RU2750973C1 - Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients - Google Patents
Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750973C1 RU2750973C1 RU2020139199A RU2020139199A RU2750973C1 RU 2750973 C1 RU2750973 C1 RU 2750973C1 RU 2020139199 A RU2020139199 A RU 2020139199A RU 2020139199 A RU2020139199 A RU 2020139199A RU 2750973 C1 RU2750973 C1 RU 2750973C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microrna
- lung
- galectin
- concentration
- obstruction
- Prior art date
Links
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 206010006440 Bronchial obstruction Diseases 0.000 title claims abstract description 10
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 14
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 14
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 3
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 208000036065 Airway Remodeling Diseases 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000034706 Graft dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 101000608757 Homo sapiens Galectin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000683910 Homo sapiens Transcriptional regulator SEHBP Proteins 0.000 description 1
- 101000743821 Homo sapiens Zinc finger protein 689 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000030934 Restrictive pulmonary disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023786 Transcriptional regulator SEHBP Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 102000048551 human LGALS3 Human genes 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000005823 lung abnormality Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000470 omalizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при мониторинге состояния реципиентов легких для диагностики обструкции бронхов трансплантированных легких.The invention relates to medicine, namely to organ transplantation and clinical laboratory diagnostics, can be used for monitoring the condition of lung recipients to diagnose bronchial obstruction of transplanted lungs.
Стабильно возрастает ежегодное количество выполняемых трансплантаций легких (ТЛ) во всем мире. Развитие программы ТЛ содействовало решению новых задач - обеспечение длительного выживания и улучшения качества жизни пациентов с трансплантированными легкими. Одним из основных патологических факторов, ограничивающих отдаленную выживаемость реципиентов после ТЛ, выступает хроническая дисфункция трансплантированных легких, гетерогенность механизмов которой привела к формированию новой классификации данной патологии.The annual number of lung transplants (LT) performed all over the world is steadily increasing. The development of the TH program helped to solve new problems - to ensure long-term survival and improve the quality of life of patients with transplanted lungs. One of the main pathological factors limiting the long-term survival of recipients after LT is chronic dysfunction of transplanted lungs, the heterogeneity of the mechanisms of which has led to the formation of a new classification of this pathology.
Диагностика и лечение дисфункции трансплантата, ассоциированной с развитием обструктивных изменений дыхательных путей, представляются крайне сложной задачей ввиду отсутствия явных признаков данного патологического процесса на ранних стадиях, таким образом, раннее выявление риска ее развития позволит эффективно корректировать стратегию лечения до наступления необратимых структурных изменений.Diagnosis and treatment of graft dysfunction associated with the development of obstructive changes in the airways seems to be an extremely difficult task due to the absence of obvious signs of this pathological process at early stages, thus, early detection of the risk of its development will make it possible to effectively adjust the treatment strategy before the onset of irreversible structural changes.
Для стратификации риска необходимы надежные биомаркеры характерных признаков, позволяющих диагностировать развитие патологии; к числу таковых относятся обструкция бронхов, отражающая течение обструктивных процессов в тканях трансплантата.Risk stratification requires reliable biomarkers of traits to diagnose the development of pathology; these include bronchial obstruction, reflecting the course of obstructive processes in the graft tissues.
Разработка малоинвазивных методов выявления признаков посттрансплантационных осложнений и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих об их развитии после трансплантации легких, направлена на повышение качества и продолжительности жизни реципиентов легких до уровня, соответствующего показателям при трансплантации других солидных органов.The development of minimally invasive methods for detecting signs of post-transplant complications and the search for new biomarkers signaling their development after lung transplantation is aimed at improving the quality and life expectancy of lung recipients to a level corresponding to those for transplantation of other solid organs.
В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием обструктивных процессов, приводящих к хронической дисфункции легочного трансплантата.Currently, active research is underway on biological agents that can be indicators of the risk of negative events associated with the development of obstructive processes leading to chronic dysfunction of the lung transplant.
МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушениях обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов; в том числе в развитии воспалительных процессов в легких [MicroRNAs in the lung / A. Sittka, B. Schmeck. // Adv Exp Med Biol. - 2013. - Vol. 774. - P. 121-134].MicroRNAs are a family of small endogenous non-coding single-stranded RNAs ranging in length from 18 to 25 nucleotides that act as post-transcriptional regulators that play a key role in a variety of biological processes. Recent studies have revealed the participation of microRNAs in the development and differentiation of hematopoietic cells, proliferation and apoptosis, metabolic disorders, autoimmune diseases, carcinogenesis and rejection of transplanted organs; including in the development of inflammatory processes in the lungs [MicroRNAs in the lung / A. Sittka, B. Schmeck. // Adv Exp Med Biol. - 2013. - Vol. 774. - P. 121-134].
