[go: up one dir, main page]

RU2752783C1 - Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility - Google Patents

Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility Download PDF

Info

Publication number
RU2752783C1
RU2752783C1 RU2020141979A RU2020141979A RU2752783C1 RU 2752783 C1 RU2752783 C1 RU 2752783C1 RU 2020141979 A RU2020141979 A RU 2020141979A RU 2020141979 A RU2020141979 A RU 2020141979A RU 2752783 C1 RU2752783 C1 RU 2752783C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
endometriosis
embryos
women
mthfr
aneuploidy
Prior art date
Application number
RU2020141979A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Ирина Николаевна Фетисова
Анна Ивановна Малышкина
Елена Львовна Бойко
Светлана Сергеевна Семененко
Николай Сергеевич Фетисов
Елена Вадимовна Полумискова
Светлана Юрьевна Ратникова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2020141979A priority Critical patent/RU2752783C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2752783C1 publication Critical patent/RU2752783C1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention relates to medicine. The essence of the invention lies in the fact that polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T) gene is determined in leukocytes of peripheral venous blood in women with widespread genital endometriosis and endometriosis-associated infertility, and upon detection of the carriage of the MTHFR 677T allele in homozygotic or embryos with an accuracy of 77%. Invention can be used to predict aneuploidy of embryos in the program of in vitro fertilization (IVF) in women with advanced genital endometriosis and endometriosis-associated infertility.
EFFECT: method does not affect the IVF procedure, is non-invasive for oocytes and embryos and allows women to be identified in the risk group for receiving aneuploid embryos from them, provides a personalized approach to the appointment of pre-implantation genetic testing, which contributes to an increase in the efficiency of the IVF procedure.
1 cl, 1 tbl, 3 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.The invention relates to medicine, namely to obstetrics and gynecology and medical genetics, and can be used to predict aneuploidy of embryos in the in vitro fertilization (IVF) program in women with common genital endometriosis and endometriosis-associated infertility.

Актуальность. Эндометриоз – это состояние, при котором определяется наличие функционально активных желез и стромы эндометрия за пределами полости матки, что вызывает хронический воспалительный процесс в этих тканях. Эндометриоз, по мнению большинства исследователей, является одним из наиболее распространенных гинекологических заболеваний, поражающих женщин активного репродуктивного возраста [A prospective cohort study of endometriosis and subsequent risk of infertility / J. Prescott [et al.] // Human Reproduction. – 2016. – Vol. 31, № 7. – P. 1475–1482]. Бесплодие — один из самых значимых, в том числе социально, симптомов эндометриоза. Эндометриозом страдают 25 - 50% инфертильных женщин, а 30 - 50% женщин с эндометриозом имеют бесплодие [Reproducibility of the Endometriosis Fertility Index: a prospective inter-/intra-rater agreement study / C. Tomassetti [et al.] // BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. - 2020. - Т. 127, № 1. - С. 107-114].Relevance. Endometriosis is a condition in which the presence of functionally active glands and stroma of the endometrium outside the uterine cavity is determined, which causes a chronic inflammatory process in these tissues. Endometriosis, according to most researchers, is one of the most common gynecological diseases affecting women of active reproductive age [A prospective cohort study of endometriosis and subsequent risk of infertility / J. Prescott [et al.] // Human Reproduction. - 2016. - Vol. 31, No. 7. - P. 1475-1482]. Infertility is one of the most significant, including socially, symptoms of endometriosis. Endometriosis affects 25-50% of infertile women, and 30-50% of women with endometriosis have infertility [Reproducibility of the Endometriosis Fertility Index: a prospective inter- / intra-rater agreement study / C. Tomassetti [et al.] // BJOG: An International Journal of Obstetrics & Gynaecology. - 2020. - T. 127, No. 1. - S. 107-114].

