RU2744846C1 - Method of treatment of acute liver failure - Google Patents
Method of treatment of acute liver failure Download PDFInfo
- Publication number
- RU2744846C1 RU2744846C1 RU2020119914A RU2020119914A RU2744846C1 RU 2744846 C1 RU2744846 C1 RU 2744846C1 RU 2020119914 A RU2020119914 A RU 2020119914A RU 2020119914 A RU2020119914 A RU 2020119914A RU 2744846 C1 RU2744846 C1 RU 2744846C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liver
- cells
- srna
- resection
- extensive
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 title claims abstract description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 26
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims abstract description 142
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 37
- ZWGNFOFTMJGWBF-VZSHSMSCSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-(1h-indol-3-yl)propanoic acid;2-oxopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1.C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZWGNFOFTMJGWBF-VZSHSMSCSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 62
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 10
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 33
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 26
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 26
- 241000842783 Orna Species 0.000 abstract description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 15
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 61
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 51
- 201000000760 cerebral cavernous malformation Diseases 0.000 description 43
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 35
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 29
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 25
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 25
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 25
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 21
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 21
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 17
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 14
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 11
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 9
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 8
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 6
- 108010033918 Alanine-glyoxylate transaminase Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 5
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 5
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 5
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 4
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 4
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 3
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000012753 partial hepatectomy Methods 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N Amiodarone hydrochloride Chemical compound [Cl-].CCCCC=1OC2=CC=CC=C2C=1C(=O)C1=CC(I)=C(OCC[NH+](CC)CC)C(I)=C1 ITPDYQOUSLNIHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012752 Hepatectomy Methods 0.000 description 2
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960005260 amiodarone Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 2
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 2
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100039111 FAD-linked sulfhydryl oxidase ALR Human genes 0.000 description 1
- 101710188810 FAD-linked sulfhydryl oxidase ALR Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 206010038669 Respiratory arrest Diseases 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000002253 anti-ischaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000004500 asepsis Methods 0.000 description 1
- 230000002886 autophagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009693 chronic damage Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006346 energetic homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000035990 intercellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000001608 morphoregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M thiopental sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC([S-])=NC1=O AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Educational Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
- Computational Mathematics (AREA)
- Algebra (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно, к гепатологии, и может быть использовано для профилактики и лечения острой печеночной недостаточности (ОПН).The invention relates to medicine, namely, to hepatology, and can be used for the prevention and treatment of acute liver failure (ARF).
На протяжении последних десятилетий проблема эффективного лечения печеночной недостаточности остается нерешенной проблемой, т.к. летальность, как при острой, так и при хронической печеночной недостаточности, по-прежнему, остается на высоком уровне и не имеет тенденции к снижению. По данным ВОЗ смертность от ОПН, сопровождающейся обширным некрозом паренхимы, достигает 70-90% и более [Ивашкин В.Т., Уланова И.Н. /Преждевременная смертность в Российской Федерации и пути ее снижения. Стратегия «шесть в четырех». //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2006, №1, с. 8-14], а после часто выполняемых в клинике операций обширной резекции печени, особенно при онкологических заболеваниях печени, смертность в раннем послеоперационном периоде достигает 7% [Л.П. Котельникова, И.М. Будянская /Профилактика и лечение осложнений после резекции печени.// Вестник хирургии им. И.И. Грекова, 2012; 171(3):67-71]. Указанные обстоятельства требуют продолжения поиска эффективных и доступных методов лечения ОПН.Over the past decades, the problem of effective treatment of liver failure remains an unresolved problem, because mortality, both in acute and in chronic liver failure, still remains at a high level and does not tend to decrease. According to WHO, mortality from acute renal failure, accompanied by extensive necrosis of the parenchyma, reaches 70-90% or more [Ivashkin VT, Ulanova IN. / Premature mortality in the Russian Federation and ways to reduce it. Six in four strategy. // Russian Journal of Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology, 2006, No. 1, p. 8-14], and after often performed in the clinic operations of extensive liver resection, especially in cancer of the liver, mortality in the early postoperative period reaches 7% [L.P. Kotelnikova, I.M. Budyanskaya / Prevention and treatment of complications after liver resection. // Bulletin of Surgery named after V.I. I.I. Grekova, 2012; 171 (3): 67-71]. These circumstances require the continuation of the search for effective and affordable treatments for ARF.
Настоятельная необходимость разработки более эффективных способов лечения печеночной недостаточности диктуется также неутешительными прогнозами дальнейшего повышения заболеваемости по этой нозологии во всех странах мира в ближайшие 10-20 лет [Плеханов А.Н., Товаршинов А.И. /Современные подходы к диагностике и лечению печеночной недостаточности (обзор литературы). //Бюллетень ВСНЦ, 2016, том 1, вып. 4 (110), с. 136].The urgent need to develop more effective methods of treating liver failure is also dictated by disappointing forecasts of a further increase in the incidence of this nosology in all countries of the world in the next 10-20 years [Plekhanov A. N., Tovarshinov A. And. / Modern approaches to the diagnosis and treatment of liver failure (literature review). // Bulletin of the All-Russian Scientific Center, 2016, volume 1, no. 4 (110), p. 136].
К настоящему времени стало очевидным, что трансплантация печени, будучи самым эффективным методом лечения острой и хронической печеночной недостаточности из-за дефицита донорских органов не может обеспечить всех нуждающихся в ней. Рассматривая высокую летальность при ОПН, как следствие нарушения процессов регенерации в поврежденной печени, надежду на повышение эффективности восстановительного лечения печени стали связывать с регенерационной медициной, основанной на применении клеточных биотехнологий.By now it has become obvious that liver transplantation, being the most effective method of treating acute and chronic liver failure due to a deficiency of donor organs, cannot provide all those who need it. Considering the high mortality rate in acute renal failure, as a consequence of the disturbance of regeneration processes in the damaged liver, the hope for an increase in the effectiveness of restorative treatment of the liver began to be associated with regenerative medicine based on the use of cellular biotechnologies.
Были предложены методы интенсивной терапии ОПН, основанные на применении экстрактов ткани печени, полученных либо от крыс с 70% резекцией, либо от неонатальных поросят [Э.И. Гальперин, Т.Г. Дюжева, Л.В. Платонова и др. Уменьшение повреждения печени при ее обширной резекции и токсическом повреждении //Анналы хирургической гепатологии, 2008, т. 13, №1, с. 51-55]. Однако при возможном клиническом применении экстрактов из нативных тканей всегда существует потенциальная опасность заражения пациента трансмиссивными инфекциями животных, а изготовление высокоэффективного медикаментозного препарата из экстракта животных тканей предполагает идентификацию химического переносчика биологических эффектов и выделение его из тканевого экстракта, чего авторами не было предпринято.Methods of intensive therapy for acute renal failure were proposed, based on the use of liver tissue extracts obtained either from rats with 70% resection, or from neonatal piglets [E.I. Galperin, T.G. Dyuzheva, L.V. Platonova et al. Reducing liver damage with extensive resection and toxic damage // Annals of surgical hepatology, 2008, vol. 13, no. 1, p. 51-55]. However, with the possible clinical use of extracts from native tissues, there is always a potential danger of infecting a patient with transmissible animal infections, and the manufacture of a highly effective drug from an extract of animal tissues involves the identification of a chemical carrier of biological effects and its isolation from a tissue extract, which was not undertaken by the authors.
В последние годы стал известен новый биотехнологический способ лечения ОПН после обширной резекции печени (ОРП), который основан на имплантации в организм (брыжейку тонкой кишки) клеточно-инженерных конструкций, состоящих из сокультивированных аллогенных клеток печени и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) в составе биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля [М. Shagidulin, N. Onishchenko, М. Krasheninnikov et al., Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure //Medimond. International Proceedings., 2010, Р. 83-86]. Достоверно ускоренное восстановление функции печени авторы объясняют высоким регенерационным потенциалом культивированных стволовых/прогениторных клеток, выделенных из костного мозга.In recent years, a new biotechnological method for the treatment of acute renal failure after extensive liver resection (ARF) has become known, which is based on the implantation into the body (mesentery of the small intestine) of cell-engineered structures consisting of co-cultured allogeneic liver cells and multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells (MMSC BM ) as part of a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel [M. Shagidulin, N. Onishchenko, M. Krasheninnikov et al., Transplantation liver cells and multipotent mesenchymal stromal cells for correction and treatment of hepatic failure // Medimond. International Proceedings., 2010, P. 83-86]. The authors explain the significantly accelerated recovery of liver function by the high regenerative potential of cultured stem / progenitor cells isolated from the bone marrow.
Между тем, внедрение в практику регенеративной медицины клеточных технологий пока не получило единодушного одобрения из-за опасности малигнизации и генетических мутаций трансплантированных стволовых/прогениторных клеток, из-за опасности развития реакции «трансплантат против хозяина» при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, а также из-за быстрой гибели или быстрого снижения активности как аутологичных, так и аллогенных клеток [А.С. Lyra, М.В. Soares, L.F. da Silva et al. / Infusion of autologous bone marrow mononuclear cells through hepatic artery results in a short-term improvement of liver function in patients with chronic liver disease: a pilot randomized controlled study. //European Journal of Gastroenterology & Hepatology.- 2010. - Vol. 22(1). - Р. 33-42].Meanwhile, the introduction of cell technologies into the practice of regenerative medicine has not yet received unanimous approval due to the danger of malignancy and genetic mutations of transplanted stem / progenitor cells, due to the risk of developing a "graft versus host" reaction during hematopoietic stem cell transplantation, as well as for the rapid death or rapid decrease in the activity of both autologous and allogeneic cells [A.S. Lyra, M.V. Soares, L.F. da Silva et al. / Infusion of autologous bone marrow mononuclear cells through hepatic artery results in a short-term improvement of liver function in patients with chronic liver disease: a pilot randomized controlled study. // European Journal of Gastroenterology & Hepatology. - 2010. - Vol. 22 (1). - R. 33-42].
Альтернативой клинического применения биомедицинских клеточных продуктов в регенерационной медицине, включая клеточно - и тканеинженерные конструкции, могут стать технологии, основанные на применении выделенного из клеток костного мозга комплекса внутриклеточных биологически активных компонентов.An alternative to the clinical application of biomedical cell products in regenerative medicine, including cell and tissue engineering constructs, can be technologies based on the use of a complex of intracellular biologically active components isolated from bone marrow cells.
Вопрос о том, какие внутриклеточные структуры и сигнальные молекулы клеток костного мозга (ККМ) способны обеспечивать «адресный перенос регенерационной информации» к поврежденным органам долго не был предметом специальных исследований.The question of which intracellular structures and signaling molecules of bone marrow cells (BMC) are capable of providing “targeted transfer of regenerative information” to damaged organs has not been the subject of special studies for a long time.
В последние годы, однако, появились исследования, из которых следует, что продуцентами и переносчиками регенерационной информации в межклеточной сигнальной системе выступают разнообразные по своим структурным и функциональным свойствам молекулы РНК [Н.В. Тишевская, А.Г. Бабаева, Н.М. Геворкян / Роль лимфоцитарных РНК в межклеточном информационном обмене и регуляции регенеративных процессов. // Российский Физиологический Журнал им. И.М. Сеченова. - 2016, - Т. 102. - вып. 11, С. 1280-1301; А.Г. Бабаева, Н.В. Тишевская, Н.М. Геворкян / О морфогенетических свойствах РНК лимфоидных и стволовых клеток при восстановительных процессах // Российская академия наук. - Научно-исследовательский институт морфологии человека, Москва. - 2016, 272 с].In recent years, however, studies have appeared, from which it follows that the producers and carriers of regenerative information in the intercellular signaling system are RNA molecules of various structural and functional properties [N.V. Tishevskaya, A.G. Babaeva, N.M. Gevorkyan / The role of lymphocytic RNAs in intercellular information exchange and regulation of regenerative processes. // Russian Physiological Journal named after THEM. Sechenov. - 2016, - T. 102. - issue. 11, S. 1280-1301; A.G. Babaeva, N.V. Tishevskaya, N.M. Gevorkyan / On the morphogenetic properties of RNA of lymphoid and stem cells during recovery processes // Russian Academy of Sciences. - Research Institute of Human Morphology, Moscow. - 2016, 272 s].