Показана роль микроРНК в патогенезе хронической обструктивной болезни легких [Preliminary studies: differences in microRNA expression in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / M. Pietrusinska, A. Pajak, P. Gorski et al. // Postepy Dermatol Alergol. - 2016. - 33(4). - P. 276-280].The role of microRNA in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease has been shown [Preliminary studies: differences in microRNA expression in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / M. Pietrusinska, A. Pajak, P. Gorski et al. // Postepy Dermatol Alergol. - 2016 .-- 33 (4). - P. 276-280].
В ряде работ отмечается участие микроРНК-339 при раке легких в качестве ингибитора пролиферации клеток [MicroRNA-339 inhibits human hepatocellular carcinoma proliferation and invasion via targeting ZNF689 / Hui Zeng, Jiaping Zheng, Song Wen et al. // Drug Des Devel Ther. - 2019. Vol. 13. - P. 435-445.].A number of studies have noted the participation of microRNA-339 in lung cancer as an inhibitor of cell proliferation [MicroRNA-339 inhibits human hepatocellular carcinoma proliferation and invasion via targeting ZNF689 / Hui Zeng, Jiaping Zheng, Song Wen et al. // Drug Des Devel Ther. - 2019. Vol. 13. - P. 435-445.].
Одним из новых профиброгенных биомаркеров является галектин-3, относящийся к семейству лектинов и играющий важную роль в регуляции процессов воспаления, иммунного ответа, дегенерации нервной ткани и фиброза. Через активацию фибробластов, прежде находящихся в покое, галектин-3 секретируется в поврежденном участке и способствует фиброзированию ткани.One of the new profibrogenic biomarkers is galectin-3, which belongs to the lectin family and plays an important role in the regulation of inflammation, immune response, nerve tissue degeneration, and fibrosis. Through the activation of fibroblasts, previously at rest, galectin-3 is secreted in the damaged area and promotes tissue fibrosis.
Галектин-3 может иметь прогностическое значение в отношении развития идиопатического легочного фиброза и структурных изменений дыхательных путей. Отмечается повышение концентрации галектина-3 в плазме крови пациентов на ранних доклинических стадиях фиброза и ассоциировано со снижением показателей функции легких и нарушениями газообмена [Galectin-3 is associated with restrictive lung disease and interstitial lung abnormalities / Jennifer E. Ho, Wei Gao., Daniel Levy et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2016. - 194 (1): 77-83].Galectin-3 may have prognostic value in relation to the development of idiopathic pulmonary fibrosis and structural changes in the airways. There is an increase in the concentration of galectin-3 in the blood plasma of patients in the early preclinical stages of fibrosis and is associated with a decrease in lung function and impaired gas exchange [Galectin-3 is associated with restrictive lung disease and interstitial lung abnormalities / Jennifer E. Ho, Wei Gao., Daniel Levy et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2016. - 194 (1): 77-83].
Галектин-3 выступает в качестве перспективного биомаркера модуляции ремоделирования дыхательных путей при заболеваниях бронхолегочной системы. У пациентов с тяжелой формой бронхиальной астмы в образцах бронхиальной биопсии выявлена связь между уровнем галектина-3 и изменением толщины ретикулярного слоя базальной мембраны, являющейся объективным отражением тяжести заболевания [Galectin-3: an early predictive biomarker of modulation of airway remodeling in patients with severe asthma treated with omalizumab for 36 months / Riccio A.M., Mauri P., De Ferrari L. et al. // Clin Transl Allergy. - 2017. - 7: 6].Galectin-3 is a promising biomarker for modulating airway remodeling in diseases of the bronchopulmonary system. In patients with severe bronchial asthma in bronchial biopsy samples, a relationship was found between the level of galectin-3 and changes in the thickness of the reticular layer of the basement membrane, which is an objective reflection of the severity of the disease [Galectin-3: an early predictive biomarker of modulation of airway remodeling in patients with severe asthma treated with omalizumab for 36 months / Riccio AM, Mauri P., De Ferrari L. et al. // Clin Transl Allergy. - 2017. - 7: 6].
