RU2746960C1 - Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ - Google Patents
Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2746960C1 RU2746960C1 RU2020131314A RU2020131314A RU2746960C1 RU 2746960 C1 RU2746960 C1 RU 2746960C1 RU 2020131314 A RU2020131314 A RU 2020131314A RU 2020131314 A RU2020131314 A RU 2020131314A RU 2746960 C1 RU2746960 C1 RU 2746960C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ngs library
- temperature
- dna
- library
- ngs
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 9
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000272470 Circus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий следующие этапы: смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты. Длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С. Изобретение позволяет снизить необходимое количество ДНК NGS библиотеки на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оптимизированного химического состава и оригинальных программ температурного режима; улучшить качества NGS библиотеки и получаемых данных секвенирования за счет сокращения количества циклов ПЦР в ходе создания NGS библиотеки. 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления образцов для высокопроизводительного секвенирования ДНК на платформах технологии DNBSEQ фирмы MGI.
Высокопроизводительное секвенирование (NGS) требует подготовки т.н. NGS библиотеки - фрагментов ДНК типичной длины 200-500 п.н. исследуемого генома, фланкированных определенными
последовательностями (адаптерами). Это относится к наиболее востребованным методам секвенирования короткой длины прочтения: секвенирование синтезом, используемое в инструментах Illumina (регистрация каждого присоединенного нуклеотида по временной метке) (Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. Bentley et al., 2008 Nov 6; 456(7218):53-9); секвенирование лигированием (принцип комплементарности цепей ДНК), используемое в инструменте SOLiD Life Technologies Thermo Fisher Scientific (Massively parallel signature sequencing. Methods Mol Biol. Zhou et al., 2006. 331:285-311), а также в более новых инструментах MGI (cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clinical Epigenetics. Fehlmann et al., 2016 November 21; 8, 123).
Само приготовление библиотек имеет общий порядок действий, не зависит от технологии секвенирования, однако последний шаг до непосредственного считывания нуклеотидных последовательностей прибором, называемый подготовкой NGS-библиотеки к секвенированию, производится по-разному в зависимости от технологии секвенирования.
В платформах Illumina библиотеку денатурируют в растворе щелочи, после чего наносят на подложку проточной ячейки, в которой происходит секвенирование. На подложке каждая молекула копируется множество раз (амплифицируется) в т.н. кластеры, с которых потом происходит считывание флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования (WO 1998044151 (А1), GLAXO GROUP LTD et al., 08.10.1998).
В платформе DNBSEQ фирмы MGI, библиотеку также подвергают множественному копированию для формирования похожих на кластеры повторяющихся последовательностей каждой молекулы NGS библиотеки: это происходит в ходе репликации по типу катящегося кольца Rolling Circle Amplification (RCA). Получающиеся ДНК молекулы являются множественными копиями фрагментов библиотеки, они наносятся на проточную ячейку, и они являются источником флуоресцентного сигнала в ходе секвенирования. Для осуществления RCA необходимо иметь фрагменты NGS библиотеки в кольцевом виде, т.е. соединить два конца каждого одноцепочечного фрагмента ДНК библиотеки в непрерывную молекулу ДНК. Так как изначально NGS библиотека имеет линейную форму, ДНК библиотеки переводится в кольцевой вид ферментативной реакцией, производящей лигирование концов некоторой доли молекул из всего образца. Реакция называется циркуляризацией NGS-библиотеки. В зависимости от технологии этой реакции доля фрагментов образца, подвергнутого циркуляризации, может отличаться.
Известен следующий способ создания кольцевых форм библиотек для NGS (WO 2007133831 (А2), COMPLETE GENOMICS INC et al., 22.11.2007). Он предлагает использовать несколько методов циркуляризации NGS-библиотеки, каждый из которых имеет недостатки. Так, первый предлагаемый метод подразумевает, что на NGS библиотеку доращивается дополнительная последовательность поли-Аденинов. Длину наращиваемого поли-А невозможно контролировать, что приводит к общей низкой эффективности циркуляризации.
Кроме того, достраиваемые фрагменты уменьшают возможность секвенирования фрагмента ДНК, относящегося непосредственно к образцу, что снижает количество данных получаемых в секвенировании в сравнении с другими методами.
Вторым методом предлагается иммобилизовать фрагменты библиотеки, что приводит к потере большого количества образца (более 90%).
В еще одном способе предлагается использовать длинный (более 40 нуклеотидов), соединяющий два конца каждого фрагмента, олигонулеотид (т.н. сплинт), что является неэффективным с точки зрения дороговизны используемого сплинт олигонуклеотида. При этом отсутствует какая-либо гибридизация сплинт олигонуклеотида с фрагментами NGS библиотеки. Это приводит к тому, что требуется большое количество NGS библиотеки, около 10 пмоль, что как минимум 10 раз превышает требования других известных методов.
