RU2751487C1 - Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium - Google Patents
Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2751487C1 RU2751487C1 RU2020122106A RU2020122106A RU2751487C1 RU 2751487 C1 RU2751487 C1 RU 2751487C1 RU 2020122106 A RU2020122106 A RU 2020122106A RU 2020122106 A RU2020122106 A RU 2020122106A RU 2751487 C1 RU2751487 C1 RU 2751487C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vkpm
- strain
- option
- nutrient medium
- paenibacillus
- Prior art date
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 22
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 title claims description 22
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 17
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 title description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 title 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 claims abstract description 62
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 241000611735 Paenibacillus peoriae Species 0.000 claims abstract description 28
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000189604 Paenibacillus jamilae Species 0.000 claims abstract description 9
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 20
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000004770 Fusariosis Diseases 0.000 abstract 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 65
- 239000000047 product Substances 0.000 description 33
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 8
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 4
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 4
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 4
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 3
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical compound O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 241000221779 Fusarium sambucinum Species 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- 101000993347 Gallus gallus Ciliary neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 241000223247 Gloeocercospora Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221300 Puccinia Species 0.000 description 1
- 241000228453 Pyrenophora Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N Rohrzucker Natural products OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 239000000589 Siderophore Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229940022682 acetone Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001794 chitinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 235000021552 granulated sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical class CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006028 limestone Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000005645 nematicide Substances 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N parathion-methyl Chemical compound COP(=S)(OC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 RLBIQVVOMOPOHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Настоящая группа изобретений относится к способу приготовления жидкой питательной среды и способу получения жидкого микробиологического препарата, предназначенного для борьбы с фитопатогенными болезнями, в частности с фузариозом сельскохозяйственных культур. The present group of inventions relates to a method for preparing a liquid nutrient medium and a method for producing a liquid microbiological preparation intended for combating phytopathogenic diseases, in particular Fusarium of agricultural crops.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИLEVEL OF TECHNOLOGY
Среди актуальных проблем в сельскохозяйственной отрасли известное место занимают грибковые болезни, главной из которых в регионах с умеренным климатом является фузариоз колоса озимой пшеницы. Заболевание наблюдается в большинстве регионов, где выращивается пшеница и обусловливает потери 25-30% урожая [Гагкаева и др, 2012.; Гагкаева, Гаврилова, 2014]. Fusarium diseases of the ear of winter wheat are among the topical problems in the agricultural sector. The disease is observed in most regions where wheat is grown and causes losses of 25-30% of the crop [Gagkaeva et al, 2012 .; Gagkaeva, Gavrilova, 2014].
Возбудителями выступают грибы рода Fusarium, которые находятся в различных частях растения, как в колосковом стержне и чешуях, так и в семенах, особенно в зародышевой части семян. The causative agents are fungi of the genus Fusarium, which are found in various parts of the plant, both in the spikelet and scales, and in the seeds, especially in the embryonic part of the seeds.
На настоящий момент времени заражение грибами рода Fusarium сельскохозяйственных культур приобрело характер пандемии, при благоприятных условиях заболевание развивается на большинстве посевных площадей и представляет серьезную опасность для здоровья населения. At the present time, the infection of crops with fungi of the genus Fusarium has acquired the character of a pandemic; under favorable conditions, the disease develops in most of the cultivated areas and poses a serious threat to public health.
Существуют различные способы защиты от фитопатогенных грибов, при этом наиболее часто применяемым из них является использование фунгицидов. Однако, эффективность применения подобных веществ постоянно снижается. Так, например, в ряде работ было показано, что эффективность применения химических средств по борьбе с фитопатогенными грибами значительно уменьшается по причине постепенного развития резистентности к действию различных фунгицидных веществ. [Becker et al., 2010; Чекмарев и др., 2011]. По данным других авторов следует, что максимальный эффект, которого можно достигнуть при применении фунгицидов составляет не более 75 %, однако этого удается достичь, если применять комплексы из нескольких фунгицидных препаратов [Санин и др., 2011; Гасич и др., 2015]. There are various methods of protection against phytopathogenic fungi, the most commonly used being the use of fungicides. However, the effectiveness of the use of such substances is constantly decreasing. For example, in a number of works it was shown that the effectiveness of the use of chemicals to combat phytopathogenic fungi is significantly reduced due to the gradual development of resistance to the action of various fungicidal substances. [Becker et al., 2010; Chekmarev et al., 2011]. According to the data of other authors, it follows that the maximum effect that can be achieved with the use of fungicides is no more than 75%, but this can be achieved if complexes of several fungicidal preparations are used [Sanin et al., 2011; Gasich et al., 2015].
В настоящее же время, вектор проводимых исследований сместился с поиска химических веществ на поиск и применение бактерий и их метаболитов, проявляющих антагонистические свойства к различным грибковым возбудителям болезней сельскохозяйственных культур [Сидоренко, 2012]. At present, the vector of ongoing research has shifted from the search for chemicals to the search and use of bacteria and their metabolites that exhibit antagonistic properties to various fungal pathogens of agricultural crops [Sidorenko, 2012].
Одной из перспективных групп микроорганизмов, отличающихся как способностью эффективно противостоять фитопатогенам, так и проявлять фитостимулирующие свойства, является группа почвенных бактерий класса Bacilli. One of the promising groups of microorganisms, distinguished both by their ability to effectively resist phytopathogens and to exhibit phytostimulating properties, is the group of soil bacteria of the Bacilli class.
В последнее время, бактерии данного семейства рассматриваются в качестве перспективных агентов биологического контроля болезней растений, а также в качестве организмов, проявляющих фитостимулирующую активность в силу их широкой распространенности, природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам и способности продуцировать вещества гормональной природы. Recently, bacteria of this family are considered as promising agents for biological control of plant diseases, as well as organisms exhibiting phytostimulatory activity due to their widespread occurrence, natural antagonism to many phytopathogenic fungi and the ability to produce substances of a hormonal nature.
Зарубежный опыт указывает на высокую эффективность применения биопрепаратов на основе бацилл для биологического контроля патогенных грибов рода Fusarium. В частности, показана их эффективность на кукурузе, огурцах и картофеле [Cavaglieri, et al., 2005; Sadfi, et al., 2001; Chen et al., 2010]. Foreign experience indicates the high efficiency of the use of bacilli-based biological products for the biological control of pathogenic fungi of the genus Fusarium. In particular, their effectiveness has been shown on corn, cucumbers and potatoes [Cavaglieri, et al., 2005; Sadfi, et al., 2001; Chen et al., 2010].
Механизм действия заключается в колонизации бактериями-антагонистами корней растений в период прорастания семян и подавление патогенных грибов за счет выделения хитинолитических ферментов, сидерофоров и специфических антимикробных пептидов. The mechanism of action consists in colonization of plant roots by bacteria-antagonists during seed germination and suppression of pathogenic fungi due to the release of chitinolytic enzymes, siderophores and specific antimicrobial peptides.
Из уровня техники известно изобретение, которое относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения бактериального препарата против болезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora и Puccinia. Штамм Bacillus subtilis BZR 517 обладает фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов. Штамм Bacillus subtilis депонирован в Коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM01728 [Патент RU 2552146 С1, опубл. 10.06.2015].From the prior art, an invention is known that relates to biotechnology, microbiology and agriculture and can be used to obtain a bacterial preparation against plant diseases caused by phytopathogenic fungi of the genus Fusarium, Microdochium, Pyrenophora and Puccinia. The Bacillus subtilis BZR 517 strain has fungicidal activity against phytopathogenic bacteria and fungi. The Bacillus subtilis strain was deposited in the Collection of the State Scientific Research Institute of Agriculture of the Russian Agricultural Academy under the registration number RCAM01728 [Patent RU 2552146 C1, publ. 10.06.2015].