Эндометриоз-ассоциированное бесплодие, которое наиболее часто встречается при распространенном генитальном эндометриозе III-IV стадии [Mahajan N. Endometrial receptivity array: clinical application // J. Human ReprodSci. – 2015. – Vol. 8, № 3. - P. 121-129], на сегодняшний день является одним из показаний к применению вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в частности метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ) в полость матки. Успех выполнения программы ЭКО в значительной мере определяется качеством получаемых эмбрионов [Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов в программе ЭКО как способ профилактики наследственной патологии / И.Н. Фетисова [и др.] // Вестник Ивановской медицинской академии. – 2018. – Т. 23, № 3. - С. 10-13]. Генетическая неполноценность эмбрионов наиболее часто обусловлена анеуплоидией – наличием численных или структурных (делеции и дупликации) хромосомных аномалий. Endometriosis-associated infertility, which is most common in advanced stage III-IV genital endometriosis [Mahajan N. Endometrial receptivity array: clinical application // J. Human ReprodSci. - 2015. - Vol. 8, No. 3. - P. 121-129], today is one of the indications for the use of assisted reproductive technologies (ART), in particular the method of in vitro fertilization (IVF) and embryo transfer (PE) into the uterine cavity. The success of the IVF program is largely determined by the quality of the embryos obtained [Preimplantation genetic diagnosis of embryos in the IVF program as a way to prevent hereditary pathology / IN. Fetisova [and others] // Bulletin of the Ivanovo Medical Academy. - 2018. - T. 23, No. 3. - S. 10-13]. Genetic inferiority of embryos is most often caused by aneuploidy - the presence of numerical or structural (deletion and duplication) chromosomal abnormalities.

Наиболее простым, но наименее точным методом выбора эмбрионов для переноса в полость матки является оценка их морфологических характеристик. Однако данный метод оценки качества эмбрионов является субъективным и не позволяет исключить наличие хромосомных аномалий даже у эмбрионов хорошего качества [Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, № 10. - C. 2245-2254].The simplest, but least accurate method of selecting embryos for transfer into the uterine cavity is to assess their morphological characteristics. However, this method of assessing the quality of embryos is subjective and does not allow excluding the presence of chromosomal abnormalities even in good quality embryos [Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, No. 10. - C. 2245-2254].

В последние годы активно внедряется преимплантационное генетическое тестирование на предмет выявления анеуплоидии (ПГТ-А), которое позволяет диагностировать генетическую аномалию эмбриона на этапе до переноса в полость матки. Перенос эуплоидного эмбриона существенно повышает шансы, наступления беременности [Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R.T. Scott [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100, № 3. - P. 697-703], однако ПГТ-А является дорогостоящим методом диагностики, что значительно ограничивает его широкое использование.In recent years, preimplantation genetic testing for the detection of aneuploidy (PGT-A) has been actively introduced, which makes it possible to diagnose a genetic anomaly of an embryo at the stage before transfer to the uterine cavity. Euploid embryo transfer significantly increases the chances of pregnancy [Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: A randomized controlled trial / R.T. Scott [et al.] // Fertil. Steril. - 2013. - Vol. 100, No. 3. - P. 697-703], however, PGT-A is an expensive diagnostic method, which significantly limits its widespread use.

Таким образом, разработка способа прогнозирования анеуплоидии эмбрионов у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием позволит выделить женщин в группу риска по получению у них анеуплоидных эмбрионов и обеспечить персонифицированный подход к назначению ПГТ-А, что позволит снизить расходы на проведение генетического тестирования и повысить эффективность процедуры ЭКО.Thus, the development of a method for predicting aneuploidy of embryos in women with common genital endometriosis and endometriosis-associated infertility will make it possible to single out women at risk of getting aneuploid embryos from them and provide a personalized approach to the appointment of PGT-A, which will reduce the cost of genetic testing and improve the efficiency of the IVF procedure.

Известен способ прогнозирования качества эмбриона в программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием путем исследования периферической венозной крови. До начала овариальной стимуляции в лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса. При обнаружении аллелей DQBl*06 и/или DRBl*13 прогнозируют высокое качество эмбрионов, при отсутствии аллелей DQBl*06 и DRBl*13 прогнозируют низкое качество эмбрионов [Патент № 2474823 Российская Федерация. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения / Малышкина А.И., Липин М.А., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А., Богатова И.К., Полумискова Е.В. // Изобретения. Полезные модели. – 2013. - № 4].A known method for predicting the quality of the embryo in the program of in vitro fertilization (IVF) in women with tubo-peritoneal infertility by examining the peripheral venous blood. Before the start of ovarian stimulation in leukocytes, HLA class II gene polymorphism is determined. When alleles DQBl * 06 and / or DRBl * 13 are detected, high quality of embryos is predicted, in the absence of alleles DQBl * 06 and DRBl * 13, low quality of embryos is predicted [Patent No. 2474823 Russian Federation. Method for predicting the quality of embryos in the in vitro fertilization program / Malyshkina A.I., Lipin M.A., Fetisova I.N., Dyuzhev Zh.A., Bogatova I.K., Polumiskova E.V. // Inventions. Utility models. - 2013. - No. 4].

