RU2751603C2 - Method for production of labeled cell culture - Google Patents
Method for production of labeled cell culture Download PDFInfo
- Publication number
- RU2751603C2 RU2751603C2 RU2019145601A RU2019145601A RU2751603C2 RU 2751603 C2 RU2751603 C2 RU 2751603C2 RU 2019145601 A RU2019145601 A RU 2019145601A RU 2019145601 A RU2019145601 A RU 2019145601A RU 2751603 C2 RU2751603 C2 RU 2751603C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cell culture
- magnetite
- microaggregates
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 31
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000011858 nanopowder Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000004020 conductor Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004880 explosion Methods 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 14
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 10
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 7
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 5
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 3
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000399119 Spio Species 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002616 MRI contrast agent Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLRVWFDVJWKAIL-LXMACRGBSA-M [2,2-dimethyl-3-[(2r,3e)-3-oxidoiminobutan-2-yl]azanidylpropyl]-[(2r,3e)-3-hydroxyiminobutan-2-yl]azanide;oxotechnetium-99(3+) Chemical compound [99Tc+3]=O.O/N=C(\C)[C@@H](C)[N-]CC(C)(C)C[N-][C@H](C)C(\C)=N\[O-] ZLRVWFDVJWKAIL-LXMACRGBSA-M 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);octadecacyanide Chemical compound [Fe+2].[Fe+2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].[Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] DCYOBGZUOMKFPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N iron(2+);oxygen(2-) Chemical group [O-2].[Fe+2] VBMVTYDPPZVILR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000009189 magnetic resonance therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002069 magnetite nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960003351 prussian blue Drugs 0.000 description 1
- 239000013225 prussian blue Substances 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82B—NANOSTRUCTURES FORMED BY MANIPULATION OF INDIVIDUAL ATOMS, MOLECULES, OR LIMITED COLLECTIONS OF ATOMS OR MOLECULES AS DISCRETE UNITS; MANUFACTURE OR TREATMENT THEREOF
- B82B1/00—Nanostructures formed by manipulation of individual atoms or molecules, or limited collections of atoms or molecules as discrete units
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а именно к клеточным технологиям, в частности к способам получения применяемых в диагностике, регенеративной терапии клеток человека, содержащих компоненты, позволяющие отслеживать их в организме человека и крупных животных.The invention relates to the field of cell biology and biotechnology, namely to cell technologies, in particular to methods of obtaining used in diagnostics, regenerative therapy of human cells containing components that allow them to be tracked in the human body and large animals.
Применение клеточных технологий в терапии широкого спектра заболеваний делает возможным комплексное и целенаправленное лечение серьезных нарушений различного генеза. Однако возникает необходимость разработки методов прижизненного мечения клеток in vitro для отслеживания клеточной миграции и адгезии после их введения в организм человека. Разработанные ранее методы прижизненного мечения клеток люминофорами и флюофорами пригодны только для небольших организмов или для исследований post mortem [Progatzky F., Dallman M.J., Lo Celso C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus, 2013, 3: 20130001]. Методы радиоактивного мечения клеток представляют угрозу для пациента и влияют на физиологию трансплантируемых клеток, снижая скорость пролиферации [Detante О., Moisan A., Dimastromatteo J., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution // Cell Transplant. 2009; 18(12):1369-1379] и дифференцировки [Brenner W., Aicher A., Eckey Т., et al. 111In-labeled CD34+ hematopoietic progenitor cells in a rat myocardial infarction model. J Nucl Med. 2004; 45:512-518].The use of cellular technologies in the treatment of a wide range of diseases makes it possible to comprehensive and targeted treatment of serious disorders of various origins. However, there is a need to develop methods for in vivo labeling of cells in vitro to track cell migration and adhesion after their introduction into the human body. The previously developed methods of in vivo labeling of cells with phosphors and fluophores are suitable only for small organisms or for post mortem studies [Progatzky F., Dallman MJ, Lo Celso C. From seeing to believing: labeling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus, 2013, 3: 20130001]. Methods of radioactive labeling of cells pose a threat to the patient and affect the physiology of the transplanted cells, reducing the proliferation rate [Detante O., Moisan A., Dimastromatteo J., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution // Cell Transplant. 2009; 18 (12): 1369-1379] and differentiation [Brenner W., Aicher A., Eckey T., et al. 111 In-labeled CD34 + hematopoietic progenitor cells in a rat myocardial infarction model. J Nucl Med. 2004; 45: 512-518].