Также из уровня техники известно изобретение, которое относится к сельскому хозяйству. Способ получения супрессивного компоста по отношению к возбудителю фузариоза растений Fusarium oxysporum и заключается в приготовлении компоста, полученного из сельскохозяйственных отходов, выделении из компоста штаммов микроорганизмов, приготовлении на основе выделенных штаммов биопрепарата, внесении биопрепарата в компост, оценке супрессивности компоста, причем проводят оценку супрессивных свойств штаммов по 4 механизмам супрессивности, оценку взаимной антагонистической активности штаммов, осуществляют двукратное внесение биопрепарата в компост, проводят оценку удобрительных свойств супрессивного компоста. Изобретение позволяет получить компосты, обладающие одновременно удобрительными свойствами и стабильными супрессивными свойствами по отношению к возбудителю фузариоза растений Fusarium oxysporum [Патент РФ № 2629776 С1, опубл. 04.09.2017].Also from the prior art, an invention is known that relates to agriculture. The method of obtaining a suppressive compost in relation to the causative agent of fusarium of plants Fusarium oxysporum consists in preparing compost obtained from agricultural waste, isolating strains of microorganisms from the compost, preparing a biological product on the basis of the isolated strains, introducing the biological product into the compost, evaluating the suppressive properties of compost strains by 4 mechanisms of suppressiveness, assessment of the mutual antagonistic activity of the strains, double introduction of the biological product into the compost, assessment of the fertilizing properties of the suppressive compost. The invention allows you to obtain composts with both fertilizing properties and stable suppressive properties in relation to the causative agent of fusarium plants Fusarium oxysporum [RF Patent No. 2629776 C1, publ. 09/04/2017].
Кроме того, из уровня техники известно изобретение, которое относится к композиции и способам, предоставленных для комбинации нового штамма Bacillus amyloliquefaciens RTI301 и нового штамма Bacillus subtilis. RTI477, комбинации, обладающей активностью, стимулирующей рост, и активностью против патогенов растений. Композиции, содержащие штаммы RTI301 и RTI477, полезны для улучшения роста растений и / или обеспечения защиты от патогенной инфекции при нанесении на корни растений, семена, каллусную ткань, трансплантаты и черенки. Синергетические результаты наблюдаются для комбинации штаммов, и комбинация штаммов полезна для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур, включая сою и кукурузу. Композиции, содержащие комбинацию штаммов, могут применяться отдельно или в комбинации с другими микробными, биологическими или химическими инсектицидами, фунгицидами, нематоцидами, бактериоцидами, гербицидами, экстрактами растений, регуляторами роста растений и удобрениями [Патент US 9622484 B2, опубл. 18.04.2017].In addition, the prior art knows the invention, which relates to compositions and methods provided for the combination of a new strain of Bacillus amyloliquefaciens RTI301 and a new strain of Bacillus subtilis. RTI477, a combination with growth promoting activity and activity against plant pathogens. Compositions containing strains RTI301 and RTI477 are useful for improving plant growth and / or providing protection against pathogenic infection when applied to plant roots, seeds, callus tissue, grafts and cuttings. Synergistic results are observed for the combination of strains, and the combination of strains is useful for increasing crop yields, including soybeans and corn. Compositions containing a combination of strains can be used alone or in combination with other microbial, biological or chemical insecticides, fungicides, nematicides, bactericides, herbicides, plant extracts, plant growth regulators and fertilizers [US Patent 9622484 B2, publ. 04/18/2017].
В патенте RU 2478290 С2 предложен способ получения биопрепарата, который содержит биомассу Bacillus amyloliquefaciens Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) В-11008 и гуматы при следующем соотношении компонентов, в об.%: биомасса Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 - вегетативных клеток и спор (1,24÷1,30)×1010 КОЕ/мл культуральной жидкости и содержанием спор 94% от общего количества КОЕ - 99,0, гуматы - 1,0. В качестве питательной среды для получения заявляемого биопрепарата используют дешевую среду на основе отходов зернового производства следующего состава, г/л: отруби пшеничные - 40,0; кукурузный экстракт - 0,5; MgSO4 - 0,9; KH2PO4 - 0,5; СаСО3 - 1,0; рН 7,0±0,2. Указанный состав среды обеспечивает высокий уровень накопления биомассы B. amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 (5,6÷5,9 г/л), высокий титр жизнеспособных клеток и спор (1,24÷1,28)×1010 КОЕ/мл) и интенсивность спорообразования (содержание спор - 94,0% от общего количества КОЕ). Штамм данного вида был проверен на следующих представителях рода: Fusarium: F. graminearum, F. solani, F. oxysporum, F. sambucinum. Данный штамм показал высокий уровень антагонистической активности. Неясной остается проверка действия данного штамма на фитопатогенные грибы. Так предлагается следующий метод: посевы с штаммом бактерий инкубируют при 28°С в течение 3 сут. К выросшей культуре B. amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 подсевают штрихом суточные суспензии тест-культур фитопатогенных бактерий (титр суспензий 108 КОЕ/мл). Затем чашки инкубируют при температуре 28°С в течение 24 ч и снимают результаты. В реальных условиях данные группы находятся в соперничестве за колонизацию ризоплана, и более правильным является следующий способ оценки антагонистической активности: одновременный посев культуры гриба и бактерии на плотной среде. Также не проверена возможность применения данного препарата на озимой пшенице. Также фитопатогенные грибы в данном способе не выделяются в ходе работы, а берутся уже известные культуры фитопатогенных грибов из различных коллекций, что может сильно сказаться на эффективности действия данного препарата в различных регионах и странах.The patent RU 2478290 C2 proposes a method for producing a biological product that contains the biomass of Bacillus amyloliquefaciens All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) B-11008 and humates with the following ratio of components, in vol.%: Biomass of Bacillus amyloliquefaciens VKPM B-11008 and spores 1.24 ÷ 1.30) × 10 10 CFU / ml of culture liquid and spore content of 94% of the total CFU - 99.0, humates - 1.0. As a nutrient medium for obtaining the claimed biological product use a cheap medium based on grain waste of the following composition, g / l: wheat bran - 40.0; corn extract - 0.5; MgSO 4 0.9; KH 2 PO 4 0.5; CaCO 3 - 1.0; pH 7.0 ± 0.2. The specified composition of the medium provides a high level of biomass accumulation of B. amyloliquefaciens VKPM V-11008 (5.6 ÷ 5.9 g / l), a high titer of viable cells and spores (1.24 ÷ 1.28) × 10 10 CFU / ml) and the intensity of sporulation (spore content - 94.0% of the total CFU). The strain of this species was tested on the following representatives of the genus: Fusarium: F. graminearum, F. solani, F. oxysporum, F. sambucinum. This strain showed a high level of antagonistic activity. It remains unclear whether the effect of this strain on phytopathogenic fungi is tested. So the following method is proposed: inoculations with a bacterial strain are incubated at 28 ° C for 3 days. To the grown cultures B. amyloliquefaciens VKPM B-11008 sow stroke DSA suspension test cultures phytopathogenic bacteria (titer suspension of 10 8 cfu / ml). The plates are then incubated at 28 ° C for 24 hours and the results are recorded. In real conditions, these groups are in competition for the colonization of Rhizoplan, and the following method for assessing antagonistic activity is more correct: simultaneous sowing of a culture of fungus and bacteria on a solid medium. Also, the possibility of using this drug on winter wheat has not been tested. Also, phytopathogenic fungi in this method are not isolated during work, but already known cultures of phytopathogenic fungi from various collections are taken, which can greatly affect the effectiveness of this drug in various regions and countries.
Ближайшим решением к заявленному является биопрепарат, раскрытый в патенте на изобретение RU 2724464 С1 «Штаммы, биопрепарат, способ получения биопрепарата и способ биологической защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза», опубл. 23.06.2020 г. Однако заявленная группа изобретений отличается тем, что является развитием предыдущей группы изобретений, созданной на основе результатов исследований тех же авторов и представляет жидкую форму биопрепарата на основе специально разработанной питательной среды, полученной определенным способом. The closest solution to the claimed is the biological product, disclosed in the patent for invention RU 2724464 C1 "Strains, biological product, a method of obtaining a biological product and a method of biological protection of crops from fusarium", publ. 06/23/2020 However, the claimed group of inventions differs in that it is a development of the previous group of inventions created on the basis of the research results of the same authors and represents a liquid form of a biological product based on a specially designed nutrient medium obtained in a certain way.
