RU2740004C1 - Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method - Google Patents
Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2740004C1 RU2740004C1 RU2019127973A RU2019127973A RU2740004C1 RU 2740004 C1 RU2740004 C1 RU 2740004C1 RU 2019127973 A RU2019127973 A RU 2019127973A RU 2019127973 A RU2019127973 A RU 2019127973A RU 2740004 C1 RU2740004 C1 RU 2740004C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- spores
- plant growth
- test system
- green
- moss
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 42
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 claims description 24
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 claims description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 22
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 241001519377 Atrichum undulatum Species 0.000 claims description 6
- 241000195877 Polytrichum commune Species 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 5
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 claims description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 claims description 4
- 241000722360 Atrichum tenellum Species 0.000 claims description 3
- 241000382388 Barbula unguiculata Species 0.000 claims description 3
- 241001504288 Bryum argenteum Species 0.000 claims description 3
- 241000195897 Ceratodon purpureus Species 0.000 claims description 3
- 241000302790 Ditrichum pusillum Species 0.000 claims description 3
- 241001663981 Ephemerum serratum Species 0.000 claims description 3
- 241001504255 Physcomitrium pyriforme Species 0.000 claims description 3
- 241001484415 Physcomitrium sphaericum Species 0.000 claims description 3
- 241000627052 Polytrichum juniperinum Species 0.000 claims description 3
- 241001141731 Pottia intermedia Species 0.000 claims description 3
- 241000512202 Pottia truncata Species 0.000 claims description 3
- 241000872838 Weissia brachycarpa Species 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 claims description 2
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 claims description 2
- 241000512239 Fissidens Species 0.000 claims 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 78
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 21
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 19
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N Abscisic acid Natural products OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 18
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 18
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 17
- 240000003307 Zinnia violacea Species 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 241000736851 Tagetes Species 0.000 description 16
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 15
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 14
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 13
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 230000004763 spore germination Effects 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 241000592344 Spermatophyta Species 0.000 description 10
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 10
- 241000801064 Zinnia Species 0.000 description 9
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 9
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 101710116959 Phytosulfokines Proteins 0.000 description 8
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101100206252 Zinnia violacea TDIF gene Proteins 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- BSUVNQLYZGXYQY-SIDFPDLGSA-N (2S)-5-amino-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(4-sulfooxyphenyl)propanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-(4-sulfooxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 BSUVNQLYZGXYQY-SIDFPDLGSA-N 0.000 description 6
- 101710129607 Phytosulfokine-alpha Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 235000012308 Tagetes Nutrition 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000023968 developmental programmed cell death Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 3
- 101100167643 Arabidopsis thaliana CLV3 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical class NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 235000016626 Agrimonia eupatoria Nutrition 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000391967 Fissidens bryoides Species 0.000 description 2
- 241000583820 Fissidens exilis Species 0.000 description 2
- 241001148463 Funaria hygrometrica Species 0.000 description 2
- 241000196323 Marchantiophyta Species 0.000 description 2
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 101800001146 Phytosulfokine-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
- A01N43/72—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms
- A01N43/88—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with nitrogen atoms and oxygen or sulfur atoms as ring hetero atoms six-membered rings with three ring hetero atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N3/00—Spore forming or isolating processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области разработки новых ростовых веществ, активных в отношении растений, с целью применения их в сельском хозяйстве, а также для высокопроизводительного тестирования (скрининга) широкого спектра низкомолекулярных соединений с целью установления их биологической активности.The invention relates to the development of new growth substances that are active against plants for the purpose of their use in agriculture, as well as for high-throughput testing (screening) of a wide range of low-molecular compounds in order to establish their biological activity.