Начиная с 2008 г. во всем мире проводятся интенсивные исследования свойств молекул малых белок некодирующих РНК - микроРНК, которые начали использовать не только в качестве биомаркеров, но и в качестве терапевтических средств регуляции восстановительных процессов при различных патологиях [D.P. Bartel / MicroRNAs: target recognition and regulatory functions // Cell.-2009. - Vol. - 136(2). - P. 215-233].Since 2008, intensive studies of the properties of small protein molecules of noncoding RNAs - microRNAs have been carried out all over the world, which have begun to be used not only as biomarkers, but also as therapeutic agents for regulating recovery processes in various pathologies [D.P. Bartel / MicroRNAs: target recognition and regulatory functions // Cell. 2009. - Vol. - 136 (2). - P. 215-233].
Однако, выделение какой-либо одной микро РНК с адресным эффектом для целей регенерационной терапии представляет собой сложный технологический процесс. Уже к 2015 году было идентифицировано свыше 1800 вне - и внутриклеточных микроРНК человека [S.M. Peterson, J.A. Thompson, M.L. Ufkin, P. Sthyanarayana, L. Liaw, C.B. Congdon / Common features of microRNA target prediction tools. // Frontiers in Genetics. - 2014.- Vol. - 5.- S.M. P.23], причем функция большинства из них остается неизвестной. Кроме того, вызывает сомнение возможность индукции и осуществления эффективного регенерационного процесса в поврежденных органах с помощью какой-либо одной выделенной микро РНК, так как уже показано, что в процессах регенерации принимают участие разные классы молекул РНК [I.K. Yan, X. Wang, Y.W. Asmann, H. Haga, Т. Patel / Circulating Extracellular RNA Markers of Liver Regeneration. // PLoS One.-2016.-Vol. 11(7)], в том числе разные классы белок некодирующих РНК, [J. Li, W. Jin, Y. Qin, W. Zhao, C. Chang, C. Xu / Expression Profile and Function Analysis of LncRNAs during Priming Phase of Rat Liver Regeneration/ // PLoS One.-2016, Jun 21, Vol.-11(6); F. Mottaghitalab, A. Rastegari, M. Farokhi, R. Dinarvand, H Hosseinkhani et al Prospects of siRNA applications in regenerative medicine. // International Journal of Pharmaceutics. 2017 May 30. - Vol. - 524(l-2). - P. 312-329].However, the isolation of any one microRNA with a targeted effect for the purposes of regenerative therapy is a complex technological process. Already by 2015, more than 1800 extra - and intracellular human microRNAs were identified [S.M. Peterson, J.A. Thompson, M.L. Ufkin, P. Sthyanarayana, L. Liaw, C.B. Congdon / Common features of microRNA target prediction tools. // Frontiers in Genetics. - 2014.- Vol. - 5.- S.M. P.23], and the function of most of them remains unknown. In addition, the possibility of induction and implementation of an effective regeneration process in damaged organs with the help of any one isolated microRNA is questionable, since it has already been shown that different classes of RNA molecules are involved in the regeneration processes [I.K. Yan, X. Wang, Y.W. Asmann, H. Haga, T. Patel / Circulating Extracellular RNA Markers of Liver Regeneration. // PLoS One.-2016.-Vol. 11 (7)], including different classes of protein noncoding RNAs, [J. Li, W. Jin, Y. Qin, W. Zhao, C. Chang, C. Xu / Expression Profile and Function Analysis of LncRNAs during Priming Phase of Rat Liver Regeneration / // PLoS One.-2016, Jun 21, Vol. -11 (6); F. Mottaghitalab, A. Rastegari, M. Farokhi, R. Dinarvand, H Hosseinkhani et al Prospects of siRNA applications in regenerative medicine. // International Journal of Pharmaceutics. 2017 May 30. - Vol. - 524 (l-2). - P. 312-329].
В последние годы стал известен биотехнологический способ индукции восстановительных процессов в поврежденной печени с помощью общей РНК (оРНК) ММСК KM [RU 2650209, С1], который, однако, был предназначен для лечения хронической печеночной недостаточности (ХПН), когда в печени уже сформированы все признаки ее хронического повреждения. Способ обеспечивает постепенное (в течение нескольких месяцев) восстановление структуры и функции поврежденных клеток, а также восстановление гистологических характеристик ткани печени, которое достигается за счет многократного (по крайней мере, трехкратного) парентерального введения в организм оРНК, выделенной из предварительно культивированных в течение 3-4-х недель ММСК КМ здорового донора. В результате применения оРНК, выделенной из ММСК КМ, а не самих ММСК КМ, этот способ позволяет избежать развития известных опасных осложнений, связанных с применением стволовых/прогениторных клеток костного мозга (малигнизация и мутация клеток). Кроме того, предложенный способ позволяет использовать только биологически активный комплекс этих клеток, содержащий в себе все типы РНК (в том числе все типы регуляторных белок - не кодирующих микро-РНК), что позволяет осуществлять непосредственный перенос регенерационной информации клеткам хронически поврежденного органа - печени, индуцируя в них процесс эффективной репаративной регенерации.In recent years, a biotechnological method of inducing recovery processes in a damaged liver using total RNA (oRNA) of MMSK KM [RU 2650209, C1] has become known, which, however, was intended for the treatment of chronic liver failure (CRF), when all signs of her chronic damage. The method provides gradual (within several months) restoration of the structure and function of damaged cells, as well as restoration of the histological characteristics of liver tissue, which is achieved through multiple (at least three-fold) parenteral administration of sRNA isolated from pre-cultured for 3 4 weeks MMSC BM from a healthy donor. As a result of using sRNA isolated from BM MMSCs, rather than BM MMSCs themselves, this method avoids the development of known dangerous complications associated with the use of stem / progenitor cells of the bone marrow (cell malignancy and mutation). In addition, the proposed method makes it possible to use only a biologically active complex of these cells, containing all types of RNA (including all types of regulatory proteins - not coding micro-RNAs), which allows direct transfer of regenerative information to cells of a chronically damaged organ - the liver, inducing in them the process of effective reparative regeneration.
Однако известный способ, предполагающий использование оРНК из ММСК КМ млекопитающих в качестве средства для коррекции печеночной недостаточности, не лишен недостатков, препятствующих его широкому и эффективному использованию для лечения ОПН.However, the known method, which involves the use of sRNA from MMSC of mammalian BM as a means for correcting liver failure, is not without drawbacks that prevent its wide and effective use for the treatment of acute renal failure.
Прежде всего, указанный выше известный способ относится к лечению ХПН, вызванной хроническим токсическим повреждением печени. К недостаткам относится также сложность и длительность сроков выделения и получения достаточных количеств ММСК КМ из мононуклеарной фракции клеток костного мозга, в которой эти клетки составляют не более 0,5-1,5%.First of all, the above known method relates to the treatment of chronic renal failure caused by chronic toxic liver damage. The disadvantages also include the complexity and duration of the isolation and production of sufficient quantities of MMSC BM from the mononuclear fraction of bone marrow cells, in which these cells make up no more than 0.5-1.5%.
Для выделения ММСК из мононуклеарной фракции клеток костного мозга сначала проводят краткосрочное культивирование (3-4 суток), а затем путем длительного культивирования выделенных ММСК КМ в течение 3-4 недель проводят наращивание клеточной массы с применением дорогостоящих культуральных сред, что существенно повышает себестоимость получения оРНК из ММСК КМ.To isolate MMSC from the mononuclear fraction of bone marrow cells, first, short-term cultivation (3-4 days) is carried out, and then, by long-term cultivation of the isolated BM MMSC for 3-4 weeks, the cell mass is increased using expensive culture media, which significantly increases the cost of obtaining sRNA from MMSK KM.
Кроме того, предложенная схема использования оРНК оказалась непригодной для лечения ОПН. Применение оРНК по известной схеме обеспечивает лишь постепенную (в течение нескольких месяцев) инволюцию и устранение признаков деструкции паренхиматозных и непаренхиматозных структур ткани печени, сформировавшихся в процессе ее длительного хронического токсического повреждения. Между тем, для успешного лечения ОПН в клинике, особенно после субтотальной или обширной резекции, уже в первые часы послеоперационного периода необходимо обеспечить условия для устранения индуцированного операционным стрессом раннего и опасного ингибирования митотической и пролиферативной активности клеток в остатке печени. Более того, требуется в первые-вторые сутки достигнуть раннего и максимально ускоренного темпа наращивания дополнительных количеств здоровых клеток в остатке здоровой ткани печени для быстрого преодоления дефицита ткани печени (ее критической массы) после операции, ускоренного восстановления печеночного гомеостаза и предотвращения гибели пациента.In addition, the proposed scheme for using sRNA was found to be unsuitable for the treatment of ARF. The use of sRNA according to a known scheme provides only a gradual (over several months) involution and elimination of signs of destruction of parenchymal and non-parenchymal structures of the liver tissue formed during its long-term chronic toxic damage. Meanwhile, for the successful treatment of acute renal failure in the clinic, especially after subtotal or extensive resection, already in the first hours of the postoperative period, it is necessary to provide conditions for eliminating the early and dangerous inhibition of mitotic and proliferative activity of cells in the liver remnant induced by operational stress. Moreover, on the first or second day, it is required to achieve an early and maximally accelerated rate of growth of additional amounts of healthy cells in the remainder of healthy liver tissue in order to quickly overcome the deficiency of liver tissue (its critical mass) after surgery, accelerate restoration of hepatic homeostasis and prevent death of the patient.
Известен способ коррекции ОПН в эксперименте после хирургической операции путем раннего применения оРНК из свежевыделенной несортированной мононуклеарной фракции ККМ в дозе 30 мкг/100 г веса животного, введенной внутрибрюшинно однократно через 3-5 часов после завершения моделирования обширной резекции печени [З.З. Гоникова, A.О. Никольская, Л.А. Кирсанова, М.Ю. Шагидулин, Н.А. Онищенко, B.И. Севастьянов / Сравнительный анализ эффективности стимуляции процессов регенерации печени клетками костного мозга и обшей РНК этих клеток // Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2019, т. 21(1), С. 113-121]. Было показано, что применение оРНК из свежевыделенных мононуклеарных ККМ способствует активизации восстановительных процессов в остатке печени после ОРП, причем эффект коррекции ОПН от применения оРНК из мононуклеарных ККМ был более выраженным, чем от применения самих мононуклеарных ККМ в эквивалентной дозе, и это, как полагают, обусловлено более высокой проникающей и регуляторной способностью оРНК как химического вещества.A known method for correcting acute renal failure in an experiment after surgery by early application of sRNA from a freshly isolated unsorted mononuclear fraction of CCM at a dose of 30 μg / 100 g of animal weight, administered intraperitoneally once 3-5 hours after the completion of the modeling of extensive liver resection [Z.Z. Gonikova, A.O. Nikolskaya, L.A. Kirsanova, M. Yu. Shagidulin, N.A. Onishchenko, V.I. Sevastyanov / Comparative analysis of the effectiveness of stimulation of liver regeneration processes by bone marrow cells and the total RNA of these cells // Bulletin of transplantology and artificial organs, 2019, v. 21 (1), pp. 113-121]. It was shown that the use of sRNA from freshly isolated mononuclear CCM promotes the activation of recovery processes in the liver residue after ORD, and the effect of ARN correction from the use of sRNA from mononuclear CCM was more pronounced than from the use of mononuclear CCM themselves in an equivalent dose, and this is believed to be due to the higher penetrating and regulatory capacity of sRNA as a chemical.