При разработке бактериальных препаратов весьма существенным является вопрос состава питательной среды, которая с одной стороны должна обеспечивать интенсивный рост культуры целевого микроорганизма, а с другой – быть достаточно дешевой для достижения экономической эффективности при производстве биопрепарата. Наиболее перспективным подходом является использование отходов других производств, что позволяет параллельно решать и задачу их утилизации, и создавать сырье для производства нового продукта. Одним из таких побочных продуктов является меласса, образующаяся в процессе производства сахара. В ней содержится 58-60% сахаров, 13-14% органических азотистых веществ, 8% несахаров, 3% пектиновых веществ, 15% безазотистых экстрактивных веществ [Терешко А. М. Перспективные направления использования отходов свеклосахарного производства. – 2016]. Более подробно состав мелассы представлен ниже в Таблице 1 согласно источнику [Егорова М. И., Широких Е. В., Кретова Я. А. Методологические аспекты пробоподготовки мелассы при определении содержания диоксида серы //Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2015. – №. 3 (65)].In the development of bacterial preparations, the question of the composition of the nutrient medium is very important, which, on the one hand, should ensure the intensive growth of the culture of the target microorganism, and on the other, be sufficiently cheap to achieve economic efficiency in the production of a biological product. The most promising approach is the use of waste from other industries, which makes it possible to simultaneously solve the problem of their disposal and create raw materials for the production of a new product. One such by-product is molasses from the sugar production process. It contains 58-60% sugars, 13-14% organic nitrogenous substances, 8% non-sugars, 3% pectin substances, 15% nitrogen-free extractive substances [Tereshko AM Prospective directions of use of beet sugar production waste. - 2016]. In more detail the composition of molasses is presented below in Table 1 according to the source [Egorova MI, Shirokikh EV, Kretova Ya. A. Methodological aspects of sample preparation of molasses in determining the content of sulfur dioxide // Bulletin of the Voronezh State University of Engineering Technologies. - 2015. - No. 3 (65)].
Таблица 1. Компонентный состав мелассы Table 1. Component composition of molasses
В настоящий момент времени при производстве сахарного песка из свекловичного сырья достаточно важным является вопрос об экономически выгодной переработке получаемых побочных продуктов. At the present time, in the production of granulated sugar from raw beets, the issue of the economically beneficial processing of the obtained by-products is quite important.
Так по данным белорусских авторов [Тарасова Г. И. Научные основы и методология комплексной переработки и утилизации многотоннажных кальцийкарбонат-, кальцийсульфат-и металлсодержащих отходов. – 2014] при выходе сахара 12-13%, свеклосахарное производство республики Беларусь дает: 80-83% сырого свекловичного жома; 5-5,5% мелассы; 10-12% фильтрационного осадка; 1,4% отсева известнякового камня; боя и хвостиков – до 3%. So, according to the Belarusian authors [Tarasova GI Scientific bases and methodology of complex processing and disposal of large-tonnage calcium carbonate, calcium sulfate and metal-containing wastes. - 2014] with a sugar yield of 12-13%, the sugar beet production of the Republic of Belarus gives: 80-83% of raw beet pulp; 5-5.5% molasses; 10-12% filter cake; 1.4% limestone dropout; fight and tails - up to 3%.
Спектр применения мелассы достаточно широк. Меласса является сырьем для производства пищевого этилового спирта, хлебопекарных дрожжей, лимонной и молочной кислот, глицерина, бутанола, ацетона, глютамата натрия, аминокислот, декстрана, антибиотиков и витаминов. Кроме того, меласса может стать одним из возобновляемых сырьевых источников для производства экологически чистого автомобильного биоэтанола. Мелассу используют для получения ряда химических соединений, применяющихся в фармацевтической, химической и других отраслях промышленности [Файзуллина Н. Р., Абдрашитов Я. М., Шукаев А. В. Получение мелассного концентрата с целью длительного хранения //Доклады Башкирского университета. – 2016. – Т. 1. – №. 4. – С. 675].The range of application of molasses is wide enough. Molasses is a raw material for the production of edible ethyl alcohol, baker's yeast, citric and lactic acids, glycerin, butanol, acetone, sodium glutamate, amino acids, dextran, antibiotics and vitamins. In addition, molasses can become one of the renewable raw materials for the production of environmentally friendly automotive bioethanol. Molasses is used to obtain a number of chemical compounds used in pharmaceutical, chemical and other industries [Fayzullina NR, Abdrashitov Ya. M., Shukaev A. V. Obtaining molasses concentrate for long-term storage // Reports of the Bashkir University. - 2016. - T. 1. - No. 4. - S. 675].
Помимо описанных выше сфер применения мелассы в литературе имеется достаточно большое количество работ, посвященных применению свекловичной мелассы в качестве питательной среды для создания на ее основе жидкого биопрепарата [Воронкович Н. В., Ананьева И. Н., Коломиец Э. И. Оптимизация состава питательной среды и условий глубинного культивирования бактерий Bасillus subtilis 17–основы биопрепарата для защиты картофеля от грибных и бактериальных болезней //Сборник представляет интерес для микробиологов и биотехнологов, а также работников промышленности и агропромышленного комплекса. – С. 178]; [Маметова А.З., Оразова Н.Ш. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ BACILLUS SUBTILIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОЙ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ // Материалы VIII Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум»];[Царенко И. Ю., Рой А. А., Курдиш И. К. Оптимизация питательной среды для культивирования Bacillus subtilis ИМВ В-7023 //Мікробіологічний журнал. – 2011. – №. 73, № 2. – С. 13-19].In addition to the above-described areas of application of molasses in the literature, there is a fairly large number of works devoted to the use of beet molasses as a nutrient medium for the creation of a liquid biological product on its basis [Voronkovich N. V., Ananyeva I. N., Kolomiets E. I. Optimization of the composition of the nutrient environment and conditions of deep cultivation of bacteria Basillus subtilis 17 - the basis of a biological product to protect potatoes from fungal and bacterial diseases // The collection is of interest to microbiologists and biotechnologists, as well as workers in industry and the agro-industrial complex. - S. 178]; [Mametova A.Z., Orazova N.Sh. STUDY OF THE COMPOSITION OF THE NUTRITIONAL MEDIUM FOR CULTIVATION OF BACILLUS SUBTILIS FOR OBTAINING FEED PROBIOTIC ADDITIVE // Materials of the VIII International Student Scientific Conference "Student Scientific Forum"]; [Tsarenko I. Yu., Roy A. A., Kurdish I. K. Optimization of the nutrient medium for cultivation of Bacillus subtilis IMV B-7023 // Microbiological journal. - 2011. - No. 73, No. 2. - S. 13-19].
Помимо публикаций можно также привести в пример патенты RU 2412612 C1, опубл.27.02.2011 и RU 2654604 C1, опубл.21.05.2018. In addition to publications, one can also cite as an example patents RU 2412612 C1, publ. 27.02.2011 and RU 2654604 C1, publ. 21.05.2018.
РАСКРЫТИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙDISCLOSURE OF THE GROUP OF INVENTIONS
Задача, решаемая заявленной группой изобретений, состоит в разработке способа приготовления жидкой питательной среды, а также в разработке способа получения на основе данной питательной среды жидкого микробиологического препарата, содержащего смесь штаммов споробразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью.The problem to be solved by the claimed group of inventions is to develop a method for preparing a liquid nutrient medium, as well as to develop a method for producing, on the basis of this nutrient medium, a liquid microbiological preparation containing a mixture of strains of spore-forming antagonist bacteria with antifusarial activity.
Технический результат заявленной группы изобретений заключается в расширении арсенала фунгицидных средств, т.е. создании нового эффективного жидкого биопрепарата на основе смеси штаммов споробразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью, выращенных на жидкой питательной среде, основанной на свекловичной мелассе, а также в оптимизации условий культивирования данных штаммов для достижения максимальной численности бактерий в препарате.The technical result of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of fungicidal agents, i.e. creation of a new effective liquid biological product based on a mixture of strains of spore-forming antagonist bacteria with antifusarial activity, grown on a liquid nutrient medium based on beet molasses, as well as in optimizing the cultivation conditions of these strains to achieve the maximum number of bacteria in the preparation.