Клеточные модельные системы являются необходимыми инструментами тестирования новых биологически активных соединений, разрабатываемых для их применения в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Культуры клеток растений были использованы для идентификации ряда новых регуляторных пептидов растений, включая целые семейства регуляторных пептидов с высоким прикладным потенциалом, таких как фитосульфокины (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-α , a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and lowaffinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043; Bahyrycz, A., Matsubayashi, Y., Ogawa, M., Sakagami, Y., and Konopińska, D. (2005). Further analogues of plant peptide hormone phytosulfokine-α (PSK-α) and their biological evaluation. J. Pept. Sci. 11, 589–592. doi:10.1002/psc.653; Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (2006). PEPTIDE HORMONES IN PLANTS. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 649–674. doi:10.1146/annurev.arplant.56.032604.144204; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2) и пептиды семейства CLE (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12- 385095-9.00014-2).Cellular model systems are essential tools for testing new biologically active compounds developed for their use in biotechnology, medicine, and agriculture. Plant cell cultures have been used to identify a number of novel plant regulatory peptides, including entire families of high potential regulatory peptides such as phytosulfokines (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623-7627.doi: 10.1073 / pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997) Phytosulfokine-α, a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and lowaffinity binding sites Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357-13362.doi: 10.1073 / pnas.94.24.13357; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999) The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia Plant Physiol. 120, 1043-1048.doi: 10.1104 / pp.120.4.1043; Bahyrycz, A., Mats ubayashi, Y., Ogawa, M., Sakagami, Y., and Konopińska, D. (2005). Further analogues of plant peptide hormone phytosulfokine-α (PSK-α) and their biological evaluation. J. Pept. Sci. 11, 589-592. doi: 10.1002 / psc.653; Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (2006). PEPTIDE HORMONES IN PLANTS. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 649-674. doi: 10.1146 / annurev.arplant.56.032604.144204; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi: 10.1016 / B978-0-12-385095-9.00014-2) and peptides of the CLE family (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H. , et al. (2006) A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845-8. doi: 10.1126 / science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013) "TDIF," in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71-75. Doi: 10.1016 / B978-0-12- 385095-9.00014-2).
Семейство коротких регуляторных пептидов, которые были объединены названием фитосульфокины (Phytosulphokines, PSKs), было открыто при проведении поиска ростовых веществ в жидкой питательной среде, кондиционированной при суспензионном культивировании изолированных клеток мезофилла спаржи Asparagus officinalis L. Важно отметить, что клетки спаржи в данных работах были использованы и как источник пептидов и как клеточная модельная тест-система (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623).The family of short regulatory peptides, which were united by the name phytosulphokines (PSKs), was discovered when searching for growth substances in a liquid nutrient medium conditioned during the suspension cultivation of isolated cells of the mesophyll of asparagus Asparagus officinalis L. It is important to note that asparagus cells in these studies were used both as a source of peptides and as a cellular model test system (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623-7627. doi: 10.1073 / pnas.93.15.7623).
Исследование кондиционирующих факторов, которые подавляют дифференциацию культивируемых клеток бархатцев в трахеальные клетки проводящей системы в ксилогенетических культурах клеток, привело к открытию пептидов-регуляторов проводящей системы семенных растений (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436). Данные пептиды-регуляторы дифференцировки сосудов оказались членами большого семейства пептидных фитогормонов CLE, в котором они заняли особое место как пептиды, связанные с процессами дифференциации, а не ростовыми процессами, в отношении которых компетентно большинство из 26 пептидов семейства CLE у растений арабидопсис (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., Kieber, J. J., and Fukuda, H. (2011). CLE Peptides can Negatively Regulate Protoxylem Vessel Formation via Cytokinin Signaling. Plant Cell Physiol. 