Перспективным считается использование метода магнитно-резонансной томографии (МРТ) для визуализации вводимых клеток. Использование МРТ требует разработки способа прижизненного мечения клеток, при котором клетки захватывают частицы контрастирующего агента, удерживают их и могут быть визуализированы методом МРТ, при этом сохраняя свою жизнеспособность, пролиферативный статус и функциональные свойства. Однако многие разработанные контрастирующие материалы не удовлетворяют требованиям безопасности при прохождении доклинических испытаний. Так, контрастирующие препараты на основе гадолиния оказались токсичными для клеток и пациентов [Нао D., Ai Т., Goerner F., et al. MRI contrast agents: Basic chemistry and safety // J. Magn. Reson. Imaging, 2012, 36: 1060-1071]. Наиболее популярными и перспективными представляются препараты на основе суперпарамагнитных частиц оксида железа, покрытых различными органическими оболочками для защиты частиц от клеток и клеток от частиц оксида железа. Однако некоторые из таких препаратов вызывают нежелательные побочные эффекты, например, большинство контрастирующих агентов на основе покрытых декстраном частиц оксида железа, в том числе и самый известный из них - Ferridex, - сняты с производства в связи с высокой частотой нежелательных побочных эффектов [https://www.mr-tip.com/serv1.php?type=db1&gid=767, дата обращения: 15.11.2019; https://www.drugs.com/pro/feridex.html, дата обращения: 15.11.2019].The use of the method of magnetic resonance imaging (MRI) for visualization of injected cells is considered promising. The use of MRI requires the development of a method for intravital cell labeling, in which cells capture particles of a contrast agent, retain them and can be visualized by MRI, while maintaining their viability, proliferative status and functional properties. However, many contrasting materials developed do not meet safety requirements when passing preclinical tests. So, contrasting preparations based on gadolinium were toxic to cells and patients [Hao D., Ai T., Goerner F., et al. MRI contrast agents: Basic chemistry and safety // J. Magn. Reson. Imaging, 2012, 36: 1060-1071]. The most popular and promising are preparations based on superparamagnetic iron oxide particles coated with various organic shells to protect particles from cells and cells from iron oxide particles. However, some of these drugs cause unwanted side effects, for example, most contrast agents based on dextran coated iron oxide particles, including the most famous of them - Ferridex, have been discontinued due to the high frequency of unwanted side effects [https: / /www.mr-tip.com/serv1.php?type=db1&gid=767, date of access: 15.11.2019; https://www.drugs.com/pro/feridex.html, date accessed: 15.11.2019].
Разработка способа прижизненного мечения клеток, при котором клетки захватывают частицы контрастирующего агента, удерживают их и могут быть визуализированы методом МРТ, при этом сохраняя свою жизнеспособность, пролиферативный статус и функциональные свойства представляется актуальной.The development of a method for in vivo labeling of cells, in which cells capture particles of a contrast agent, retain them and can be visualized by MRI, while maintaining their viability, proliferative status and functional properties, seems relevant.
В большинстве случаев в качестве контрастирующего агента используются наночастицы размером до 100 нм или суперпарамагнитные частицы (SPION, диаметр до 20 нм) оксида железа (смесь оксидов, формула смеси Fe3O4), покрытые какими-либо органическими веществами (декстран, полиэтиленимин и т.д.) для улучшения проникновения в клетку и снижения цитотоксичности и т.п. [Rakesh М.Р., Nanasaheb D.T., Prajkta B.S., et al. Comprehensive cytotoxicity studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles // Biochemistry and Biophysics Reports, 2018, 13:63-72]. Однако уже в концентрации до 80 мкг/мл таких частиц начинает проявляться цитотоксичность препаратов [Rezaei М., Mafakheri Н., Khoshgard K., et al. The Cytotoxicity of Dextran-coated Iron Oxide Nanoparticles on Hela and MCF-7 Cancerous Cell Lines // IJT. 2017; 11(5):31-36]. В такой концентрации цитотоксичность незначительна: 10-15%. По нашим собственным данным, для успешной визуализации SPION-меченых клеток на клинических МРТ-томографах необходима концентрация частиц свыше 100 мкг/мл, оптимально 150-300 мкг/мл. Однако можно ожидать, что такая концентрация магнитных частиц будет высокотоксична для клеток.In most cases, nanoparticles up to 100 nm in size or superparamagnetic particles (SPION, diameter up to 20 nm) of iron oxide (mixture of oxides, mixture formula Fe 3 O 4 ) coated with any organic substances (dextran, polyethyleneimine, etc.) are used as a contrast agent. etc.) to improve cell penetration and reduce cytotoxicity, etc. [Rakesh M. P., Nanasaheb DT, Prajkta BS, et al. Comprehensive cytotoxicity studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles // Biochemistry and Biophysics Reports, 2018, 13: 63-72]. However, already at a concentration of up to 80 μg / ml of such particles, the cytotoxicity of drugs begins to manifest [Rezaei M., Mafakheri N., Khoshgard K., et al. The Cytotoxicity of Dextran-coated Iron Oxide Nanoparticles on Hela and MCF-7 Cancerous Cell Lines // IJT. 2017; 11 (5): 31-36]. At this concentration, cytotoxicity is negligible: 10-15%. According to our own data, for successful visualization of SPION-labeled cells on clinical MRI tomographs, a particle concentration of more than 100 μg / ml is required, optimally 150-300 μg / ml. However, this concentration of magnetic particles can be expected to be highly toxic to cells.
В известных из уровня техники препаратах для мечения клеток обычно используют SPION, полученные методом проведения химических реакций. В статье Zhu Х.М., Wang Y.X., Leung K.С., et al. Enhanced cellular uptake of aminosilane-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles in mammalian cell lines // Int J Nanomedicine. 2012; 7:953-964 описываются способы синтеза наночастиц, при которых сердцевину из оксида железа синтезируют щелочным соосаждением двух частей хлорида железа и одной части сульфата железа в растворе NaOH в атмосфере азота при перемешивании. Осадок отделяют с помощью магнита и промывают деоксигенированной водой. Частицы SPIO@SiO2 и SPIO@SiO2-NH2 получают реакцией гидролиза тетраэтоксисилана или (3-аминопропил) триэтоксисилана на поверхности наночастиц SPIO. Для получения наночастиц SPIO@dextran декстран с молекулярной массой 70 кДа предварительно растворяют в растворе NaOH и кипятят с обратным холодильником в течение 2 часов, затем этот раствор по каплям добавляют к диспергированным в ультразвуке наночастицам SPIO в воде с рН 3. Смесь перемешивают и кипятят с обратным холодильником в течение 30 минут. Продукты отделяют магнитом и промывают деоксигенированной водой.The cell labeling preparations known in the art typically use SPIONs prepared by chemical reactions. Zhu H.M., Wang Y.X., Leung K.C., et al. Enhanced cellular uptake of aminosilane-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles in mammalian cell lines // Int J Nanomedicine. 2012; 7: 953-964 describe methods for the synthesis of nanoparticles in which an iron oxide core is synthesized by alkaline coprecipitation of two parts of ferric chloride and one part of ferrous sulfate in NaOH solution under nitrogen atmosphere with stirring. The precipitate is separated with a magnet and washed with deoxygenated water. SPIO @ SiO2 and SPIO @ SiO2-NH2 particles are obtained by hydrolysis of tetraethoxysilane or (3-aminopropyl) triethoxysilane on the surface of SPIO nanoparticles. To obtain SPIO @ dextran nanoparticles, dextran with a molecular weight of 70 kDa is preliminarily dissolved in a NaOH solution and boiled under reflux for 2 hours, then this solution is added dropwise to the ultrasonically dispersed SPIO nanoparticles in water with
Подобные способы получения суперпарамагнитных наночастиц трудоемки и дорогостоящи, кроме того, полученные этими способами препараты содержат остаточные следы используемых цитотоксичных веществ.Such methods of obtaining superparamagnetic nanoparticles are laborious and expensive; in addition, the preparations obtained by these methods contain residual traces of the cytotoxic substances used.