Известен способ создания библиотек в кольцевой форме, используемый самой компанией MGI (ЕР 3192877 (A1), BGI SHENZHEN СО LTD, 19.07.2017). Метод описывает процесс перевода NGS библиотеки в кольцевую форму как часть процесса создания NGS библиотеки из стартового материала РНК. В данном способе эффективность циркуляризации не превышает 15% и, как следствие, требуется сравнительно большое для NGS секвенирования (около 400 нг, или около 1 пмоль) количество ДНК библиотеки.
Кроме того, перед процессом циркуляризации в способе вынужденно выполняется процесс изоляции одноцепочечной ДНК (одной из двух цепей каждого фрагмента NGS библиотеки) путем иммобилизации одной из цепей на магнитных частицах. Это является дополнительным шагом, который приводит к частичной потере образца в ходе очистки на магнитных частицах. Прототипом патентуемого изобретения является метод создания кольцевой формы NGS-библиотек с помощью двойного лигирования адаптеров компании MGI (ЕР3207169 (B1), MGI TECH СО LTD, 01.07.2020).
Циркуляризация в нем осуществляется в 5 этапов. Начинается процесс либо с денатурации NGS библиотеки, либо с изоляции одной из ДНК цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Далее, оставшиеся ДНК цепи каждого фрагмента смешиваются с сплинт-олигонуклеотидом. Сплинт имеет комплементарность к обоим концам одноцепочечного фрагмента NGS библиотеки и призван повысить эффективность замыкания ДНК фрагмента в кольцо. Далее, в реакционную смесь добавляется фермент ДНК лигаза и концы фрагмента NGS библиотеки лигируются друг с другом, переводя часть фрагментов NGS библиотеки в кольцевой вид. Далее, в раствор добавляются экзонуклеазы, деградирующие любую ДНК в некольцевой форме, т.е. те фрагменты ДНК, которые не были переведены в кольцевой вид. Наконец, идет очистка кольцевой ДНК от реакционной смеси, после которой получается очищенная от ферментов и солей NGS библиотека в кольцевой форме.
Минусом прототипа является необходимость модифицировать одну из цепей фрагментов NGS библиотеки биотином, чтобы селективно отбирать только одну из цепей каждого фрагмента NGS библиотеки. Способ также обладает низкой эффективностью циркуляризации и необходимостью создания большого количества NGS библиотеки из большого количества исходного материала: в примерах использовалось по 3 мкг ДНК на каждую NGS библиотеку. Кроме того, метод приводит к созданию больших молекул за счет лигирования фрагментов библиотеки друг с другом, вплоть до размера 50-250 тысяч пар нуклеотидов.
Нами поставлена задача повысить эффективность процесса циркуляризации NGS библиотеки и уменьшить требуемое для одной реакции количество NGS библиотеки. Это позволит снизить требования к количеству ДНК на всех предыдущих этапах, и как следствие, улучшить качество образца и получаемых в ходе секвенирования данных.
Это особенно важно для таких применений NGS как секвенирования экзома и транскриптома человека, где лишние ПЦР циклы в ходе создания NGS библиотеки сильно снижают качество получаемого результата.
Кроме того, нами поставлена задача: разработать способ создания кольцевой формы NGS библиотеки, позволяющий использовать доступные реагенты и ферменты любого производителя, работать не с помощью закрытых коммерческих наборов (MGI), а с любыми, в том числе, более бюджетными, аналогами ферментов и химических реактивов.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в:
снижении необходимого количества ДНК NGS библиотеки на подготовку ее к секвенированию на платформах DNBSEQ путем использования оптимизированного химического состава и оригинальных программ температурного режима;
улучшении качества NGS библиотеки и получаемых данных секвенирования за счет сокращения количества циклов ПЦР в ходе создания NGS-библиотеки.
Нами предложено введение новых этапов в процесс циркуляризации NGS-библиотеки, изменение состава реакционной смеси, температурных режимов и их длительности.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ включает следующие этапы: смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК. При этом смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонулкеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ. Перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты Длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С.
Способ осуществляют следующим образом.
Для перевода NGS библиотеки в кольцевую форму (циркуляризации) используются следующие расходные материалы:
- Пробирки на 1,5 мл без ДНКаз;
- Штативы под 1,5 мл пробирки;
- Микропробирки LoBind 1,5 мл (Eppendorf) или аналоги;
- 96% этанол;
- Носы с фильтрами 2-20, 20-300, 300-1200 типа Vertex (SSI) или аналоги.
- AMPure ХР магнитные частицы или аналогичные им
- Набор для Qubit ssDNA или аналоги
- Сплинт олигонулеотид 5'-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3'
- LowTE буфер
- NaCl раствор 200 мМ
- Лигаза Т4 из расчета 200 ед/мкл с рабочим буфером
- Exo I и Exo III нуклеазы
- ЭДТА 0.5 Μ раствор
- Вода mQ качества
- Лед в форме
- Носы к автоматическим пипеткам выбранного производителя
Для циркуляризации используются следующее оборудование:
- Термоциклер ПЦР под 0.2 мл пробирки;
- Qubit 2+ версии (Life Technologies) или аналог;
- Центрифуга и Вортекс Microspin FV-2400 (Biosan) или аналог;
- Автоматические пипетки Eppendorf в диапазоне объемов от 0,5 до 10 мкл, от 2 до 20 мкл, от 200 до 200 мкл, от 100 до 1000 мкл или аналоги с носами на пипетки (к ним необходимы носики с фильтрами);
Протокол проведения циркуляризации заключается в следующих шагах:
1. Добавить в ПЦР пробирку нужное кол-во ДНК библиотеки (протестировано на 15-600 нг) объемом V мкл до 30 мкл.
2. Добавить 38 - V мкл (до общего объема 38 мкл) Low ТЕ буфера.
3. Добавить 2 мкл 200 мМ раствора NaCl.
4. Добавить 1 мкл 100 мкМ раствора сплинт олигонуклеотида.
5. Перемешать и поставить на программу гибридизации:
1. 95°С 2 минуты,
2. 65°С 2 минуты,
3. 40°С 2 минуты,
4. 4°С хранение.
6. Когда температура опустится до 4°С, переместить образцы на 4°С или на лед на не менее чем 1 минуту.
7. Сбросить капли на микроцентрифуге.
8. На льду добавить 5 мкл 10х буфера для лигирования, 4 мкл Лигазы Т4 (200 ед/мкл), перемешать пипетированием, коротко центрифугировать.
9. Поставить в термоциклер на 37°С на не менее чем 1 час.
10. Достать, сбросить капли на микроцентрифуге.
11. Добавить не менее 6 ед. Exo I и не менее 30 ед. Exo III нуклеаз, соответственно, перемешать пипетированием.
12. Поставить в термоциклер на 37°С на 30 минут.
13. Добавить 2 мкл 0.5 Μ раствора ЭДТА, перемешать, перенести в 1.5 пробирку.
14. Добавить 120 мкл магнитных частиц (AMPure ХР или аналог).
15. 10 минут инкубации на комнатной температуре, поставить на магнитный штатив, отобрать супернатант.
16. 2 раза промыть 200 мкл 80% этанола на магнитном штативе, отобрать этанол, высушить в течение 5 минут с открытой крышкой.
17. Добавить 20 мкл mQ воды, перемешать, инкубировать 10 минут на столе.
18. Перенести на магнитный штатив, отобрать 18 мкл супернатанта, перенести в новую пробирку.
19. Измерить концентрацию с помощью набора Qubit ssDNA, в зависимости от количества библиотеки в реакции, взять 2 мкл или более.
20. Посчитать соотношение общего количества одноцепочечной ДНК к изначальному количеству добавленной библиотеки в нг. Нормальным выходом является показатель выше 15%.
Пример.
В таблице приведены результаты циркуляризации методом, описанным в предлагаемом способе (предлаг.цирк.) и методом, предлагаемым производителем MGI их коммерческим набором (MGI цирк.). Для одних и тех же образцов приведены: количество ДНК NGS библиотеки, добавленной в реакцию для ее перевода в кольцевую форму (вход, нг); кол-во кольцевой ДНК NGS библиотеки, полученной из добавленной, после реакции циркуляризации (выход, нг); эффективность циркуляризации, доля переведенной в кольцевую форму ДНК, измеренной в процентах. Видно, что в каждом образце эффективность циркуляризации, сделанной в соответствии с предлагаемым способом, минимум в 2 раза выше эффективности циркуляризации, выполненной по способу-прототипу. Кроме того, количество ДНК в предлагаемом методе было 30 нг, т.е. около 0.1-0.2 пмоль фрагментов NGS библиотеки (в зависимости от средней длины фрагментов). Это как минимум в 5 раз меньше 1 пмоль, требуемого для цикруляризации по способу-прототипу. Таким образом, для каждой NGS-библиотеки из примера, требуемое количество библиотеки, необходимой для секвенирования, понижается минимум в 10 раз за счет предлагаемого метода циркуляризации.
Таким образом, представленные данные подтверждают повышение эффективности циркуляризации, снижение необходимого количества NGS библиотеки для проведения циркуляризации, уменьшение требований к количеству NGS библиотеки, необходимой для секвенирования, в результате использования предлагаемого способа.
Claims (1)
- Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ, включающий смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида; лигирование концов фрагментов ДНК ферментом ДНК-лигазой; деградацию ДНК, находящейся не в кольцевой форме, ферментами экзонуклеазы; очистку полученных кольцевых фрагментов ДНК, отличающийся тем, что смешивание NGS библиотеки и сплинт-олигонуклеотида проводят в растворе, содержащем NaCl в концентрации 10 мМ; перед этапом лигирования концов фрагментов ДНК осуществляют температурную обработку реакционной смеси по следующей программе: при температуре 95°С в течение 2 минут, при температуре 65°С в течение 2 минут, при температуре 40°С в течение 2 минут и при температуре 4°С в течение не менее 1 минуты; а длительность этапа лигирования концов фрагментов ДНК составляет не менее 1 часа при температуре 37°С.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020131314A RU2746960C1 (ru) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020131314A RU2746960C1 (ru) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2746960C1 true RU2746960C1 (ru) | 2021-04-22 |
Family
ID=75584932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020131314A RU2746960C1 (ru) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2746960C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781613C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-10-14 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки Illumina для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3192877A1 (en) * | 2014-09-12 | 2017-07-19 | BGI Shenzhen Co., Limited | Vesicular linker and uses thereof in nucleic acid library construction and sequencing |
| EP3207169B1 (en) * | 2014-10-14 | 2020-07-01 | MGI Tech Co., Ltd. | Mate pair library construction |
-
2020
- 2020-09-23 RU RU2020131314A patent/RU2746960C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3192877A1 (en) * | 2014-09-12 | 2017-07-19 | BGI Shenzhen Co., Limited | Vesicular linker and uses thereof in nucleic acid library construction and sequencing |
| EP3207169B1 (en) * | 2014-10-14 | 2020-07-01 | MGI Tech Co., Ltd. | Mate pair library construction |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ЯНКЕВИЧ Т, Разработка системы типирования генов HLA I и II классов на уровне высокого разрешения методом высокопроизводительного секвенирования NGS, авто диссертации, Москва, 2018. * |
| ЯНКЕВИЧ Т, Разработка системы типирования генов HLA I и II классов на уровне высокого разрешения методом высокопроизводительного секвенирования NGS, автореферат диссертации, Москва, 2018. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781613C1 (ru) * | 2021-12-22 | 2022-10-14 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки Illumina для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK3192877T3 (en) | VESICULAR ADAPTERS AND APPLICATIONS THEREOF IN NUCLEIC ACID LIBRARY CONSTRUCTION AND SEQUENCE | |
| CN113166797A (zh) | 基于核酸酶的rna耗尽 | |
| CN105400776B (zh) | 寡核苷酸接头及其在构建核酸测序单链环状文库中的应用 | |
| JP5702148B2 (ja) | １ステップｒｔ−ｐｃｒの阻害低減 | |
| CN111549099B (zh) | 一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法 | |
| TW201321518A (zh) | 微量核酸樣本的庫製備方法及其應用 | |
| CN109957562B (zh) | 一种快速构建转录组测序文库的方法及试剂盒 | |
| WO2000056877A1 (en) | Method for amplifying nucleic acid sequence | |
| CN114096678A (zh) | 多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用 | |
| EP1840226A1 (en) | Microwave assisted PCR amplification of DNA | |
| CN107893100A (zh) | 一种单细胞mRNA逆转录与扩增的方法 | |
| US11041151B2 (en) | RNA array compositions and methods | |
| CN111549025B (zh) | 链置换引物和细胞转录组文库构建方法 | |
| RU2746960C1 (ru) | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ | |
| RU2781613C1 (ru) | Способ создания кольцевой формы NGS библиотеки Illumina для высокопроизводительного секвенирования на платформах технологии DNBSEQ | |
| WO2025000136A1 (zh) | 一种快速检测多种类型rna的链特异性文库制备方法与高通量测序技术 | |
| EP4095254A2 (en) | Fragmentation of dna | |
| CN106283198B (zh) | 用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法 | |
| EP3828283A1 (en) | An improved sequencing method and kit | |
| EP1604044B1 (en) | Recovery of dna | |
| US20250043338A1 (en) | Probe-based device-free single-cell rna profiling | |
| RU2830886C1 (ru) | Технология полноэкзомного обогащения на основе гибридизации с полноэкзомной РНК-библиотекой | |
| CN114763546B (zh) | 一种dU5`衔接子及其应用和构建的cDNA文库 | |
| CN116497105B (zh) | 基于末端转移酶的单细胞转录组测序试剂盒及测序方法 | |
| CN118957022B (zh) | 一种接头组合物和小rna文库及其构建方法 |