52, 37–48. doi:10.1093/pcp/pcq129; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2). Модельные системы in vitro, основанные на культурах проростков Arabidopsis thaliana L., выращиваемых в вертикально ориентированных чашках Петри (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845–8. doi:10.1126/science.1128439), также сыграли важную роль при открытии семейств регуляторных пептидов CLE и дополнили экспериментальные работы по открытию CLE-пептидов, основанные на анализе процессов дифференциации в культурах клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436). Две цитируемые работы двух независимых групп авторов вышли подряд в одном выпуске Science за 2006 г., дополняют друг друга по смыслу и составляют единое целое как значительный этап в развитии функциональной пептидомики растений. Важно подчеркнуть, что растительные клеточные модельные тест-системы, использованные для анализа биологической активности пептидов в данных работах, сыграли ключевую роль в открытии новых пептидных регуляторов роста растений.The study of conditioning factors that suppress the differentiation of cultured marigold cells into tracheal cells of the conducting system in xylogenetic cell cultures led to the discovery of peptides regulating the conducting system of seed plants (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K. , Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436). These peptides regulating vascular differentiation turned out to be members of a large family of peptide phytohormones CLE, in which they occupied a special place as peptides associated with differentiation processes rather than growth processes, for which most of the 26 peptides of the CLE family in Arabidopsis plants are competent (Kondo, T ., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H., et al. (2006) A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845-8. Doi: 10.1126 / science.1128439; Kondo, Y., Hirakawa, Y., Kieber, JJ, and Fukuda, H. (2011). CLE Peptides can Negatively Regulate Protoxylem Vessel Formation via Cytokinin Signaling. Plant Cell Physiol. 52, 37-48. Doi: 10.1093 / pcp / pcq129; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier) , 71-75. Doi: 10.1016 / B978-0-12-385095-9.00014-2). Model systems in vitro based on cultures of Arabidopsis thaliana L. seedlings grown in vertically oriented Petri dishes (Kondo, T., Sawa, S., Kinoshita, A., Mizuno, S., Kakimoto, T., Fukuda, H. , et al. (2006). A plant peptide encoded by CLV3 identified by in situ MALDI-TOF MS analysis. Science 313, 845-8. doi: 10.1126 / science.1128439), also played an important role in the discovery of the families of regulatory peptides CLE and supplemented experimental work on the discovery of CLE peptides based on the analysis of differentiation processes in cell cultures of marigolds Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae , N., et al. (2006) Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436). The two cited works of two independent groups of authors appeared in a row in one issue of Science for 2006, complement each other in meaning and form a single whole as a significant stage in the development of functional plant peptidomics. It is important to emphasize that plant cell model test systems used to analyze the biological activity of peptides in these works played a key role in the discovery of new peptide plant growth regulators.
Универсальность клеточных модельных культур как тест-систем была продемонстрирована применительно к новым ростовым веществам в работах с клетками спаржи. После открытия фитосульфокинов в культивируемых клетках спаржи (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623) авторы использовали тест на пролиферацию клеток спаржи не только для тестирования биологической активности растительных пептидов, включая фитосульфокины, и не только пептидов, продуцируемых клетками спаржи, но и для открытия семейства пептидных фитогормонов PSY в растениях арабидопсис (Amano, Y., Tsubouchi, H., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007). Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18333–8. doi:10.1073/pnas.0706403104). Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что культивируемые клетки спаржи Asparagus officinalis L. были апробированы как универсальные клеточные модельные системы для тестирования биологической активности новых пептидов из высших растений, принадлежащих к различным систематическим группам. Результаты применения модельных клеток спаржи для тестирования пептидов PSY из Arabidopsis thaliana L. были подтверждены в тестах на культурах клеток самого растения арабидопсис, который был источником исследуемых пептидов, и привели к открытию нового семейства растительных регуляторных пептидов PSY (Amano, Y., Tsubouchi, H., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007). Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18333–8. doi:10.1073/pnas.0706403104). Еще одним примером универсальности клеток растений как тест-систем на биологическую активность низкомолекулярных биорегуляторов являются работы, в которых исследовалось действие фитосульфокинов, открытых в клетках спаржи Asparagus officinalis L., на процессы дифференциации сосудистых элементов в ксилогенных культурах клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043; Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009). Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. doi:10.1104/pp.109.135954). Фитосульфокины из спаржи оказались активными в отношении клеток бархатцев, чувствительных к пептидным факторам клеточной дифференцировки CLE. Таким образом, анализ митотической активности и процессов дифференцировки в культивируемых ксилогенных клетках бархатцев позволил выявить новые функциональные свойства фитосульфокинов. Культура клеток бархатцев была апробирована в экспериментах по исследованию биологической активности фитосульфокинов в широком диапазоне концентраций, включая наномолярный (Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009). Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. doi:10.1104/pp.109.135954).The versatility of model cell cultures as test systems was demonstrated in relation to new growth substances in work with asparagus cells. After the discovery of phytosulfokines in cultured asparagus cells (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623 –7627. Doi: 10.1073 / pnas.93.15.7623), the authors used the asparagus cell proliferation test not only to test the biological activity of plant peptides, including phytosulfokines, and not only peptides produced by asparagus cells, but also to discover the PSY peptide phytohormone family in Arabidopsis plants (Amano, Y., Tsubouchi, H., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007). Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad Sci USA 104, 18333-8 doi: 10.1073 / pnas.0706403104). From the results obtained, it can be concluded that the cultivated asparagus cells Asparagus officinalis L. were tested as universal cellular model systems for testing the biological activity of new peptides from higher plants belonging to different taxonomic groups. The results of using model asparagus cells for testing PSY peptides from Arabidopsis thaliana L. were confirmed in tests on cell cultures of the Arabidopsis plant itself, which was the source of the studied peptides, and led to the discovery of a new family of plant regulatory PSY peptides (Amano, Y., Tsubouchi, H ., Shinohara, H., Ogawa, M., and Matsubayashi, Y. (2007) Tyrosine-sulfated glycopeptide involved in cellular proliferation and expansion in Arabidopsis . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 18333-8. Doi : 10.1073 / pnas.0706403104). Another example of the versatility of plant cells as test systems for the biological activity of low molecular weight bioregulators is the work in which the effect of phytosulfokines discovered in the cells of Asparagus officinalis L. on the processes of differentiation of vascular elements in xylogenic cell cultures of marigold Zinnia elegans L. (Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia . Plant Physiol. 120, 1043-1048.doi: 10.1104 / pp.120.4.1043; Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009) . Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. Doi: 10.1104 / pp. 109.135954). Phytosulfokines from asparagus were found to be active against marigold cells sensitive to the peptide factors of cell differentiation CLE. Thus, analysis of mitotic activity and differentiation processes in cultured xylogenic marigold cells made it possible to reveal new functional properties of phytosulfokines. The marigold cell culture was tested in experiments to study the biological activity of phytosulfokines in a wide range of concentrations, including nanomolar (Motose, H., Iwamoto, K., Endo, S., Demura, T., Sakagami, Y., Matsubayashi, Y., et al. (2009). Involvement of phytosulfokine in the attenuation of stress response during the transdifferentiation of Zinnia mesophyll cells into tracheary elements. Plant Physiol. doi: 10.1104 / pp. 109.135954).
В качестве клеточных тест-систем известны культуры протопластов риса в агарозных блоках, которые были использованы для тестирования биологической активности фитосульфокинов. Биотесты на основе протопластов риса представляют собой агарозные блоки с протопластами, заключенными в толще агаровой среды, инкубация которых происходит в жидкой среде с добавлением или без добавления исследуемого соединения. Критерием фитогормональной активности исследуемого вещества является интенсивность процесса деления протопластов и образования каллусных структур в толще агара, которая оценивается путем подсчета их числа в агарозных блоках (Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-α, a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific highand low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357).Cultures of rice protoplasts in agarose blocks are known as cellular test systems, which were used to test the biological activity of phytosulfokines. Bioassays based on rice protoplasts are agarose blocks with protoplasts enclosed in the thickness of an agar medium, which are incubated in a liquid medium with or without the addition of a test compound. The criterion of the phytohormonal activity of the test substance is the intensity of the process of protoplast division and the formation of callus structures in the agar layer, which is assessed by counting their number in agarose blocks (Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-α , a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific highand low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357-13362. doi: 10.1073 / pnas.94.24.13357).