Суперпарамагнитные наночастицы магнетита, или оксида железа Fe3O4, полученные методом электрического взрыва проводника в атмосфере воздуха, не содержат побочных продуктов химических реакций, легкодоступны и дешевле покрытых аналогов. Такие частицы были использованы в качестве контрастирующего агента, предположительно отвечающего требованиям безопасности для клеток. В работе: Левчук К.А., Шумеев А.Н., Золина Т.Л., Котова А.В., Александрова Л.В., Багаева В.В., Айзенштадт А.А., Коткас И.Е., Масленникова И.И., Енукашвили Н.И. Метод прижизненного мечения мезенхимных стромальных клеток человека суперпарамагнитными частицами магнетита / Трансляционная медицина: от теории к практике: Материалы 5-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов // под ред. д.м.н. А.В. Силина. - СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2017. - с. 54-55 описан способ получения культуры меченых мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из пупочного канатика и жировой ткани человека. Способ заключается в том, что ММСК инкубируют в культуральной среде, содержащей 200 нг/мл нанопорошка магнетита с размером частиц 5-20 нм в течение 24 часов. Предварительно суспензию наночастиц обрабатывают ультразвуком с частотой 37 кГц для того, чтобы разбить агрегаты наночастиц. После 24-часовой инкубации с частицами магнетита клеточные культуры ММСК сохраняли жизнеспособность на уровне контроля, то есть 95% от общего количества клеток, и содержали захваченные наночастицы. Однако по нашим собственным данным этот способ не позволяет получить устойчиво воспроизводящийся результат. Кроме того, он требует слишком большого времени инкубации клеточной культуры с наночастицами магнетита. Частицы размером 5-20 нм требуют покрытия органическими компонентами (декстран и т.д.) для предотвращения агрегации, что является трудозатратной и дорогостоящей процедурой. При этом увеличивается фактический размер частиц, а значит, уменьшается их количество на клетку, что приводит к ухудшению степени визуализации при сканировании. Кроме того, в России не производится нанопорошок магнетита с таким размером частиц, поэтому их использование неудобно, нецелесообразно и зависит от дорогостоящего и долго поставляемого сырья.Superparamagnetic nanoparticles of magnetite, or iron oxide Fe 3 O 4 , obtained by the method of electric explosion of a conductor in an air atmosphere, do not contain by-products of chemical reactions, are readily available and cheaper than their coated counterparts. Such particles have been used as a contrast agent, presumably meeting the safety requirements for cells. In work: Levchuk K.A., Shumeev A.N., Zolina T.L., Kotova A.V., Aleksandrova L.V., Bagaeva V.V., Aizenshtadt A.A., Kotkas I.E. , Maslennikova I.I., Enukashvili N.I. The method of intravital labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic particles of magnetite / Translational medicine: from theory to practice: Proceedings of the 5th scientific-practical conference of young scientists and specialists // Ed. d.m.s. A.V. Silina. - SPb .: Publishing house of the North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, 2017 .-- p. 54-55 describe a method for obtaining a culture of labeled mesenchymal stromal cells (MMSC) from the umbilical cord and human adipose tissue. The method consists in incubating MMSC in a culture medium containing 200 ng / ml magnetite nanopowder with a particle size of 5-20 nm for 24 hours. The suspension of nanoparticles is preliminarily treated with ultrasound at a frequency of 37 kHz in order to break up the aggregates of nanoparticles. After 24-hour incubation with magnetite particles, MMSC cell cultures retained viability at the control level, that is, 95% of the total number of cells, and contained captured nanoparticles. However, according to our own data, this method does not allow obtaining a consistently reproducible result. In addition, it requires too long incubation time of the cell culture with magnetite nanoparticles. Particles 5-20 nm in size require coating with organic components (dextran, etc.) to prevent aggregation, which is laborious and expensive. At the same time, the actual size of the particles increases, which means that their number per cell decreases, which leads to a deterioration in the degree of visualization during scanning. In addition, magnetite nanopowder with such a particle size is not produced in Russia, so their use is inconvenient, impractical and depends on expensive and long-term supplied raw materials.
Задачей настоящего изобретения является создание способа получения культуры меченых клеток, обеспечивающего стабильное и воспроизводимое мечение клеток с сохранением их жизнеспособности и пролиферативного статуса, с возможностью визуализации клеток методом МРТ.The objective of the present invention is to provide a method for obtaining a culture of labeled cells that provides stable and reproducible labeling of cells while maintaining their viability and proliferative status, with the ability to visualize cells by MRI.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения культуры меченых клеток нанопорошок магнетита со среднеарифметическим размером частиц 80-110 нм соединяют с жидкой фазой, полученную суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой и длительностью, достаточной для диспергирования крупных агрегатов. Полученную суспензию наночастиц выдерживают не менее 10 минут для получения микроагрегатов размером не более 5 мкм, в оптимальном варианте средний размер макроагрегатов около 1 мкм. Полученную суспензию микроагрегатов вносят в культуру клеток, выращенную до не более 80% конфлуэнтности, до концентрации 50-600 мкг/мл, и затем выдерживают культуру клеток в среде для культивирования с упомянутыми микроагрегатами в течение 2-14 часов при температуре в диапазоне 37°С.The problem is solved by the fact that in the method of obtaining a culture of labeled cells, magnetite nanopowder with an arithmetic mean particle size of 80-110 nm is combined with a liquid phase, the resulting suspension is treated with ultrasound with a frequency and duration sufficient to disperse large aggregates. The resulting suspension of nanoparticles is kept for at least 10 minutes to obtain microaggregates with a size of no more than 5 microns, in the optimal version, the average size of macroaggregates is about 1 micron. The resulting suspension of microaggregates is introduced into a cell culture grown to no more than 80% confluence, to a concentration of 50-600 μg / ml, and then the cell culture is maintained in a culture medium with the mentioned microaggregates for 2-14 hours at a temperature in the range of 37 ° C ...
В отличие от прототипа, в заявляемом способе используют доступный и относительно недорогой порошок магнетита со среднеарифметическим размером частиц 80-110 нм, при этом концентрация частиц в суспензии выше в 250-3000 раз, что обеспечивает количество частиц, необходимое для эффективного мечения всех клеток в культуре. Кроме того, выдерживание культуры клеток в присутствии микроагрегатов магнетита производят в течение более короткого времени, что обеспечивает лучшую сохранность и пролиферативные свойства клеток. Многочисленные повторения способа показали, что он воспроизводим, клетки жизнеспособны, способны к пролиферации, и также их можно визуализировать с помощью МРТ [Коткас И.Е., Енукашвили Н.И., Асадулаев Ш.М., и др. Визуализация распределения аутологичных мезенхимальных клеток введенных в организм пациента, страдающего циррозом печени алиментарной этиологии // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2017, 9(4):76-78; Коткас И.Е., Асадулаев Ш.М., Марченко Н.В., Енукашвили Н.И. Оценка изменений биохимических показателей крови у пациента с диагнозом цирроза печени на фоне использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2018; 150(2): 174-176; Коткас И.Е., Асадулаев Ш.М., Енукашвили Н.И., и др. Возможность визуализации распределения в организме человека аутологичных мезенхимальных клеток, введенных в артериальное русло печени // Медицинская визуализация, 2017, 6:72-75.]. Суспензию микроагрегатов магнетита добавляют любым доступным способом, как в культуральной жидкости, так и в сбалансированном солевом растворе.Unlike the prototype, the inventive method uses an affordable and relatively inexpensive magnetite powder with an arithmetic mean particle size of 80-110 nm, while the concentration of particles in the suspension is 250-3000 times higher, which provides the number of particles required for effective labeling of all cells in culture ... In addition, keeping the cell culture in the presence of magnetite microaggregates is carried out for a shorter time, which ensures better preservation and proliferative properties of cells. Numerous repetitions of the method showed that it is reproducible, the cells are viable, capable of proliferation, and they can also be visualized using MRI [Kotkas I.E., Enukashvili N.I., Asadulaev Sh.M., et al. Visualization of the distribution of autologous mesenchymal cells introduced into the body of a patient suffering from cirrhosis of the liver of alimentary etiology // Bulletin of the North-Western State Medical University named after I. I.I. Mechnikova, 2017, 9 (4): 76-78; Kotkas I.E., Asadulaev Sh.M., Marchenko N.V., Enukashvili N.I. Evaluation of changes in blood biochemical parameters in a patient with a diagnosis of liver cirrhosis against the background of the use of autologous mesenchymal stem cells. Experimental and Clinical Gastroenterology 2018; 150 (2): 174-176; Kotkas I.E., Asadulaev Sh.M., Enukashvili N.I., et al. The possibility of visualizing the distribution in the human body of autologous mesenchymal cells introduced into the arterial bed of the liver // Medical imaging, 2017, 6: 72-75.] ... A suspension of magnetite microaggregates is added by any available method, both in the culture liquid and in a balanced salt solution.
В одном из вариантов осуществления способа используют нанопорошок магнетита, полученный методом электрического взрыва проводников. Этот метод позволяет получить полидисперсный порошок частиц без примесей побочных продуктов, что происходит при синтезе наночастиц методом химических реакций.In one embodiment of the method, magnetite nanopowder obtained by the method of electric explosion of conductors is used. This method makes it possible to obtain a polydisperse powder of particles without impurities of by-products, which occurs during the synthesis of nanoparticles by the method of chemical reactions.
В одном из вариантов осуществления способа в качестве культуры клеток используют культуру мезенхимных стволовых клеток, в другом варианте осуществления способа используют культуру фибробластов. Для мечения используют культуру любых клеток, пригодных для введения в организм человека или животных, например культуру мезенхимных стволовых клеток или культуру фибробластов. Выбор конкретных клеток зависит от типа лечения и ограничивается только медицинскими показаниями.In one embodiment of the method, a culture of mesenchymal stem cells is used as a cell culture, in another embodiment of the method, a culture of fibroblasts is used. For labeling, a culture of any cells suitable for introduction into a human or animal organism is used, for example, a culture of mesenchymal stem cells or a culture of fibroblasts. The choice of specific cells depends on the type of treatment and is limited only by medical indications.
В одном варианте осуществления способа после выдерживания в суспензии микроагрегатов магнетита клетки промывают и рассевают в соотношении не ниже допустимого предела концентрации. Это обеспечивает увеличение количества меченых клеток и дополнительно удаляет микроагрегаты магнетита, которые не проникли внутрь клеток, а прикрепились к ним снаружи.In one embodiment of the method, after keeping the magnetite microaggregates in suspension, the cells are washed and sieved in a ratio not lower than the permissible concentration limit. This provides an increase in the number of labeled cells and additionally removes microaggregates of magnetite, which did not penetrate into the cells, but were attached to them from the outside.
Задача решается также тем, что при осуществлении заявленного способа получается культура меченых клеток для введения в организм человека.The problem is also solved by the fact that the implementation of the claimed method produces a culture of labeled cells for introduction into the human body.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following drawings.
На Фиг. 1. представлены кривые распределения частиц по размеру сразу после обработки ультразвуком (линия 1), через 3 и 4 часа после отключения мешалки (линии 2 и 3). Размер частиц определяли методом лазерной дифракции.FIG. 1 shows the curves of particle size distribution immediately after sonication (line 1), 3 and 4 hours after turning off the stirrer (
На Фиг. 2. представлены данные анализа иммунофенотипа и жизнеспособности клеток, содержащих микроагрегаты оксида железа. На четырех гистограммах приведены примеры проточной цитометрии меченых клеток по положительным (CD73, CD90) и отрицательным (CD34, CD45) маркерам. Также приведен усредненный иммунофенотип. Жизнеспособность определяли методом окрашивания 7-AAD. Процент неокрашенных клеток (99,49) соответствует проценту живых клеток.FIG. 2. presents the data of the analysis of the immunophenotype and viability of cells containing microaggregates of iron oxide. Four histograms show examples of flow cytometry of labeled cells for positive (CD73, CD90) and negative (CD34, CD45) markers. The average immunophenotype is also shown. Viability was determined by the 7-AAD staining method. The percentage of unstained cells (99.49) corresponds to the percentage of living cells.
На Фиг. 3. Внешний вид культуры клеток, содержащих микроагрегаты оксида железа, после криоконсервации (0 h) и последующей культивации в течение 2 суток (48 h).FIG. 3. Appearance of the culture of cells containing microaggregates of iron oxide after cryopreservation (0 h) and subsequent cultivation for 2 days (48 h).
На Фиг. 4. представлена электронная микрофотография тонкой ультраструктуры клеток, содержащих микроагрегаты оксида железа.FIG. 4. shows an electron micrograph of the fine ultrastructure of cells containing microaggregates of iron oxide.
На Фиг. 5. представлен МРТ органов брюшной полости (из: Коткас И.Е., Енукашвили Н.И., Асадулаев Ш.М., и др. Визуализация распределения аутологичных мезенхимальных клеток, введенных в организм пациента, страдающего циррозом печени алиментарной этиологии // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2017, 9(4):76-78).FIG. 5. presented MRI of the abdominal organs (from: Kotkas I.E., Enukashvili N.I., Asadulaev Sh.M., et al. Visualization of the distribution of autologous mesenchymal cells injected into the body of a patient suffering from liver cirrhosis of alimentary etiology // Bulletin Mechnikov North-West State Medical University, 2017, 9 (4): 76-78).
На Фиг. 6. представлен вид МСК, содержащих микроагрегаты оксида железа в день трансплантации (А) и клеток, выделенных через 1 год из биоптата печени в области трансплантации (Б).FIG. 6 shows the type of MSCs containing microaggregates of iron oxide on the day of transplantation (A) and cells isolated 1 year later from a liver biopsy in the area of transplantation (B).
Способ осуществляли следующим образом.The method was carried out as follows.
Пример 1. Получение культуры меченых мезенхимных стволовых клеток.Example 1. Obtaining a culture of labeled mesenchymal stem cells.
В пенициллиновый флакон, содержащий 30 мг нанопорошка магнетита с размером частиц 80-110 нм (ООО «Передовые порошковые технологии», Томск), добавляли 10 мл стерильного физиологического раствора, перемешивали и переносили в 15 мл пробирки. Далее пробирки обрабатывали ультразвуком с частотой 37 кГц в течение 15 минут, встряхивая пробирку каждые 3 минуты. Полученная взвесь частиц с концентрацией частиц 3 мг/мл стабильна в течение суток. Измерение размеров частиц (Фиг. 1) показало, что средний размер частиц после УЗ обработки составляет 80-100 нм, однако в течение 10 минут образуются микроагрегаты 0,5-1,5 мкм (80% 0,9-1,1 мкм) и далее размер микроагрегатов не меняется в течение 12 часов. Перед применением 1 мл полученной взвеси микроагрегатов переносили в 4 мл или 9 мл физиологического раствора или культуральной среды, таким образом получали готовый препарат микроагрегатов с концентрацией 600 мкг/мл или 300 мкг/мл соответственно. Взвесь микроагрегатов с концентрацией 300 мкг/мл при необходимости использовали для получения взвесей с меньшей концентрацией микроагрегатов.In a penicillin vial containing 30 mg of magnetite nanopowder with a particle size of 80-110 nm (OOO "Advanced Powder Technologies", Tomsk), 10 ml of sterile saline was added, mixed and transferred into 15 ml test tubes. Then the tubes were sonicated at a frequency of 37 kHz for 15 minutes, shaking the tube every 3 minutes. The resulting suspension of particles with a particle concentration of 3 mg / ml is stable during the day. Measurement of the particle size (Fig. 1) showed that the average particle size after ultrasonic treatment is 80-100 nm, however, microaggregates 0.5-1.5 μm (80% 0.9-1.1 μm) are formed within 10 minutes and then the size of the micro-aggregates does not change for 12 hours. Before use, 1 ml of the resulting suspension of microaggregates was transferred into 4 ml or 9 ml of saline or culture medium, thus obtaining a finished preparation of microaggregates with a concentration of 600 μg / ml or 300 μg / ml, respectively. A suspension of microaggregates with a concentration of 300 μg / ml, if necessary, was used to obtain suspensions with a lower concentration of microaggregates.
