RU2749741C1 - Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека - Google Patents
Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2749741C1 RU2749741C1 RU2020140951A RU2020140951A RU2749741C1 RU 2749741 C1 RU2749741 C1 RU 2749741C1 RU 2020140951 A RU2020140951 A RU 2020140951A RU 2020140951 A RU2020140951 A RU 2020140951A RU 2749741 C1 RU2749741 C1 RU 2749741C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- genome
- protein
- interest
- sgrna
- Prior art date
Links
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 6
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 21
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 101001000998 Homo sapiens Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Proteins 0.000 description 6
- 102100035620 Protein phosphatase 1 regulatory subunit 12C Human genes 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 108050008316 DNA endonuclease RBBP8 Proteins 0.000 description 5
- 102100039524 DNA endonuclease RBBP8 Human genes 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000012361 double-strand break repair Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000746134 Homo sapiens DNA endonuclease RBBP8 Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000709749 Pseudomonas phage PP7 Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 101150088049 dna2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рибонуклеопротеиновому комплексу для редактирования генома человека путем вставки в него интересующей последовательности, который включает белок spCas9, связанный с sgRNA-PP7, кодируемой последовательностью, которая связана с эффекторным химерным белком. Изобретение эффективно при моделировании генетических заболеваний человека на клеточных системах. 4 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к генной инженерии. Данная система может быть использована в фундаментальных исследованиях клеточной биологии, а также при моделировании генетических заболеваний человека на клеточных системах.
Основным методом бесшовного внесения интересующей ДНК-последовательности в клеточный геном является метод направленной гомологичной рекомбинации [Capecchi М.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92]. В данном методе используются донорные конструкции, содержащие выбранную для вставки ДНК последовательность между плечами гомологии - последовательностями, которые идентичны участкам, фланкирующим участок генома, в который будет проводиться вставка. Такая методика позволяет проводить очень точные модификации, но с низкой частотой: успешное встраивание последовательности в геном происходит в одной из 105-107 клеток [Capecchi Μ.R. Altering the genome by homologous recombination. // Science. 1989. T. 244. №4910. C. 1288-92]. Внесение двунитевого разрыва в выбранный для редактирования участок генома увеличивает эффективность вставки конструкции с плечами гомологии на несколько порядков [Bibikova Μ., Carroll D., Segal D.J., Trautman J.K., Smith J., Kim Y.-G., Chandrasegaran S. Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases // Mol. Cell. Biol. 2001. T. 21. №1. C. 289-297.; Plessis Α., Perrin Α., Haber J.E., Dujon B. Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus // Genetics. 1992. T. 130. №3. C. 451-460.; Rouet P., Smih F., Jasin M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. // Mol. Cell. Biol. 1994. T. 14. №12. C. 8096-106.; Rudin N., Sugarman E., Haber J.E. Genetic and physical analysis of double-strand break repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. // Genetics. 1989. T. 122. №3. C. 519-34].
В связи с этим было разработано множество специфичных ДНК-связывающих белков для внесения двунитевых разрывов в геном. Из них доминирующую роль на данный момент занимает система CRISPR-Cas9, специфичность которой задается короткой последовательностью гидовой РНК (sgRNA) [Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.-S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease // Nat. Biotechnol. 2013. T. 31. №3. C. 230-232.; Cong L., Ran F.Α., Cox D., Lin S., Barretto R., Habib N., Hsu P.D., Wu X., Jiang W., Marraffini L.Α., Zhang F. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems // Science. 2013. T. 339. №6121. C. 819.; Jinek M., East Α., Cheng Α., Lin S., Ma E., Doudna J. RNA-programmed genome editing in human cells // Elife. 2013. T. 2. С.e00471].
Репарация внесенного эндонуклеазой двунитевого разрыва ДНК может проходить несколькими путями. Среди них путь гомологичной репарации может привести к встраиванию интересующей последовательности ДНК в геном, так как в этом пути в качестве матрицы может использоваться внесенная в клетку донорная ДНК.
Одним из способов повышения эффективности вставки интересующей последовательности в геном является увеличение вероятности прохождения репарации двуцепочечного разрыва по пути гомологичной репарации. Для этого можно использовать искусственные системы, привлекающие к области ДНК разрыва белки, благоприятствующие гомологичной репарации.
Среди белков, принимающих участие на ранних этапах гомологичной репарации, особый интерес вызывает CtIP белок, который связывает концевые участки ДНК и активирует резекцию 5' концов, взаимодействуя с MRN комплексом и Exol/Dna2 нуклеазами [Yeh С.D., Richardson С.D., Corn J.E. Advances in genome editing through control of DNA repair pathways // Nat. Cell Biol. 2019. T. 21. №12. C. 1468-1478].