Культуры клеток спаржи Asparagus officinalis L. (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623–7627. doi:10.1073/pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine- , a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high- and low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357–13362. doi:10.1073/pnas.94.24.13357) и ксилогенные культуры клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999). The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia. Plant Physiol. 120, 1043–1048. doi:10.1104/pp.120.4.1043) являются ближайшими аналогами клеточных тест-систем для установления и изучения биологической активности коротких пептидов и других низкомолекулярных соединений применительно к культурам спор зеленых мхов, разработанных в данном изобретении. В процессе прорастания спор зеленых мхов, использованных в данном изобретении, происходит запуск процессов развития организма из одной клетки, основанных на клеточной дифференцировке. Asparagus officinalis L. cell cultures (Matsubayashi, Y., and Sakagami, Y. (1996). Phytosulfokine, sulfated peptides that induce the proliferation of single mesophyll cells of Asparagus officinalis L. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 7623 –7627. Doi: 10.1073 / pnas.93.15.7623; Matsubayashi, Y., Takagi, L., and Sakagami, Y. (1997). Phytosulfokine-, a sulfated pentapeptide, stimulates the proliferation of rice cells by means of specific high - and low-affinity binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 13357-13362. doi: 10.1073 / pnas.94.24.13357) and xylogenic cell cultures of marigold Zinnia elegans L. (Ito, Y., Nakanomyo, I ., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436; Matsubayashi, Y., Takagi, L., Omura, N., Morita, A., and Sakagami, Y. (1999) The Endogenous Sulfated Pentapeptide Phytosulfokine-α Stimulates Tracheary Element Differentiation of Isolated Mesophyll Cells of Zinnia . Plant Physiol. 120, 1043-1048. doi: 10.1104 / pp.120.4.1043) are the closest analogues of cellular test systems for establishing and studying the biological activity of short peptides and other low molecular weight compounds in relation to the spore cultures of green moss developed in this invention. In the process of germination of spores of green mosses used in this invention, the development of an organism from one cell, based on cellular differentiation, is triggered.
Известно применение мхов в качестве культивируемых объектов в модельных тест-системах (Vujicic М.М. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, стр. 11-15). При этом для культивирования мхов используются чашки Петри, а в качестве эксплантируемого и культивируемого материала используются побеги зеленых мхов или талломы печеночников (Vujicic М.М. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, стр. 11-15). Следует отметить, что побеги зеленых мхов и талломы печеночников являются сложными многоклеточными органами растений, их эксплантация и культивирование на искусственных средах дает некоторые результаты по тестированию ростовых веществ. Интерпретация этих результатов ограничена анализом воздействия тестируемых веществ на многоклеточные органы и целые растения и не дает возможности проследить в эксперименте эффект вещества на отдельные клетки. В отличие от подобных многоклеточных модельных систем, культуры клеток и одноклеточных систем, таких как споры, могут быть использованы для исследования воздействия различных химических агентов на отдельные клетки и клеточные процессы.It is known to use mosses as cultivated objects in model test systems (Vujicic M.M. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, pp. 11-15). At the same time, Petri dishes are used for the cultivation of mosses, and shoots of green mosses or thalli of liverworts are used as the explanted and cultivated material (Vujicic M.M. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica Serbica, 41, 2017, pp. 11-15). It should be noted that shoots of green mosses and thalli of liverworts are complex multicellular organs of plants; their explantation and cultivation on artificial media gives some results in testing growth substances. The interpretation of these results is limited to the analysis of the effect of the tested substances on multicellular organs and whole plants and does not make it possible to trace the effect of the substance on individual cells in the experiment. Unlike similar multicellular model systems, cell cultures and unicellular systems such as spores can be used to study the effect of various chemical agents on individual cells and cellular processes.
Прототипом культуры спор мхов, используемой в качестве клеточной системы для тестирования биологической активности пептидов и других низкомолекулярных биорегуляторов являются ксилогенные культуры клеток бархатцев Zinnia elegans L. (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12- 385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).The prototype of the moss spore culture used as a cell system for testing the biological activity of peptides and other low molecular weight bioregulators is xylogenic cell cultures of marigold Zinnia elegans L. (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans Plant Physiol. 65, 57-60.doi: 10.1104 / pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436; Kondo , Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013) “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71-75. Doi: 10.1016 / B978-0-12- 385095-9.00014- 2; Iakimova, ET, and Woltering, EJ (2017). Xylogenesis in zinnia ( Zinnia elegans ) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental pr ogrammed cell death event. Planta 245, 681–705. doi: 10.1007 / s00425-017-2656-1.).
Техническая проблема, возникающая при работе с культурами клеток спаржи, бархатцев и другими клетками семенных растений как тест-системами для анализа биологической активности низкомолекулярных соединений, заключается в целом ряде их недостатков:The technical problem that arises when working with cell cultures of asparagus, marigolds and other cells of seed plants as test systems for analyzing the biological activity of low molecular weight compounds consists in a number of their disadvantages:
1. Высокая гетерогенность клеток. Культивируемые клетки семенных растений, используемые в тестах, в частности, ксилогенные клетки бархатцев, являющиеся прототипом клеточной системы данного изобретения, отличаются высоким разнообразием размеров и формы клеток, а также высокой гетерогенностью по клеточной морфологии (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).1. High cell heterogeneity. The cultivated cells of seed plants used in tests, in particular, the xylogenic cells of marigolds, which are the prototype of the cell system of the present invention, are distinguished by a high variety of cell sizes and shapes, as well as high heterogeneity in cell morphology (Fukuda, H., and Komamine, A. ( 1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans . Plant Physiol. 65, 57-60. Doi: 10.1104 / pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006) Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation Science 313, 842-5 . doi: 10.1126 / science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71-75. doi: 10.1016 / B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, ET, and Woltering, EJ (2017). Xylogenesis in zinnia ( Zinnia elegans ) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi: 10.1007 / s00425-017-2656-1.).
2. Сложность микроскопического анализа клеток, в котором необходимо тщательно анализировать элементы текстуры клеточной стенки бледных, слабоокрашенных клеток. В частности такими клетками являются культивируемые клетки бархатцев Zinnia elegans (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.). При этом анализ можно проводить только в медленном режиме «от клетки к клетке», необходимо тщательно анализировать особенности внутренней структуры каждой клетки по формированию трахеальных элементов, связанной с изменением структуры клеточной оболочки.2. The complexity of microscopic analysis of cells, in which it is necessary to carefully analyze the elements of the texture of the cell wall of pale, weakly colored cells. In particular, such cells are cultured cells of marigold Zinnia elegans (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol .. 65, 57-60 doi: 10.1104 / pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006) Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71-75.doi: 10.1016 / B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, ET, and Woltering, EJ (2017). Xylogenesis in zinnia ( Zinnia elegans ) cell cultures: unraveling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. Doi: 10.1007 / s00425-017-2656-1.). In this case, the analysis can only be carried out in a slow mode "from cell to cell", it is necessary to carefully analyze the features of the internal structure of each cell in the formation of tracheal elements associated with a change in the structure of the cell membrane.
3. Полиплоидность и гетерозиготность, которые свойственны культурам клеток семенных растений. В популяции культивируемых клеток семенных растений возможно варьирование не только плоидности, но и числа хромосом.3. Polyploidy and heterozygosity, which are inherent in seed plant cell cultures. In the population of cultivated cells of seed plants, it is possible to vary not only ploidy, but also the number of chromosomes.
4. Необходимость проводить сложный, многостадийный процесс выделения клеток из растительных тканей, в частности, применительно к прототипу данного изобретения, клеткам бархатцев Zinnia elegans, необходимо проводить разрушение листовой ткани и выделять клетки мезофилла, которые на следующих стадиях надо проводить через несколько подготовительных стадий культивирования на специальных средах для получения адекватных для тестовых экспериментов клеток (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.).4. The need to carry out a complex, multistage process of isolating cells from plant tissues, in particular, in relation to the prototype of this invention, the cells of marigold Zinnia elegans , it is necessary to destroy the leaf tissue and isolate mesophyll cells, which in the next stages should be carried out through several preparatory stages of cultivation on special media for obtaining cells adequate for test experiments (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans . Plant Physiol. 65, 57-60. Doi: 10.1104 / pp.65.1.57; Iakimova, ET, and Woltering, EJ (2017). Xylogenesis in zinnia ( Zinnia elegans ) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event Planta 245, 681-705. Doi: 10.1007 / s00425-017-2656-1.).