На сегодняшний день объективными методами верификации степени и характера структурных изменений дыхательных путей легочного трансплантата являются трансбронхиальная биопсия и рутинные методы рентгенологической и эндоскопической визуализации [Early identification of chronic lung allograft dysfunction: the need of biomarkers / Tissot A., Danger R., Claustre J., Magnan A. and Brouard S. // Front. Immunol. - 2019. - 10:1681] - (прототип). Мультиспиральная компьютерная томография является одним из самых эффективных неинвазивных методов диагностики обструктивных процессов бронхолегочной системы, однако будучи разновидностью рентгенологических исследований, имеет ряд противопоказаний и ограничений в применении. Методика выполнения видеобронхоскопии и трансбронхиальной биопсии отличается инвазивностью, что становится существенным недостатком данных видов исследований.To date, the objective methods for verifying the degree and nature of structural changes in the airways of a lung transplant are transbronchial biopsy and routine methods of X-ray and endoscopic imaging [Early identification of chronic lung allograft dysfunction: the need of biomarkers / Tissot A., Danger R., Claustre J. , Magnan A. and Brouard S. // Front. Immunol. - 2019. - 10: 1681] - (prototype). Multispiral computed tomography is one of the most effective non-invasive methods for diagnosing obstructive processes of the bronchopulmonary system, however, being a type of X-ray examination, it has a number of contraindications and limitations in its use. The technique of performing video bronchoscopy and transbronchial biopsy is invasive, which becomes a significant disadvantage of these types of studies.
Трансбронхиальная биопсия выполняется в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированных легких. Однако трансбронхиальная биопсия имеет ряд ограничений и рисков, характерных для инвазивных методов диагностики. Получение биоптата подразумевает исследование локального участка трансплантата, что не гарантирует исчерпывающей характеристики состояния всего органа [Characteristic patterns in the fibrotic lung. Comparing idiopathic pulmonary fibrosis with chronic lung allograft dysfunction / Fernandez I. E., Heinzelmann K., Verleden S., Eickelberg O. // Ann Am Thorac Soc. - 2015. - №12. - Vol. S1. - P. 34-41]. Трудоемкость реализации и высокий риск осложнений при применении данного метода подтверждаются многочисленными публикациями как отечественных, так и зарубежных исследователей.Transbronchial biopsy is performed within the time period after transplantation, as stipulated by the protocol, as well as when signs of impaired function of the transplanted lungs appear. However, transbronchial biopsy has a number of limitations and risks associated with invasive diagnostic methods. Obtaining a biopsy implies a study of the local area of the graft, which does not guarantee a comprehensive characterization of the state of the entire organ [Characteristic patterns in the fibrotic lung. Comparing idiopathic pulmonary fibrosis with chronic lung allograft dysfunction / Fernandez I. E., Heinzelmann K., Verleden S., Eickelberg O. // Ann Am Thorac Soc. - 2015. - No. 12. - Vol. S1. - P. 34-41]. The complexity of implementation and the high risk of complications when using this method are confirmed by numerous publications of both domestic and foreign researchers.
Очевидна необходимость разработки новых неинвазивных диагностических технологий, позволяющих не только выявить наличие обструктивных изменений бронхов у реципиентов после трансплантации легких, но и осуществлять мониторинг и раннюю диагностику развития обструктивных процессов с возможностью эффективной коррекции.There is an obvious need to develop new non-invasive diagnostic technologies that allow not only to reveal the presence of obstructive changes in the bronchi in recipients after lung transplantation, but also to monitor and early diagnose the development of obstructive processes with the possibility of effective correction.
Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики обструктивных процессов в бронхиальных путях у реципиентов после трансплантации легких.We have set the task of developing an affordable, reliable method for non-invasive diagnosis of obstructive processes in the bronchial tract in recipients after lung transplantation.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении неинвазивности диагностики, снижении ее трудоемкости и времени проведения, доступности ранней диагностики развития обструктивных процессов бронхов у реципиентов трансплантированных легких при одновременном достижении эффективной диагностики бронхиальных осложнений у данного контингента пациентов, а также повышении ее объективности за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние всего трансплантата.The technical result achieved by the implementation of the invention is to ensure non-invasive diagnosis, reduce its labor intensity and time, the availability of early diagnosis of the development of bronchial obstructive processes in recipients of transplanted lungs while achieving an effective diagnosis of bronchial complications in this contingent of patients, as well as increasing its objectivity for account of the possibility of making a judgment, taking into account the indicator reflecting the condition of the entire graft.
Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированными легкими и улучшить результаты трансплантации за счет своевременного определения показаний к выполнению трансбронхиальной биопсии и коррекции терапии путем определения уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 в плазме венозной крови.The proposed method allows to increase the survival rate of patients with transplanted lungs and improve the results of transplantation due to the timely determination of indications for performing transbronchial biopsy and correction of therapy by determining the expression level of microRNA-339 and the concentration of galectin-3 in the venous blood plasma.
Нами эмпирически установлен диагностически эффективный показатель развития обструктивных изменений бронхов легочного трансплантата, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 в плазме венозной крови реципиента трансплантированных легких.We have empirically established a diagnostically effective indicator of the development of obstructive changes in the bronchi of a lung transplant, based on an assessment of the expression level of microRNA-339 and the concentration of galectin-3 in the venous blood plasma of the recipient of the transplanted lungs.
Использование предполагаемого теста позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение инвазивных методов трансбронхиальной биопсии для уточнения диагноза обструктивных изменений трансплантированных легких.The use of the proposed test makes it possible to limit the number of patients who require invasive methods of transbronchial biopsy to clarify the diagnosis of obstructive changes in transplanted lungs.
Сущность изобретения состоит в следующем.The essence of the invention is as follows.
Для диагностики обструкции бронха у реципиента трансплантированного легкого/легких определяют в плазме его венозной крови уровень концентрации галектина-3 и экспрессии микроРНК-339 по формулеTo diagnose bronchial obstruction in a recipient of a transplanted lung / lungs, the level of galectin-3 concentration and expression of microRNA-339 is determined in the plasma of his venous blood according to the formula
Э=2-(Ct1-Ct2),E = 2 - (Ct1-Ct2) ,
гдеWhere
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,E - expression level of microRNA-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339,Ct1 is the value of the threshold PCR cycle for the microRNA-339 sample,
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.Ct2 is the PCR cycle threshold value for the internal control represented by Cel-miR-39.
При и концентрации галектина-3 более 11,7 нг/мл и величине Э более 0,02 диагностируют наличие обструкции бронха легочного трансплантата.When the concentration of galectin-3 is more than 11.7 ng / ml and the value of E is more than 0.02, the presence of obstruction of the bronchus of a pulmonary transplant is diagnosed.
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
В качестве материала для исследования концентрации/уровня экспрессии биомаркера используется плазма венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.Venous blood plasma is used as a material for studying the concentration / expression level of the biomarker. As a rule, blood sampling for research is carried out simultaneously with the routine examination of patients.
Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.Blood is collected in disposable tubes with EDTA anticoagulant (BD Vacutainer, Becton Dickinson, USA) and centrifuged for 10 minutes at 3500/1500 g rpm at room temperature. The resulting plasma is frozen and stored at -20 ° C.
Определение уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 проводят с использованием реагентики, входящей в состав наборов и в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией.Determination of the expression level of microRNA-339 and the concentration of galectin-3 is carried out using the reagent included in the kits and in accordance with the instructions attached to them.
Уровень экспрессии микроРНК-339 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).The expression level of microRNA-339 is determined by the polymerase chain reaction method, for example, using SerumPlasma reagent kits (Qiagen, USA).
РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляют 1,6×108 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.RNA is isolated from 100 μl of blood plasma using SerumPlasma kits (Qiagen, USA). After incubation of plasma with phenolic mixture of Qiazol, 1.6 × 10 8 copies of synthetic microRNA Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) are added as an internal control of RNA extraction.
Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируют путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°С с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.Isolated samples with total RNA are converted by carrying out a reverse transcription reaction into cDNA: at t ° = 37 ° C for 60 minutes, followed by incubation at 95 ° C for 5 minutes, cooling on ice and bringing the sample volume to 200 μL with deionized water. Further, to identify the microRNAs under study, polymerase chain reaction (PCR) with real-time detection is performed. PCR reaction conditions: 15 minutes at t ° = 95 ° C, followed by 40 cycles of 15 seconds at t ° = 94 ° C, 30 seconds at t ° = 55 ° C and 30 seconds at t ° = 70 ° C in an amplifier ...
Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн. ед.) и рассчитывают по формулеThe value of the expression level of microRNA of the studied samples of venous blood plasma is expressed in relative units (rel.units) and calculated by the formula
Э=2-(Ct1-Ct2),E = 2 - (Ct1-Ct2) ,
гдеWhere
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,E - expression level of microRNA-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339 (то есть значение порогового цикла микроРНК-339 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),Ct1 - value of the threshold cycle of PCR for a sample of microRNA-339 (that is, the value of the threshold cycle of microRNA-339 on a nucleic acid analyzer or amplifier),
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).Ct2 is the threshold value of the PCR cycle for the internal control represented by Cel-miR-39 (i.e., the threshold value for the internal control represented by Cel-miR-39 on a nucleic acid analyzer or amplifier).
Концентрация галектина-3 может быть измерена иммуноферментным методом, например, с помощью наборов реагентов Human Galectin-3 Platinum ELISA (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria).The concentration of galectin-3 can be measured by enzyme immunoassay, for example, using Human Galectin-3 Platinum ELISA reagent kits (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria).
Определение проводят с использованием реагентики, входящей в состав наборов и в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией. В подготовленные для работы планшеты с фиксированными на дне лунок моноклональными антителами к галектину-3, добавляют заранее подготовленные калибраторы, контроли и разведенные в 2 раза буфером образцы плазмы венозной крови пациентов. Инкубируют микропланшет при комнатной температуре (18-25°С) в течение 60 минут при встряхивании в термо-шейкере со скоростью 400 оборотов в минуту. После четырехкратного отмывания планшета от несвязавшихся компонентов реакции в каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (стрептавидин-HRP). Инкубируют планшет при комнатной температуре (18-25°С) в течение 60 минут при встряхивании со скоростью 400 оборотов в минуту.The determination is carried out using the reagent included in the kits and in accordance with the instructions attached to them. Prepared for work plates with monoclonal antibodies to galectin-3 fixed at the bottom of the wells are supplemented with previously prepared calibrators, controls and samples of venous blood plasma diluted in 2 times with buffer. Incubate the microplate at room temperature (18-25 ° C) for 60 minutes with shaking in a thermo-shaker at 400 rpm. After four times washing the plate from unbound reaction components, 100 μl of the working solution of the conjugate (streptavidin-HRP) is added to each well. Incubate the plate at room temperature (18-25 ° C) for 60 minutes with shaking at 400 rpm.
Для выявления ферментной метки в планшет вносят по 100 мкл субстрата, предварительно отмыв 4-х кратно планшет. Время инкубации составляет 30 минут в темноте. Реакцию останавливают с помощью стоп-реагента, также предусмотренного производителем набора (по 100 мкл в лунку). Интенсивность изменения цвета реагентной смеси прямо коррелирует с концентрацией галектина-3 в исследуемом образце. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм.To identify the enzyme label, add 100 μl of the substrate to the plate, having previously washed the plate 4 times. The incubation time is 30 minutes in the dark. The reaction is stopped using a stop reagent also provided by the kit manufacturer (100 μl per well). The intensity of the color change in the reagent mixture directly correlates with the concentration of galectin-3 in the test sample. Optical density is measured on a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.
У реципиентов легких с величиной экспрессии микроРНК-339 Э выше 0,02 отн. ед. и концентрацией галектина-3 выше 11,7 нг/мл в плазме венозной крови определяют наличие обструкции бронха/бронхов после трансплантации.In lung recipients with an expression value of microRNA-339 E higher than 0.02 rel. units and a concentration of galectin-3 above 11.7 ng / ml in venous blood plasma determine the presence of bronchial / bronchial obstruction after transplantation.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.To prove the possibility of realizing the declared purpose and achieving the specified technical result, we present the following data.
Пример 1Example 1
Пациенту Б., 45 лет, выполнена последовательная двусторонняя трансплантация легких. Послеоперационный период протекал гладко. Измеренный на 441 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови составил 0,46 отн. ед., концентрация галектина-3 составила 25,8 нг/мл. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие обструкции бронхов трансплантированных легких. Методом видеобронхоскопии был выявлен рубцовый стеноз нижнедолевого бронха левого легкого. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.Patient B., 45 years old, underwent sequential bilateral lung transplantation. The postoperative period was uneventful. The level of microRNA-339 expression in venous blood plasma measured on day 441 after surgery was 0.46 rel. units, the concentration of galectin-3 was 25.8 ng / ml. In accordance with the proposed method, the patient was diagnosed with the development of bronchial obstruction of the transplanted lungs. Video bronchoscopy revealed cicatricial stenosis of the lower lobe bronchus of the left lung. Correction of immunosuppressive therapy was carried out, treatment was prescribed according to indications.