Указанный технический результат достигается за счет предложенного способа приготовления стерильной питательной среды для получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium, который содержит этапы: The specified technical result is achieved due to the proposed method for preparing a sterile nutrient medium for obtaining a liquid microbiological preparation based on a mixture of strains of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi p. Fusarium, which contains stages:
- смешивания 1,5-2,5% свекловичной мелассы и растворенной в воде нитроаммофоски с концентрацией 1,625-2,43 г/л;- mixing 1.5-2.5% beet molasses and nitroammophoska dissolved in water with a concentration of 1.625-2.43 g / l;
- дробной стерилизации.- fractional sterilization.
При этом дробную стерилизацию проводят по схеме: нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С, выдержка 18-24 ч, нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С, выдержка 18-24 ч, нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С. In this case, fractional sterilization is carried out according to the scheme: heating to 90-95 ° C, cooling to 30-35 ° C, exposure 18-24 hours, heating to 90-95 ° C, cooling to 30-35 ° C, exposure 18-24 h, heating to 90-95 ° С, cooling to 30-35 ° С.
Кроме того, технический результат достигается за счет способа получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium, выращенных по отдельности на жидкой питательной среде посредством инкубации чистых культур в стерильной питательной среде на шейкере-инкубаторе в течение 3-5 суток, инокуляции, перемешивания и культивирования при 30-35 °С в течение 48-72 часов при постоянной аэрации; последующего смешивания полученных жидких монокультур штаммов в равных пропорциях.In addition, the technical result is achieved due to the method of obtaining a liquid microbiological preparation based on a mixture of strains of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi p. Fusarium grown separately on a liquid nutrient medium by incubating pure cultures in a sterile nutrient medium on an incubator shaker for 3-5 days, inoculation, stirring and cultivation at 30-35 ° C for 48-72 hours with constant aeration; subsequent mixing of the obtained liquid monocultures of strains in equal proportions.
При этом смесь штаммов содержит не менее 109 КОЕ/г жизнеспособных бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium. At the same time, the mixture of strains contains at least 10 9 CFU / g of viable bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi r. Fusarium.
Вышеуказанные и другие задачи, особенности, преимущества, а также техническая значимость данного изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания изобретения и чертежей.The above and other objects, features, advantages, as well as the technical significance of the present invention will be better understood from the following detailed description of the invention and the drawings.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS
На фигуре 1 показан график кривых роста для штамма О 1.27 в зависимости от концентрации мелассы, где *Х6 – 1% мелассы в среде; Х7 – 1,5% мелассы; Х8 – 2% мелассы; Х9 – 2,5% мелассы; Х10 – 3% мелассы.Figure 1 shows a graph of growth curves for strain O 1.27 depending on the concentration of molasses, where * X6 - 1% molasses in the medium; X7 - 1.5% molasses; X8 - 2% molasses; X9 - 2.5% molasses; X10 - 3% molasses.
На фигуре 2 показан график кривых роста для штамма О 2.11 в зависимости от концентрации солей, где *Х13 – соотношение 1:30 – 1,625 г/л; Х14 – 1:25 – 1,95 г/л; Х15 – 1:20 – 2,43 г/л; Х16 – 1:15 – 3,25 г/л; Х17 – 1:10 – 4,875 г/л; Х18 – среда на основе 2,5% мелассы без добавления солей.The figure 2 shows a graph of growth curves for strain O 2.11, depending on the concentration of salts, where * X13 - the ratio of 1:30 - 1.625 g / l; X14 - 1:25 - 1.95 g / l; X15 - 1:20 - 2.43 g / l; X16 - 1:15 - 3.25 g / l; X17 - 1:10 - 4.875 g / l; X18 is a medium based on 2.5% molasses without the addition of salts.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙIMPLEMENTATION OF THE GROUP OF INVENTIONS
Для разработки способа приготовления жидкого биопрепарата использовали 10 выделенных наиболее эффективных штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов:To develop a method for preparing a liquid biological product, 10 isolated most effective strains of spore-forming antagonist bacteria were used:
1. Штамм Paenibacillus jamilae K 1.14 (ВКПМ В-13016).1. Strain Paenibacillus jamilae K 1.14 (VKPM B-13016).
2. Штамм Paenibacillus peoriae O 1.27 (ВКПМ В-13017).2. Strain Paenibacillus peoriae O 1.27 (VKPM B-13017).
3. Штамм Paenibacillus peoriae O 2.11 (ВКПМ В-13018).3. Strain Paenibacillus peoriae O 2.11 (VKPM B-13018).
4. Штамм Paenibacillus peoriae R 3.13 (ВКПМ В-13019).4. Strain Paenibacillus peoriae R 3.13 (VKPM B-13019).
5. Штамм Paenibacillus peoriae R 4.5 (ВКПМ В-13020).5. Strain Paenibacillus peoriae R 4.5 (VKPM B-13020).
6. Штамм Bacillus amyloliquefaciens R 4.6 ВКПМ В-13021).6. Strain Bacillus amyloliquefaciens R 4.6 VKPM B-13021).
7. Штамм Paenibacillus jamilae R 4.24 (ВКПМ В-13022).7. Strain Paenibacillus jamilae R 4.24 (VKPM B-13022).
8. Штамм Paenibacillus polymyxa R 5.31 (ВКПМ В-13023).8. Strain Paenibacillus polymyxa R 5.31 (VKPM B-13023).
9. Штамм Paenibacillus peoriae R 6.14 (ВКПМ В-13048).9. Strain Paenibacillus peoriae R 6.14 (VKPM B-13048).
10. Штамм Bacillus amyloliquefaciens V 3.14 (ВКПМ В-13024).10. Strain Bacillus amyloliquefaciens V 3.14 (VKPM B-13024).
Характеристика 10 штаммов бактерий-антагонистов, используемых при разработке способа изготовления жидкого биопрепарата представлена в Таблице 2. The characteristics of 10 strains of antagonist bacteria used in the development of a method for manufacturing a liquid biological product are presented in Table 2.
Указанные выше штаммы были депонированы 7 ноября 2017 г. (национальное патентное депонирование) и 18 ноября 2019 г. (международное патентное депонирование) в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (адрес: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) – далее ВКПМ. The above strains were deposited on November 7, 2017 (national patent deposit) and November 18, 2019 (international patent deposit) at the Bioresource Center of the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) NRC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetics (address: 117545, g Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) - hereinafter VKPM.
ВКПМ осуществляет депонирование для целей патентной процедуры в российской коллекции, уполномоченной на депонирование для целей патентной процедуры и удовлетворяет соответствующим для таких коллекций требованиям, а также гарантирует поддержание жизнеспособности депонируемых объектов в течение по меньшей мере срока действия патента, в том числе является Международным органом по депонированию согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов.VKPM makes a deposit for the purposes of patent procedure in a Russian collection authorized for deposit for the purposes of patent procedure and meets the relevant requirements for such collections, and also guarantees the maintenance of the viability of the deposited objects for at least the term of the patent, including being an International Depository Authority according to the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms.
Таблица 2. Характеристика штаммов бактерий-антагонистов, используемых при разработке способа изготовления жидкого биопрепарата с антифузариозной активностью.Table 2. Characteristics of antagonist bacterial strains used in the development of a method for manufacturing a liquid biological product with antifusarial activity.
Согласно заключению ВКПМ, работа с данными штаммами не требует специальных мер предосторожности. According to the conclusion of the VKPM, working with these strains does not require special precautions.