Было показано, что использование spCas9 белка, связанного через короткий линкер с эффекторным CtIP белком, может повышать эффективность встраивания интересующей последовательности в два раза [Charpentier Μ., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet Κ., Dardillac Ε., Boix С, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier J. M., Anegon I., Lopez В., Giovannangeli C., Concordet J. P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. №1. C. 1-11]. Однако повышение эффективности в такой системе значительно зависит от выбранного для редактирования участка ДНК и может полностью пропадать для некоторых вариантов sgRNA [Charpentier Μ., Khedher Α.Η.Υ., Menoret S., Brion Α., Lamribet K., Dardillac Ε., Boix С, Perrouault L., Tesson L., Geny S., Cian A. De, Itier J.M., Anegon I., Lopez В., Giovannangeli C., Concordet J.P. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nat. Commun. 2018. T. 9. №1. С.1-11]. Разработка новой, более стабильной и эффективной системы позволяет расширить возможности применения геномного редактирования.
На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих наиболее близких аналогах.
Известна система редактирования генома, использующая сшивку CtIP белка через короткий линкер с Cas9 белком (WO 2018162702, А1). Однако она показала ограниченную эффективность на клетках млекопитающих, что может объясняться конформационными ограничениями, которые накладывает прямая сшивка белков.
В качестве прототипа нами выбрана система, предполагающая привлечение эффекторных белков репарации с помощью MS2 системы адаптеров [Tran N.-T., Bashir S., Li X., Rossius J., Chu V.Т., Rajewsky K., 
R. Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors // Front. Genet. 2019. T. 10. C. 2-5].
Использование MS2 адаптеров для привлечения белков увеличивает эффективность вставки интересующей последовательности, однако ограничивает применение этой системы клеточными линиями, в которых не используются широко применяемые MS2 адаптеры.
Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является расширение арсенала средств для увеличения эффективности вставки целевых конструкций в геном человека.
Технический результат заключается в расширении арсенала средств для увеличения эффективности вставки целевых конструкций в геном человека.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Предложен рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека, исключая клетки зародышевой линии человека, путем вставки в него интересующей последовательности, включающий белок spCas9, связанный с sgRNA-PP7, кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 1, которая связана с эффекторным химерным белком, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2.
Разработанный рибонуклеопротеиновый комплекс может быть доставлен в клетку с помощью трансфекции или электропорации в виде двух векторов.
В нашей работе последовательность химерного эффекторного белка (SEQ ID NO: 2) была получена за счет сшивки последовательности белка РСР - белка адаптерной системы, полученной из бактериофага РР7 (123 а.о.), через линкер с NLS последовательностью для локализации белка в ядре (34 а.о.), с последовательностью гена человеческого CtIP белка (897 а.о.). Для облегчения считывания успешной экспрессии химерного эффекторного белка к его концу через Р2А-Т2А разрезающиеся последовательности был добавлен репортерный красный флуоресцентный белок mRuby. Эта конструкция была клонирована в pCS2+ вектор по сайтам рестрикции BamHI/XbaI. Карта вектора, несущего последовательность химерного эффекторного белка, представлена на фиг.1.
Конструкция, несущая sgRNA-PP7 последовательность (SEQ ID NO: 1), которая была получена внесением двух РР7 шпилек в последовательность sgRNA, под U6 промотором, была клонирована в lentiCRISPR v2 вектор по сайтам рестрикции KpnI/NheI. Карта бицистронного вектора, несущего последовательность spCas9 белка и последовательность sgRNA-PP7 представлена на фиг.2.
Для изменения места вставки интересующей последовательности в геном, целевой участок sgRNA из первых 20 нуклеотидов может быть клонирован в вектор по сайтам рестрикции BsmBI. Последовательность целевой части sgRNA может быть получена отжигом двух олигонуклеотидов. При дизайне олигонуклеотидов для отжига следует использовать 20 нуклеотидов непосредственно перед РАМ участком в выбранном для вставки месте в геноме. При отсутствии G нуклеотида в начале целевой последовательности, этот нуклеотид нужно внести перед целевой частью sgRNA для успешной транскрипции с U6 промотора. Для клонирования по BsmBI сайтам к олигонуклеотиду прямой направленности следует добавить САСС последовательность и к олигонуклеотиду обратной направленности -АААС последовательность.