Пример 2Example 2
Пациенту М., 56 лет, выполнена последовательная двусторонняя трансплантация легких. В течение периода наблюдения (с первых суток и до 1,5 года после трансплантации) послеоперационный период протекал без осложнений. Измеренный на 273 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме крови составил 0,004 отн. ед., концентрация галектина-3 составила 1,66 нг/мл. По результатам рентгенографического исследования органов грудной клетки признаков обструкции бронхов трансплантата не выявлено.Patient M., 56 years old, underwent sequential bilateral lung transplantation. During the observation period (from the first day to 1.5 years after transplantation), the postoperative period was uneventful. The level of microRNA-339 expression in blood plasma measured on day 273 after surgery was 0.004 rel. units, the concentration of galectin-3 was 1.66 ng / ml. According to the results of X-ray examination of the chest organs, there were no signs of bronchial obstruction of the transplant.
Предложенный способ апробирован в клинической практике на 17 реципиентах легких. Величина экспрессии микроРНК-339 после трансплантации выше установленного нами порогового значения - 0,02 отн. ед. и концентрации галектина-3 более 11,7 нг/мл установлена у 6 реципиентов легких, у 5 (83,3%) из них развились бронхиальные осложнения после трансплантации, связанные с обструкцией бронха, что подтверждено результатами рентгенологического, эндоскопического и функциональных исследований. Чувствительность предлагаемого способа диагностики составила 83,3%, его специфичность - 81,8%. Диагностическая эффективность разработанного способа составила 82,4%.The proposed method has been tested in clinical practice in 17 lung recipients. The expression value of microRNA-339 after transplantation is higher than the threshold value established by us - 0.02 rel. units and galectin-3 concentration of more than 11.7 ng / ml was found in 6 lung recipients, 5 (83.3%) of them developed bronchial complications after transplantation associated with bronchial obstruction, which was confirmed by the results of X-ray, endoscopic and functional studies. The sensitivity of the proposed diagnostic method was 83.3%, its specificity was 81.8%. The diagnostic efficiency of the developed method was 82.4%.
Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность у реципиентов трансплантированных легких диагностировать течение обструктивных процессов в бронхах, приводящих к дисфункции легочного трансплантата.The use of the patented method in clinical practice makes it possible for transplanted lung recipients to diagnose the course of obstructive processes in the bronchi, leading to dysfunction of the lung transplant.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139199A RU2750973C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139199A RU2750973C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2750973C1 true RU2750973C1 (en) | 2021-07-07 |
Family
ID=76755940
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020139199A RU2750973C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2750973C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759048C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-11-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient |
| RU2760195C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-11-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2255654C2 (en) * | 2002-04-01 | 2005-07-10 | Николаев Эдуард Константинович | Method for diagnosing the cases of airways potency disorders (obstruction) during artificial lung ventilation applied to bronchial asthma and other bronchopulmonary diseases |
| RU2004138916A (en) * | 2004-12-30 | 2006-06-10 | Лариса Александровна Степанищева (RU) | METHOD FOR EARLY NON-INVASIVE DIAGNOSTICS OF BRONCH REMODELING PROCESSES IN CHRONIC OBSTRUCTION OF LUNG BRONCH (COPD) |
| WO2011119185A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Methods of inhibiting inflammation and inflammatory diseases using gal-3bp (btbd17b, lgals3bp, galectin-3 binding protein, mac-2 binding protein) |
| RU2733866C1 (en) * | 2020-02-03 | 2020-10-07 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Нижегородский Научно-Исследовательский Институт Гигиены И Профпатологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека (Фбун "Нниигп" Роспотребнадзора) | Method for determining clinical course of chronic occupational bronchitis |
-
2020
- 2020-11-30 RU RU2020139199A patent/RU2750973C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2255654C2 (en) * | 2002-04-01 | 2005-07-10 | Николаев Эдуард Константинович | Method for diagnosing the cases of airways potency disorders (obstruction) during artificial lung ventilation applied to bronchial asthma and other bronchopulmonary diseases |