В качестве питательного субстрата для данных бактериальных культур использовали среду следующего состава (г/л):A medium of the following composition (g / L) was used as a nutrient substrate for these bacterial cultures:
Меласса – 10-30 г/л;Molasses - 10-30 g / l;
Азофоска (нитроаммофоска) – 1,625-4,875 г/л (используется удобрение, соответствующее ГОСТ 19691-84 Нитроаммофоска. Технические условия (Кочетков В.Н. Фосфорсодержащие удобрения. Справочник, М.: Химия, 1982.);Azofoska (nitroammofosk) - 1.625-4.875 g / l (fertilizer is used that corresponds to GOST 19691-84 Nitroammofosk. Specifications (Kochetkov VN Phosphorus-containing fertilizers. Handbook, M .: Chemistry, 1982.);
Водопроводная вода – 1 л.Tap water - 1 liter.
Среда стерилизовалась методом дробной стерилизации по схеме: прогревалась до 90-95° С, затем выдерживалась 18 часов при 30-35 °С. Далее нагрев до 90-95° С повторялся, и среда вновь выдерживалась при 30-35 °С 18 часов, после чего нагревалась до 90-95 °С в последний раз. The medium was sterilized by the method of fractional sterilization according to the scheme: it was warmed up to 90-95 ° C, then kept for 18 hours at 30-35 ° C. Further, heating to 90-95 ° C was repeated, and the medium was again kept at 30-35 ° C for 18 hours, after which it was heated to 90-95 ° C for the last time.
Такой подход позволяет достичь практически полного удаления посторонних бактерий из среды.This approach allows you to achieve almost complete removal of foreign bacteria from the environment.
Метод подбора оптимальных концентраций мелассы для культивирования бактерий.The method of selecting the optimal concentration of molasses for the cultivation of bacteria.
Для подбора оптимальной концентрации мелассы пользовались планшетным ридером FLUOstar® Omega (BMG LABTECH Co). To select the optimal concentration of molasses, a FLUOstar® Omega plate reader (BMG LABTECH Co) was used.
В лунки планшета вносили питательную среду на основе мелассы с различной концентрацией (100 мкл). Так в работе были использованы среды с концентрацией мелассы от 1 до 3%. A nutrient medium based on molasses with various concentrations (100 μL) was introduced into the wells of the plate. So in the work were used media with a molasses concentration of 1 to 3%.
Затем в лунки с питательной средой вносили суспензию бактериальных клеток исследуемого штамма (10 мкл). После чего планшет загружали в данный прибор и культивировали в нем в течение 18 часов при температуре 36,7-37,0 °С с периодическим покачиванием планшета, для получения кривых роста. Об оптимальной концентрации мелассы для того или иного штамма судили по скорости выхода штаммов в стационарную фазу. Then, a suspension of bacterial cells of the studied strain (10 μl) was introduced into the wells with the nutrient medium. Then the plate was loaded into this device and cultured in it for 18 hours at a temperature of 36.7-37.0 ° C with periodic rocking of the plate to obtain growth curves. The optimal concentration of molasses for a particular strain was judged by the rate of release of the strains into the stationary phase.
Метод подбора оптимальной концентрации солей в питательной среде. The method of selecting the optimal concentration of salts in the nutrient medium.
Подбор оптимальной концентрации солей для питательной среды осуществляли по аналогичной изложенной выше схеме. В качестве источника солей (а именно азота) использовали минеральное удобрение Азофоска (по ГОСТ 19691-84). Концентрацию подбирали так, чтобы получить соотношение 1:20, где на одну часть N (азота) должно приходиться 20 частей C (углерода), данное соотношение в ряде статей указывается в качестве оптимального. Для того чтобы выявить оптимальную концентрацию солей для каждого из штаммов использовали 5 точек, а именно: 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 и 1:30 соответственно. Данные концентрации солей вносили в 2,5% среду на основе мелассы, который после этого автоклавировали для стерилизации полученной среды. The selection of the optimal concentration of salts for the nutrient medium was carried out according to a similar scheme described above. The mineral fertilizer Azofosk (according to GOST 19691-84) was used as a source of salts (namely nitrogen). The concentration was selected so as to obtain a ratio of 1:20, where one part of N (nitrogen) should account for 20 parts of C (carbon), this ratio is indicated in a number of articles as optimal. In order to identify the optimal salt concentration for each of the strains, 5 points were used, namely: 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 and 1:30, respectively. These salt concentrations were introduced into 2.5% molasses medium, which was then autoclaved to sterilize the resulting medium.
После чего среды вносили в 96-луночный планшет по схеме описанной выше и также вносили культуры исследуемых штаммов. Затем в планшетном ридере FLUOstar® Omega (BMG LABTECH Co) снимали кривые роста в течение 18 часов культивирования.After that, the medium was added to a 96-well plate according to the scheme described above, and the cultures of the studied strains were also added. Then, growth curves were recorded in a FLUOstar® Omega plate reader (BMG LABTECH Co) for 18 hours of culture.
Подбор оптимальных концентраций мелассы и солей для культивирования штаммов бактерий-антагонистов на среде с мелассой.Selection of optimal concentrations of molasses and salts for the cultivation of antagonist bacterial strains on a medium with molasses.
Для того чтобы определить оптимальные концентрации для культивирования каждого из штаммов бактерий, проводили культивирование в 96-луночном планшете в течение 18 часов. In order to determine the optimal concentration for the cultivation of each of the bacterial strains, cultivation was carried out in a 96-well plate for 18 hours.
В каждую лунку планшета, как было написано выше, вносили по 100 мкл среды с различной концентрацией сначала мелассы, а затем с различной концентрацией нитроаммофоски. В полученную среду вносили 10 мкл суспензии клеток и культивировали в ридере FLUOstar® Omega (BMG LABTECH Co) с периодическим помешиванием при температуре 36,7-37,0 °С, с периодическим снятием спектров поглощения пропускаемого света длиной волны 600 нм (каждые 10 минут). In each well of the plate, as described above, 100 μl of medium was added with different concentrations of molasses first, and then with different concentrations of nitroammophoska. The resulting medium was added with 10 μl of cell suspension and cultured in a FLUOstar® Omega reader (BMG LABTECH Co) with periodic stirring at a temperature of 36.7-37.0 ° C, with periodic recording of absorption spectra of transmitted light with a wavelength of 600 nm (every 10 minutes ).
Для каждого из штаммов строился график (см. фиг. 1) для определения оптимальной концентрации мелассы.For each of the strains, a graph was constructed (see Fig. 1) to determine the optimal concentration of molasses.
Так на фигуре 1 можно отчетливо видеть, что концентрация мелассы 3% оказывает негативное действие на штамм Paenibacillus peoriae O 1.27, ингибируя рост данного штамма. Хороший рост данного штамма наблюдался в диапазоне концентраций мелассы от 1,5% до 2,5%. Оптимальной концентрацией для данного штамма является 2,5% мелассы, поскольку при этой концентрации бактерии раньше вышли в стационарную фазу и при этом оптическая плотность в растворе была выше, чем при других концентрациях мелассы. So in figure 1 you can clearly see that the concentration of
На основе анализа всех полученных данных, было выявлено что оптимальной для культивирования всех штаммов является концентрация мелассы в диапазоне от 1,5% до 2,5%. Based on the analysis of all the data obtained, it was revealed that the optimal concentration for the cultivation of all strains is the concentration of molasses in the range from 1.5% to 2.5%.
Аналогичная работа была проделана и для определения диапазона оптимальной концентрации солей в питательной среде. При работе с концентрациями солей использовали среднюю концентрацию мелассы в среде из установленного оптимального диапазона (2%), изменяя лишь концентрацию солей в питательной среде.Similar work was done to determine the range of optimal salt concentration in the nutrient medium. When working with salt concentrations, we used the average concentration of molasses in the medium from the established optimal range (2%), changing only the concentration of salts in the nutrient medium.
При определении количества сахаров и сахара-подобных веществ использовали ареометр. Так при измерении с помощью ареометра выявили, что в мелассе содержалось 78% углеводов. В дальнейшем полученные данные по количеству сахаросодержащих веществ понадобились нам для расчета необходимой для внесения концентрации солей (1:20 как оптимум, что было описано выше).A hydrometer was used to determine the amount of sugars and sugar-like substances. Thus, when measured with a hydrometer, it was found that the molasses contained 78% carbohydrates. In the future, we needed the obtained data on the amount of sugar-containing substances to calculate the salt concentration required for the introduction (1:20 as the optimum, which was described above).