Для успешного проведения вставки в геном требуется донорный вектор, несущий интересующую последовательностью. В качестве донора использовали конструкцию, несущую левое плечо гомологии к AAVS1 локусу (804 п.н.), SA сигнал акцептора сплайсинга, Т2А разрезающуюся последовательность, флуоресцентный зеленый EGFP белок (239 а.о.), сигнал полиаденилирования bGH poly(A) и правое плечо гомологии к AAVS1 локусу (804 п.н.). Эта конструкция была клонирована в pQE30 вектор по сайтам рестрикции XhoI/XbaI. Карта вектора, несущего донорную последовательность EGFP к AAVS1 локусу, представлена на фиг.3.
При изменении места вставки интересующей последовательности в геном плечи гомологии должны быть подобраны так, чтобы совпадать с последовательностями, окружающими место для вставки. При этом рекомендуется выбирать плечи гомологии так, чтобы участок генома, попадающий в область вставки между плечами гомологии, не превышал 100 п.н., в идеале не превышал 10 п.н. Плечи гомологии не должны содержать целевой последовательности sgRNA или не должны содержать РАМ участка после него. При изменении последовательности, выбранной для встраивания в геном, она должна быть помещена в донорный вектор на место EGFP последовательности.
В качестве примера использовали комплекс для проведения вставки EGFP гена в AAVS1 локус клеточной линии HEK293T. В качестве целевой последовательности был выбран TGTCCCTAGTGGCCCCACTG участок AAVS1 локуса. Для проверки эффективности комплекс был использован в сравнении с существующей MS2 системой адаптеров. Векторы, кодирующие комплексы и донорный вектор, несущий последовательность EGFP, были доставлены в клетку методом электропорации. После электропорации клетки проходили отбор пуромицином в течении трех дней. На четвертый день клетки подвергались анализу на проточном цитофлуориметре. Результаты проточной цитофлуориметрии редактируемых клеток представлены на фиг.4 и в таблице.
R2 областью обозначены EGFP/mRuby положительные клетки, которые прошли геномную вставку EGFP последовательности в AAVS1 локус и содержат химерный эффекторный белок. R3 областью обозначены mRuby положительные клетки, которые не прошли геномную вставку и содержат химерный эффекторный белок. Эффективность вставки рассчитывалась как отношение количества клеток в области R2 к общему количеству клеток в областях R2 и R3.
Клетки, успешно получившие компоненты предлагаемой системы, встраивают интересующую последовательность в клеточный геном, что может быть использовано для моделирования наследственных заболеваний.
Отдельно стоит отметить, что увеличенная эффективность встраивания интересующей последовательности в геном позволит с большей легкостью изучать модели полигенетических заболеваний, вызванных изменениями в нескольких генах, среди которых различные формы диабета, рака и болезней сердца.
Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека, не предполагает использование человеческих эмбрионов.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования «Российский национальный исследовательский
медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (Federalnoe gosudarstvennoe autonomnoe obrazovatelnoe
uchrezhdenie vysshego obrazovaniya «Rossijskij natsionalnyj issledovatelskij
meditsinskij universitet imeni N.I. Pirogova» Ministerstva zdravookhraneniya
Rossijskoj Federatsii)
<120> Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека
<160> 2
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 165
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность, кодирующая sgRNA-PP7
<400> 1
caccggagac gggataccgt ctctgtttta gagctaggcc taaggagttt atatggaaac 60
ccttaggcct agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcct aaggagttta 120
tatggaaacc cttaggccaa gtggcaccga gtcggtgctt ttttt 165
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 3162
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Последовательность, кодирующая химерный эффекторный белок
<400> 2
atgggttcca aaaccatcgt tctttcggtc ggcgaggcta ctcgcactct gactgagatc 60
cagtccaccg cagaccgtca gatcttcgaa gagaaggtcg ggcctctggt gggtcggctg 120
cgcctcacgg cttcgctccg tcaaaacgga gccaagaccg cgtatcgcgt caacctaaaa 180