| RU2004138916A (en) * | 2004-12-30 | 2006-06-10 | Лариса Александровна Степанищева (RU) | METHOD FOR EARLY NON-INVASIVE DIAGNOSTICS OF BRONCH REMODELING PROCESSES IN CHRONIC OBSTRUCTION OF LUNG BRONCH (COPD) |
| WO2011119185A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Methods of inhibiting inflammation and inflammatory diseases using gal-3bp (btbd17b, lgals3bp, galectin-3 binding protein, mac-2 binding protein) |
| RU2733866C1 (en) * | 2020-02-03 | 2020-10-07 | Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Нижегородский Научно-Исследовательский Институт Гигиены И Профпатологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека (Фбун "Нниигп" Роспотребнадзора) | Method for determining clinical course of chronic occupational bronchitis |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MEHI SJ et al. MicroRNA-339 and microRNA-556 regulate Klotho expression in vitro. Age (Dordr). 2014 Feb; 36 (1): 141-9.doi: 10.1007 / s11357-013-9555-6. Epub 2013 Jul 2. * |
| O. P. SHEVCHENKO et al. Features of the microRNA expression profile in potential lung recipients. BULLETIN OF TRANSPLANTOLOGY AND ARTIFICIAL ORGANS. volume XXI, No 3-2019. * |
| ШЕВЧЕНКО О.П. и др. Особенности профиля экспрессии микроРНК у потенциальных реципиентов легких. ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ. том XXI, No 3-2019. MEHI S.J. et al. MicroRNA-339 and microRNA-556 regulate Klotho expression in vitro. Age (Dordr). 2014 Feb;36(1):141-9.doi: 10.1007/s11357-013-9555-6. Epub 2013 Jul 2. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2759048C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-11-09 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient |
| RU2760195C1 (en) * | 2020-11-30 | 2021-11-22 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111500710B (en) | Use of circRNA730 as biomarker for the prediction, diagnosis or prognosis of sepsis | |
| RU2750973C1 (en) | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipients | |
| Hwang et al. | Urinary periostin excretion predicts renal outcome in IgA nephropathy | |
| Tay et al. | Serum myeloperoxidase levels in predicting the severity of stroke and mortality in acute ischemic stroke patients | |
| Górska et al. | Comparative study of periostin expression in different respiratory samples in patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease | |
| CN114752669A (en) | Application of circular RNA in preparation of stroke diagnosis product | |
| Shevchenko et al. | MiR‐339 and galectin‐3: diagnostic value in patients with airway obstruction after lung transplantation | |
| RU2759048C1 (en) | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient | |
| RU2760195C1 (en) | Method for diagnosing bronchial obstruction in lung transplant recipient | |
| RU2758993C1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of myocardial fibrosis in transplanted heart | |
| RU2761470C1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of myocardial fibrosis in donor heart recipients | |
| RU2772054C1 (en) | Method for noninvasive diagnosis of myocardial fibrosis of cardiac allograft | |
| RU2760093C1 (en) | Method for non-invasive diagnosis of myocardial fibrosis in cardiac transplant recipients | |
| Gao et al. | Differential miR-195-5p and its potential role during the development of carotid artery stenosis | |
| CN112557664B (en) | Application and detection kit of CRYAB in the detection of acute kidney injury | |
| RU2841552C1 (en) | Method for prediction of remote result of kidney transplantation | |
| RU2733866C1 (en) | Method for determining clinical course of chronic occupational bronchitis | |
| WO2011064324A1 (en) | Method of diagnosis of fibrotic diseases | |
| RU2758973C1 (en) | Method for diagnosing acute rejection of transplant in transplanted heart recipient | |
| RU2798948C1 (en) | Method for preoperative prediction of acute cellular rejection of a transplanted heart | |
| Mao et al. | Associations of serum expressions of miR-499 and sex determining region Y-box 6 with prognosis of acute myocardial infarction patients | |
| RU2778269C1 (en) | Method for diagnosing the risk of exacerbation of chronic inflammatory bronchopulmonary process in children with congenital lung malformations | |
| RU2761732C1 (en) | Method for differential diagnostics of uremic pseudoperitonitis and peritonitis in patients receiving renal replacement therapy - program hemodialysis | |
| RU2761733C1 (en) | Method for differential diagnostics of uremic pancreatitis and destructive pancreatitis in patients receiving renal replacement therapy - program hemodialysis | |
| CN113514643A (en) | Splicing-related protein 130 for diagnosis and disease severity assessment in idiopathic pulmonary fibrosis |