Данный способ имеет ряд недостатков:This method has several disadvantages:

1. Данный способ предназначен для прогнозирования морфологических характеристик эмбрионов и не позволяет прогнозировать анеуплоидию.1. This method is intended to predict the morphological characteristics of embryos and does not allow predicting aneuploidy.

2. Для системы генов HLA характерно явление множественного аллелизма, то есть в генофонде популяции присутствуют десятки и сотни аллелей одного гена. Подобное аллельное разнообразие может затруднять интерпретацию полученных данных.2. The HLA gene system is characterized by the phenomenon of multiple allelism, that is, tens and hundreds of alleles of one gene are present in the gene pool of a population. This allelic diversity can make it difficult to interpret the data obtained.

3. Высокая стоимость исследования.3. The high cost of research.

Известен способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток. Сущность способа заключается в том, что пациентку генотипируют по полиморфным локусам, по результатам генотипирования определяют вероятность получения эмбрионов низкого качества по формуле р=1/(1+е-z), где Z=-2236-0,79*AMHT/G - 20,621*AMHG/G +0,993*FSHRA/G+ 0,364*FSHRG/G - 1,206*LHCGR(935 A>G)A/G + 1,164*LHCGR(935 A>G)A/A + 22,888*LHCGR(872 A>G)A/G + 21,6*LHCGR(872 A>G)A/A. При значениях p больше 0,5 прогнозируют получение эмбрионов низкого качества, а при значениях р меньше 0,5 не прогнозируют получение эмбрионов низкого качества [Патент № 2577729 Российская Федерация. Способ прогнозирования качества эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий с учетом генотипа пациенток / Донников А.Е., Калинина Е.А., Владимирова И.В., Сухих Г.Т. // Изобретения. Полезные модели. - 2016. - № 8].A known method for predicting the quality of embryos in programs of assisted reproductive technologies, taking into account the genotype of patients. The essence of the method lies in the fact that the patient is genotyped by polymorphic loci, according to the results of genotyping, the probability of obtaining low quality embryos is determined by the formula p = 1 / (1 + e-z), where Z = -2236-0.79 * AMHT / G - 20.621 * AMHG / G + 0.993 * FSHRA / G + 0.364 * FSHRG / G - 1.206 * LHCGR (935 A> G) A / G + 1.164 * LHCGR (935 A> G) A / A + 22.888 * LHCGR (872 A> G) A / G + 21.6 * LHCGR (872 A> G) A / A. With p values greater than 0.5, the production of low quality embryos is predicted, and with p values less than 0.5, the production of low quality embryos is not predicted [Patent No. 2577729 Russian Federation. Method for predicting the quality of embryos in programs of assisted reproductive technologies taking into account the genotype of patients / Donnikov A.E., Kalinina E.A., Vladimirova I.V., Sukhikh G.T. // Inventions. Utility models. - 2016. - No. 8].

Данный способ имеет следующие недостатки:This method has the following disadvantages:

1. Данный способ предназначен для прогнозирования морфологических характеристик эмбрионов и не позволяет прогнозировать анеуплоидию.1. This method is intended to predict the morphological characteristics of embryos and does not allow predicting aneuploidy.

2. Большое количество исследуемых генов и наличие сложных математических расчетов затрудняет использование способа.2. A large number of genes under study and the presence of complex mathematical calculations make it difficult to use the method.

3. Высокая стоимость исследования.3. The high cost of research.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения [Патент № 2657769 Российская Федерация. Способ прогнозирования наличия хромосомных аномалий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества на основании оценки транскрипционного профиля в кумулюсных клетках в программе экстракорпорального оплодотворения / Сафонова Н.А., Донников А.Е., Калинина Е. А., Макарова Н.П., Бурменская О.В., Долгушина Н.В., Горшинова В. К., Сухих Г.Т. // Изобретения. Полезные модели. – 2018. - № 17]. Способ заключается в том, что на основании анализа уровня экспрессии мРНК гена PFKP в кумулюсных клетках определяют вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества по формуле:Closest to the proposed method is a method for predicting the presence of chromosomal abnormalities in embryos of satisfactory and poor quality based on the assessment of the transcriptional profile in cumulus cells in the in vitro fertilization program [Patent No. 2657769 Russian Federation. Method for predicting the presence of chromosomal abnormalities in embryos of satisfactory and poor quality based on the assessment of the transcriptional profile in cumulus cells in the in vitro fertilization program / Safonova N.A., Donnikov A.E., Kalinina E.A., Makarova N.P., Burmenskaya O V.V., Dolgushina N.V., Gorshinova V.K., Sukhikh G.T. // Inventions. Utility models. - 2018. - No. 17]. The method consists in the fact that based on the analysis of the level of expression of mRNA of the PFKP gene in cumulus cells, the probability of aneuploidies in embryos of satisfactory and poor quality is determined by the formula:

p=exp(logit)/(1+exp(logit),p = exp (logit) / (1 + exp (logit),

где logit=-2,59+0,48*PFKP,where logit = -2.59 + 0.48 * PFKP,

где PFKP - уровень экспрессии мРНК гена PFKP;where PFKP is the level of mRNA expression of the PFKP gene;

р - искомая вероятность наличия анеуплоидий в эмбрионах удовлетворительного и плохого качества, и при значениях р выше 0,5 прогнозируют наличие хромосомных аномалий в данной группе эмбрионов.p is the desired probability of the presence of aneuploidies in embryos of satisfactory and poor quality, and at p values above 0.5, the presence of chromosomal abnormalities in this group of embryos is predicted.

Данный способ имеет следующие недостатки:This method has the following disadvantages:

1. Метод предполагает использование инвазивной процедуры: трансвагинальная пункция яичников, которая имеет риск тяжелых осложнений.1. The method involves the use of an invasive procedure: transvaginal ovarian puncture, which carries the risk of severe complications.

2. Методика забора кумулюсных клеток для исследования увеличивает время нахождения ооцитов вне инкубатора, что может неблагоприятно сказываться на их оплодотворении и последующем развитии эмбрионов. 2. The method of collecting cumulus cells for research increases the time spent by oocytes outside the incubator, which may adversely affect their fertilization and subsequent development of embryos.

3. Данный способ предполагает забор и исследование кумулюсных клеток каждого ооцита, полученного после стимуляции овуляции у женщин, независимо от дальнейшего развития и качества эмбрионов, что увеличивает затраты расходных материалов.3. This method involves the collection and study of cumulus cells of each oocyte obtained after ovulation stimulation in women, regardless of the further development and quality of embryos, which increases the cost of consumables.

4. После забора кумулюсных клеток, каждый ооцит (а в последующем и эмбрион) необходимо культивировать в отдельной капле среды, что потребует большего количества затрачиваемых на 1 пациентку культуральных сред, расходных материалов и оборудования.4. After collecting cumulus cells, each oocyte (and subsequently an embryo) must be cultured in a separate drop of medium, which will require a larger amount of culture media, consumables and equipment consumed per patient.

5. Кумулюсные клетки отражают процессы, происходящие в каждом конкретном ооците, полученном в данной программе ЭКО, что обуславливает необходимость повторного исследования при проведении последующих циклов ВРТ.5. Cumulus cells reflect the processes occurring in each specific oocyte obtained in this IVF program, which necessitates a re-examination during subsequent ART cycles.

6. Данный метод позволяет прогнозировать хромосомные аномалии только у эмбрионов удовлетворительного и плохого качества и не предназначен для прогнозирование хромосомных нарушений при получении эмбрионов хорошего качества. 6. This method allows predicting chromosomal abnormalities only in embryos of satisfactory and poor quality and is not intended for predicting chromosomal abnormalities when obtaining embryos of good quality.

7. Высокая стоимость исследования.7. High cost of research.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.These disadvantages are proposed to be eliminated in the claimed method.

Техническим результатом является расширения арсенала способов прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием. The technical result is to expand the arsenal of methods for predicting aneuploidy of embryos in the IVF program in women with common genital endometriosis and endometriosis-associated infertility.

Технический результат достигается тем, что у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием в лейкоцитах периферической крови определяют полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) и при выявлении носительства аллеля MTHFR 677T в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют анеуплоидию эмбрионов с точностью 77%.The technical result is achieved by the fact that in women with widespread genital endometriosis and endometriosis-associated infertility in peripheral blood leukocytes, polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR C677T) is determined, and upon detection of the carriage of the MTHFR 677T allele in the homo- or heterozygous state, ano- or heterozygous state is predicted accuracy of 77%.

Проведено определение полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) у 41 женщины с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием до начала вступления в программу ЭКО с последующей оценкой наличия анеуплоидии эмбрионов с помощью метода сравнительной геномной гибридизации на чипах (aCGH - comparative genomic hybridization) с использованием оборудования фирмы Agilent Technologies (США). The polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ( MTHFR C677T) gene was determined in 41 women with advanced genital endometriosis and endometriosis-associated infertility before entering the IVF program, followed by assessment of the presence of embryo aneuploidy using comparative genomic hybridization on chips (comparative hybridization) using equipment from Agilent Technologies (USA).

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать анеуплоидию эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием путем определения у них полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) в лейкоцитах периферической крови.The novelty of the proposed method lies in the fact that for the first time it is proposed to predict aneuploidy of embryos in the IVF program in women with widespread genital endometriosis and endometriosis-associated infertility by determining their polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ( MTHFR C677T) gene in peripheral blood leukocytes.

Ранее определение полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) использовалось для прогнозирования риска развития привычного невынашивания беременности [Полиморфизм генов фолатного обмена у женщин с первичной привычной потерей беременности ранних сроков / А.С. Добролюбов [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - 2006. - T. XIII, № 4. - С. 60], наружного генитального эндометриоза [Полиморфизмы генов фолатного обмена у женщин с наружным генитальным эндометриозом / М.Л. Добрынина [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - 2007. - Т. XIV, № 1. - С. 110-112], быстрого роста миомы матки [Малышкина А.И., Фетисова И.Н., Дюжев Ж.А. Генетические маркеры предрасположенности к быстрому росту лейомиомы матки // Проблемы репродукции. - 2012 - (Специальный выпуск) – С. 188-189]. Previously, the definition of gene polymorphism 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ( MTHFR C677T) was used to predict the risk of recurrent miscarriage [Polymorphism of folate metabolism genes in women with primary recurrent early pregnancy loss / A.S. Dobrolyubov [et al.] // Bulletin of new medical technologies. - 2006. - T. XIII, № 4. - P. 60], external genital endometriosis [Polymorphisms of folate metabolism genes in women with external genital endometriosis / ML. Dobrynina [et al.] // Bulletin of new medical technologies. - 2007. - T. XIV, № 1. - S. 110-112], rapid growth of uterine fibroids [Malyshkina AI, Fetisova IN, Dyuzhev Zh.A. Genetic markers of predisposition to rapid growth of uterine leiomyoma // Problems of reproduction. - 2012 - (Special issue) - S. 188-189].

В литературе отсутствуют сведения об использовании определения полиморфизма гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) для прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.There is no information in the literature on the use of the polymorphism determination of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase ( MTHFR C677T) gene for predicting embryo aneuploidy in the in vitro fertilization program in women with advanced genital endometriosis and endometriosis-associated infertility.

Как известно, 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза является ключевым ферментом в процессе синтеза метионина из гомоцистеина. Гомо- и гетерозиготное носительство аллеля MTHFR 677Т обусловливает снижение активности энзима и, соответственно, приводит к развитию гипергомоцистеинемии. Повышение уровня содержания гомоцистеина является фактором риска развития тромбофилических осложнений, вероятность которых еще более повышается в период беременности вследствие перестройки свертывающей, противосвертывающей и фибринолитической систем организма. Тромбофилический и атерогенный эффект гипергомоцистеинемии сказывается в нарушении плацентации и прерывании беременности [Рудзевич А.Ю., Кукарская И.И., Фильгус Т.А. Влияние врожденной тромбофилии на беременность и возможность коррекции // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 4. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27781 (дата обращения: 07.12.2020)].It is known that 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase is a key enzyme in the synthesis of methionine from homocysteine. Homo- and heterozygous carriage of the MTHFR 677T allele causes a decrease in the enzyme activity and, accordingly, leads to the development of hyperhomocysteinemia. An increase in the level of homocysteine is a risk factor for the development of thrombophilic complications, the likelihood of which increases even more during pregnancy due to the restructuring of the coagulation, anticoagulant and fibrinolytic systems of the body. Thrombophilic and atherogenic effect of hyperhomocysteinemia affects placentation disorders and abortion [Rudzevich A.Yu., Kukarskaya II, Filgus T.A. Influence of congenital thrombophilia on pregnancy and the possibility of correction // Modern problems of science and education. - 2018. - No. 4. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=27781 (date of access: 07.12.2020)].

Возможно недостаточная активность ферментов фолатного обмена может быть причиной снижения метилирования в половых клетках. При этом изменение профиля метилирования центромерных районов хромосом в процессе гаметогенеза может способствовать нарушению расхождения гомологов в мейозе и формированию несбалансированных гамет и как следствие анеуплоидных эмбрионов.Perhaps insufficient activity of enzymes of folate metabolism can be the reason for a decrease in methylation in germ cells. At the same time, a change in the methylation profile of centromeric regions of chromosomes in the process of gametogenesis can contribute to a violation of the divergence of homologues in meiosis and the formation of unbalanced gametes and, as a consequence, aneuploid embryos.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.The inventive method is carried out as follows.

I. Забор крови для исследования.I. Blood sampling for research.

Кровь у пациенток получают методом венепункции локтевой вены (объем 3 мл) в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом. В качестве консерванта используют 0,5М раствор ЭДТА в соотношении консервант : кровь – 1:10Blood from patients is obtained by venipuncture of the cubital vein (volume 3 ml) in disposable plastic tubes with a preservative. A 0.5M EDTA solution is used as a preservative in the ratio of preservative: blood - 1:10

II. Выделение и очищение ДНК.II. Isolation and purification of DNA.

Выделение тотальной геномной ДНК из 100 мкл цельной венозной крови проводят сорбентным методом с использованием набора «Проба-ГС-Генетика» («ДНК-технология», Россия) по протоколу производителя.Isolation of total genomic DNA from 100 μl of whole venous blood is carried out by the sorbent method using a set "Proba-GS-Genetics" ("DNA-technology", Russia) according to the manufacturer's protocol.

III. Изучают полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFR C677T (rs1801133) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием амплификатора детектирующего ДТпрайм («ДНК-технология», Россия) и набора реагентов «Генетика метаболизма фолатов» («ДНК-технология», Россия). III. The polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene MTHFR C677T (rs1801133) is studied by the polymerase chain reaction method in real time using the DTprime detecting amplifier (DNA-technology, Russia) and a set of reagents “Genetics of folate metabolism” (“DNA-technology”, Russia).

При выявлении носительства аллеля MTHFR 677T гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют получение анеуплоидных эмбрионов в программе ЭКО у женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием.If the carriage of the MTHFR 677T allele of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene in the homo- or heterozygous state is detected, aneuploid embryos are predicted in the IVF program in women with advanced genital endometriosis and endometriosis-associated infertility.

Отличительные признаки способа: в лейкоцитах периферической крови женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием определяют полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) и при выявлении носительства аллеля MTHFR 677Т в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют получение анеуплоидных эмбрионов.Distinctive features of the method: in the peripheral blood leukocytes of women with widespread genital endometriosis and endometriosis-associated infertility, polymorphism of the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR C677T) is determined, and upon detection of the carriage of the MTHFR 677T allele in homo- or heterozygous embryonic state is predicted.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:The essence of the proposed method is illustrated by the following examples:

Пример 1. Example 1.

Женщина А., 28 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз IV стадии: эндометриоидные кисты обоих яичников, ретроцервикальный эндометриоз, экстрагенитальный эндометриоз (эндометриоз мочевого пузыря, кишечника). Woman A., 28 years old, diagnosis: Primary infertility. Common stage IV genital endometriosis: endometrioid cysts of both ovaries, retrocervical endometriosis, extragenital endometriosis (endometriosis of the bladder, intestines).

При молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гомозиготное носительство аллеля MTHFR 677С в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR 677С/С), то есть отсутствие в генотипе аллеля MTHFR 677Т.Molecular genetic testing of the folate cycle genes revealed homozygous carriage of the MTHFR 677C allele in the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR 677C / C), that is, the absence of the MTHFR 677T allele in the genotype.

Заключение: прогноз отсутствия анеуплоидии у эмбриона.Conclusion: prognosis of the absence of aneuploidy in the embryo.

Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 2 зрелых ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 2 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено отсутствие анеуплоидии у обоих эмбрионов. Superovulation was stimulated using a short protocol. As a result of transvaginal puncture, 2 mature oocytes were obtained. After in vitro fertilization, 2 embryos were obtained. On the 5th day of cultivation, the embryos underwent biopsy of the trophectoderm cells. As a result of preimplantation genetic testing by the method of comparative hybridization on chips, the absence of aneuploidy in both embryos was revealed.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.The forecast for the claimed method was confirmed.

Пример 2. Example 2.

Женщина К., 30 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз IV стадии: эндометриоидная киста правого яичника, ретроцервикальный эндометриоз, экстрагенитальный эндометриоз (эндометриоз мочевого пузыря). Согласно предложенному способу при молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гомозиготное носительство аллеля MTHFR 677Т в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR 677T/Т).Woman K., 30 years old, diagnosis: Primary infertility. Common stage IV genital endometriosis: right ovarian endometrioid cyst, retrocervical endometriosis, extragenital endometriosis (bladder endometriosis). According to the proposed method, during molecular genetic testing of the folate cycle genes, homozygous carriage of the MTHFR 677T allele in the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR 677T / T) was determined.

Заключение: прогноз наличия анеуплоидии эмбрионов.Conclusion: prognosis of the presence of embryo aneuploidy.

Стимуляция суперовуляции проводилась по длинному протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 4 ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 4 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено наличие анеуплоидии у всех четырех эмбрионов. Superovulation was stimulated using a long protocol. As a result of transvaginal puncture, 4 oocytes were obtained. After in vitro fertilization, 4 embryos were obtained. On the 5th day of cultivation, the embryos underwent biopsy of the trophectoderm cells. As a result of preimplantation genetic testing by comparative hybridization on chips, aneuploidy was revealed in all four embryos.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.The forecast for the claimed method was confirmed.

Пример 3. Example 3.

Женщина В., 29 лет, диагноз: Первичное бесплодие. Распространенный генитальный эндометриоз III стадии: ретроцервикальный эндометриоз с распространением патологического процесса на крестцово-маточные связки. Woman V., 29 years old, diagnosis: Primary infertility. Common stage III genital endometriosis: retrocervical endometriosis with the spread of the pathological process to the sacro-uterine ligaments.

Согласно предложенному способу при молекулярно-генетическом тестировании генов фолатного цикла было определено гетерозиготное носительство аллеля MTHFR 677Т в гене 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR 677 C/T).According to the proposed method, during molecular genetic testing of the folate cycle genes, heterozygous carriage of the MTHFR 677T allele in the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR 677 C / T) was determined.

Заключение: прогноз наличия анеуплоидии эмбрионов.Conclusion: prognosis of the presence of embryo aneuploidy.

Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции было получено 3 зрелых ооцита. После проведения экстракорпорального оплодотворения получено 3 эмбриона. На 5 день культивирования эмбрионам проводилась биопсия клеток трофэктодермы. В результате преимплантационного генетического тестирования методом сравнительной гибридизации на чипах было выявлено наличие анеуплоидии всех трех эмбрионов. Superovulation was stimulated using a short protocol. As a result of transvaginal puncture, 3 mature oocytes were obtained. After in vitro fertilization, 3 embryos were obtained. On the 5th day of cultivation, the embryos underwent biopsy of the trophectoderm cells. As a result of preimplantation genetic testing by the method of comparative hybridization on chips, aneuploidy of all three embryos was revealed.

Прогноз по заявляемому способу подтвердился.The forecast for the claimed method was confirmed.

Результаты исследования приведены в таблице 1.The research results are shown in Table 1.

Таблица №1Table # 1

ПоказательIndex КоличествоQuantity Всего обследованоTotal surveyed 4141 Истинно-положительный результатTrue positive result 14 fourteen Ложно-положительный результатFalse positive 9 nine Истинно-отрицательный результатTrue negative result 14 fourteen Ложно-отрицательный результатFalse negative result 4 4

Чувствительность метода: 77,0%Method sensitivity: 77.0%

Специфичность метода: 61,0%Method specificity: 61.0%

Точность метода: 68,0%Method accuracy: 68.0%

Преимущества заявляемого метода:The advantages of the proposed method:

1. Так как метод основан на оценке полиморфизма генов, исследование проводится один раз в жизни.1. Since the method is based on the assessment of gene polymorphism, the study is carried out once in a lifetime.

2. Способ позволяет прогнозировать анеуплоидию эмбрионов не зависимо от их качества.2. The method makes it possible to predict aneuploidy of embryos regardless of their quality.

3. Способ не оказывает влияние на проведение процедуры ЭКО, так как материалом для исследования является периферическая кровь.3. The method does not affect the IVF procedure, since the material for the study is peripheral blood.

4. Способ неинвазивен для ооцитов и эмбрионов.4. The method is non-invasive for oocytes and embryos.

5. Способ позволяет выделить женщин в группу риска по получению у них анеуплоидных эмбрионов, обеспечивает персонифицированный подход к назначению преимплантационного генетического тестирования, что способствует повышению эффективности процедуры ЭКО.5. The method allows to single out women in the risk group for getting aneuploid embryos from them, provides a personalized approach to the appointment of preimplantation genetic testing, which improves the efficiency of the IVF procedure.

6. Доступность и небольшая стоимость способа.6. Availability and low cost of the method.

Claims (1)

Способ прогнозирования анеуплоидии эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения путем генетического исследования, отличающийся тем, что в лейкоцитах периферической крови женщин с распространенным генитальным эндометриозом и эндометриоз-ассоциированным бесплодием определяют полиморфизм гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR C677T) и при выявлении носительства аллеля MTHFR 677Т в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют получение анеуплоидных эмбрионов. A method of predicting aneuploidy embryos in vitro fertilization by genetic testing, characterized in that in peripheral blood leukocytes women with advanced endometriosis and endometriosis-associated infertility determine gene polymorphism of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T) and the detection of carriers of the allele in MTHFR 677T the homo- or heterozygous state predicts the production of aneuploid embryos.
RU2020141979A 2020-12-18 2020-12-18 Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility RU2752783C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020141979A RU2752783C1 (en) 2020-12-18 2020-12-18 Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020141979A RU2752783C1 (en) 2020-12-18 2020-12-18 Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2752783C1 true RU2752783C1 (en) 2021-08-03

Family

ID=77226287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020141979A RU2752783C1 (en) 2020-12-18 2020-12-18 Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2752783C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2589681C2 (en) * 2011-06-29 2016-07-10 БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд. Non-invasive detection of genetic foetal abnormality
US10438686B2 (en) * 2008-07-01 2019-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and systems for assessment of clinical infertility

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10438686B2 (en) * 2008-07-01 2019-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and systems for assessment of clinical infertility
RU2589681C2 (en) * 2011-06-29 2016-07-10 БиДжиАй Дженомикс Ко., Лтд. Non-invasive detection of genetic foetal abnormality

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study / M.G. Minasi [et al.] // Hum Reprod. - 2016. - Vol. 31, N 10. - C. 2245-2254. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8754014B2 (en) Methods for selecting oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome
Kimelman et al. Non-invasive prenatal testing in the context of IVF and PGT-A
Li et al. Higher chromosomal aberration rate in miscarried conceptus from polycystic ovary syndrome women undergoing assisted reproductive treatment
US9090938B2 (en) Methods for selecting competent oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome
Laisk-Podar et al. Genetic variants associated with female reproductive ageing–potential markers for assessing ovarian function and ovarian stimulation outcome
Xiao et al. Next-generation sequencing is more efficient at detecting mosaic embryos and improving pregnancy outcomes than single-nucleotide polymorphism array analysis
WO2021159722A1 (en) Method for evaluating and predicting placenta-derived diseases and kit
Raschia et al. Quantitative trait loci exploration and characterization of gestation length in Holstein cattle
JP2013510575A (en) Genes differentially expressed in cumulus cells and assays for identification of pregnancy-bearing oocytes using them
RU2752783C1 (en) Method for prediction of embryo aneuploidy in the extracorporal fertilization program in women with endometriosis-associated infertility
US20070238111A1 (en) Identification of genes or polypeptides the expression of which correlates to fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability
Dang et al. The effect of carrier characteristics and female age on preimplantation genetic testing results of blastocysts from Robertsonian translocation carriers
Fathi et al. Impact of miRNAs in the pathoetiology of recurrent implantation failure
Tan et al. Impact of blastocyst grading and blastocyst biopsy dates on the clinical outcomes of patients undergoing preimplantation genetic testing
RU2532367C2 (en) Method for detecting genetic predisposition to recurrent pregnancy loss
Yang et al. Application of next-generation sequencing to preimplantation genetic testing for recurrent hydatidiform mole patients
US20110124511A1 (en) Gene Expression Profile-Facilitated In Vitro Fertilization
RU2819536C1 (en) Method for diagnosing chromosomal mosaicism in patients with disturbed formation and functioning of reproductive system by vaginal epithelium by fluorescent in situ hybridisation (fish) with dna probes complementary to centromeric sequences of sex chromosomes
RU2791586C1 (en) Method for assessing the risk of premature reduction of ovarian reserve
RU2760499C1 (en) Method for predicting non-developing pregnancy associated with chromosomal abnormalities of the embryo
Ask Gullstrand Genetics of new phenotypes of pregnancy loss in dairy cattle
Martinez et al. COMPARISON OF IVF OUTCOMES FROM USE OF 2 DIFFERENT PGT-A LABORATORIES
Navarro-Sánchez et al. Noninvasive Methods of Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidies
Stegemiller et al. Genome-Wide Association Analyses of Fertility Traits in Beef Heifers. Genes 2021, 12, 217
Kong et al. Genetic Aspect of Recurrent Implantation Failure