ctggatcagg cggacgtcgt tgattccgga cttccgaaag tgcgctacac tcaggtatgg 240
tcgcacgacg tgacaatcgt tgcgaatagc accgaggcct cgcgcaaatc gttgtacgat 300
ttgaccaagt ccctcgtcgc gacctcgcag gtcgaagatc ttgtcgtcaa ccttgtgccg 360
ctgggccgtc gtctcctggc aagcgctgga ggaggtggaa gcggaggagg aggaagcgga 420
ggaggaggta gcggacctaa gaaaaagagg aaggtggctg ctgctaccgg tatgaacatc 480
tcgggaagca gctgtggaag ccctaactct gcagatacat ctagtgactt taaggacctt 540
tggacaaaac taaaagaatg tcatgataga gaagtacaag gtttacaagt aaaagtaacc 600
aagctaaaac aggaacgaat cttagatgca caaagactag aagaattctt caccaaaaat 660
caacagctga gggaacagca gaaagtcctt catgaaacca ttaaagtttt agaagatcgg 720
ttaagagcag gcttatgtga tcgctgtgca gtaactgaag aacatatgcg gaaaaaacag 780
caagagtttg aaaatatccg gcagcagaat cttaaactta ttacagaact tatgaatgaa 840
aggaatactc tacaggaaga aaataaaaag ctttctgaac aactccagca gaaaattgag 900
aatgatcaac agcatcaagc agctgagctt gaatgtgagg aagacgttat tccagattca 960
ccgataacag ccttctcatt ttctggcgtt aaccggctac gaagaaagga gaacccccat 1020
gtccgataca tagaacaaac acatactaaa ttggagcact ctgtgtgtgc aaatgaaatg 1080
agaaaagttt ccaagtcttc aactcatcca caacataatc ctaatgaaaa tgaaattcta 1140
gtagctgaca cttatgacca aagtcaatct ccaatggcca aagcacatgg aacaagcagc 1200
tatacccctg ataagtcatc ttttaattta gctacagttg ttgctgaaac acttggactt 1260
ggtgttcaag aagaatctga aactcaaggt cccatgagcc cccttggtga tgagctctac 1320
cactgtctgg aaggaaatca caagaaacag ccttttgagg aatctacaag aaatactgaa 1380
gatagtttaa gattttcaga ttctacttca aagactcctc ctcaagaaga attacctact 1440
cgagtgtcat ctcctgtatt tggagctacc tctagtatca aaagtggttt agatttgaat 1500
acaagtttgt ccccttctct tttacagcct gggaaaaaaa aacatctgaa aacactccct 1560
tttagcaaca cttgtatatc tagattagaa aaaactagat caaaatctga agatagtgcc 1620
cttttcacac atcacagtct tgggtctgaa gtgaacaaga tcattatcca gtcatctaat 1680
aaacagatac ttataaataa aaatataagt gaatccctag gtgaacagaa taggactgag 1740
tacggtaaag attctaacac tgataaacat ttggagcccc tgaaatcatt gggaggccga 1800
acatccaaaa ggaagaaaac tgaggaagaa agtgaacatg aagtaagctg cccccaagct 1860
tcttttgata aagaaaatgc tttccctttt ccaatggata atcagttttc catgaatgga 1920
gactgtgtga tggataaacc tctggatctg tctgatcgat tttcagctat tcagcgtcaa 1980
gagaaaagcc aaggaagtga gacttctaaa aacaaattta ggcaagtgac tctttatgag 2040
gctttgaaga ccattccaaa gggcttttcc tcaagccgta aggcctcaga tggcaactgc 2100
acgttgccca aagattcccc aggggagccc tgttcacagg aatgcatcat ccttcagccc 2160
ttgaataaat gctctccaga caataaacca tcattacaaa taaaagaaga aaatgctgtc 2220
tttaaaattc ctctacgtcc acgtgaaagt ttggagactg agaatgtttt agatgacata 2280
aagagtgctg gttctcatga gccaataaaa atacaaacca ggtcagacca tggaggatgt 2340
gaacttgcat cagttcttca gttaaatcca tgtagaactg gtaaaataaa gtctctacaa 2400
aacaaccaag atgtatcctt tgaaaatatc cagtggagta tagatccggg agcagacctt 2460
tctcagtata aaatggatgt tactgtaata gatacaaagg atggcagtca gtcaaaatta 2520
ggaggagaga cagtggacat ggactgtaca ttggttagtg aaaccgttct cttaaaaatg 2580
aagaagcaag agcagaaggg agaaaaaagt tcaaatgaag aaagaaaaat gaatgatagc 2640
ttggaagata tgtttgatcg gacaacacat gaagagtatg aatcctgttt ggcagacagt 2700
ttctcccaag cagcagatga agaggaggaa ttgtctactg ccacaaagaa actacacact 2760
catggtgata aacaagacaa agtcaagcag aaagcgtttg tggagccgta ttttaaaggt 2820
gatgaaagag agactagctt gcaaaatttt cctcatattg aggtggttcg gaaaaaagag 2880
gagagaagaa aactgcttgg gcacacgtgt aaggaatgtg aaatttatta tgcagatatg 2940
ccagcagaag aaagagaaaa gaaattggct tcctgctcaa gacaccgatt ccgctacatt 3000
ccacccaaca caccagagaa tttttgggaa gttggttttc cttccactca gacttgtatg 3060
gaaagaggtt atattaagga agatcttgat ccttgtcctc gtccaaaaag acgtcagcct 3120
tacaacgcaa tattttctcc aaaaggcaag gagcagaaga ca 3162
<---
Claims (1)
- Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека, исключая клетки зародышевой линии человека, путем вставки в него интересующей последовательности, включающий белок spCas9, связанный с sgRNA-PP7, кодируемой последовательностью SEQ ID NO: 1, которая связана с эффекторным химерным белком, кодируемым последовательностью SEQ ID NO: 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020140951A RU2749741C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020140951A RU2749741C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2749741C1 true RU2749741C1 (ru) | 2021-06-16 |
Family
