, что потенциал штаммов Corynebacterium glutamicum АТСС13032 и АТСС13869 по удельной активности ацетолактатсинтазы и по уровню продукции валина существенно различается. Штамм VB2, производный от Corynebacterium glutamicum АТСС13869, продуцирует в 5 раз больше валина по сравнению со штаммом VC2, производным от Corynebacterium glutamicum АТСС13032.
Штаммы, содержащие мутацию PilvB(G183A) в регуляторной области оперона ilvBNC - Corynebacterium glutamicum VC3, Corynebacterium glutamicum VB3, обеспечивают увеличение продукции валина от 50 до 400% по сравнению с контрольными штаммами. При этом эффект, который оказывает мутация PilvB(G183A) в регуляторной области ilvBNC, зависит от родительского штамма.
Пример 6. Получение валина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамма Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676
Для выделения валина из культуральной жидкости штамм Corynebacterium glutamicum VB3 ВКПМ В-13677 или штамм Corynebacterium glutamicum VC3 ВКПМ В-13676 выращивают в колбах в условиях и на среде как описано в примере 4. После выращивания твердые остатки, такие как клетки, удаляют из культуральной жидкости методом центрифугирования и фильтрацией через мембрану с последующим вакуум-выпариванием образовавшегося пермеата. Из водного раствора валин выделяют кристаллизацией с последующей перекристаллизацией из раствора соляной кислоты (14). Выход валина из КЖ составляет 50,7%, содержание валина в полученном продукте -99,6%.
Таким образом, наличие мутации PilvB(G183A), локализованной в регуляторной области оперона ilvBNC, в штамме бактерий Corynebacterium glutamicum - продуценте аминокислоты с разветвленной боковой цепью позволяет значительно повысить выход целевой аминокислоты по сравнению с родительским штаммом, что представляет интерес для получения и усовершенствования продуцентов аминокислот из группы ВСАА.
Разработанный на основе заявляемой бактерии способ получения валина расширяет арсенал известных способов получения этой наиболее востребованной из группы ВСАА аминокислоты и позволяет повысить уровень продукции валина на 50-400% по сравнению с родительским штаммом.
Список источников информации
1. US 5521074 А
2. US 7632663 В1
3. US 9290770 В2
4. US 10457919 В2
5. US 5658766А
6. ЕР 0477000 А2
7. Wada М., Hijikata N.. Aoki R., Takesue N., and Yokota A. Enhanced valine production in Corynebacterium glutamicum with defective H+-ATPase and C-terminal truncated acetohydroxyacid synthase. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008). V. 72 (11). P. 2959-2965.
8. US 20160108444 A1
9. Morbach S., Junger C., Sahmand H., Eggeling L. Attenuation Control of ilvBNC in Corynebacterium glutamicum: Evidence of Leader Peptide Formation without the Presence of a Ribosome Binding Site. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2000. V.90. - №5. - P. 501-507
10. ЕР 1860193 A1
11. Liebl W., Ehrmann M., Ludwig W., Schleifer K.H. Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns Int. J. Syst. Bacteriol. - Vol. 41(2). - P. 255-260.
12. Schäfer A., Tauch A., Jäger W., Kalinowski J., Thierbach G., and Pühler. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the E. coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. -(1994). V. 145. P. 69-73.
13. Sambrook I., Russell D. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001
14. A.E. Агаджанян, Г.Ж. Оганесян и Е.А. Агаджанян Выделение и очистка валина из культуральной жидкости Химический журнал Армении, 2002, №4, 55, стр. 121-129
15. Taratina M.G., Raevskaya N.M., Shustikova Т.Е., et al. Assessment of effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application to enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Biotekhnologiya (Biotechnology), 2015, 6, 16-24. doi: 10.21519/0234-2758-2015-6-16-24
16. Guo Y., Han M., Xu J., Zhang W. Analysis of acetohydroxyacid synthase variants from branched-chain amino acids-producing strains and their effects on the synthesis of branched-chain amino acids in Corynebacterium glutamicum. Protein Expression and Purification. -(2015). - V. 109. P. 106-112
17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 193(1) 265-275.
18. Биотехнология и биоинженерия, Рига, 1978
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный
научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов Национального исследовательского центра «Курчатовский
институт»» (НИЦ «Курчатовский институт»- ГосНИИгенетика)
<120> Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать
L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии
<160> 2
<210> 1
<211> 292
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(-292)
<223> ilvBNC regulator region
<400> 1
catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60
gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgag ggctttcttg 120
ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180
atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240
ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292
<210> 2
<211> 292
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(-292)
<223> ilvBNC regulator region с заменой гуанина на аденин в позиции -183 п.н.
перед старт кодоном структурного гена ilvB
<400> 2
catgaccatt attcgacttg tagtagtaac cgcgcggcgc ctgccgtaac ggccttccaa 60
gtcgtctcgt caagcgccct cgacaacact caccacagtg ttggaacgaa ggctttcttg 120
ttggttatga cccaagtagc caactttgca acagacatct gtcgcactgc gtgcacacgc 180
atccgcgtcg gaacaatttt aaatgagggc tttgtcttta ggctgagttg aaatcggctt 240
ggcttggacg ggtcctgtga aaatccttat ttagtaaagg agccagaaag tc 292
<---
Claims (2)
1. Бактерия Corynebacterium glutamicum с мутацией, представляющей собой замену гуанина на аденин в положении -183 в нуклеотидной последовательности перед старт-кодоном первого структурного гена ilvB оперона ilvBNC, - продуцент аминокислоты с разветвленной боковой цепью - L-валина.
2. Способ получения L-валина, включающий культивирование бактерии по п. 1 в подходящих условиях до оптимального накопления целевого продукта и выделение целевой аминокислоты из культуральной жидкости.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2753996C1 true RU2753996C1 (ru) | 2021-08-25 |
Family
ID=77460490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020132710A RU2753996C1 (ru) | 2020-10-05 | 2020-10-05 | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2753996C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
| US20160108444A1 (en) * | 2013-03-11 | 2016-04-21 | Cj Cheiljedang Corporation | Strain having enhanced L-valine productivity and L-valine production method using the same |
| RU2675506C2 (ru) * | 2013-06-03 | 2018-12-20 | Эвоник Дегусса Гмбх | Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом |
-
2020
- 2020-10-05 RU RU2020132710A patent/RU2753996C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1860193A1 (en) * | 2006-05-22 | 2007-11-28 | Evonik Degussa GmbH | Promoter-activity modulation for branched-chain amino acid production |
| US20160108444A1 (en) * | 2013-03-11 | 2016-04-21 | Cj Cheiljedang Corporation | Strain having enhanced L-valine productivity and L-valine production method using the same |
| RU2675506C2 (ru) * | 2013-06-03 | 2018-12-20 | Эвоник Дегусса Гмбх | Способ получения l-лейцина, l-валина, l-изолейцина, альфа-кетоизовалерата, альфа-кето-бета-метилвалерата или альфа-кетоизокапроата с использованием рекомбинантных коринебактерий, содержащих оперон ilvbn, который можно индуцировать пропионатом |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEN C. ET AL. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 for L-valine production. Metab Eng., 2015 May;29:66-75. doi: 10.1016/j.ymben.2015.03.004. * |
| CHEN C. ET AL. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 for L-valine production. Metab Eng., 2015 May;29:66-75. doi: 10.1016/j.ymben.2015.03.004. WADA М. ET AL. Enhanced Valine Production in Corynebacterium glutamicum with Defective H+-ATPase and C-Terminal Truncated Acetohydroxyacid Synthase. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2008, 72:11, 2959-2965, doi: 10.1271/bbb.80434. * |
| WADA М. ET AL. Enhanced Valine Production in Corynebacterium glutamicum with Defective H+-ATPase and C-Terminal Truncated Acetohydroxyacid Synthase. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2008, 72:11, 2959-2965, doi: 10.1271/bbb.80434. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110039313A1 (en) | Method for the fermentative production of cadaverine | |
| US7754446B2 (en) | Alleles of the rel gene from coryneform bacteria | |
| US8637295B1 (en) | Process for the production of L-lysine | |
| CN105492616A (zh) | 使用含有可通过丙酸盐诱导的ilvbn操纵子的重组棒杆菌生产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或α-酮异己酸的方法 | |
| JP6341907B2 (ja) | フィードバック耐性アルファ−イソプロピルリンゴ酸合成酵素 | |
| RU2676137C2 (ru) | Микроорганизм для продуцирования О-ацетилгомосерина и способ получения О-ацетилгомосерина с использованием этого микроорганизма | |
| RU2699516C2 (ru) | Новая лизиндекарбоксилаза и способ получения кадаверина с ее использованием | |
| US8119374B2 (en) | Nucleotide sequences of coryneform bacteria coded for proteins participating in L-serine metabolism and method for microbial production of L-serine | |
| US8080395B2 (en) | Alleles of the PRPD1 gene from coryneform bacteria | |
| US8592187B2 (en) | Alleles of the oxyR gene from coryneform bacteria | |
| WO2001098472A1 (en) | Novel glucose-6-phosphate dehydrogenase | |
| RU2288265C2 (ru) | Способ получения l-треонина | |
| JP5227789B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸の発酵的製造方法 | |
| RU2753996C1 (ru) | Бактерия Corynebacterium glutamicum с повышенной способностью продуцировать L-валин и способ получения L-валина с использованием этой бактерии | |
| US20030087400A1 (en) | Process for the fermentative production of L-lysine using coryneform bacteria | |
| CN100372927C (zh) | tdcBC/pckA基因失活的微生物和利用该微生物生产L-苏氨酸的方法 | |
| WO2021048353A1 (en) | Coryneform bacteria with a heterologous threonine transporter and their use in the production of l-threonine | |
| US20060106207A1 (en) | Nucleotide sequences that encode deregulated phosphoglycerate dehydrogenases of coryneform bacteria and method for producing l-serine | |
| RU2639247C1 (ru) | L-Лизин-продуцирующая коринеформная бактерия с инактивированным геном ltbR и способ получения L-лизина с использованием этой бактерии | |
| RU2612159C1 (ru) | L-Лизин-продуцирующая коринеформная бактерия с мутантным геном fusA и способ получения L-лизина с использованием этой бактерии | |
| Jakobsen | Study and engineering of methanolassimilation and L-lysineproduction in the thermotolerantbacterium Bacillus methanolicus |