Между тем, анализ эффективности регуляторного воздействия оРНК из свежевыделенных ККМ на восстановительные процессы в печени при ОПН показал, что эффект от однократного применения оРНК из свежевыделенных ККМ в указанной дозе недостаточен.Meanwhile, the analysis of the effectiveness of the regulatory effect of sRNA from freshly isolated CCM on recovery processes in the liver in acute renal failure showed that the effect of a single application of sRNA from freshly isolated CCM at the indicated dose is insufficient.
Известен способ лечения ОПН [RU 2701792, С1] путем двукратного применения оРНК из свежевыделенных мононуклеарных ККМ в лечебной дозе оРНК 50-60 мкг/100 г веса животного в предоперационном периоде, а затем через 3-4 часа после операции (прототип). Обладая высокой регуляторной активностью и предотвращая развитие летальных исходов при моделировании обширной резекции печени (70-75% печени), способ-прототип не способствует предотвращению или снижению летальности при моделировании субтотальной резекции печени (85-90% печени).There is a method of treating acute renal failure [RU 2701792, C1] by double application of oRNA from freshly isolated mononuclear CCM in a therapeutic dose of oRNA of 50-60 μg / 100 g of animal weight in the preoperative period, and then 3-4 hours after surgery (prototype). Possessing high regulatory activity and preventing the development of lethal outcomes when simulating extensive liver resection (70-75% of the liver), the prototype method does not help to prevent or reduce mortality when simulating subtotal liver resection (85-90% of the liver).
Таким образом, несмотря на существующие достоинства применения оРНК из свежевыделенных мононуклеарных ККМ при ОПН по сравнению с применением свежевыделенных мононуклеарных ККМ, (отсутствие опасности возникновения мутаций и малигнизации, возможности развития реакции «трансплантат против хозяина», а также достоверно более высокая регуляторная активность) даже при двукратном применении свежевыделенной оРНК сохраняется неудовлетворенность результатами ее индукционного воздействия на процессы восстановительной регенерации в печени при моделировании тяжелых форм ОПН путем хирургического иссечения критических объемов ткани печени.Thus, despite the existing advantages of using sRNA from freshly isolated mononuclear BMCs in ARF compared with the use of freshly isolated mononuclear BMCs (no risk of mutations and malignancy, the possibility of developing a “graft versus host” reaction, as well as significantly higher regulatory activity) even with double use of freshly isolated sRNA remains dissatisfied with the results of its induction effect on the processes of regenerative regeneration in the liver when modeling severe acute renal failure by surgical excision of critical volumes of liver tissue.
По современным представлениям недостаточная эффективность применения клеточных биотехнологий при тяжелых формах острых заболеваний печени может быть связана с возникающим в ткани печени истощением резервов активации собственных тканевых адаптационно - приспособительных механизмов, запускающих и регулирующих процесс восстановительной регенерации: например, в результате возникновения резкого дефицита печеночной ткани и возросшей функциональной нагрузки на оставшуюся ткань после обширной резекции печени при ОПН. Такое представление обосновывается тем, что индукция регенерационных процессов в печени, как и в других органах, всегда начинается с активации и использования собственных сохранившихся резервов, необходимых для защиты и выживания клеток, а именно с процессов клеточной аутофагии, развивающихся в рамках эволюционно выработанного неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы для формирования энергетической, структурной и функциональной устойчивости клеток к действию различных стрессорных факторов внешней и внутренней среды организма [А.Д. Браун, Г.П. Мозженок / Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы //Л., Изд. Наука, 1987].According to modern concepts, the insufficient efficiency of the application of cellular biotechnologies in severe forms of acute liver diseases can be associated with the depletion of the reserves of activation of its own tissue adaptive mechanisms that trigger and regulate the process of restorative regeneration that occurs in the liver tissue: for example, as a result of a sharp deficiency of liver tissue and increased functional load on the remaining tissue after extensive liver resection in ARF. This view is substantiated by the fact that the induction of regeneration processes in the liver, as in other organs, always begins with the activation and use of its own preserved reserves necessary for the protection and survival of cells, namely, with the processes of cellular autophagy developing within the framework of an evolutionarily developed nonspecific adaptation syndrome the cellular system for the formation of energy, structural and functional resistance of cells to the action of various stress factors of the external and internal environment of the body [A.D. Brown, G.P. Brain / Nonspecific adaptive syndrome of the cellular system // Leningrad, Ed. Science, 1987].
Аутофагия представляет собой процесс прижизненной утилизации измененного метаболитами содержимого цитоплазмы клеток для поддержания их структурного и энергетического гомеостаза. В настоящее время аутофагию рассматривают даже не как процесс «запрограмированного умирания», а как процесс преимущественно «запрограммированного выживания» клеток [М.П. Потапнев / Аутофагия, апоптоз, некроз клеток и иммунное распознавание своего и чужого // Иммунология, 2014, №2, с. 95-102]. Аутофагия ингибирует развитие необратимого апоптоза клеток и играет защитную роль в условиях оксидативного стресса [Pu Т., Liao Х.Н., Sun Н. et al. / Augmenter of liver regeneration regulates autophagy in renal ischemia-reperfusion injury via the AMPK/mTOR pathway// Apoptosis, 2017 jul.; 22(7): 955-969].Autophagy is the process of in vivo utilization of the contents of the cytoplasm of cells changed by metabolites to maintain their structural and energetic homeostasis. Currently, autophagy is considered not even as a process of "programmed dying", but as a process of predominantly "programmed survival" of cells [M.P. Potapnev / Autophagy, apoptosis, cell necrosis and immune recognition of self and alien // Immunology, 2014, no. 2, p. 95-102]. Autophagy inhibits the development of irreversible apoptosis of cells and plays a protective role under conditions of oxidative stress [Pu T., Liao HN, Sun N. et al. / Augmenter of liver regeneration regulates autophagy in renal ischemia-reperfusion injury via the AMPK / mTOR pathway // Apoptosis, 2017 jul .; 22 (7): 955-969].
В печени аутофагия служит важнейшим регулятором поддержания функциональной активности ее стволовых/прогениторных клеток, которые, как известно, являются непременными участниками запуска процессов самообновления, пролиферации и дифференцировки клеток печени при регенерации [Cheng Y., Wang В., Zhou Н., Dang S. et al. /Autophagy is required for the maintenance of liver progenitor cell functionality // Cell Physiol Biochem., 2015; 36(3): 1163-1174].In the liver, autophagy serves as the most important regulator of maintaining the functional activity of its stem / progenitor cells, which, as you know, are indispensable participants in the initiation of the processes of self-renewal, proliferation and differentiation of liver cells during regeneration [Cheng Y., Wang B., Zhou N., Dang S. et al. / Autophagy is required for the maintenance of liver progenitor cell functionality // Cell Physiol Biochem., 2015; 36 (3): 1163-1174].
Известно также, что фармакологическая модуляция аутофагии в печени в ранние сроки после обширной (70-75%) и субтотальной (85-90%) резекции печени способна повысить выживаемость животных и эффективность регенерации оставшейся части печени [Lin C.W., Chen Y.S., Lin С.С.et al. / Amiodarone as an autophagy promoter reduces liver injury and enhances liver regeneration and survival in mice after partial hepatectomy // Sci. Rep., 2015 Oct 30; 5: 15807].It is also known that pharmacological modulation of autophagy in the liver in the early stages after extensive (70-75%) and subtotal (85-90%) liver resection can increase the survival rate of animals and the efficiency of regeneration of the remaining part of the liver [Lin CW, Chen YS, Lin C. C. et al. / Amiodarone as an autophagy promoter reduces liver injury and enhances liver regeneration and survival in mice after partial hepatectomy // Sci. Rep., 2015
Таким образом, по нашему мнению, из-за недостаточной выраженности процессов аутофагии в печени в результате критического истощения ее индукционных резервов при тяжелом (критическом) снижении массы печени, регенерационный эффект от применения оРНК из свежевыделенных ККМ оказался недостаточным при лечении тяжелых форм ОПН.Thus, in our opinion, due to insufficient severity of autophagy processes in the liver as a result of critical depletion of its induction reserves in severe (critical) decrease in liver weight, the regenerative effect from the use of sRNA from freshly isolated CCM was insufficient in the treatment of severe forms of acute renal failure.
Техническая проблема заключается в повышении активности индукционного и регуляторного воздействия оРНК из свежевыделенных ККМ на процессы репаративной регенерации печени для обеспечения ускорения темпа, надежности и результативности лечения тяжелых и крайне тяжелых форм ОПН, развивающихся после хирургического иссечения критических объемов ткани печени.The technical problem is to increase the activity of the inductive and regulatory effect of sRNA from freshly isolated CCM on the processes of reparative liver regeneration to ensure an acceleration of the rate, reliability and effectiveness of treatment of severe and extremely severe forms of acute renal failure developing after surgical excision of critical volumes of liver tissue.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предлагаемого изобретения заключается:The technical result achieved by the implementation of the proposed invention is:
- в сокращении сроков и повышении эффективности лечения ОПН, включая предотвращение летальных исходов после обширной резекции печени (70-75% печени), а также снижение летальности при осуществлении субтотальной резекции печени (85-90% печени) путем интраоперационной индукции у оперируемого пациента раннего и более высокого темпа процессов восстановительной регенерации (индукция высокого уровня митотической и пролиферативной активности клеток в оставшейся части печени уже на вторые сутки послеоперационного периода) за счет интраоперационного применения биологически эффективной дозы активированной оРНК, полученной из ККМ, предварительно подвергнутых аутофагии, что позволяет повысить мощность и эффективность формирования регенерационного процесса в печени, всегда происходящего в рамках неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы на воздействия стресс факторов слабой и умеренной биологической силы.- in reducing the time and increasing the effectiveness of treatment of acute renal failure, including preventing deaths after extensive liver resection (70-75% of the liver), as well as reducing mortality during subtotal liver resection (85-90% of the liver) by intraoperative induction in the operated patient, an early and a higher rate of regenerative regeneration processes (induction of a high level of mitotic and proliferative activity of cells in the remaining part of the liver already on the second day of the postoperative period) due to the intraoperative use of a biologically effective dose of activated sRNA obtained from CCMs previously subjected to autophagy, which makes it possible to increase the power and efficiency the formation of a regenerative process in the liver, always occurring within the framework of a nonspecific adaptive syndrome of the cellular system to the effects of stress factors of weak and moderate biological strength.
в простоте и низкой себестоимости процесса получения активированной оРНК из ККМ, предварительно подвергнутых аутофагии.in the simplicity and low cost of the process of obtaining activated sRNA from CCM, previously subjected to autophagy.
Нами предложена оригинальная «предварительная подготовка» несортированных мононуклеарных ККМ перед выделением из них оРНК. За счет хранения этих клеток при 4-6°С в ион сбалансированном водно-солевом растворе «Кустодиол» (раствор Бредшнейдера) в течение 3-18 часов происходит активация оРНК. Предлагаемый режим хранения, обеспечивая аутофагию ККМ, исключает при этом развитие необратимого апоптоза этих клеток.We have proposed an original “preliminary preparation” of unsorted mononuclear CCMs prior to the isolation of sRNA from them. By storing these cells at 4-6 ° C in an ion-balanced water-salt solution "Custodiol" (Bredschneider's solution) for 3-18 hours, oRNA is activated. The proposed storage regime, providing autophagy of BMC, excludes the development of irreversible apoptosis of these cells.