ID=76415276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020140951A RU2749741C1 (ru) | 2020-12-11 | 2020-12-11 | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2749741C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786396C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-12-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634395C1 (ru) * | 2015-12-01 | 2017-10-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) | Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека |
| WO2018162702A1 (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-13 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nuclease fusions for enhancing genome editing by homology-directed transgene integration |
-
2020
- 2020-12-11 RU RU2020140951A patent/RU2749741C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2634395C1 (ru) * | 2015-12-01 | 2017-10-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) | Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека |
| WO2018162702A1 (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-13 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Nuclease fusions for enhancing genome editing by homology-directed transgene integration |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| M. CHARPENTIER et al., CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair, NATURE COMMUNICATIONS, 2018, Vol.9, N.1133. * |
| NGOC-TUNG TRAN et al. Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors, Front Genet, 2019, Vol.10, N.365. * |
| NGOC-TUNG TRAN et al. Enhancement of Precise Gene Editing by the Association of Cas9 With Homologous Recombination Factors, Front Genet, 2019, Vol.10, N.365. M. CHARPENTIER et al., CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair, NATURE COMMUNICATIONS, 2018, Vol.9, N.1133. * |
| PHILIPPE ROUET et al. Introduction of Double-Strand Breaks into the Genome of Mouse Cells by Expression of a Rare-Cutting Endonuclease, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, 1994, Vol.14, No.12, p.8096-8106. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786396C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-12-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека |
| RU2808600C1 (ru) * | 2022-12-22 | 2023-11-30 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ редактирования генома млекопитающих путем гомологичной репарации |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11931426B2 (en) | Recombinogenic nucleic acid strands in situ | |
| US20230203541A1 (en) | Optimized gene editing utilizing a recombinant endonuclease system | |
| ES2926021T3 (es) | Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma | |
| ES2784754T3 (es) | Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo | |
| CN116209755A (zh) | 可编程核酸酶和使用方法 | |
| CN107109422A (zh) | 使用由两个载体表达的Cas9蛋白质调节基因表达的方法 | |
| CN110300802A (zh) | 用于动物胚胎碱基编辑的组合物和碱基编辑方法 | |
| WO2020087631A1 (zh) | 基于C2c1核酸酶的基因组编辑系统和方法 | |
| RU2749741C1 (ru) | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека | |
| RU2750939C1 (ru) | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека путем вставки в него интересующей последовательности | |
| WO2022147157A1 (en) | Novel nucleic acid-guided nucleases | |
| CN111051509A (zh) | 用于电介质校准的含有c2cl核酸内切酶的组合物以及使用其进行电介质校准的方法 | |
| RU2808600C1 (ru) | Способ редактирования генома млекопитающих путем гомологичной репарации | |
| RU2808601C1 (ru) | Система привлечения белка к месту разрыва ДНК для увеличения эффективности редактирования генома млекопитающего | |
| RU2808045C1 (ru) | Система для увеличения эффективности редактирования генома млекопитающего за счет гомологичной репарации | |
| RU et al. | OF INTEREST INTO IT | |
| KR102539173B1 (ko) | 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도 | |
| WO2025149051A1 (zh) | 腺嘌呤脱氨酶、包含其的碱基编辑器融合蛋白和碱基编辑器系统及其应用 | |
| WO2021249536A1 (zh) | 含barstar基因的工程菌及其在barnase基因克隆中的应用 | |
| Krishnappan | Establishing a Working Protocol for Plasmid Cloning and shRNA Design in Endogenous Brachionus manjavacas Gene TRP7 | |
| NZ747343B2 (en) | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies | |
| NZ747343A (en) | Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies |