RU2740576C1 - Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes - Google Patents
Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2740576C1 RU2740576C1 RU2019135781A RU2019135781A RU2740576C1 RU 2740576 C1 RU2740576 C1 RU 2740576C1 RU 2019135781 A RU2019135781 A RU 2019135781A RU 2019135781 A RU2019135781 A RU 2019135781A RU 2740576 C1 RU2740576 C1 RU 2740576C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rbbp8
- h2ax
- genes
- seq
- radiation therapy
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 title description 2
- 101150097169 RBBP8 gene Proteins 0.000 title 1
- 101000746134 Homo sapiens DNA endonuclease RBBP8 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 101001067891 Homo sapiens Histone H2AX Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100039524 DNA endonuclease RBBP8 Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102100034533 Histone H2AX Human genes 0.000 claims description 27
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 24
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 208000013718 rectal benign neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000001046 green dye Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 8
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 108050002772 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Proteins 0.000 description 4
- 102000012199 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 Human genes 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 150000005699 fluoropyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 1
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 1
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 1
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- -1 C-FLAR Proteins 0.000 description 1
- 102100021390 C-terminal-binding protein 1 Human genes 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102100032919 Chromobox protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710173115 Chromobox protein homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101000735361 Mus musculus Poly(rC)-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 101150044041 h2ax gene Proteins 0.000 description 1
- 102000049029 human RBBP8 Human genes 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000033586 regulation of DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000020874 response to hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
- G16B20/10—Ploidy or copy number detection
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Evolutionary Biology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии и онкологии, и может быть использовано для малоинвазивной диагностики радиорезистентных форм рака прямой кишки.The invention relates to medicine, namely to molecular biology and oncology, and can be used for minimally invasive diagnosis of radioresistant forms of rectal cancer.
Колоректальный рак (КРР) - одно из наиболее распространенных злокачественных новообразований в мире: каждый год регистрируется около 1000000 новых случаев этого заболевания и более 700000 летальных исходов. В России за последнее 10 лет заболеваемость КРР значительно увеличилась, и как по числу новых случаев, так и по числу умерших больных уступает лишь раку легкого, желудка и молочной железы (Кутилин Д.С, Кошелева Н.Г., Максимов А.Ю., Гусарева М.А., Бондаренко Е.С., Сагакянц А.Б., Донцов В.А., Габричидзе П.Н., Черняк М.Н., Гречкин Ф.Н., Мезенцев С.С, Ульянова Е.П., Полуэктов СИ. Влияние различных доз лучевой терапии на выживаемость клеток аденокарциномы толстой кишки линии НТ-29 // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - №3.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=28918 (дата обращения: 06.09.2019).).Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignant neoplasms in the world, with about 1,000,000 new cases and more than 700,000 deaths every year. In Russia, over the past 10 years, the incidence of colorectal cancer has increased significantly, and both in the number of new cases and in the number of patients who died it is second only to lung, stomach and breast cancer (Kutilin D.S., Kosheleva N.G., Maksimov A.Yu. , Gusareva M.A., Bondarenko E.S., Sagakyants A.B., Dontsov V.A., Gabrichidze P.N., Chernyak M.N., Grechkin F.N., Mezentsev S.S, Ulyanova E P., Poluektov SI The effect of different doses of radiation therapy on the survival rate of colon adenocarcinoma cells of the NT-29 line // Modern problems of science and education. - 2019. - No. 3. URL: http: //www.science-education. ru / ru / article / view? id = 28918 (date accessed: 09/06/2019).).
Радиотерапия в интеграции с химиотерапией и хирургические методы являются основными направлениями лечения КРР (Кит О.И, Геворкян Ю.А., Солдаткина Н.В., Новикова И.Α., Гусарева М.А. Клинико-морфологические эффекты предоперационной лучевой терапии крупнымRadiotherapy in integration with chemotherapy and surgical methods are the main areas of treatment for colorectal cancer (Keith O.I., Gevorkyan Yu.A., Soldatkina N.V., Novikova I.Y., Gusareva M.A. Clinical and morphological effects of preoperative radiation therapy to large
фракционированием дозы при раке прямой кишки // Тюменский медицинский журнал. - 2016. - Т. 18. - №2. - С 39-44.). Один из вариантов предоперационного лечения - это короткий курс лучевой терапии, который проводится на первичную опухоль и зону регионарного метастазирования за 5 фракций с разовой очаговой дозой (РОД) 5 Гр до СОД (суммарной очаговой дозы) 25 Гр, что изоэффективно 40 Гр. (Кутилин Д.С, Кошелева Н.Г., Максимов А.Ю., Гусарева М.А., Бондаренко Е.С, Сагакянц А.Б., Донцов В.А., Габричидзе П.Н., Черняк М.Н., Гречкин Ф.Н., Мезенцев С.С, Ульянова Е.П., Полуэктов СИ. Влияние различных доз лучевой терапии на выживаемость клеток аденокарциномы толстой кишки линии НТ-29 // Современные проблемы науки и образования. - 2019. - №3.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id:=28918 (дата обращения: 06.09.2019).). Большое влияние на эффективность подобной терапии оказывает исходная радиорезистентность опухолевых клеток, зависящая от их генетических особенностей (Ярмоненко СП., Вайнсон А.А. Радиобиология человека и животных. М., 2004.549 с). К подобным особенностям можно отнести показатель копийности генов (Copy Number Variation (CNV)) - вид генетического полиморфизма, результатом которого может явиться снижение или повышение числа копий определенного гена, и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена -белка или не кодирующей РНК (Кутилин Д.С, Айрапетова Т.Г., Анистратов П.А., Пыльцин СП., Лейман И.А., Карнаухов Н.С, Кит О.И. Изменение копийности генов в опухолевых клетках и внеклеточной ДНК у больных аденокарциномой легкого // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2019. - Т. 167. - №6. - С. 731-738; Zarrei Μ., MacDonald J.R., Merico D., Scherer S.W. A copy number variation map of the human genome// Nature Reviews Genetics. - 2015. - №16(3). - PP. 172-83.).dose fractionation in rectal cancer // Tyumen Medical Journal. - 2016. - T. 18. - No. 2. - 39-44.). One of the options for preoperative treatment is a short course of radiation therapy, which is performed on the primary tumor and the area of regional metastasis in 5 fractions with a single focal dose (RAD) of 5 Gy to a SOD (total focal dose) of 25 Gy, which is isoeffective at 40 Gy. (Kutilin D.S., Kosheleva N.G., Maksimov A.Yu., Gusareva M.A., Bondarenko E.S, Sagakyants A.B., Dontsov V.A., Gabrichidze P.N., Chernyak M. N., Grechkin F.N., Mezentsev S.S., Ulyanova E.P., Poluektov S.I. Effect of different doses of radiation therapy on the survival of HT-29 colon adenocarcinoma cells // Modern problems of science and education. - 2019. - No. 3 .; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id:=28918 (date of access: 06.09.2019).). The initial radioresistance of tumor cells, depending on their genetic characteristics, has a great influence on the effectiveness of such therapy (Yarmonenko SP., Vainson AA Radiobiology of man and animals. M., 2004.549 p). These features include the Copy Number Variation (CNV), a type of genetic polymorphism that can result in a decrease or increase in the copy number of a particular gene, and, consequently, a decreased or increased expression of the protein gene product or non-coding RNA ( Kutilin D.S., Airapetova T.G., Anistratov P.A., Pyltsin S.P., Leiman I.A., Karnaukhov N.S., Kit O.I.Changes in the copy number of genes in tumor cells and extracellular DNA in patients with adenocarcinoma of the lung // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2019. - T. 167. - No. 6. - P. 731-738; Zarrei Μ., MacDonald JR, Merico D., Scherer SW A copy number variation map of the human genome / / Nature Reviews Genetics. - 2015. - No. 16 (3). - PP. 172-83.).
CNV являются следующим уровнем в полном понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса. Так была изучена роль CNV в качестве фактора малигнизации тканей желудка и легкого (см. Gunther Т., Schneider-Stock R.,
Α., Lippert Η., Roessner A. Mdm2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of Mdm2 protein and p53 alterations. A Mod Pathol. - 2000 - V. 13(6) - P.621-626; Кутилин Д.С, Енин Я.С, Петрусенко Н.А., Водолажский Д.И. Изменение копийности генетических локусов при малигнизации тканей легкого // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - №6.; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994). Было проведено исследование относительной копийности генетических локусов, ответственных за регуляцию апоптоза (ΒΑΧ, BCL2, C-FLAR, Р53, MDM2), пролиферацию (SOX2, ОСТ4, NANOG, ΡΙΚ3 и ΜΚΙ67), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A1) в образцах, содержащих опухолевые и нормальные клетки тканей легкого и выявлены генетические локусы, которые имеют высокий потенциал в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования рака легкого (HV2, HIF1A1, Ρ53, MDM2). Однако этот потенциал ограничен высоким уровнем инвазивности при получении биоматериала. Возможное решение этой проблемы находится в переходе на исследование копийности генов во внеклеточной ДНК плазмы крови.., Lippert Η., Roessner A. Mdm2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of Mdm2 protein and p53 alterations. A Mod Pathol. - 2000 - V. 13 (6) - P.621-626; Kutilin D.S., Yenin Y.S., Petrusenko N.A., Vodolazhsky D.I. Change in copy number of genetic loci during malignancy of lung tissue // Modern problems of science and education. - 2016. - No. 6 .; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994). We studied the relative copy number of genetic loci responsible for the regulation of apoptosis (то, BCL2, C-FLAR, P53, MDM2), proliferation (SOX2, OCT4, NANOG, 3 and ΜΚΙ67), oxidative phosphorylation (HV2) and response to hypoxia (HIF1A1 ) in samples containing tumor and normal cells of lung tissue and identified genetic loci that have high potential as molecular markers for predicting lung cancer (HV2, HIF1A1, Ρ53, MDM2). However, this potential is limited by the high level of invasiveness in obtaining biomaterials. A possible solution to this problem lies in the transition to the study of the copy number of genes in the extracellular DNA of blood plasma.
К внеклеточной ДНК в организме следует относить: клеточную и митохондриальную ДНК из соматических и из опухолевых клеток, подвергающихся процессам апоптоза и некроза; ДНК из эритробластов, ядра которых энуклеируются в процессе дифференцировки в эритроциты, ДНК из лимфоцитов в процессе их апоптотической гибели после стимуляции, ДНК эмбрионов в крови матери, бактериальную и вирусную ДНК. При многих видах опухолей определяется повышенный уровень внеклеточной ДНК (внДНК) в периферической крови. При этом прогресс заболевания часто связан с постепенным повышением уровня внДНК. Более того, довольно часто уровень внДНК возрастает при метастазировании опухоли, по сравнению со значениями в отсутствие последних (см. Козлов В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии. Медицинская иммунология. 2013, Т. 15, №5, с. 399-412).Extracellular DNA in the body should include: cellular and mitochondrial DNA from somatic and from tumor cells undergoing the processes of apoptosis and necrosis; DNA from erythroblasts, the nuclei of which are enucleated in the process of differentiation into erythrocytes, DNA from lymphocytes in the process of their apoptotic death after stimulation, DNA of embryos in the mother's blood, bacterial and viral DNA. Many types of tumors have elevated levels of extracellular DNA (cfDNA) in the peripheral blood. Moreover, the progress of the disease is often associated with a gradual increase in the level of cfDNA. Moreover, quite often the level of cfDNA increases with tumor metastasis, compared with the values in the absence of the latter (see Kozlov VA Free extracellular DNA in normal and pathological conditions. Medical Immunology. 2013, T. 15, No. 5, p. 399-412).
Изменение числа копий генов Н2АХ и RBBP8 ассоциировано с развитием радиорезистентности опухолевых клеток.Changes in the number of copies of the H2AX and RBBP8 genes are associated with the development of radioresistance of tumor cells.
Ген Н2АХ кодирует гистоновый белок из семейства Н2А. В ответ на двухцепочечные разрывы в ДНК, вызванные ионизирующим излучением, Н2АХ становится фосфорилированным по серину в положении 139 (Η2ΑΧ). Из-за этой модификации (фосфорилированной формы гистона) ДНК становится менее конденсированной, освобождается место для присоединения белковых комплексов, необходимых во время репарации (см. Ayoub Ν., Jeyasekharan A.D., Bemal J.Α., Venkitaraman A.R. HP1-beta mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response// Nature. - 2008. - V.453 (7195). - P. 682-6).The H2AX gene encodes a histone protein from the H2A family. In response to double-stranded DNA breaks caused by ionizing radiation, H2AX becomes phosphorylated at serine at position 139 (Η2ΑΧ). Due to this modification (the phosphorylated form of histone), the DNA becomes less condensed, freeing up space for the attachment of protein complexes necessary during repair (see Ayoub Ν., Jeyasekharan AD, Bemal J.Α., Venkitaraman AR HP1-beta mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response // Nature. - 2008. - V.453 (7195). - P. 682-6).
RBBP8 кодирует белок, который регулирует пролиферацию клеток. Этот белок образует комплексы с транскрипционным ко-репрессором СТВР, а также модулирует функции BRCA1 в регуляции транскрипции и репарации ДНК (см. Sartori А.А., Lukas С, Coates J., Mistrik Μ., Fu S., Bartek J., Baer R., Lukas J., Jackson S.P..Human CtIP promotes DNA end resection// Nature. - 2007. - V. 450(7169). - P. 509-14.).RBBP8 encodes a protein that regulates cell proliferation. This protein forms complexes with the transcriptional co-repressor CTBP, and also modulates the functions of BRCA1 in the regulation of transcription and DNA repair (see Sartori A.A., Lukas C, Coates J., Mistrik Μ., Fu S., Bartek J., Baer R., Lukas J., Jackson SP Human CtIP promotes DNA end resection // Nature 2007 V. 450 (7169) P. 509-14).
Поэтому, в качестве маркеров для прогнозирования радирезистентности рака прямой кишки допустимо использование показателя относительной копийности H2AX и RBBP8.Therefore, the relative copy numbers H2AX and RBBP8 can be used as markers for predicting the radioresistance of rectal cancer.
Из патентных источников известно следующее изобретение, наиболее близкое нашему:The following invention is known from patent sources, which is closest to ours:
«Способ прогнозирования чувствительности опухоли к лучевой терапии у больных раком прямой кишки» (см. патент RU 2349916 С1, опубликован: 20.03.2009, Бюл. №8) Способ основан на гистологическом исследовании биоптата, взятого из опухоли после 4-го сеанса лучевой терапии, проводимой дробно-протяженным методом. При наличии патоморфоза III-IV степени прогнозируют высокую чувствительность опухоли к облучению, а при наличии патоморфоза I-II степени - низкую чувствительность. Использование способа позволяет прогнозировать чувствительность опухоли у больных раком прямой кишки к проводимой лучевой терапии в ранние сроки, что позволяет при выявлении радиорезистентности опухоли своевременно выполнять радикальную операцию - экстирпацию прямой кишки."A method for predicting the sensitivity of a tumor to radiation therapy in patients with rectal cancer" (see patent RU 2349916 C1, published: 20.03.2009, bull. No. 8) The method is based on a histological study of a biopsy taken from a tumor after the 4th session of radiation therapy carried out by the fractional-extended method. In the presence of grade III-IV pathomorphism, high sensitivity of the tumor to radiation is predicted, and in the presence of grade I-II pathomorphosis, low sensitivity. The use of the method makes it possible to predict the sensitivity of the tumor in patients with rectal cancer to radiation therapy in the early stages, which makes it possible to timely perform a radical operation - rectal extirpation when detecting tumor radioresistance.
Однако, описанный выше способ принципиально отличается от нашего. Данный способ не является малоинвазивным и не позволяет диагностировать радиорезистентную форму рака прямой кишки до начала терапии.However, the method described above is fundamentally different from ours. This method is not minimally invasive and does not allow diagnosing a radioresistant form of rectal cancer before starting therapy.
Анализ патентных источников (www.fips.ru) также показал отсутствие действующих патентов и заявок на «Малоинвазивный способ определения чувствительности опухоли прямой кишки к лучевой терапии на основании изменения копийности генов H2AX и RBBP8».Analysis of patent sources (www.fips.ru) also showed the absence of valid patents and applications for “Minimally invasive method for determining the sensitivity of rectal tumor to radiation therapy based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes”.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и точного способа с уникальными высокоспецифичными последовательностями синтетических олигонуклеотидов (праймеров) для диагностики радиорезистентного рака прямой кишки.The technical result of the claimed invention is the creation of a new, easy to implement, not expensive and accurate method with unique highly specific sequences of synthetic oligonucleotides (primers) for the diagnosis of radioresistant rectal cancer.
Сущность способа заключается в том, что образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 Μ NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15°С. Из плазмы крови выделяют внДНК фенол-хлороформным методом и проводят амплификацию с высокоспецифичными праймерами для генов H2AX RBBP8 и GAPDH, анализируют первичные данные и вычисляют относительную копийность (rC) по формуле 2-ΔCt, где ΔCt=Ct(H2AX или RBBP8) - Ct(GAPDH). Затем сравнивают полученные значения rC с прогностическими значениями копийности, и при значениях в интервале rCH2AX>13,1*10-3 и rCRBBP8>21,8*10-3 у пациента диагностируют радиорезистентную форму рака прямой кишки (чувствительность 96%, специфичность 95%), а при значениях в интервале rCH2AX<13,1*10-3 и rCRBBP8<21,8*10-3 у пациента диагностируют чувствительную к лучевой терапии форму рака прямой кишки (чувствительность 96%, специфичность 92%).The essence of the method is that blood samples (10 ml of blood and 3 ml of 10 mM phosphate buffer, pH 7.5, with 0.15 Μ NaCl and 50 mM EDTA) are separated into plasma and a cell fraction by centrifugation for 20 minutes at 400 g at 15 ° C. CfDNA is isolated from blood plasma by phenol-chloroform method and amplification is carried out with highly specific primers for genes H2AX RBBP8 and GAPDH, primary data are analyzed and relative copy number (rC) is calculated according to formula 2 - ΔCt, where ΔCt = Ct (H2AX or RBBP8) - Ct ( GAPDH). Then the obtained rC values are compared with the prognostic copy number values, and at values in the range of rC H2AX > 13.1 * 10 -3 and rC RBBP8 > 21.8 * 10 -3 , the patient is diagnosed with radioresistant form of rectal cancer (sensitivity 96%, specificity 95%), and at values in the range of rC H2AX <13.1 * 10 -3 and rC RBBP8 <21.8 * 10 -3 , the patient is diagnosed with a form of rectal cancer sensitive to radiation therapy (sensitivity 96%, specificity 92%) ...
Заявленный анализ основан на определении количества копий генов H2AX или RBBP8 относительно референсного гена GAPDH во внДНК плазмы крови больных раком прямой кишки, и последующем сравнении полученных значений с интервалом копийности rCH2AX и rCRBBP8 характерным для радиорезистентной или чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.The claimed analysis is based on the determination of the number of copies of the H2AX or RBBP8 genes relative to the reference GAPDH gene in blood plasma cfDNA of patients with rectal cancer, and the subsequent comparison of the obtained values with the rC H2AX and rC RBBP8 copy range characteristic of radioresistant or radiation-sensitive forms of rectal cancer.
Заявленный способ включает следующие приемы:The claimed method includes the following techniques:
- выделение внеклеточной ДНК из плазмы крови с помощью метода фенол-хлороформной экстракции;- isolation of extracellular DNA from blood plasma using the method of phenol-chloroform extraction;
- определение относительной копийности генетических локусов Н2АХ и RBBP8 методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA-Green и специфичных праймеров на матрице выделенной внДНК;- determination of the relative copy number of the Н2АХ and RBBP8 genetic loci by RT-PCR in the presence of EVA-Green dye and specific primers on the template of isolated cfDNA;
- анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора;- analysis of primary data using the thermal amplifier software;
- расчет относительной копийности гена (гС) на основании соотношения сигналов, продуцируемых амплификатами изучаемой и референсной последовательностей,- calculation of the relative gene copy number (rC) based on the ratio of signals produced by amplifications of the studied and reference sequences,
- сравнением гС пробы с прогностическими значениями копийности rСстандарт, определенными для радиорезистентной и чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.- comparison of the HS sample with the predicted copy number rC standard , determined for radioresistant and radiation-sensitive forms of rectal cancer.
Для осуществления способа были разработаны специфичные олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для генов Н2ЛХ, RBBP8 и GAPDH. Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1) осуществлялся с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank.To implement the method, specific oligonucleotide forward and reverse primers were developed for the Н2ЛХ, RBBP8 and GAPDH genes. The design of specific oligonucleotide primers (Table 1) was carried out using the reference sequences of the NCBI GenBank.
Заявленный способ осуществляется следующим образом:The claimed method is carried out as follows:
На первом этапе образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 Μ NaCl и 50 мМ ЭДТА) разделяют на плазму и фракцию клеток центрифугированием в течение 20 минут при 400 g при 15°С.Из плазмы крови ДНК выделяют фенол-хлороформным методом в нашей модификации. К плазме крови добавляют равный объем лизирующего буфера (2% SDS и 1% меркаптоэтанол) и 20 мкл протеиназы К, инкубируют в термостате при 58°С 1 час.К полученному лизату добавляют равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугируют 20 минут 3000 об/мин. После разделения фаз отбирают водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляют равный объем 95% изопропилового спирта и раствор 5М NaCl до концентрации 100 тМ, пробирку помещают в холодильник на -20°С на 60 минут. Далее центрифугируют 15 минут при 12700 об/мин, при -10°С, декантируют супернатант, а осадок промывают 80% этиловым спиртом, центрифугированием удаляют остатки этанола, высушивают осадок в твердотельном термостате и растворяют в 10 мМ ТЕ буфере. Концентрация полученных препаратов ДНК измеряется на флюориметре. Для проведения ПЦР-РВ концентрацию ДНК в каждом образце нормализуют до 0,5 нг/мкл.At the first stage, blood samples (10 ml of blood and 3 ml of 10 mM phosphate buffer, pH 7.5, with 0.15 Μ NaCl and 50 mM EDTA) are separated into plasma and a cell fraction by centrifugation for 20 minutes at 400 g at 15 ° C. From blood plasma, DNA is isolated by the phenol-chloroform method in our modification. An equal volume of lysis buffer (2% SDS and 1% mercaptoethanol) and 20 μl of proteinase K are added to blood plasma, incubated in a thermostat at 58 ° C for 1 hour. An equal volume of alkaline phenol and chloroform (1: 1 ratio) is added to the resulting lysate, centrifuged for 20 minutes at 3000 rpm. After phase separation, take the aqueous phase into a separate sterile tube. An equal volume of 95% isopropyl alcohol and a 5M NaCl solution are added to the aqueous phase to a concentration of 100 mM, the test tube is placed in a refrigerator at -20 ° C for 60 minutes. Then centrifuged for 15 minutes at 12700 rpm, at -10 ° C, the supernatant is decanted, and the precipitate is washed with 80% ethyl alcohol, ethanol residues are removed by centrifugation, the precipitate is dried in a solid-state thermostat and dissolved in 10 mM TE buffer. The concentration of the obtained DNA preparations is measured on a fluorometer. For RT-PCR, the DNA concentration in each sample is normalized to 0.5 ng / μl.
Амплификацию проводят в 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей 3 нг внДНК, 0,20 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х ПЦР-буфер, 1х краситель EvaGreen, и 0,1 е.а./мкл реакционной смеси ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, и по 600 нМ прямого и обратного праймеров для референсного гена или гена-мишени.Amplification is carried out in 20 μl of PCR mixture containing 3 ng cfDNA, 0.20 mM dNTPs, 2.5 mM MgCl 2 , 1x PCR buffer, 1x dye EvaGreen, and 0.1 u.a. / μl of the reaction mixture of DNA Thermus aquaticus polymerase, and 600 nM forward and reverse primers for the reference or target gene.
Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводят на термоциклере по следующей программе: t=95°C в течение 4 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10 с, t=58°C (чтение сигнала) в течение 30 с, t=72°C в течение 30 с. Quantitative PCR-RT amplification is carried out on a thermal cycler according to the following program: t = 95 ° C for 4 minutes. 40 cycles: t = 95 ° C for 10 s, t = 58 ° C (signal reading) for 30 s, t = 72 ° C for 30 s.
Относительная копийность генов Н2АХ и RBBP8 вычисляется следующим образом: рассчитывается Ct для целевого (Н2АХ или RBBP8) и референсного локуса (GAPDH), далее рассчитывается величина AQ -Ct(целевой локус) - Ct(референсный локус); копийность целевого локуса относительно референсного (rC) рассчитывается по формуле 2-ΔCt.The relative copy number of the H2AX and RBBP8 genes is calculated as follows: C t is calculated for the target (H2AX or RBBP8) and reference locus (GAPDH), then the value AQ -C t (target locus) - C t (reference locus) is calculated; copy number of the target locus relative to the reference (rC) is calculated by the formula 2 - ΔCt.
Сравниваются полученные значения гС с интервалом прогностического коэффициента копийности:The obtained values of gC are compared with the interval of the prognostic copy ratio:
- при значениях rCH2AX>13,1*10-3 и rCRBBP8>21,8*10-3 у пациента диагностируют радиорезистентную форму рака прямой кишки (чувствительность 96%, специфичность 95%),- with rC H2AX > 13.1 * 10 -3 and rC RBBP8 > 21.8 * 10 -3 , the patient is diagnosed with radioresistant rectal cancer (sensitivity 96%, specificity 95%),
- при значениях rCH2AX<13,l*10-3 и rCRBBP8<21,8*10-3 у пациента диагностируют чувствительную к лучевой терапии форму рака прямой кишки (чувствительность 96%, специфичность 92%).- at rC H2AX <13, l * 10 -3 and rC RBBP8 <21.8 * 10 -3 , the patient is diagnosed with a form of rectal cancer sensitive to radiation therapy (sensitivity 96%, specificity 92%).
Предлагаемым способом было осуществлено обследование 30 пациентов, у которых был диагностирован рак прямой кишки. Для доказательства прогностической ценности предлагаемого способа приводятся две выписки из историй болезни.The proposed method was carried out to examine 30 patients who were diagnosed with rectal cancer. To prove the predictive value of the proposed method, two extracts from case histories are given.
1. Больной Ш., 70 лет, состоит на учете в РНИОИ с июня 2019 г, диагноз рак средне- и верхнеампулярного отделов прямой кишки, cT3N0Mo, St II, кл.гр.1. Patient Sh., 70 years old, has been registered with the RNIOI since June 2019, diagnosed with cancer of the middle and upper ampullar parts of the rectum, cT3N 0 Mo, St II, class gr.
МРТ ОБП, ОМТ (от 10.06.2019 г. ) - на 12-14 см от анодермального перехода, в области границы средне- и верхнеампулярного отделов прямой кишки по левой стенке участок опухоли 16x24x11 мм. Лимфоузлы не поражены. СРКТ ОГК (от 13.06.2019 г.) - КТ-признаки единичных мелких очагов S1 справа и S3 слева. ВКС (от 01.07.2019 г.) - на 11 см до 15 см от ануса по левой стенке - опухолевидное экзофитное образование на широком основании в виде утолщенной фиксированной площадки с эрозированной мелкобугристой поверхностью. Гистологический анализ -G1 аденокарцинома.MRI OBP, OMT (dated 06/10/2019) - at 12-14 cm from the anodermal junction, in the area of the border of the mid- and upper ampullar rectum on the left wall, the tumor area is 16x24x11 mm. The lymph nodes are not affected. SRCT OGK (from 13.06.2019) - CT signs of single small foci S1 on the right and S3 on the left. VKS (from 07/01/2019) - 11 cm to 15 cm from the anus on the left wall - a tumor-like exophytic formation on a broad base in the form of a thickened fixed area with an eroded small-bumpy surface. Histological analysis of -G1 adenocarcinoma.
Консультация радиолога (от 01.07.2019 г.) - показано проведение курса конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза, на фоне радиомодификации фторпиримидинами.Consultation with a radiologist (from 07/01/2019) - a course of conformal radiation therapy is shown to the rectal area, lymph nodes of the small pelvis, against the background of radiomodification with fluoropyrimidines.
Перед началом лечения взята кровь для выделения внДНК. Результаты молекулярно-генетического анализа образцов внДНК rCH2AX=6,1*10-3 и rCRBBP8=12,0*10-3 соответствуют прогностическим коэффициентам чувствительной к лучевой терапии формы рака прямой кишки.Before starting treatment, blood was taken to isolate cfDNA. The results of molecular genetic analysis of cfDNA samples rC H2AX = 6.1 * 10 -3 and rC RBBP8 = 12.0 * 10 -3 correspond to the predictive coefficients of the form of rectal cancer sensitive to radiation therapy.
С 08.07.2019 г. по 07.08.2019 г. после СРКТ-топометрической подготовки проведен курс конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза на линейном ускорителе низких энергий Unique Varian 6MV, на фоне радиомодификации фторпиримидинами -капецитабин 1650 мг/м.From 07/08/2019 to 08/07/2019, after CPRT-topometric preparation, a course of conformal radiation therapy was carried out to the rectal area, lymph nodes of the small pelvis on a Unique Varian 6MV linear low-energy accelerator, against the background of radiomodification with fluoropyrimidines - capcitabine 1650 mg / m.
МРТ ОБП, ОМТ (от 30.09.2019 г. ) - MP-признаков рецидива опухолевого процесса нет, метастатического поражения лимфатических узлов не обнаружено. ВКС (от 27.09.2019 г.) - эндоскопически полный регресс опухоли (полный патоморфоз).MRI OBP, OMT (dated September 30, 2019) - there are no MP signs of recurrence of the tumor process, no metastatic lesions of the lymph nodes were found. VKS (from September 27, 2019) - endoscopically complete tumor regression (complete pathomorphosis).
2. Больной П., 70 лет, состоит на учете в РНИОИ с апреля 2019 г., диагноз: рак средне- и верхненеампулярного отделов прямой кишки, cT3N1Mx, St III, кл.гр.2.2. Patient P., 70 years old, has been registered with the RNIOI since April 2019, diagnosed with cancer of the middle and upper neoplastic rectum, cT3N1M x , St III, class group 2.
ВКС (от 31.03.2019 г.) - на расстоянии 8 см от ануса до 18 см -слизистая бугристая, контактно кровоточива. Гистологический анализ -низкодифференцированная аденокарцинома. СРКТ ОГК, ОБП, ОМТ (от 10.04.2019 г.) - опухоль прямой кишки 9,1×4,6 см с переходом на ректосигмоидный отдел, инфильтрация окружающей клетчатки, мтс-узлами в ней до 1 см. МРТ ОБП, ОМТ (от 11.04.2019 г.) - на 8,6 см от входа в анус, на 4,5 см от анодермального перехода циркулярный опухолевый процесс, протяженностью не менее 80 мм. Структура опухоли преимущественно солидная, просвет локально сужен. Экстрамуральный рост с инвазией мезореткальной клетчатки, наличие десмопластической реакции клетчатки. В паректальной клетчатке лимфоузел 9 мм. В мезоректальной клетчатке -единичные лимфоузлы до 5-6 мм.VKS (from 31.03.2019) - at a distance of 8 cm from the anus to 18 cm - mucous tuberous, contact bleeding. Histological analysis - poorly differentiated adenocarcinoma. SRCT OGK, OBP, OMT (dated 04/10/2019) - rectal tumor 9.1 × 4.6 cm with the transition to the rectosigmoid section, infiltration of the surrounding tissue, mts nodes in it up to 1 cm. MRI OBP, OMT ( from 04/11/2019) - 8.6 cm from the entrance to the anus, 4.5 cm from the anodermal junction, a circular tumor process, at least 80 mm long. The structure of the tumor is predominantly solid, the lumen is locally narrowed. Extramural growth with invasion of mesoretic tissue, presence of desmoplastic tissue reaction. In the parectal tissue, the lymph node is 9 mm. In the mesorectal tissue, there are single lymph nodes up to 5-6 mm.
Консультация радиолога (от 16.04.2019 г.) покачано проведение курса конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза.Consultation with a radiologist (dated 04/16/2019), the course of conformal radiation therapy to the rectal area and pelvic lymph nodes was started.
Перед началом лечения взята кровь для выделения внДНК. Результаты молекулярно-генетического анализа образцов внДНК rCH2AX=16,5*10-3 и rCRBBP8=27,4*10-3 соответствуют прогностическим коэффициентам радиорезистентной формы рака прямой кишки.Before starting treatment, blood was taken to isolate cfDNA. The results of molecular genetic analysis of cfDNA samples rC H2AX = 16.5 * 10 -3 and rC RBBP8 = 27.4 * 10 -3 correspond to the predictive coefficients of radioresistant form of rectal cancer.
С 23.04.2019 г. по 29.05.2019 г. после СРКТ-топометрической подготовки проведен курс конформной лучевой терапии на зону прямой кишки, лимфоузлы малого таза, паховые зоны с обеих сторон, на фоне радиомодификации капецитабином 1650 мг/м2 в сутки на линейном ускорителе низких энергий Unique Varian 6MV.From 23.04.2019 till 29.05.2019, after QDSL-topometricheskoy prepare a course conformal radiotherapy on rectal area, pelvic lymph nodes, inguinal region on both sides, on the background of radiomodification capecitabine 1650 mg / m 2 per day on the line low energy accelerator Unique Varian 6MV.
МРТ ОБП, ОМТ (от 22.07.2019 г.) - MP-картина солидной опухоли средне- и верхненеампулярного отделов прямой кишки с инвазией окружающей клетчатки. ВКС (от 22.07.2019 г.) - рак прямой кишки, состояние после курса НАХЛТ, эндоскопически без выраженной динамики.MRI OBP, OMT (from 22.07.2019) - MP-picture of a solid tumor of the middle and upper neoplastic parts of the rectum with invasion of the surrounding tissue. VKS (from 22.07.2019) - rectal cancer, condition after the course of NACHLT, endoscopically without pronounced dynamics.
Заявляемый способ, включает разработанные нами праймеры и является экономически оправданным для диагностики радиорезистентного рака прямой кишки, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, осуществление анализа возможно с плазмой крови, занимает не более 5 часов.The inventive method includes primers developed by us and is economically justified for the diagnosis of radioresistant rectal cancer, carried out in a standard molecular biology laboratory (PCR), without the use of special expensive equipment; has a high sensitivity and specificity, the analysis is possible with blood plasma, it takes no more than 5 hours.
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 1<160> 1
<210> 1<210> 1
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
AGGCCTCCCA GGAGTACTAA 20AGGCCTCCCA GGAGTACTAA 20
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 2<160> 2
<210> 1<210> 1
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
CTGAAGCGGC TCAGCTCTTT 20CTGAAGCGGC TCAGCTCTTT 20
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 3<160> 3
<210> 1<210> 1
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
ACCGAGGATT TGGCACTCTG 20ACCGAGGATT TGGCACTCTG 20
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 4<160> 4
<210> 1<210> 1
<211> 20<211> 20
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
TCCGAGATTG CCTCGGGATT 20TCCGAGATTG CCTCGGGATT 20
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 5<160> 5
<210> 1<210> 1
<211> 19<211> 19
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
GCTGAACGGG AAGCTCACT 19GCTGAACGGG AAGCTCACT 19
<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut<110> Kutilin, Denis; Rostovskij nauchno-issledovatelskij onkologicheskij institut
<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.<120> Low invasive method for radioresistant colon cancer diagnosis based on changes in the copy number of the H2AX and RBBP8 genes.
<160> 6<160> 6
<210> 1<210> 1
<211> 21<211> 21
<212> DNA<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
GCAGGTTTTT CTAGACGGCA G 21GCAGGTTTTT CTAGACGGCA G 21
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019135781A RU2740576C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019135781A RU2740576C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2740576C1 true RU2740576C1 (en) | 2021-01-15 |
Family
ID=74184077
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019135781A RU2740576C1 (en) | 2019-11-06 | 2019-11-06 | Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2740576C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010144192A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-12-16 | Children's Medical Center Corporation | Prognosis indicators for solid human tumors |
| WO2012066451A1 (en) * | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Pfizer Inc. | Prognostic and predictive gene signature for colon cancer |
| RU2586775C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова" (ФГБУ "ПИЯФ") | Method for non-invasive diagnosis of colorectal cancer |
-
2019
- 2019-11-06 RU RU2019135781A patent/RU2740576C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010144192A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-12-16 | Children's Medical Center Corporation | Prognosis indicators for solid human tumors |
| WO2012066451A1 (en) * | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Pfizer Inc. | Prognostic and predictive gene signature for colon cancer |
| RU2586775C1 (en) * | 2015-04-27 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова" (ФГБУ "ПИЯФ") | Method for non-invasive diagnosis of colorectal cancer |
Non-Patent Citations (5)
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101437718B1 (en) | Markers for predicting gastric cancer prognostication and Method for predicting gastric cancer prognostication using the same | |
| ES2714582T3 (en) | Procedure for predicting the response to chemotherapy in a patient who suffers or is at risk of developing recurrent breast cancer | |
| EP3874068A1 (en) | Methods to diagnose and treat cancer using non-human nucleic acids | |
| CN107889509A (en) | Methods and kits for molecular subtyping of bladder cancer | |
| Shukla et al. | Genetic changes of P 53 and Kras in gallbladder carcinoma in Kumaon region of Uttarakhand | |
| RU2740576C1 (en) | Minimally invasive method for detecting sensitivity of rectal tumour to radiation therapy based on change in abundance of n2ax and rbbp8 genes | |
| Xie et al. | Saliva supernatant miR-21: a novel potential biomarker for esophageal cancer detection | |
| US10301685B2 (en) | Method for predicting the benefit from inclusion of taxane in a chemotherapy regimen in patients with breast cancer | |
| NOURAEI et al. | Expression of survivin and its spliced variants in bladder tumors as a potential prognostic marker | |
| KR102052398B1 (en) | Biomarkers for diagnosis of prostate cancer and uses thereof | |
| KR102108299B1 (en) | MicroRNA Biomarker for Predicting Lymph Node Metastasis of Gastric Cancer | |
| RU2728428C1 (en) | Minimally invasive method for detecting sensitivity of prostate tumours to radiation therapy based on change in brca2 and rad50 gene copying | |
| CN113564250B (en) | Biomarkers for head and neck cancer and methods of using them | |
| US20210189504A1 (en) | Method and kit for measurement of rna | |
| RU2754154C1 (en) | Method for determining the radiosensitivity of malignant rectal tumours | |
| Abbas et al. | Relationship between human telomerase reverse transcriptase gene and some microRNAs expression levels in patients with bladder cancer | |
| WO2021191485A1 (en) | Biomarkers for predicting a patient's response to bcg therapy, methods and uses based thereon | |
| RU2813653C1 (en) | Method of early diagnosis of rectal cancer relapses while monitoring course of disease | |
| RU2766774C1 (en) | Minimally invasive method for diagnosing metastatic lesions of regional lymph nodes in patients with cervical cancer based on the copy number of the ccnd1 and ppargc1a genes | |
| Wu et al. | Rapid detection of gene expression by a colorectal cancer Enzymatic Gene Chip Detection Kit | |
| KR20130011348A (en) | Primers for detecting methylations of promoter and a kit for diagnosing a cancer using the same | |
| JP2025001351A (en) | Analytical method, kit and device for detection | |
| WO2001077385A1 (en) | Method of detecting cancer | |
| KR20220166744A (en) | Biomarkers for predicting prostatic carcinoma prognosis and uses thereof | |
| RU2678227C1 (en) | Minimally invasive method for diagnostics of lung cancer on basis of changing copy number of mtdna hv2 locus |