Разработанная нами технология подготовки получения и применения оРНК при ОПН обеспечивает ранний и более высокий уровень митотической и пролиферативной активности в сохранившихся клетках резецированной печени, создает условия для раннего восстановления (на 7-10 сутки) исходной массы печени и тем самым позволяет предотвратить летальность после обширной резекции печени (70-75%) и снизить летальность после субтотальной резекции печени (85-90%).The technology developed by us for the preparation of the production and use of sRNA in acute renal failure provides an early and higher level of mitotic and proliferative activity in the preserved cells of the resected liver, creates conditions for early recovery (on days 7-10) of the initial liver mass and thereby prevents mortality after extensive resection liver (70-75%) and reduce mortality after subtotal liver resection (85-90%).
В предлагаемом нами способе лечения ОПН, исходным материалом для получения активированной оРНК служит свежевыделенная фракция гемопоэтических мононуклеарных ККМ (аутологичных или аллогенных) здорового донора. В качестве донора мононуклеарных ККМ при резекции печени может выступать сам пациент, но только до резекции у него печени, так как операция обширной резекции печени (70-75%) и тем более субтотальная резекция (85-90%) сама по себе уже в ранний период (первые сутки) ингибирует регенераторные процессы, как в печени, так и в костном мозге.In our proposed method for treating acute renal failure, a freshly isolated fraction of hematopoietic mononuclear CCM (autologous or allogeneic) of a healthy donor serves as the starting material for obtaining activated sRNA. The patient himself can act as a donor of mononuclear CCM during liver resection, but only before resection of his liver, since the operation of extensive liver resection (70-75%) and even more subtotal resection (85-90%) itself already in the early period (first day) inhibits regenerative processes, both in the liver and in the bone marrow.
В предлагаемом способе лечения ОПН, развившейся после хирургической операции резекции печени используется предварительно активированная оРНК из мононуклеарных ККМ. Активированная оРНК содержит уже готовый спектр молекул РНК тех типов и классов, которые образовались в результате аутофагии мононуклеарных ККМ в ответ на применение их гипотермической консервации (биологически допустимый стресс-фактор умеренной силы) в ион сбалансированном водно-солевом консервирующем растворе «Кустодиол», обеспечивающем при температуре 4-6°С длительную и надежную сохранность этих клеток в течение 3-18 часов. Длительная и надежная сохранность мононуклеарных ККМ обеспечивается составом консервирующего раствора и гипотермическими условиями хранения, которые воздействуют на ККМ, как адаптогены средней и слабой биологической силы, индуцирующие в самих ККМ гомеостатическую перестройку (в том числе метаболизма) через активацию процессов аутофагии в рамках развития эволюционно выработанного в клетках неспецифического адаптационного синдрома.In the proposed method for the treatment of acute renal failure, developed after a surgical operation of liver resection, a pre-activated sRNA from mononuclear CCM is used. The activated sRNA contains a ready-made spectrum of RNA molecules of those types and classes that were formed as a result of autophagy of mononuclear CCM in response to the application of their hypothermic preservation (biologically acceptable stress factor of moderate strength) in the ion-balanced water-salt preservative solution "Custodiol", which provides temperature 4-6 ° C long-term and reliable preservation of these cells for 3-18 hours. Long-term and reliable preservation of mononuclear CCMs is ensured by the composition of the preserving solution and hypothermic storage conditions, which affect CCMs as adaptogens of medium and weak biological strength, inducing homeostatic rearrangements in CCMs (including metabolism) through the activation of autophagy processes within the development of evolutionarily developed in cells of nonspecific adaptation syndrome.
При введении в организм для лечения ОПН активированная оРНК в биологически эффективной дозе, полученная из ККМ, подвергнутых аутофагии, действует более ускоренно и результативно на поврежденную печень, так как реализует свой эффект на клетки печени и как адаптоген (в рамках неспецифического адаптивного синдрома), и как готовый регулятор процессов регенерации, аккумулирующий в своем составе адекватный спектр молекул РНК, необходимых для запуска процессов аутофагии и регенерации поврежденной печени. В результате активированная оРНК более ускоренно и эффективно индуцирует в клетках поврежденной печени процессы аутофагии - ранней самой важной и определяющей фазы запуска регенераторного процесса, проявляющегося более ранней активацией восстановительных и пролиферативных процессов.When introduced into the body for the treatment of acute renal failure, activated sRNA in a biologically effective dose, obtained from CCM subjected to autophagy, acts more rapidly and effectively on the damaged liver, since it realizes its effect on liver cells and as an adaptogen (within the framework of a nonspecific adaptive syndrome), and as a ready-made regulator of regeneration processes, accumulating in its composition an adequate range of RNA molecules necessary for starting autophagy and regeneration of a damaged liver. As a result, the activated sRNA more accelerated and efficiently induces autophagy in the cells of the damaged liver - the earliest most important and defining phase of the start of the regenerative process, manifested by the earlier activation of regenerative and proliferative processes.
Очевидно, запуск регенерационного процесса в печени осуществляют два фактора - содержащиеся в активированной оРНК многочисленные микро РНК, образовавшиеся в процессе индукции аутофагии ККМ при их гипотермическом хранении в растворе «Кустодиол», а также микро РНК ускоренно экспрессировавшиеся в клетках поврежденной печени под воздействием использования адаптогенов.Obviously, the start of the regeneration process in the liver is carried out by two factors - numerous microRNAs contained in the activated oRNA, formed during the induction of CMC autophagy during their hypothermic storage in Custodiol solution, as well as microRNAs acceleratedly expressed in cells of the damaged liver under the influence of the use of adaptogens.
Достоинствами предлагаемого способа лечения ОПН, позволяющими обеспечить клиническую доступность метода и по существу достигнуть выраженного и надежного лечебного эффекта являются:The advantages of the proposed method of treating acute renal failure, allowing to ensure the clinical availability of the method and, in essence, to achieve a pronounced and reliable therapeutic effect are:
- раннее интраоперационное применение активированной оРНК в эффективной дозе при ОПН, вызванной обширной (70-75%) или субтотальной (85-90%) резекцией печени позволяет уже в 1-2 сутки послеоперационного периода активизировать адаптационные и восстановительные процессы в остатке печени, затормозить деструктивные процессы, обеспечить максимально раннюю регенерационную поддержку печени и, тем самым, предотвратить или достоверно снизить процент летальных исходов.- early intraoperative use of activated sRNA in an effective dose for acute renal failure caused by extensive (70-75%) or subtotal (85-90%) liver resection makes it possible to activate adaptation and recovery processes in the remainder of the liver already in 1-2 days of the postoperative period, slow down destructive processes, to provide the earliest possible regenerative support of the liver and, thereby, prevent or reliably reduce the percentage of deaths.
- возможность применения при необходимости повторных парентеральных введений активированной оРНК и достижения позитивного результата при использовании даже сниженных доз препарата.- the possibility of using, if necessary, repeated parenteral injections of activated sRNA and achieving a positive result when using even reduced doses of the drug.
- возможность обеспечить раннюю компенсаторную поддержку процессам восстановительной регенерации не только печени, но и адаптационную поддержку других органов (почки, легкие), относящихся к единой системе детоксикации организма и участвующих в поддержании печеночного гомеостаза, а также в снижении опасности возникновения летальных исходов;- the ability to provide early compensatory support for the processes of restorative regeneration not only of the liver, but also adaptive support of other organs (kidneys, lungs) that belong to the unified detoxification system of the body and participate in maintaining hepatic homeostasis, as well as in reducing the risk of death;
- возможность проводить более эффективную регенерационную терапию различных органов и систем в организме, так как активированная оРНК, выделенная из мононуклеарной фракции ККМ здорового донора, сохраняет универсальность регуляторных свойств этих клеток и будучи биохимическим препаратом с высокой проникающей активностью, обладает более мощным регуляторным воздействием, чем неактивированная оРНК;- the ability to conduct more effective regenerative therapy of various organs and systems in the body, since the activated oRNA isolated from the mononuclear fraction of the CCM of a healthy donor retains the versatility of the regulatory properties of these cells and, being a biochemical preparation with high penetrating activity, has a more powerful regulatory effect than the inactivated oRNA;
- возможность использования стандартного ион сбалансированного водно-солевого консервирующего раствора «Кустодиол», применяющегося в трансплантологии для сохранения (консервации) различных органов перед пересадкой делает процедуру индукции аутофагии в мононуклеарных ККМ, используемых для получения препарата активированной оРНК, доступной для широкого клинического применения.- the possibility of using the standard ion-balanced water-salt preservative solution "Custodiol", which is used in transplantology to preserve (preserve) various organs before transplantation, makes the procedure for induction of autophagy in mononuclear MCMs used to obtain an activated oRNA preparation available for wide clinical use.
Сущность изобретения заключается в следующем.The essence of the invention is as follows.
Для лечения ОПН в эксперименте после хирургической операции, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени, получают несортированную фракцию мононуклеарных клеток костного мозга от крысы-донора и хранят в растворе «Кустодиол» при температуре 4-6°С в течение 3-18 часов. Затем из нее получают общую РНК и вводят в дозе 90-110 мкг/100 г веса животного однократно внутрибрюшинно экспериментальному животному - крысе сразу после завершения хирургического моделирования ОПН путем обширной (70-75%) или субтотальной (85-90%) резекции печени, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени.For the treatment of acute renal failure in an experiment after a surgical operation, as a result of which a critical deficit of functioning liver tissue is formed, an unsorted fraction of bone marrow mononuclear cells is obtained from a donor rat and stored in a Custodiol solution at a temperature of 4-6 ° C for 3-18 hours ... Then, total RNA is obtained from it and injected at a dose of 90-110 μg / 100 g of animal weight once intraperitoneally to an experimental animal - a rat immediately after the completion of surgical modeling of ARF by extensive (70-75%) or subtotal (85-90%) liver resection, as a result of which a critical deficit of functioning liver tissue is formed.
Хирургической операцией, в результате которой формируется критический дефицит функционирующей ткани печени может быть обширная или субтотальная резекция печени.A surgical operation resulting in a critical deficit of functioning liver tissue can be extensive or subtotal liver resection.
Таким образом, для лечения в эксперименте тяжелой формы ОПН, созданной путем хирургического иссечения больших (70-75%) и крайне больших (85-90%) объемов ткани печени, выделяют мононуклеарную фракцию ККМ от здорового животного-донора-крысы. Затем полученную фракцию несортированных мононуклеарных клеток активируют для индукции в этих клетках процессов аутофагии и адаптивной перестройки клеточного (в том числе энергетического) гомеостаза путем погружения их в охлажденный консервирующий раствор «Кустодиол» с допустимым сроком хранения в нем при температуре 4-6°С в течение от 3 до 18 часов (срок в течение которого ККМ преимущественно сохраняют жизнеспособность и в них развивается аутофагия, что контролируется по уровню появления в сохраняемых клетках необратимого апоптоза, составляющего не более 7-10% от общей массы клеток).Thus, for experimental treatment of severe acute renal failure, created by surgical excision of large (70-75%) and extremely large (85-90%) volumes of liver tissue, a mononuclear BMC fraction is isolated from a healthy rat donor animal. Then the resulting fraction of unsorted mononuclear cells is activated to induce autophagy processes in these cells and adaptive restructuring of cellular (including energy) homeostasis by immersing them in a chilled preservative solution "Custodiol" with a permissible shelf life in it at a temperature of 4-6 ° C for from 3 to 18 hours (the period during which CCM predominantly remain viable and autophagy develops in them, which is controlled by the level of occurrence of irreversible apoptosis in preserved cells, which is no more than 7-10% of the total mass of cells).
Затем из полученной фракции несортированных мононуклеарных ККМ, которые активированы процессом их хранения в охлажденном растворе «Кустодиол», выступающего в роли биологически допустимого адаптогена, выделяют оРНК, которая является уже активированной, т.к. содержит в своем составе новый готовый спектр образовавшихся молекул РНК, способных запустить адаптационный и регенерационный процессы в печени после применения.Then, from the obtained fraction of unsorted mononuclear CCM, which are activated by the process of their storage in a cooled solution of "Custodiol", which acts as a biologically acceptable adaptogen, oRNA is isolated, which is already activated, because contains in its composition a new ready-made spectrum of the formed RNA molecules capable of starting the adaptation and regeneration processes in the liver after application.
Активированную оРНК вводят экспериментальному животному -крысе однократно внутрибрюшинно интраоперационно сразу после завершения хирургического моделирования ОПН путем обширной (70-75%) или субтотальной (85-90%) резекции печени в дозе 90-110 мкг/100 грамм веса животного.The activated sRNA is administered to the experimental rat animal once intraperitoneally intraoperatively immediately after the completion of surgical modeling of ARF by extensive (70-75%) or subtotal (85-90%) liver resection at a dose of 90-110 μg / 100 grams of animal weight.
Предлагаемый способ, главным компонентом которого, является получение и применение активированной оРНК, обладает более мощным лечебным воздействием на поврежденную (резецированную) печень, чем неактивированная оРНК, полученная из свежевыделенных ККМ.The proposed method, the main component of which is the production and use of activated oRNA, has a more powerful therapeutic effect on the damaged (resected) liver than non-activated oRNA obtained from freshly isolated CCM.
Обнаруженный эффект обусловлен двумя механизмами:The discovered effect is due to two mechanisms:
- активированная оРНК, будучи экзогенным адаптогеном, оказывает адаптивное воздействие на организм пациента с острой печеночной недостаточностью, вызывает гомеостатическую перестройку метаболизма в сохранившихся клетках печени, а также в клетках других органов, индуцируя в них процессы аутофагии. За счет индукции процессов аутофагии создаются предпосылки для запуска процессов восстановительного морфогенеза (регенерации) в клетках печени, костного мозга, а также в клетках других органов (почки, легкие), участвующих в поддержании детоксикационной функции печени;- activated sRNA, being an exogenous adaptogen, has an adaptive effect on the body of a patient with acute liver failure, causes homeostatic restructuring of metabolism in preserved liver cells, as well as in cells of other organs, inducing autophagy processes in them. Due to the induction of autophagy processes, prerequisites are created for starting the processes of restorative morphogenesis (regeneration) in the cells of the liver, bone marrow, as well as in the cells of other organs (kidneys, lungs) involved in maintaining the detoxification function of the liver;
- активированная оРНК содержит дополнительно в своем составе новый готовый спектр именно тех регуляторных молекул РНК, которые образовались в процессе аутофагии мононуклеарных ККМ, более ускоренно запускающие в организме регенераторные процессы, дополнительно усиливая морфорегуляторную активность клеток печени, костного мозга, а также клеток почек и легких, участвующих в поддержании функции печени, как у экспериментального животного, так и у пациента в клинике.- the activated sRNA additionally contains in its composition a new ready-made spectrum of precisely those regulatory RNA molecules that were formed in the process of autophagy of mononuclear BMCs, which more rapidly trigger regenerative processes in the body, further enhancing the morphoregulatory activity of liver cells, bone marrow, as well as kidney and lung cells, participating in the maintenance of liver function, both in the experimental animal and in the patient in the clinic.
Сочетанная реализация обоих механизмов при использовании активированной оРНК существенно усиливает и ускоряет восстановительный процесс в остатке резецированной печени.The combined implementation of both mechanisms using activated sRNA significantly enhances and accelerates the recovery process in the remnant of the resected liver.
Способ осуществляется следующим образомThe method is carried out as follows
Для лечения ОПН, развившейся после моделирования обширной и субтотальной резекции печени, применяют оРНК из активированных мононуклеарных ККМ, предварительно подвергнутых процессу аутофагии в охлажденном консервирующем растворе «Кустодиол».For the treatment of acute renal failure, which has developed after modeling an extensive and subtotal liver resection, sRNA is used from activated mononuclear BMCs previously subjected to autophagy in a cooled preservative solution "Custodiol".
В результате аутофагии в мононуклеарных ККМ происходит адаптивная структурно-функциональная перестройка, обеспечивающая повышение устойчивости этих клеток к действию стрессорных факторов. В обзоре литературы показано, что медикаментозная индукция процессов аутофагии в печени повышает эффективность регенерации печени и выживаемость мышей после частичной гепатэктомии [Lin C.W., Chen Y.S., Lin С.С.et al. / Amiodarone as an autophagy promoter reduces liver injury and enhances liver regeneration and survival in mice after partial hepatectomy // Sci. Rep., 2015 Oct 30; 5: 15807]. оРНК, полученная из этих ККМ, становится активированной, так как содержат в своем составе именно тот спектр готовых вновь образовавшихся молекул РНК, который отсутствует или недостаточен в поврежденном органе, но который при введении в организм ускоренно и более мощно адаптирует поврежденные органы (печень), индуцируя в них приспособительные (аутофагию клеток печени) и восстановительные процессы (восстановительную регенерацию).As a result of autophagy, an adaptive structural and functional rearrangement occurs in mononuclear BMCs, providing an increase in the resistance of these cells to the action of stress factors. A literature review shows that drug induction of autophagy processes in the liver increases the efficiency of liver regeneration and survival of mice after partial hepatectomy [Lin C.W., Chen Y.S., Lin C.C. et al. / Amiodarone as an autophagy promoter reduces liver injury and enhances liver regeneration and survival in mice after partial hepatectomy // Sci. Rep., 2015
Комплекс активированных молекул оРНК содержит все необходимые типы РНК, в том числе все типы регуляторных РНК (прежде всего микро РНК), обеспечивающих перенос «регенерационной и сигнальной информации» клеткам костного мозга и клеткам поврежденной печени пациента для ускоренной и мощной индукции восстановительных процессов в печени, а также для индукции адаптивно-приспособительных процессов в органах (почки, легкие), поддерживающих детоксикационную функцию печени.The complex of activated sRNA molecules contains all the necessary types of RNA, including all types of regulatory RNAs (primarily microRNAs) that provide the transfer of "regenerative and signaling information" to bone marrow cells and cells of the patient's damaged liver for accelerated and powerful induction of recovery processes in the liver, as well as for the induction of adaptive processes in organs (kidneys, lungs) that support the detoxification function of the liver.
Выполнение способа начинают с получения мононуклеарной фракции клеток из аспирата костного мозга животного. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала болынеберцовых и бедренных костей крысы-донора получали ККМ путем аспирации их шприцом с иглой 18G, содержащим среду для забора (0.5 мл фосфатно-буферного раствора с 50 ЕД/мл гепарина и 0.25 мг/л гентамицина).The method begins with obtaining a mononuclear fraction of cells from an animal bone marrow aspirate. To do this, under ether anesthesia from the bone marrow canal of the tibial and femur bones of the donor rat, CCM was obtained by aspiration with a syringe with an 18G needle containing a sampling medium (0.5 ml of phosphate-buffered saline with 50 U / ml of heparin and 0.25 mg / L of gentamicin).
Суспензию ККМ центрифугировали при 1500 об/мин (350g) 5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов и тромбоцитов (114 мМ NH4CL, 7,5 mM KHCO3, 100 мкМ EDTA) в течение 3 минут и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей 10% телячью эмбриональную сыворотку («HyClonegold», USA), инсулин 0.4 мкМ, 0.25 мг/л гентамицина.The CMC suspension was centrifuged at 1500 rpm (350g) for 5 minutes, the cell pellet was resuspended in a solution for lysis of erythrocytes and platelets (114 mM NH 4 CL, 7.5 mM KHCO 3 , 100 μM EDTA) for 3 minutes and re-centrifuged. The hemolyzed supernatant was removed by suction, and the cell pellet was resuspended in DMEM medium (PanEco, Russia) containing 10% fetal calf serum (HyClonegold, USA), 0.4 μM insulin, 0.25 mg / L gentamicin.
Выделенные клетки представляли собой мононуклеарную фракцию, преимущественно гемопоэтических ККМ, суммарный выход которых колебался от 0,8-1.5×107 клеток. Далее удаляли среду DMEM, а выделенные мононуклеарные ККМ помещали в охлажденный до 4-6°С консервирующий раствор «Кустодиол» (Др. Франц Келер Хеми ГмбХ, Германия) сроком от 3 до 18 часов, в течение которого мононуклеарные клетки сохраняют жизнеспособность, поддерживая свой гомеостаз за счет эволюционно выработанного механизма адаптивной структурно-функциональной и энергетической перестройки собственных резервов в ответ на стрессорное воздействие гипотермии и ион сбалансированного консервирующего раствора. Этот процесс структурно-функциональной и энергетической перестройки, обеспечивающий сохранение жизнеспособности ККМ, сопровождается процессом аутофагии и развитием обратимого апоптоза клеток в процессе хранения, что контролировали путем измерения и объективной оценки количества жизнеспособных клеток с помощью витального красителя 7-AAD (7 аминоактиномицин D, фирмы Beckman Coulter, США), который проникает в ядра только нежизнеспособных клеток и интерколирует в двойную спираль ДНК. Позитивно окрашенные, то есть нежизнеспособные мононуклеарные клетки при использовании 7-AAD, составляли не более 7-10% после хранения в растворе «Кустодиол» в сроках от 3 до 18 часов.The isolated cells were a mononuclear fraction, mainly hematopoietic CCM, the total yield of which ranged from 0.8-1.5 × 10 7 cells. Next, the DMEM medium was removed, and the isolated mononuclear CCMs were placed in a preservative solution "Custodiol" cooled to 4-6 ° C (Dr. Franz Kehler Chemie GmbH, Germany) for a period of 3 to 18 hours, during which mononuclear cells remain viable, maintaining their homeostasis due to an evolutionarily developed mechanism of adaptive structural-functional and energetic restructuring of their own reserves in response to the stressful effects of hypothermia and ion-balanced preservative solution. This process of structural, functional and energetic rearrangement, ensuring the preservation of the viability of CCM, is accompanied by the process of autophagy and the development of reversible cell apoptosis during storage, which was controlled by measuring and objectively assessing the number of viable cells using the vital dye 7-AAD (7 aminoactinomycin D, Beckman Coulter, USA), which penetrates into the nuclei of only non-viable cells and intercolates into the DNA double helix. Positively stained, that is, non-viable mononuclear cells when using 7-AAD, accounted for no more than 7-10% after storage in Custodiol solution for periods from 3 to 18 hours.
Жизнеспособность свежевыделенных мононуклеарных ККМ, то есть без холодового хранения, составляла 97-99%. Рецептура консервирующего раствора «Кустодиол», предназначенного для осуществления противоишемической защиты донорских органов при трансплантации и использованного нами для получения активированных мононуклеарных ККМ представлена в таблице №1.The viability of freshly isolated mononuclear CCM, that is, without cold storage, was 97-99%. The recipe of the preservative solution "Custodiol", intended for the implementation of anti-ischemic protection of donor organs during transplantation and used by us to obtain activated mononuclear CCM is presented in Table 1.
Далее приступали к выделению активированной оРНК из выделенных и подвергнутых аутофагии мононуклеарных ККМ по методике «Extract RNA», разработанной фирмой «ЕВРОГЕН» (Россия).Next, we proceeded to isolate activated sRNA from isolated and autophagic mononuclear BMCs according to the Extract RNA technique developed by EUROGEN (Russia).
К полученной фракции мононуклеарных клеток добавляли реагент Extract RNA из расчета 1 мл реагента на 1×106 клеток (в камере Горяева предварительно подсчитывали количество клеток), инкубировали смесь 15 минут, периодически пипетируя,) и центруфугировали при 13400 об/мин 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку и приступали к разделению фаз. Для этого добавляли 0.2 мл хлороформа на каждый 1 мл реагента Extract RNA, инкубировали смесь в течение 5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая образец; затем образец центруфугировали при 13400 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре. В ходе центруфугирования происходило разделение смесей на три фазы: нижнюю-органическую фенол хлороформную фазу желтоватого оттенка, интерфазу белого цвета и верхнюю бесцветную водную фазу. РНК находится в верхней водной фазе, которую аккуратно собирали и переносили в чистую пробирку.To the obtained fraction of mononuclear cells, the Extract RNA reagent was added at the rate of 1 ml of reagent per 1 × 10 6 cells (the number of cells was preliminarily counted in the Goryaev chamber), the mixture was incubated for 15 minutes, periodically pipetting) and centrifuged at 13400 rpm for 10 minutes to remove undissolved fragments. The supernatant was transferred to a new tube and phase separation was started. For this, 0.2 ml of chloroform was added for each 1 ml of Extract RNA reagent, the mixture was incubated for 5 min at room temperature, periodically shaking the sample; then the sample was centrifuged at 13,400 rpm for 15 minutes at room temperature. In the course of centrifugation, the mixtures were separated into three phases: a lower organic phenol chloroform phase of a yellowish hue, a white interphase, and an upper colorless aqueous phase. The RNA is in the upper aqueous phase, which is carefully collected and transferred to a clean tube.
Затем приступали к непосредственному выделению оРНК. Для этого в водную фазу добавляли 0.5 мл 100% изопропанола на каждый 1 мл использованного реагента (Extract RNA). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем аккуратно, по стенке пробирки, добавляли 2 мл 75% этанола на каждый 1 мл изопропанола, использованного ранее. Полученный образец центрифугировали на максимальной скорости (13400 об/мин) в течение 5 минут. Удаляли этанол пипеткой и осадок, выделенной оРНК, растворяли в 1 мл воды и определяли концентрацию оРНК в 100 мкл образца на спектрофотометре при длине волны 260 нм. Из каждых 4-6 млн исходно использованных мононуклеарных клеток КМ в 1 мл определялось 380-500 мкг оРНК. Далее из этого концентрированного раствора оРНК готовили рабочие растворы оРНК, требуемой концентрации для введения в организм животного с целью лечения ОПН. Активированная оРНК, выделенная из мононуклеарных ККМ, представляет собой биотехнологический продукт высокой степени очистки, который вводят парентерально (внутрибрюшинно) и интраоперационно животным (крысы) на этапе завершения хирургического моделирования ОПН.Then we proceeded to the direct isolation of sRNA. For this, 0.5 ml of 100% isopropanol was added to the aqueous phase for each 1 ml of the used reagent (Extract RNA). The resulting mixture was incubated at room temperature for 10 minutes and centrifuged at 13,400 rpm for 10 minutes at room temperature. Then carefully, along the wall of the tube, 2 ml of 75% ethanol was added for each 1 ml of isopropanol used earlier. The resulting sample was centrifuged at maximum speed (13,400 rpm) for 5 minutes. Ethanol was removed with a pipette, and the precipitate of the isolated sRNA was dissolved in 1 ml of water, and the concentration of sRNA in 100 μl of the sample was determined on a spectrophotometer at a wavelength of 260 nm. From each 4-6 million initially used mononuclear cells of KM, 380-500 μg of sRNA was determined in 1 ml. Further, from this concentrated solution of oRNA, working solutions of oRNA were prepared, the required concentration for introduction into the animal's body for the purpose of treating ARF. Activated sRNA isolated from mononuclear CCM is a highly purified biotechnological product that is administered parenterally (intraperitoneally) and intraoperatively to animals (rats) at the stage of completing surgical modeling of ARF.
Рабочий раствор активированной оРНК содержал 76-100 мкг РНК/мл (к 1.0 мл концентрированного раствора оРНК добавляли 4 мл дистиллированной воды). Введение оРНК осуществляли в дозе 90-110 мкг на 100 г веса животного. У животных с моделью ОПН активированную оРНК вводили однократно интраоперационно, сразу после выполнения обширной (70-75%) или субтотальной (85-90%) резекции печени внутрибрюшинно, то есть крысе массой 300 г однократно вводят по 300±30 мкг (270-330 мкг) оРНК в виде 2,7 - 3,3 мл рабочего раствора оРНК при содержании в нем 100 мкг оРНК/мл или 3,5 - 4,3 мл рабочего раствора оРНК при содержании в нем 76 мкг оРНК/мл.The working solution of activated sRNA contained 76-100 μg RNA / ml (4 ml of distilled water was added to 1.0 ml of concentrated solution of oRNA). The introduction of sRNA was carried out at a dose of 90-110 μg per 100 g of animal weight. In animals with a model of ARF, activated sRNA was injected intraoperatively once, immediately after extensive (70-75%) or subtotal (85-90%) liver resection was performed intraperitoneally, that is, a rat weighing 300 g was injected once at 300 ± 30 μg (270-330 μg) of sRNA in the form of 2.7 - 3.3 ml of a working solution of oRNA with a content of 100 μg of oRNA / ml or 3.5 - 4.3 ml of a working solution of oRNA with a content of 76 μg of oRNA / ml.
Приводим примеры осуществления предлагаемого способа лечения ОПН после обширной (70-75%) и субтотальной (85-90%) резекции печени.We give examples of the implementation of the proposed method of treatment of acute renal failure after extensive (70-75%) and subtotal (85-90%) liver resection.
Все исследования с использованием лабораторных животных проводили в строгом соответствии с законодательством Российской Федерации (в соответствии с Правилами лабораторной практики, утвержденными приказом Минздрава России №708 от 23.08.2010 г, а также стандартам ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к условиям содержания животных») и с соблюдением биотических принципов, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, 2005 г.All studies using laboratory animals were carried out in strict accordance with the legislation of the Russian Federation (in accordance with the Rules of laboratory practice, approved by order of the Ministry of Health of Russia No. 708 dated 23.08.2010, as well as the standards GOST R ISO 10993-2-2009 "Medical devices. Assessment biological action of medical devices.
Эффективность предлагаемого способа лечения ОПН, возникшей в результате снижения функционирующей массы печени до критического уровня, изучали на моделях обширной и субтотальной резекции печени у крыс.The effectiveness of the proposed method for the treatment of acute renal failure, resulting from a decrease in the functioning liver mass to a critical level, was studied in models of extensive and subtotal liver resection in rats.
При создании модели обширной резекции печени (резекция 70-75% общей массы печени) у крыс под внутримышечной анестезией раствором золетила из расчета 15 мг/кг с соблюдением правил асептики и антисептики вскрывали брюшную полость, выводили печень в рану и последовательно накладывали лигатуры на основания серединной, левой боковой и правой передней долей печени, после чего их резецировали.When creating a model of extensive liver resection (resection of 70-75% of the total liver mass) in rats under intramuscular anesthesia with zoletil solution at the rate of 15 mg / kg, following the rules of asepsis and antiseptics, the abdominal cavity was opened, the liver was removed into the wound, and ligatures were sequentially applied to the base of the median , left lateral and right anterior lobes of the liver, after which they were resected.
Модель субтотальной резекции печени создавали, путем резекции (85-90% общей массы печени) за счет иссечения не только серединной, левой боковой и правой передней долей печени, но также правой задней доли печени. Под внутримышечной анестезией раствором золетила из расчета 15 мг/кг веса выполняли верхнюю срединную лапаротомию длиной 3-4 см. Срединную (40%) и левую латеральную (30%) доли печени выводили в рану, долевые сосуды перевязывали у основания, после чего доли удаляли. Далее, выделяли обе правые доли печени: переднюю и заднюю (20%), перевязывали долевые сосуды у основания и удаляли. После резекции печени в брюшную полость вводили раствор антибиотика. Лапаротомный разрез ушивали наглухо непрерывным швом. [Madrahimov N, Dirsch О, Broelsch С, Dahmen U. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. //Ann Surg. 2006; - Vol. 244. - p. 89-98.]The subtotal liver resection model was created by resection (85-90% of the total liver mass) by excising not only the middle, left lateral and right anterior lobes of the liver, but also the right posterior lobe of the liver. Under intramuscular anesthesia with a solution of zoletil at the rate of 15 mg / kg of weight, an upper midline laparotomy 3-4 cm long was performed.The median (40%) and left lateral (30%) lobes of the liver were taken out into the wound, the lobe vessels were tied at the base, after which the lobes were removed ... Further, both right lobes of the liver were isolated: anterior and posterior (20%), the lobar vessels were ligated at the base and removed. After liver resection, an antibiotic solution was injected into the abdominal cavity. The laparotomic incision was closed tightly with a continuous suture. [Madrahimov N, Dirsch O, Broelsch C, Dahmen U. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. // Ann Surg. 2006; - Vol. 244. - p. 89-98.]
Операцию проводили всегда в утренние часы (в период с 10 до 12 часов), когда суточный ритм митотической активности клеток печени минимален).The operation was always performed in the morning (from 10 am to 12 noon), when the daily rhythm of mitotic activity of liver cells is minimal).
Всего было прооперировано 135 крыс, у 105 из которых выполняли обширную резекцию печени (n=105) и у 30 выполняли субтотальную резекцию печени (n=30).A total of 135 rats were operated on, 105 of which underwent extensive liver resection (n = 105) and 30 underwent subtotal liver resection (n = 30).
Всех животных с обширной резекцией печени разделили на 3 группы: группа 1 (n=25, контроль с введением физ. раствора); группа 2 (n=40), группа сравнения, в которой выполняли интраоперационное однократное внутрибрюшинное введение неактивированной оРНК из свежевыделенных ККМ. Группа сравнения состояла из 2 подгрупп: А (n=20), в которой вводили оРНК в дозе 90 мкг/100 г веса животного; подгруппа Б (n=20), в которой вводили оРНК в дозе 110 мкг/100 г веса животного. Группа 3 (n=40) -опытная, в которой выполняли интраоперационное однократное внутрибрюшинное введение активированной оРНК, выделенной из мононуклеарных ККМ, активированных хранением в охлажденном консервирующем растворе «Кустодиол». Опытная группа состояла из 2 подгрупп: А (n=20), в которой оРНК выделяли из ККМ, хранившихся в растворе «Кустодиол» при температуре 4°С в течение 3 часов и вводили животному в дозе 90 мкг/100 г веса; подгруппа Б (n=20), в которой оРНК, выделяли из мононуклеарных ККМ, хранившихся в охлажденном растворе «Кустодиол» при 6°С в течение 18 часов и вводили животному в дозе 110 мкг/100 грамм веса.All animals with extensive liver resection were divided into 3 groups: group 1 (n = 25, control with the introduction of saline); group 2 (n = 40), comparison group, in which an intraoperative single intraperitoneal injection of inactivated sRNA from freshly isolated CCM was performed. The comparison group consisted of 2 subgroups: A (n = 20), in which sRNA was administered at a dose of 90 μg / 100 g of animal weight; subgroup B (n = 20), in which sRNA was administered at a dose of 110 μg / 100 g of animal weight. Group 3 (n = 40) -experienced, in which an intraoperative single intraperitoneal injection of activated sRNA isolated from mononuclear BMs activated by storage in a refrigerated preservative solution "Custodiol" was performed. The experimental group consisted of 2 subgroups: A (n = 20), in which oRNA was isolated from CCM stored in a Custodiol solution at 4 ° C for 3 hours and administered to the animal at a dose of 90 μg / 100 g of body weight; subgroup B (n = 20), in which oRNA was isolated from mononuclear CCM stored in a chilled Custodiol solution at 6 ° C for 18 hours and administered to the animal at a dose of 110 μg / 100 grams of body weight.
Результаты 3-х групп экспериментов оценивали по летальности животных, по динамике восстановления функциональных (биохимических) показателей, гистологической структуры (по уровню митотической активности гепатоцитов) и массы резецированной печени.The results of 3 groups of experiments were assessed according to the lethality of animals, according to the dynamics of restoration of functional (biochemical) parameters, histological structure (according to the level of mitotic activity of hepatocytes) and the mass of the resected liver.
Всего из 105 крыс, у которых моделировали ОПН путем обширной резекции печени, погибло 10 животных в течение 5-ти первых суток после резекции печени, (общая летальность составила 9,5%). Однако все животные, погибшие после обширной резекции, относились к 1- контрольной группе без терапии, (n=25) и внутри этой группы летальность составила 40%. У выживших животных в группах 1, 2 и 3 функциональное состояние печени исследовали в динамике параллельно с оценкой степени развития восстановительных процессов в печени в течение первых 28 суток после выполнения обширной резекции печени. Для этого животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения раствора тиопентала натрия в дозировке, вызывающей остановку дыхания, и проводили биохимические исследования крови, а также морфологическое исследование остатка печени через 24 ч, 48 ч, 72 ч, на 5, 7,10, 14, 18, 21 и 28-е сутки после выполнения обширной резекции печени.In total, out of 105 rats in which ARF was modeled by extensive liver resection, 10 animals died within the first 5 days after liver resection (total mortality was 9.5%). However, all animals that died after extensive resection belonged to the 1-control group without therapy (n = 25) and within this group the mortality rate was 40%. In surviving animals in
Биохимическими методами исследовали кровь на содержание аланин -аминотрансферазы (АлАТ), аспарагин - аминотрансферазы (АсАТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Для этого у крысы забрали 28-32 мкл крови, наносили на специальные тест-полоски Reflotron™, которые сразу же устанавливали в биохимический анализатор Reflotron™, («Roche», Швейцария) (Принцип измерения - рефлексионная фотометрия, точность измерения - ±0,5%, воспроизводимость -<=0.2%, линейность: ±0,05%).Biochemical methods were used to study blood for the content of alanine aminotransferase (ALT), asparagine aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP). For this, 28-32 μL of blood was taken from the rat, applied to special Reflotron ™ test strips, which were immediately installed in the Reflotron ™ biochemical analyzer, (Roche, Switzerland) (The measurement principle is reflex photometry, the measurement accuracy is ± 0, 5%, reproducibility - <= 0.2%, linearity: ± 0.05%).
Затем вскрывали брюшную полость, эксплантировали печень и взвешивали ее. Для гистологического исследования печени извлекали фрагмент оставшейся доли печени, разрезали его на кусочки размерами 3×4×5 мм и помещали в раствор Буэна (через 24 часа раствор Буэна заменяли на 70% этанол) для фиксации. После завершения фиксации кусочки промывали в проточной воде в течение 3 ч, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм наклеивали влажным способом на стекла с поли-L-лизиновым покрытием («Thermo», США). Затем препараты высушивали в течение 48 ч в термостате при 37°C, депарафинировали, регидратировали и окрашивали срезы гематоксилином и эозином. В гистологических препаратах срезов ткани печени в 30 полях зрения определяли количество митотически делящихся клеток (в %о - промилле), а так же рассчитывали митотический индекс (МИ). Достоверность различия исследуемых показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью параметрического критерия t-Стьюдента при р<0.05.Then the abdominal cavity was opened, the liver was explanted and weighed. For histological examination of the liver, a fragment of the remaining lobe of the liver was removed, cut into
Приводим результаты сравнительного изучения эффективности применения неактивированной оРНК, выделенной из свежевыделенных ККМ, и из активированной оРНК, выделенной из ККМ после их гипотермического хранения в растворе «Кустодиол» для ускорения темпа индукции восстановительных процессов в печени в соответствии с пердлагаемым способом при ОПН после обширной (70-75%) резекции печени. Для контроля восстановления функциональных показателей печени проводили динамические исследования активности цитолитических ферментов в сыворотке крови крыс 1, 2 и 3 группы. В таблице 2, представлена динамика восстановления уровня активности цитолитических ферментов после обширной резекции печени в 1 - контрольной группе - введение физиологического раствора. В таблице 3 представлена динамика восстановления уровня активности цитолитических ферментов у крыс в группе 2, где после моделирования обширной резекции печени интраоперационно однократно внутрибрюшинно применяли неактивированную оРНК из свежевыделенных ККМ.We present the results of a comparative study of the effectiveness of the use of non-activated oRNA isolated from freshly isolated CCM and from activated oRNA isolated from CCM after their hypothermic storage in Custodiol solution to accelerate the rate of induction of recovery processes in the liver in accordance with the proposed method in ARF after extensive (70 -75%) liver resection. To control the restoration of the functional parameters of the liver, dynamic studies of the activity of cytolytic enzymes in the blood serum of rats of
Так как в подгруппах А и Б у крыс 2 группы опытов, где применялись разные дозы оРНК (90 и 110 мкг/100 г веса животного), не было выявлено достоверных различий исследуемых показателей по срокам, результаты в подгруппах А и Б были объединены и составили цифровые значения исследуемых показателей в таблице 3.Since in subgroups A and B in rats of the 2nd group of experiments, where different doses of sRNA were used (90 and 110 μg / 100 g of animal weight), there were no significant differences in the studied parameters in terms of timing, the results in subgroups A and B were combined and amounted to numerical values of the studied indicators in table 3.
В таблице 4 представлены результаты изучения динамики восстановления активности цитолитических ферментов в сыворотке крови крыс группы 3, где после моделирования обширной резекции печени интраоперационно однократно внутрибрюшинно применяли активированную оРНК в дозе 90 и 110 мкг/100 г веса животного из ККМ, подвергнутых аутофагии путем гипотермического хранения при 4-6°С в растворе «Кустодиол» в течение 3-18 часов. Так как в подгруппах А и Б у крыс группы 3, где применялись разные дозы активированной оРНК (90 и 110 мкг/100 г веса животного), выделенные из ККМ, подвергнутых разным режимам гипотермической консервации в растворе «Кустодиол» в пределах указанного диапазона значений (см. выше), не было выявлено достоверных различий уровня активности цитолитических ферментов на одних и тех же исследуемых сроках, полученные результаты были объединены и составили цифровые значения исследуемых показателей представленных в таблице 4.Table 4 presents the results of studying the dynamics of the restoration of the activity of cytolytic enzymes in the blood serum of rats of
Сравнительный анализ результатов, представленных в таблицах 2, 3 и 4, позволил установить, что в таблице 2 (контрольная 1 группа) показатели цитолиза (АлАТ, АсАТ и ЩФ) у выживших животных резко и неуклонно нарастали в течение первых 5 суток, затем стабилизировались и начиная с 10-14 суток возникала отчетливая тенденция их нормализации. В группе 2 (таблица №3) показатели цитолиза нарастали лишь в течение 1 и 3-х суток; к 5-м суткам намечалась отчетливая тенденция к снижению цитолитической активности. На 5-е сутки снижение цитолитической активности становилось для всех исследованных печеночных ферментов АлАТ, АсАТ и ЩФ достоверным по сравнению с контролем.A comparative analysis of the results presented in tables 2, 3 and 4 made it possible to establish that in table 2 (control group 1) the cytolysis indices (ALT, AST and ALP) in the surviving animals increased sharply and steadily during the first 5 days, then stabilized and starting from 10-14 days there was a clear tendency of their normalization. In group 2 (table No. 3), cytolysis indices increased only during 1 and 3 days; by the 5th day there was a clear tendency towards a decrease in cytolytic activity. On the 5th day, the decrease in cytolytic activity became significant for all the studied liver enzymes ALT, AST, and ALP compared to the control.