Первичный материал биоптата печени или жировой ткани получали операционным путем в объеме 100 мкл. Ткани печени выдерживали в 0,1% растворе коллагеназы I и IV типов в течении 20 минут в термошейкере при температуре 37°С при постоянном помешивании. Полученную смесь центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 4 мл питательной среды, например, среды Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для стволовых клеток (СК) или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия) и 10 мкг/мл раствора пенициллина-стрептомицина (HyClone, Германия). Помещали суспензию клеток в культуральный флакон площадью 25 см2. Помещали флаконы в СО2-инкубатор, например, BBD 6220 (Thermo, Германия) при температуре 37°С, время экспозиции 3-5 суток в зависимости от состояния клеток. Далее СК культивировали известным способом культивирования мезенхимных СК.The primary material of a biopsy of the liver or adipose tissue was obtained by surgery in a volume of 100 μl. Liver tissues were kept in a 0.1% solution of type I and IV collagenase for 20 minutes in a thermal shaker at 37 ° C with constant stirring. The resulting mixture was centrifuged, the supernatant was removed, the pellet was resuspended in 4 ml of culture medium, for example, Advanced Stem Cell Media (HyClone, Germany) supplemented with 20% fetal bovine serum for stem cells (SC) or Advanced Supplement for Stem Cells ( HyClone, Germany) and 10 μg / ml penicillin-streptomycin solution (HyClone, Germany). The cell suspension was placed in a culture flask with an area of 25 cm 2 . The vials were placed in a CO 2 incubator, for example, BBD 6220 (Thermo, Germany) at a temperature of 37 ° C, the exposure time is 3-5 days, depending on the state of the cells. Then the SCs were cultivated by the known method of cultivating mesenchymal SCs.
При достижении 80% конфлюэнтности, меняли среду, добавляя в нее взвесь микроагрегатов с концентрацией 3, 30, 50, 100, 200, 300 или 600 мкг\мл. Для этого удаляли старую среду и добавляли 27 мл готовой новой среды и 3 мл приготовленного готового раствора с микроагрегатами. Перед добавлением взвеси микроагрегатов ее необходимо хорошо ресуспендировать. Далее клетки инкубировали в среде с микроагрегатами от 2 до 14 часов, после чего среду удаляли и заменяли на новую, без микроагрегатов. Клетки включали микроагрегаты во всем диапазоне концентрации микроагрегатов и времени инкубирования. Дальнейшие эксперименты по выявлению меченых клеток на МРТ показали, что доступны для визуализации меченые клетки, инкубировавшиеся во взвеси микроагрегатов с концентрацией не ниже 50 мкг/мл.Upon reaching 80% confluence, the medium was changed by adding a suspension of microaggregates with a concentration of 3, 30, 50, 100, 200, 300, or 600 μg / ml. For this, the old medium was removed and 27 ml of the prepared new medium and 3 ml of the prepared prepared solution with microaggregates were added. Before adding a suspension of microaggregates, it must be well resuspended. Then the cells were incubated in a medium with microaggregates for 2 to 14 hours, after which the medium was removed and replaced with a new one without microaggregates. The cells included microaggregates over the entire range of microaggregates concentration and incubation time. Further experiments to identify labeled cells on MRI showed that labeled cells incubated in a suspension of microaggregates with a concentration of at least 50 μg / ml are available for visualization.
Иммунофенотип и жизнеспособность клеток, содержащих микроагрегаты оксида железа определяли методом проточной цитометрии меченых клеток по положительным (CD73, CD90) и отрицательным (CD34, CD45) маркерам. На Фиг. 2 приведены результаты анализа, а также приведен усредненный иммунофенотип. Жизнеспособность клеток определяли методом окрашивания 7-AAD. Процент неокрашенных клеток (99,49) соответствует проценту живых клеток (Фиг. 2).The immunophenotype and viability of cells containing microaggregates of iron oxide were determined by flow cytometry of labeled cells using positive (CD73, CD90) and negative (CD34, CD45) markers. FIG. 2 shows the results of the analysis, and also shows the average immunophenotype. Cell viability was determined by the 7-AAD staining method. The percentage of unstained cells (99.49) corresponds to the percentage of living cells (Fig. 2).
Пример 2. Получение культуры меченых фибробластов.Example 2. Obtaining a culture of labeled fibroblasts.
Первичный материал биоптата кожи площадью 0,8-1 см2 был получен операционным путем. Удаляли остатки жировой ткани, эпителий. Препарировали дермальный слой и инкубировали его в 0, 1% растворе коллагеназы I и IV типов в течении 45 минут в термошейкере при температуре 37°С при постоянном помешивании. Полученную смесь центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали в 0,1% растворе коллагеназы I и IV типов и трипсина и инкубировали еще 30 мин. Отмывали диссоциированный биоптат от ферментов и ресуспендировали в 4 мл питательной среды, например, среды Advanced Stem Cell Media (HyClone, Германия) с добавлением 20% фетальной коровьей сыворотки для СК или заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Германия) и 10 мкг/мл раствора пенициллина-стрептомицина (HyClone, Германия). Помещали суспензию клеток в культуральный флакон площадью 25 см2.Primary skin biopsy material with an area of 0.8-1 cm 2 was obtained by surgery. The remains of adipose tissue and epithelium were removed. The dermal layer was dissected and incubated in a 0.1% solution of collagenase I and IV types for 45 minutes in a thermal shaker at 37 ° C with constant stirring. The resulting mixture was centrifuged, the supernatant was removed, the precipitate was resuspended in a 0.1% solution of collagenase I and IV types and trypsin and incubated for another 30 min. The dissociated biopsy sample was washed from enzymes and resuspended in 4 ml of culture medium, for example, Advanced Stem Cell Media (HyClone, Germany) with the addition of 20% fetal bovine serum for SC or Serum Replacement Advanced Supplement for Stem Cells (HyClone, Germany) and 10 μg / ml penicillin-streptomycin solution (HyClone, Germany). The cell suspension was placed in a culture flask with an area of 25 cm 2 .
При достижении 80% конфлюэнтности, инкубировали клетки с взвесью микроагрегатов, как описано в Примере 1.When 80% confluence was reached, the cells were incubated with a suspension of microaggregates as described in Example 1.
Пример 3. Жизнеспособность клеток после криоконсервацииExample 3. Cell viability after cryopreservation
Клетки МСК выращивали и вводили метку как описано в Примере 1. По достижении конфлюэнтности 80% клетки снимали с подложки раствором трипсина : Версена, отмывали от этого раствора центрифугированием в культуральной среде и ресуспендировали в криосреде, содержащей 50% фетальной бычьей сыворотки, 8% диметилсульфоксида и 42% ДМЕМ с низким содержанием глюкозы. Клетки замораживали с использованием программируемого устройства для замораживания клеток CryoMed (Thermofisher Sci). Замороженные клетки хранили в жидком азоте 2-5 мес. Клетки размораживали, погружая пробирки в водяную баню при 37°С, после этого отмывали клетки от криосреды и высевали при стандартных условиях культивирования, описанных в примере 1. Оценивали наличие в клетках наночастиц оксида железа, жизнеспособность клеток, возможность их пассирования (пересева). На Фиг. 3 представлены данные, подтверждающие наличие в клетках наночастиц после криоконсервации, а также способность меченых клеток расти в культуре после размораживания.MSC cells were grown and labeled as described in Example 1. Upon reaching 80% confluence, the cells were removed from the support with trypsin: Versene solution, washed from this solution by centrifugation in culture medium and resuspended in cryo-media containing 50% fetal bovine serum, 8% dimethyl sulfoxide and 42% low glucose DMEM. Cells were frozen using a CryoMed programmable cell freezer (Thermofisher Sci). Frozen cells were stored in liquid nitrogen for 2-5 months. The cells were thawed by immersing the tubes in a water bath at 37 ° C, after which the cells were washed from the cryo medium and plated under standard cultivation conditions described in Example 1. The presence of iron oxide nanoparticles in the cells, the viability of the cells, and the possibility of their passaging (reseeding) were assessed. FIG. 3 shows the data confirming the presence of nanoparticles in cells after cryopreservation, as well as the ability of labeled cells to grow in culture after thawing.
Пример 4. Исследование тонкой ультраструктуры клеток, содержащих микроагрегаты, методом электронной микроскопии.Example 4. Study of the fine ultrastructure of cells containing microaggregates by electron microscopy.
Для оценки тонкой ультраструктуры клеток готовили препараты для электронной микроскопии стандартным способом после фиксации глутаровым альдегидом. На электронных микрофотографиях видно, что микроагрегаты магнетита окружены мембраной, отделяющей их от остального пространства клетки. (Фиг. 4).To assess the fine ultrastructure of cells, preparations for electron microscopy were prepared using the standard method after fixation with glutaraldehyde. Electron micrographs show that magnetite microaggregates are surrounded by a membrane that separates them from the rest of the cell. (Fig. 4).
Пример 5. Выявление меченых клеток после трансплантации в организм человека.Example 5. Identification of labeled cells after transplantation into the human body.
У пациента К., 59 лет с диагнозом цирроза печени алиментарной этиологии был произведен забор жировой ткани на внутренний поверхности бедра с последующим выделением из нее мезенхимальных клеток. В дальнейшем выполнялось 4 пассажа культивирования выделенных мезенхимальных клеток. Полученные в результате культивирования клетки были помечены микрочастицами оксида железа, как описано в примере 1. В дальнейшем выполнена селективная ангиография на уровне собственной печеночной артерии с последующим введением меченых аутологичных мезенхимальных клеток в количестве 25 миллионов. Через сутки после введения клеток в собственную печеночную артерию, пациенту выполнена магнитно-резонансная терапия органов брюшной полости. По результатам данного исследования было возможно визуально оценить распределение введенных клеточных структур в ткани печени. Все введенные в собственную печеночную артерию клеточные структуры зафиксировались у данного пациента преимущественно в левой доле печени, в области II и III сегментов (Фиг. 5, из: Коткас И.Е., Енукашвили Н.И., Асадулаев Ш.М., и др. Визуализация распределения аутологичных мезенхимальных клеток введенных в организм пациента, страдающего циррозом печени алиментарной этиологии // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2017, 9(4):76-78). Через 1 год при проведении стандартной диагностической биопсии по медицинским показаниям 1/5 биоптата высеяли в культуральную среду как описано в примере 1. В культивируемых клетках оценивали наличие наночастиц железа как методом морфологического анализа культур, так и методом окрашивания берлинской лазурью. При микроскопическом анализе культур показано присутствие микроагрегатов оксида железа как непосредственно перед трансплантацией (Фиг. 6А), так через год после трансплантации (Фиг. 6Б).Patient K., 59 years old, diagnosed with cirrhosis of the liver of alimentary etiology, was sampled of adipose tissue on the inner surface of the thigh, followed by isolation of mesenchymal cells from it. Subsequently, 4 culturing passages of the isolated mesenchymal cells were performed. The cells obtained as a result of culturing were labeled with microparticles of iron oxide, as described in example 1. Subsequently, selective angiography was performed at the level of the own hepatic artery, followed by the introduction of labeled autologous mesenchymal cells in the amount of 25 million. One day after the cells were injected into his own hepatic artery, the patient underwent magnetic resonance therapy of the abdominal organs. Based on the results of this study, it was possible to visually assess the distribution of the introduced cellular structures in the liver tissue. All the cellular structures introduced into the own hepatic artery were fixed in this patient mainly in the left lobe of the liver, in the region of II and III segments (Fig. 5, from: Kotkas I.E., Enukashvili N.I., Asadulaev Sh.M., and etc. Visualization of the distribution of autologous mesenchymal cells injected into the body of a patient suffering from liver cirrhosis of alimentary etiology // Bulletin of the Mechnikov North-Western State Medical University, 2017, 9 (4): 76-78). After 1 year, when carrying out a standard diagnostic biopsy for medical indications, 1/5 of the biopsy was inoculated into the culture medium as described in example 1. In cultured cells, the presence of iron nanoparticles was assessed both by morphological analysis of cultures and by staining with Prussian blue. Microscopic analysis of cultures showed the presence of microaggregates of iron oxide both immediately before transplantation (Fig. 6A) and one year after transplantation (Fig. 6B).
Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Способ получения культуры меченых клеток» на предмет выдачи патента РФ на изобретение.The applicant asks to consider the submitted materials of the application "Method for obtaining a culture of labeled cells" for the issue of a RF patent for an invention.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019145601A RU2751603C2 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Method for production of labeled cell culture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019145601A RU2751603C2 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Method for production of labeled cell culture |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019145601A3 RU2019145601A3 (en) | 2021-06-30 |
| RU2019145601A RU2019145601A (en) | 2021-06-30 |
| RU2751603C2 true RU2751603C2 (en) | 2021-07-15 |
Family
ID=76742281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019145601A RU2751603C2 (en) | 2019-12-30 | 2019-12-30 | Method for production of labeled cell culture |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2751603C2 (en) |
-
2019
- 2019-12-30 RU RU2019145601A patent/RU2751603C2/en active
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2019145601A3 (en) | 2021-06-30 |
| RU2019145601A (en) | 2021-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bull et al. | Stem cell tracking using iron oxide nanoparticles | |
| Edmundson et al. | Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine | |
| Jasmin et al. | Tracking stem cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles: perspectives and considerations | |
| Hour et al. | Magnetic targeted delivery of the SPIONs-labeled mesenchymal stem cells derived from human Wharton's jelly in Alzheimer's rat models | |
| Liu et al. | Heating effect and biocompatibility of bacterial magnetosomes as potential materials used in magnetic fluid hyperthermia | |
| Liu et al. | Biocompatible iron oxide nanoring-labeled mesenchymal stem cells: an innovative magnetothermal approach for cell tracking and targeted stroke therapy | |
| Hua et al. | In vivo magnetic resonance imaging tracking of transplanted superparamagnetic iron oxide-labeled bone marrow mesenchymal stem cells in rats with myocardial infarction | |
| Qi et al. | The application of super paramagnetic iron oxide-labeled mesenchymal stem cells in cell-based therapy | |
| El Haj et al. | An in vitro model of mesenchymal stem cell targeting using magnetic particle labelling | |
| Naseroleslami et al. | The effects of superparamagnetic iron oxide nanoparticles-labeled mesenchymal stem cells in the presence of a magnetic field on attenuation of injury after heart failure | |
| Zhang et al. | Visual bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the repair of spinal cord injury | |
| JP5578613B2 (en) | Magnetic nanoparticle composite and cell labeling method using the magnetic nanoparticle composite | |
| Chen et al. | Stem cell tracking with nanoparticle-based ultrasound contrast agents | |
| Kim et al. | Use of nanoparticles to monitor human mesenchymal stem cells transplanted into penile cavernosum of rats with erectile dysfunction | |
| CN108939094A (en) | The method and application of a kind of micro-nano bubble loading nano particle and its ultrasonic labeled stem cells | |
| RU2751603C2 (en) | Method for production of labeled cell culture | |
| Zheng et al. | Dynamic imaging of allogeneic adipose-derived regenerative cells transplanted in ischemic hind limb of apolipoprotein E mouse model | |
| Fang et al. | Magnet-guided bionic system with LIFU responsiveness and natural thrombus tropism for enhanced thrombus-targeting ability | |
| Awang-Junaidi et al. | Regeneration of testis tissue after ectopic implantation of porcine testis cell aggregates in mice: improved consistency of outcomes and in situ monitoring | |
| Calzi et al. | Labeling of stem cells with monocrystalline iron oxide for tracking and localization by magnetic resonance imaging | |
| Chen et al. | Therapeutic effect of transplanting magnetically labeled bone marrow stromal stem cells in a liver injury rat model with 70%-hepatectomy | |
| AU2005221396A1 (en) | Compositions comprising cells and magnetic materials for targeted delivery | |
| Cai et al. | Specific, Non-invasive, and magnetically directed targeting of magnetic erythrocytes in blood vessels of Mice | |
| Chen et al. | Treatment of rat with traumatic brain injury and MR tracing in vivo via combined transplantation of bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic iron oxide and Schwann cells | |
| CN101166541A (en) | Method and composition for repairing heart tissue |