В результате расчетов по содержанию сахаров- и подобных им веществ, содержащих углерод, и соответственно учитывая, что в Азофоске лишь 16% азота, были получены следующие значения по концентрации солей, необходимых для внесения в питательную среду: As a result of calculations on the content of sugars and similar substances containing carbon, and, accordingly, taking into account that there is only 16% nitrogen in Azofosk, the following values were obtained for the concentration of salts required for introduction into the nutrient medium:
При соотношении 1:10 (N:C) – необходимо внести 4,875 г нитроаммофоски на 1 литр.At a ratio of 1:10 (N: C), 4.875 g of nitroammofoska per 1 liter must be added.
1:15 – 3,25 г/л;1:15 - 3.25 g / l;
1:20 – 2,43 г/л;1:20 - 2.43 g / l;
1:25 – 1,95 г/л;1:25 - 1.95 g / l;
1:30 – 1,625 г/л.1:30 - 1.625 g / l.
Данные концентрации, как было описано выше, вносились в жидкую питательную среду на основе 2% раствора мелассы. После чего данные среды по 100 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета в последующем добавляя к ним 10 мкл суспензии бактерий. Также для выявления различий по отношению к среде без мелассы в лунки нижнего ряда вносили среду без солей с 2% раствором мелассы. Затем данный планшет также загружали в ридер и инкубировали в течение 18 часов для построения кривых роста (см. фиг. 2). These concentrations, as described above, were introduced into a liquid nutrient medium based on a 2% molasses solution. After that, these media, 100 μl were introduced into the wells of a 96-well plate, followed by adding 10 μl of bacteria suspension to them. Also, to reveal differences in relation to the medium without molasses, a medium without salts with a 2% molasses solution was introduced into the wells of the lower row. The plate was then also loaded into the reader and incubated for 18 hours to build growth curves (see FIG. 2).
Как можно понять исходя из данных, представленных на фигуре 2, заметна ярко выраженная разница между средой, в которую добавляли соли с той, в которою не привносили соли извне (Х13, Х14 против Х18). Стоит также отметить, что для данного штамма по мере роста концентрации нитроаммофоски в среде очевидным становится угнетение его скорости размножения, а при соотношении 1:10 размножение бактерий данного штамма вообще не наблюдается в течение 18 часов. Исходя из данных графика можно также сделать вывод, что для данного штамма наиболее оптимальной для развития является соотношение углерода к азоту на уровне от 1:15 до 1:25. As can be understood from the data presented in figure 2, there is a pronounced difference between the medium to which salts were added with the one in which no salts were added from the outside (X13, X14 versus X18). It is also worth noting that for this strain, as the concentration of nitroammofoska in the medium increases, the inhibition of its reproduction rate becomes obvious, and at a ratio of 1:10, the reproduction of bacteria of this strain is not observed at all for 18 hours. Based on the data of the graph, it can also be concluded that for this strain, the most optimal for development is the ratio of carbon to nitrogen at the level from 1:15 to 1:25.
В последующем анализе было выявлено, что такое соотношение является оптимальным для 7 штаммов из 10 (Paenibacillus jamilae К 1.14, Paenibacillus peoriae О 1.27, Paenibacillus peoriae О 2.11, Paenibacillus peoriae R 3.13, Paenibacillus peoriae R 4.5, Paenibacillus jamilae R 4.24, Paenibacillus polymyxa R 5.31), для оставшихся 3 штаммов (Bacillus amyloliquefaciens V 3.14, Bacillus amyloliquefaciens R 4.6, Paenibacillus peoriae R 6.14) оптимальным было соотношение 1:30. In the subsequent analysis, it was revealed that this ratio is optimal for 7 out of 10 strains (Paenibacillus jamilae K 1.14, Paenibacillus peoriae O 1.27, Paenibacillus peoriae O 2.11, Paenibacillus peoriae R 3.13, Paenibacillus peoriae R 4.5, Paenibacillus peoriae R 4.5, Paenibacillus peoriae R 4.5, Paenibacillus R4 5.31), for the remaining 3 strains (Bacillus amyloliquefaciens V 3.14, Bacillus amyloliquefaciens R 4.6, Paenibacillus peoriae R 6.14), the optimal ratio was 1:30.
Для экспериментальной проверки выводов были заложены 9 экспериментальных вариантов (см. Таблицу 3).For experimental verification of the conclusions, 9 experimental options were laid (see Table 3).
Таблица 3. Схема опыта по наработке жидкого биопрепарата на среде с разным содержанием мелассы и нитроаммофоскиTable 3. Scheme of the experiment on the production of a liquid biological product on a medium with different contents of molasses and nitroammophoska
содержание нитроаммофоски, г/лC: N ratio
nitroammophoska content, g / l
2,43 г/л20: 1
2.43 g / l
1,95 г/л25: 1
1.95 g / l
1,625 г/л30: 1
1.625 g / l
После приготовления 9 вариантов питательной среды среда в объеме 100 мл в 250 мл Эрленмейеровских колбах подвергалась дробной стерилизации, а именно проводился трехкратный прогрев питательной среды с 1,5 - 2,5% мелассы при температуре свыше 90 °С в течение 2,5 часов с последующим охлаждением до 30 °С и выдержкой 18 часов. Контрольный бактериологический посев показал эффективность проведенной стерилизации (полное отсутствие роста бактерий при посеве 1 мл неразбавленной среды на питательный агар глубинным способом).After the preparation of 9 variants of the culture medium, the medium in a volume of 100 ml in 250 ml Erlenmeyer flasks was subjected to fractional sterilization, namely, the culture medium was heated three times with 1.5 - 2.5% molasses at temperatures above 90 ° C for 2.5 hours with subsequent cooling to 30 ° C and holding for 18 hours. The control bacteriological inoculation showed the effectiveness of the performed sterilization (complete absence of bacterial growth when inoculating 1 ml of undiluted medium on nutrient agar by the submerged method).
Подготовленные таким образом варианты питательной среды инокулировались 0,5 мл жидкой суточной культуры тестируемого штамма, после чего колбы помещались на термостатируемый шейкер-инкубатор и культивировались при 200 об/мин и 30 °С в течение 48 часов. После завершения культивирования производился посев полученной на тестируемой среде культуре штамма на среду МПА в трехкратной повторности с последующим учетом числа колоний. Таким образом, определялось число жизнеспособных клеток штамма на каждом из 9 вариантов среды. Поскольку именно бактерии-антагонисты являются действующим началом создаваемого биопрепарата, их число после культивирования отражает степень пригодности того или иного состава питательной среды для получения биопрепарата. Аналогичные исследования были последовательно проведены для всех 10 штаммов бактерий-антагонистов. Результаты проведенных испытаний приведены в Таблице 4.The culture medium variants prepared in this way were inoculated with 0.5 ml of a daily liquid culture of the test strain, after which the flasks were placed on a thermostatted shaker incubator and cultured at 200 rpm and 30 ° C for 48 hours. After the completion of the cultivation, the culture of the strain obtained on the test medium was inoculated on the MPA medium in triplicate, followed by taking into account the number of colonies. Thus, the number of viable cells of the strain on each of the 9 variants of the medium was determined. Since it is bacteria-antagonists that are the active principle of the created biological product, their number after cultivation reflects the degree of suitability of a particular composition of the nutrient medium for obtaining a biological product. Similar studies were consistently carried out for all 10 strains of antagonist bacteria. The test results are shown in Table 4.
Таблица 4. Число жизнеспособных клеток штаммов бактерий-антагонистов при культивировании на питательных средах с разным содержанием мелассы и нитроаммофоскиTable 4. The number of viable cells of antagonist bacterial strains when cultivated on nutrient media with different contents of molasses and nitroammofoska
По итогам исследований ясно, что разные штаммы по-разному реагируют на содержание мелассы и минеральных солей в составе среды. Тем не менее, при диапазоне концентраций мелассы от 1,5 до 2,5% и содержании нитроаммофоски 1,625 - 2,43 г/л общее содержание жизнеспособных клеток во всех случаях превышает 109 КОЕ/мл, что обеспечивает средний титр препарата свыше 109 КОЕ/мл при составлении композиции из 10 штаммов. Такой титр является достаточным и обеспечивает заявляемые в изобретении свойства получаемого биопрепарата.Based on the research results, it is clear that different strains react differently to the content of molasses and mineral salts in the medium. Nevertheless, with the concentration range of molasses from 1.5 to 2.5% and the content of nitroammofoska 1.625 - 2.43 g / l, the total content of viable cells in all cases exceeds 10 9 CFU / ml, which provides an average titer of the drug over 10 9 CFU / ml when composing a composition of 10 strains. This titer is sufficient and provides the claimed in the invention properties of the obtained biological product.
Таким образом, в ходе проделанной работы была определена оптимальная схема стерилизации: трехкратный прогрев питательной среды с мелассой и азофоской при температуре 90-95 °С в течение порядка 2,5 часов с последующим охлаждением до 30-35 °С и выдержкой порядка 18 часов. Thus, in the course of the work done, the optimal sterilization scheme was determined: three times heating the nutrient medium with molasses and azofos at a temperature of 90-95 ° C for about 2.5 hours, followed by cooling to 30-35 ° C and holding for about 18 hours.
При подборе оптимальных концентраций мелассы и минеральных веществ (Азофоска) для создания жидкой питательной среды было выявлено:When selecting the optimal concentrations of molasses and minerals (Azofosk) to create a liquid nutrient medium, it was revealed:
- Оптимальной концентрацией мелассы для всех штаммов является концентрация мелассы в диапазоне 1,5 – 2,5% (15-25 г/л).- The optimal concentration of molasses for all strains is the concentration of molasses in the range of 1.5 - 2.5% (15-25 g / l).
- Оптимальной концентрацией нитроаммофоски является концентрация в диапазоне 1,625 - 2,43 г/л.- The optimal concentration of nitroammophoska is a concentration in the range of 1.625 - 2.43 g / l.
Ниже приведены примеры осуществления способа получения жидкого микробиологического препарата на основе 10 штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium посредством специального способа приготовлении жидкой питательной среды на основе свекловичной мелассы.Below are examples of the implementation of the method for producing a liquid microbiological preparation based on 10 strains of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi p. Fusarium by means of a special method of preparing a liquid nutrient medium based on beet molasses.
Пример 1 Example 1
Способ получения жидкого микробиологического препарата включает в себя способ приготовления жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 1,5% свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации 1,625 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 °С, выдержка 18 ч, нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 ° С, выдержка 18 ч, нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 3 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 30 °С в течение 48 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 109 КОЕ/мл.A method for producing a liquid microbiological preparation includes a method for preparing a liquid nutrient medium based on molasses as follows: 1.5% of beet molasses is mixed with tap water and nitroammofoska is added at a concentration of 1.625 g / l. The culture medium is subjected to fractional sterilization according to the following scheme: heating to 90 ° C, cooling to 30 ° C, holding for 18 hours, heating to 90 ° C, cooling to 30 ° C, holding for 18 hours, heating to 90 ° C, cooling to 30 ° C. Sterilization of the medium is carried out in parallel in 10 stainless steel boilers with a volume of 50 liters each with built-in heating elements and a thermostat, while the volume of the medium in each boiler is 20 liters. At the end of sterilization, liquid starter cultures of strains in a volume of 100 ml obtained by incubating pure cultures in a sterile nutrient medium of the same composition on an incubator shaker for 3 days are introduced into each of the cauldrons. After inoculation of starter cultures, sterile bubblers on silicone tubes are immersed in kettles for mixing and aeration. Bubblers and tubes are pre-sterilized by autoclaving in closed bixes at 121 ° C for an hour. The cultivation is carried out at 30 ° C for 48 hours with constant aeration. At the end of the cultivation, the obtained liquid monocultures of antagonist bacteria strains are mixed in equal proportions to obtain the final biological product. As a result, the content of viable antagonist bacteria in the biological product is at least 10 9 CFU / ml.
Пример 2Example 2
Способ включает приготовление жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 2,5% свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации -2,43 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: нагрев до 95 °С, охлаждение до 35 °С, выдержка 24 ч, нагрев до 95 °С, охлаждение до 35 °С, выдержка 24 ч, нагрев до 95° С, охлаждение до 35 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 5 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 35 °С в течение 72 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 109 КОЕ/мл.The method includes preparing a liquid nutrient medium based on molasses as follows: 2.5% of beet molasses is mixed with tap water and nitroammofoska is added at a concentration of 2.43 g / l. The culture medium is subjected to fractional sterilization according to the following scheme: heating to 95 ° С, cooling to 35 ° С, holding for 24 h, heating to 95 ° С, cooling to 35 ° С, holding for 24 hours, heating to 95 ° С, cooling to 35 ° C. Sterilization of the medium is carried out in parallel in 10 stainless steel boilers with a volume of 50 liters each with built-in heating elements and a thermostat, while the volume of the medium in each boiler is 20 liters. At the end of sterilization, liquid starter cultures of strains in a volume of 100 ml obtained by incubating pure cultures in a sterile nutrient medium of the same composition on an incubator shaker for 5 days are introduced into each of the cauldrons. After inoculation of starter cultures, sterile bubblers on silicone tubes are immersed in kettles for mixing and aeration. Bubblers and tubes are pre-sterilized by autoclaving in closed bixes at 121 ° C for an hour. The cultivation is carried out at 35 ° C for 72 hours with constant aeration. At the end of the cultivation, the obtained liquid monocultures of antagonist bacteria strains are mixed in equal proportions to obtain the final biological product. As a result, the content of viable antagonist bacteria in the biological product is at least 10 9 CFU / ml.
Пример 3Example 3
Способ включает приготовление жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 2 % свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации -1,95 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: Нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 °С, выдержка 20 ч, нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 ° С, выдержка 20 ч, нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 4 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 33 °С в течение 60 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 109 КОЕ/мл.The method includes preparing a liquid nutrient medium based on molasses as follows: 2% of beet molasses is mixed with tap water and nitroammofoska is added at a concentration of -1.95 g / l. The culture medium is subjected to fractional sterilization according to the following scheme: Heating to 93 ° С, cooling to 33 ° С, holding for 20 h, heating to 93 ° С, cooling to 33 ° С, holding for 20 h, heating to 93 ° С, cooling to 33 ° C. Sterilization of the medium is carried out in parallel in 10 stainless steel boilers with a volume of 50 liters each with built-in heating elements and a thermostat, while the volume of the medium in each boiler is 20 liters. At the end of sterilization, liquid starter cultures of strains in a volume of 100 ml obtained by incubating pure cultures in a sterile nutrient medium of the same composition on an incubator shaker for 4 days are introduced into each of the cauldrons. After inoculation of starter cultures, sterile bubblers on silicone tubes are immersed in kettles for mixing and aeration. Bubblers and tubes are pre-sterilized by autoclaving in closed bixes at 121 ° C for an hour. The cultivation is carried out at 33 ° C for 60 hours with constant aeration. At the end of the cultivation, the obtained liquid monocultures of antagonist bacteria strains are mixed in equal proportions to obtain the final biological product. As a result, the content of viable antagonist bacteria in the biological product is at least 10 9 CFU / ml.
В ходе весенне-летнего сезона 2019 года было проведено исследование эффективности обработки полученным жидким биопрепаратом посевов озимой пшеницы и проведена оценка фунгицидного действие препарата в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium на растениях и в почве.During the spring-summer season of 2019, a study was made of the effectiveness of the treatment of winter wheat crops with the obtained liquid biological product and an assessment of the fungicidal effect of the drug against phytopathogenic fungi of the river was carried out. Fusarium on plants and soil.
Было наработано в общей сложности 30 л жидкого биопрепарата в виде культур бактерий-антагонистов на специально подобранной питательной среде на основе свекловичной мелассы.A total of 30 liters of liquid biological product were produced in the form of cultures of antagonist bacteria on a specially selected nutrient medium based on beet molasses.