В группе 3 - опытной (таблица 4) ферменты цитолиза также нарастали в течение 1 и 2 суток, но уже на 3 сутки снижение цитолитической активности АлАТ, АсАТ в сыворотке крови становилось достоверным по сравнению с контролем (таблица 2), а на 5 сутки снижение уровня ферментов цитолиза было более выраженным и достоверным по сравнению с показателями в группе 2 (таблица 3). В результате нормализация исследуемых показателей в сыворотке крови наступала в группе 1 к 18 суткам, в группе 2 к 10-12 суткам, а в группе 3, к 6-8 суткам.In group 3 - experimental (table 4), cytolysis enzymes also increased during 1 and 2 days, but already on
Исследование митотической активности гепатоцитов из резецированной печени позволило установить ее активацию через 48 часов во всех трех исследуемых группах (достоверные различия в митотической активности гепатоцитов печени крыс в подгруппах А и Б в группах 2 и 3 отсутствовали и поэтому результаты их подгрупп были объединены) по сравнению с исходным уровнем: исходный уровень митотической активности, оцениваемый до резекции печени по МИ, составил 0,2-0,3 промилле - %о - (1-2 митоза на 30 полей зрения), тогда как в 1 (контрольной) группе МИ через 48 час после обширной резекции печени составил 5,181%о (на 7334 клетки определялось 38 митозов), а в группе 2 с введением неактивированных оРНК из мононуклеарной фракции ККМ на этом же сроке МИ составил 21,7%о (на 9526 клеток определялось 207 митозов), т.е. во второй группе МИ был приблизительно в 4 раза выше, чем в первой контрольной группе, в 3 опытной группе МИ составил 31,8%о (10564 клеток определялось 335 митозов), то есть в группе 3 МИ был выше, чем в группе 1 более чем в 6 раз и почти в 1,5 раза выше по сравнению с группой 2. Приведенные изменения митотической активности гепатоцитов в печени крыс 1, 2 и 3 групп через 48 часов после резекции печени были установлены на основании подсчета количества митотически делящихся гепатоцитов в 30 полях зрения, однако уже в каждом поле зрения гистологических препаратов во 2, но особенно в 3 группе выявлялось существенно большее количество митотически делящихся гепатоцитов, чем в 1 - контрольной группе.The study of the mitotic activity of hepatocytes from the resected liver made it possible to establish its activation after 48 hours in all three study groups (there were no significant differences in the mitotic activity of rat liver hepatocytes in subgroups A and B in
Анализируя полученные результаты, мы установили, что в группе 2 повышенный уровень митотической активности гепатоцитов сохраняется в течение 5 суток, тогда как в группе 3 повышенный уровень митотической активности снижается уже к 3 суткам после моделирования обширной резекции печени. В контроле слегка повышенный уровень митотической активности по сравнению с исходным уровнем сохраняется в сроках до 10 суток. Эти данные представлены на рис. 1, который отражает динамику сравнительного изучения митотической активности гепатоцитов (МИ) в 1, 2 и 3 группах опытов в течение 14 суток после обширной резекции печени. (*-р<0,05 по сравнению с группами 1 и 3; #-р<0,05 по сравнению с группами 2 и 3).Analyzing the results obtained, we found that in
Достоверно более высокий уровень митотической активности гепатоцитов в группе 3 по сравнению с 1 и 2 группами на 2 сутки способствует достоверно более раннему восстановлении исходной массы печени после обширной резекции у животных группы 3.A significantly higher level of mitotic activity of hepatocytes in
Достоверно более высокий уровень митотической активности гепатоцитов на 2 сутки после моделирования обширной резекции печени и достоверно более резкое и раннее снижение этого показателя на 3 сутки в печени крыс группы 3 находятся в соответствии с более ранним (к 6-8 суткам) восстановлением функции печени у крыс в этой группе, так как известно, что митотически делящиеся клетки не способны одновременно эффективно выполнять свои регенераторные и тканеспецифические функции.A significantly higher level of mitotic activity of hepatocytes on
На рис. 2 представлена динамика восстановления массы печени после обширной резекции в 3х группах опытов: в 1 - контрольной (введение физиологического раствора), в группе 2 с интраоперационным введением неактивированной оРНК из ККМ в дозе 90 и 110 мкг/100 г веса животного и в группе 3 с интраоперационным введением активированной оРНК из ККМ в дозе 90 и ПО мкг/100 г веса животного, предварительно подвергнутых аутофагии, что соответствует их предварительной активации. (*-р<0,05 по сравнению с группами 1 и 3; #-р<0,05 по сравнению с группами 3 и 2).In fig. 2 shows the dynamics of recovery of liver mass after extensive resection in 3 groups of experiments: in group 1 - control (administration of saline), in
Из рисунка 2 видно, что в группах 2 и 3 темп восстановления массы печени до исходных значений был выше, чем в контроле, причем в группе 3 темп восстановления массы печени до исходных значений был выше, чем в группе 2. В 1-контрольной группе восстановление массы печени происходило в более медленном темпе, особенно в первые две недели после резекции, в результате масса печени только к 18-20 суткам приближалась к исходным значениям и полностью восстанавливалась лишь на 22-24 сутки наблюдения. Нами отмечено также, что более высокий темп восстановления массы печени в группе 2 коррелировал с более высоким темпом восстановления функциональных показателей печени (АлАТ, АсАТ, ЩФ) в этой группе по сравнению с контролем.Figure 2 shows that in
В группе 3 восстановление массы печени до исходного уровня происходило быстрее, чем в группе 2 - к 8-10 суткам наблюдения и это соответствовало еще более раннему восстановлению функциональных показателей в группе 3 (таблицы 2-4) по сравнению с группами 1 и 2.In
Подтверждением того, что процесс регенерации печени (подобно другим органам) начинается с усиления аутофагии, могут служить результаты динамического измерения массы остатка печени в опытах с применением оРНК. Из рисунка 2 видно, что, несмотря на иссечение одинаковой массы печени (70-75%) во всех 3 группах опытов в течение первых 2 суток наблюдается процесс более резкого снижения массы печени во 2 и 3-ей группах опытов, причем достоверным это снижение было в группе 3 на сроке 48 часов, по сравнению с контролем, где более резкое снижение массы остатка печени ко 2-м суткам наблюдения сменялось более резким повышением скорости восстановления массы печени с достижением исходных значений к 8-10 суткам.Confirmation that the process of liver regeneration (like other organs) begins with an intensification of autophagy can be obtained from the results of dynamic measurements of the mass of the liver remnant in experiments using sRNA. Figure 2 shows that, despite the excision of the same liver mass (70-75%) in all 3 groups of experiments, during the first 2 days, a process of a sharper decrease in liver weight is observed in the 2nd and 3rd groups of experiments, and this decrease was significant. in
В 30 опытах на крысах с субтотальной резекцией (85-90%) печени, у которых по данным литературы уровень летальности достигает 90% [Madrahimov N, Dirsch О, Broelsch С, Dahmen U. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. //Ann Surg. 2006; - Vol. 244. - p. 89-98; Рудаков B.C., Астрелина T.A., Губарев K.K., Журбин A.C., Светлакова Д.С., Восканян С.Э. Влияние трансплантации аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на летальность и продолжительность жизни после обширных резекций печени: экспериментальное исследование // Клин. и эксперимент.хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. 2019. Т. 7, No 2. С. 31-37], была изучена возможность снижения летальности после применения активированной оРНК. Было выполнено 2 группы опытов: 1 -контроль (n=10) - моделирование субтотальной резекции печени с введением физиологического раствора и 2 - опыт (n=20), где однократное интраоперационное внутрибрюшинное введение активированной оРНК в дозе 90 мкг/100 г (n=10) и 110 мкг/100 г веса животного (n=10) выполняли у животных с субтотальной резекцией печени. Исследование летальности крыс в течение 10 суток, показало, что в контроле летальность составила 8 крыс из 10, когда как в опытах с введением оРНК в дозе 90 мкг/100 г веса погибло 4 из 10, а с введением 110 мкг/100 г веса погибло 5 из 10, то есть активированная оРНК способствовала снижению летальности у крыс с субтотальной резекцией печени практически в 2 раза.In 30 experiments on rats with subtotal resection (85-90%) of the liver, in which, according to the literature, the mortality rate reaches 90% [Madrahimov N, Dirsch O, Broelsch C, Dahmen U. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. // Ann Surg. 2006; - Vol. 244. - p. 89-98; Rudakov B.C., Astrelina T.A., Gubarev K.K., Zhurbin A.C., Svetlakova D.S., Voskanyan S.E. Effect of transplantation of allogeneic multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells on mortality and life expectancy after extensive liver resections: an experimental study // Klin. and experiment. hir. Journal. them. acad. B.V. Petrovsky. 2019. V. 7,
В совокупности полученные результаты позволяют заключить, что однократное интраоперационное введение активированной оРНК в дозе 90-110 мкг/100 грамм веса животного по предлагаемому способу лечения ОПН обеспечивает более быстрый темп нормализации показателей функции печени, исключает возникновение летальных исходов после обширной резекции и существенно снижает летальность при субтотальной резекции печени за счет индукции раннего и более высокого уровня митотической и пролиферативной активности клеток печени, позволяющей в более короткие сроки превысить критические значения массы печени и достигнуть адекватных значений функционирующей массы печени, способной обеспечить ускоренное восстановление печеночного гомеостаза в организме.Taken together, the results obtained allow us to conclude that a single intraoperative injection of activated sRNA at a dose of 90-110 μg / 100 grams of animal weight according to the proposed method for treating acute renal failure provides a faster rate of normalization of liver function parameters, eliminates the occurrence of deaths after extensive resection and significantly reduces mortality in subtotal liver resection due to the induction of an early and higher level of mitotic and proliferative activity of liver cells, which makes it possible to exceed the critical values of the liver mass in a shorter time and achieve adequate values of the functioning liver mass, which is able to provide an accelerated restoration of hepatic homeostasis in the body.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020119914A RU2744846C1 (en) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Method of treatment of acute liver failure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020119914A RU2744846C1 (en) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Method of treatment of acute liver failure |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2744846C1 true RU2744846C1 (en) | 2021-03-16 |
Family
ID=74874443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020119914A RU2744846C1 (en) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Method of treatment of acute liver failure |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2744846C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701792C1 (en) * | 2018-10-30 | 2019-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of treating acute hepatic impairment |
| RU2739996C1 (en) * | 2020-06-16 | 2020-12-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of chronic hepatic failure correction |
-
2020
- 2020-06-16 RU RU2020119914A patent/RU2744846C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2701792C1 (en) * | 2018-10-30 | 2019-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of treating acute hepatic impairment |
| RU2739996C1 (en) * | 2020-06-16 | 2020-12-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of chronic hepatic failure correction |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BAI H. et al. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA during proliferative phase of rat liver regeneration. J Cell Physiol. 2019, 234(10), p.18897-18905. * |
| YAN I.K. et al. Circulating Extracellular RNA Markers of Liver Regeneration. PLoS One. 2016, 11(7), e0155888. * |
| ГОНИКОВА З.З. Исследование регенераторной активности общей РНК клеток костного мозга на экспериментальных моделях печеночной недостаточности. Диссер. Москва 2019, стр.1-118. * |
| ГОНИКОВА З.З. Исследование регенераторной активности общей РНК клеток костного мозга на экспериментальных моделях печеночной недостаточности. Диссер. Москва 2019, стр.1-118. РУДАКОВ В.С. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на регенерацию печени после ее обширной резекции. Автореф. диссер. Москва 2017, стр.1-24. BAI H. et al. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA during proliferative phase of rat liver regeneration. J Cell Physiol. 2019, 234(10), p.18897-18905. YAN I.K. et al. Circulating Extracellular RNA Markers of Liver Regeneration. PLoS One. 2016, 11(7), e0155888. * |
| РУДАКОВ В.С. Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на регенерацию печени после ее обширной резекции. Автореф. диссер. Москва 2017, стр.1-24. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Activated human umbilical cord blood platelet‐rich plasma enhances the beneficial effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Chemotherapy‐induced POF rats | |
| RU2744846C1 (en) | Method of treatment of acute liver failure | |
| RU2739996C1 (en) | Method of chronic hepatic failure correction | |
| RU2701792C1 (en) | Method of treating acute hepatic impairment | |
| Gokkaya et al. | Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP) | |
| CN114599379A (en) | A kind of pharmaceutical composition for preventing or treating sepsis, kit and application and treatment method thereof | |
| Alhabboubi et al. | Injection of rat mesenchymal stem cells leads to their homing and differentiation in the liver in a blunt liver trauma model | |
| BR102016022647A2 (en) | methods for treating age-related organ or tissue dysfunction through heterochronic transbiosis using non-viable pluripotent stem cells | |
| Marchac et al. | Lp3: endogenous stem cell therapy improves diabetic wound healing | |
| Bukulmez | Activation of Ovarian Cortex | |
| CN119857099A (en) | Application of HY-133073 in preparing medicine for resisting central immune escape of liver cancer | |
| Menger et al. | Lp34: amphibian epidermal lipoxygenase Ambloxe enhances mammalian wound healing in vivo | |
| CN114209840A (en) | Application of MIF inhibitor in preparation of medicine for treating osteoarthritis | |
| Keck et al. | LP1: the influence of Local Anesthetics on Viability and Proliferation of Preadipocytes and Their Differentiation to Adipocytes | |
| Baumann et al. | LP20: Improving Aesthetic Outcomes in Head and Neck Reconstruction with Structural Fat Grafting | |
| Hendrickx et al. | LP15: Wound Bed Vascularization by Endothelial Cells: Differentiation Status Matters | |
| Hollenbeck et al. | LP8: THE EXTENDED ABDOMINAL WALL FLAP FOR CTA | |
| Rohleder et al. | LP37: Expression of Antimicrobial Peptides in Maxillofacial Surgical Site Infections | |
| Manoli et al. | LP42: Comparative Gene Expression Analysis of Repaired and Unrepaired Peripheral Nerves during the Early Phase after Nerve Lesion | |
| Kueckelhaus et al. | LP31: Promotion of Wound Healing by Regulator Proteins of the Innate Immune System | |
| Fabre et al. | LP25: OUTCOME AFTER REVISION OF MICROVASCULAR FREE DIEP, SIEA AND SGAP FLAP FOR AUTOLOGEOUS BREAST RECONSTRUCTION: A RETROSPECTIVE ANALYSIS | |
| Engel et al. | LP2: Variable Vascular Carriers for Neoangiogenesis and Mutual Seeding of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Osteocytes for Advanced Osseous Tissue Engineering | |
| Tom et al. | LP6: An Analysis of Patient Quality of Life and Morbidity Due to Hand and Upper Extremity Trauma in Honduras | |
| Kuhbier et al. | LP12: Adipose-Derived Stem Cells Seeded on Three-Dimensional Scaffolds of Spider Silk | |
| Yadav et al. | LP21: MANDIBLE RECONSTRUCTION USING LEFT FREE FIBULA OSTEOCUTANEOUS FLAP-STUDY OF OVER 400 CASES. |