30 га озимой пшеницы были дважды обработаны жидкой формой биопрепарата в ходе плановых обработок посевов (препарат добавлялся в баковую смесь непосредственно перед опрыскиванием). Перед обработкой, а также после каждой из обработок проводились анализы почвы и растений на частоту встречаемость фитопатогенных грибов р. Fusarium. В растениях анализу подвергался колос и стебель. В качестве контроля использовались образцы почв и растений, взятые на том же поле, в той его части, где в баковую смесь биопрепарат не добавлялся. Также были проведены морфобиометрические исследования растений пшеницы на контроле и в опыте.30 hectares of winter wheat were twice treated with a liquid form of a biological product during routine crop treatments (the drug was added to the tank mix just before spraying). Before the treatment, as well as after each of the treatments, soil and plant analyzes were carried out for the frequency of occurrence of phytopathogenic fungi of the r. Fusarium. In plants, the ear and stem were analyzed. As a control, we used samples of soils and plants taken in the same field, in that part of it, where the biological product was not added to the tank mixture. Were also carried out morphobiometric studies of wheat plants in control and experiment.
По результатам проведенных исследований, после первой обработки в колосе озимой пшеницы наблюдалось достоверное снижение встречаемости грибов р. Fusarium на 40,4% после первой обработки и на 34,1% поле второй обработки. В стеблях снижение встречаемости составило 2% после первой обработки и 9,3% после второй обработки. В почве снижение составило 5,3% после первой обработки и 17,4% после второй обработки.According to the results of the studies, after the first treatment in the ear of winter wheat, there was a significant decrease in the occurrence of mushrooms from the r. Fusarium by 40.4% after the first treatment and 34.1% after the second treatment. In stems, the decrease in incidence was 2% after the first treatment and 9.3% after the second treatment. In the soil, the decrease was 5.3% after the first treatment and 17.4% after the second treatment.
Таким образом, при внесении жидкого биопрепарата на растения сверху с помощью опрыскивателя, прежде всего, наблюдается снижение численности фитопатогенов именно в колосе, что является наиболее значимым для сдерживания развития фузариоза колоса и снижения доли зерна, пораженного микотоксинами.Thus, when applying a liquid biological product to plants from above using a sprayer, first of all, there is a decrease in the number of phytopathogens in the spike, which is most significant for curbing the development of fusarium spike and reducing the proportion of grain affected by mycotoxins.
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020122106A RU2751487C1 (en) | 2020-07-03 | 2020-07-03 | Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020122106A RU2751487C1 (en) | 2020-07-03 | 2020-07-03 | Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2751487C1 true RU2751487C1 (en) | 2021-07-14 |
Family
ID=77019648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020122106A RU2751487C1 (en) | 2020-07-03 | 2020-07-03 | Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2751487C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116590199A (en) * | 2023-06-26 | 2023-08-15 | 上海市农业科学院 | A kind of Paenibacillus peirui and its application in the prevention and treatment of corn ear rot |
| RU2829228C1 (en) * | 2024-04-23 | 2024-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Агрохолод" | Nutrient medium for cultivation of bacteria of genera paenibacillus and bacillus |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478290C2 (en) * | 2011-11-11 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" | Biological preparation for stimulation of growth and protection of plants from diseases, increase in productivity and soil fertility |
| CN109266589A (en) * | 2018-11-22 | 2019-01-25 | 青岛中达农业科技有限公司 | Jie meter La series bacillus and its application of one plant of inhibition anthrax-bacilus and sickle-like bacteria |
| RU2724464C1 (en) * | 2019-12-02 | 2020-06-23 | Общество с ограниченной ответственностью «Агрофирма «Урожайная» | Strains, biopreparation, biopreparation production method and method for biological protection of crops against fusariosis |
-
2020
- 2020-07-03 RU RU2020122106A patent/RU2751487C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2478290C2 (en) * | 2011-11-11 | 2013-04-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Бациз" | Biological preparation for stimulation of growth and protection of plants from diseases, increase in productivity and soil fertility |
| CN109266589A (en) * | 2018-11-22 | 2019-01-25 | 青岛中达农业科技有限公司 | Jie meter La series bacillus and its application of one plant of inhibition anthrax-bacilus and sickle-like bacteria |
| RU2724464C1 (en) * | 2019-12-02 | 2020-06-23 | Общество с ограниченной ответственностью «Агрофирма «Урожайная» | Strains, biopreparation, biopreparation production method and method for biological protection of crops against fusariosis |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116590199A (en) * | 2023-06-26 | 2023-08-15 | 上海市农业科学院 | A kind of Paenibacillus peirui and its application in the prevention and treatment of corn ear rot |
| RU2829228C1 (en) * | 2024-04-23 | 2024-10-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Агрохолод" | Nutrient medium for cultivation of bacteria of genera paenibacillus and bacillus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101569737B1 (en) | Novel endophytic bacteria Bacillus oryzicola isolated from rice rhizosphere and development of a natural biopesticide and plant strengthener using same | |
| Keneni et al. | Characterization of acid and salt tolerant rhizobial strains isolated from faba bean fields of Wollo, Northern Ethiopia | |
| US20190077721A1 (en) | Method of manufacturing organic fertilizers by using organic raw material, antagonistic microorganism, fermentative microorganism, and synthetic microorganism, and organic fertilizers manufactured by said manufacturing method | |
| US6589524B1 (en) | Strains of Bacillus for biological control of pathogenic fungi | |
| EP0401560B1 (en) | Antibacterial, anti-nematode and/or plant-cell activating composition, and chitinolytic microorganisms for producing the same | |
| CN101463337B (en) | A strain of Achromobacter xylosoxidans and use thereof for depredating clomazone | |
| RU2751487C1 (en) | Method for producing liquid nutrition medium and method for obtaining liguid microbiological agent based on strains mixture of spore-forming bacteria-antagonists of phytopathogenic fungi of g. fusarium | |
| KR20080045346A (en) | Novel Bacillus subtilis M27 strain and method for controlling plant fungal disease comprising the active ingredient | |
| CN110791459B (en) | A strain of Bacillus subtilis for preventing and controlling soil-borne fusarium wilt of continuous cropping lily and its application | |
| Laktionov et al. | Determination of toxicity of various preparative forms of pesticidal fungicides for nodule bacteria inoculants | |
| CN117511778A (en) | A kind of Sonoran Desert Bacillus Bacillus sonorensis KMBJ4 and its application | |
| RU2551968C2 (en) | Bacillus pumilus A 1.5 BACTERIA STRAIN AS AGENT FOR INCREASING PLANT PRODUCTIVITY AND PLANT PROTECTION FROM DISEASES CAUSED BY PHYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS | |
| WO2018215925A1 (en) | A biological soil conditioner | |
| KR20130041530A (en) | Bacillus subtilis pbs-5 and soil microbial agent using the same | |
| RU2675503C1 (en) | Method of obtaining biological preparation for stimulation of growth and protection of plants against diseases | |
| Emtsev et al. | Protective effect of Klebsiella bacteria on lawn grasses under conditions of soil salinization | |
| RU2760337C1 (en) | Preparation for increasing the yield of spring wheat | |
| RU2840733C1 (en) | Bacillus velezensis w017 bacteria strain as agent for increasing plant productivity and protection thereof from diseases | |
| KR100616408B1 (en) | Lawn growth promoter containing lysopus oligosporus and method for promoting grass growth using same | |
| JP4340707B2 (en) | Method for producing filamentous fungal spores | |
| RU2760336C1 (en) | Preparation for increasing the yield of spring barley | |
| KR100713059B1 (en) | Novel Ryzopus Oligosporus KCCM 10624 and Plant Growth Promoters and Plant Disease Resistance Enhancers Comprising the Same | |
| RU2793159C1 (en) | Consortium of microorganisms designed to improve plant growth | |
| RU2827176C1 (en) | Method of using bacillus atrophaeus 119 strain together with mineral fertilizers and ameliorants to increase crop capacity and quality of crops | |
| RU2752903C1 (en) | Mixture of bacterial strains with cellulolytic and fungicidal activity |