Технический результат, который позволяет получать настоящее изобретение, заключается достижении высокой чувствительности и специфичности гомогенной клеточной тест-системы при низких концентрациях тестируемых веществ, высокой стандартизируемости процесса тестирования и высокой воспроизводимости результатов теста.The technical result, which allows obtaining the present invention, is to achieve high sensitivity and specificity of a homogeneous cell test system at low concentrations of the tested substances, high standardization of the testing process and high reproducibility of test results.
Для решения технической проблемы, связанной с использованием культур клеток спаржи, бархатцев и других семенных растений в качестве тест-систем для анализа биологической активности низкомолекулярных веществ, и достижения заявленного технического результата предлагается способ высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений, в котором в качестве клеточной тест-системы используют споры зеленых мхов, включающий стадию подготовки, которая заключается в выделении спор зеленого мха из гаметофоров зеленых мхов путем механического разрушения спорофитов с одновременным переводом спор в водную суспензию в стерильной воде, а также центрифугирование для очистки; стадию культивирования клеточной тест-системы, к которой добавлены кандидаты регуляторов роста растений; и стадию анализа роста клеточной тест-системы, на которой пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида, добавленного в лунки культуральных планшетов, и с помощью видеокамеры, которой оборудован микроскоп, получают изображения спор в лунках, при этом в качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах.To solve the technical problem associated with the use of cell cultures of asparagus, marigold and other seed plants as test systems for analyzing the biological activity of low molecular weight substances, and to achieve the claimed technical result, a method for high-throughput screening of plant growth regulators is proposed, in which, as a cell test system spores of green mosses are used, including the stage of preparation, which consists in the isolation of spores of green moss from gametophores of green mosses by mechanical destruction of sporophytes with simultaneous transfer of spores into an aqueous suspension in sterile water, as well as centrifugation for purification; a stage of culturing a cell test system to which the candidate plant growth regulators have been added; and the stage of analysis of the growth of a cell test system, in which samples are prepared by chemical fixation with paraformaldehyde added to the wells of culture plates, and using a video camera equipped with a microscope, images of spores in the wells are obtained, while as an indicator of the cellular activity of the test substance plant growth regulator use the proportion of germinated spores of green mosses from their total number in the experimental and control samples.
Клеточная тест-система может быть выбрана из растений, принадлежащих к видам Atrichum tenellum, Atrichum undulatum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrella patens, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum commune, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata, Pottia intermedia, Weissia brachycarpa.Cellular test system may be selected from plants belonging to the species Atrichum tenellum, Atrichum undulatum, Barbula unguiculata , Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrella patens, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum , Polytrichum commune , Polytrichum juniperinum , Pottia truncata , Pottia intermedia , Weissia brachycarpa .
На стадии подготовки клеточной системы споры выделяют из гаметофоров зеленых мхов. Споры выделяют путем механического разрушения спорофитов, осуществляют перевод спор в водную суспензию в стерильной воде и центрифугируют. Выделенные споры депонируют в стерильной воде при температуре от 4 до 10°С на срок от 3 до 90 суток.At the stage of preparation of the cellular system, spores are isolated from the gametophores of green mosses. Spores are isolated by mechanical destruction of sporophytes, the spores are transferred into an aqueous suspension in sterile water and centrifuged. Isolated spores are deposited in sterile water at a temperature of 4 to 10 ° C for a period of 3 to 90 days.
На стадии культивирования споры зеленых мхов культивируют в стандартных культуральных планшетах в жидкой питательной среде. Культивирование спор зеленого мха осуществляют при температуре от 16 до 28°С в условиях фотопериода длиной от 8 до 20 ч.At the stage of cultivation, spores of green mosses are cultivated in standard culture plates in a liquid nutrient medium. Cultivation of green moss spores is carried out at a temperature of 16 to 28 ° C under conditions of a photoperiod of 8 to 20 hours.
Анализ роста клеточной тест-системы осуществляют после завершения культивирования спор на жидкой питательной среде в течение периода от 24 до 72 суток. Пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида.The analysis of the growth of the cell test system is carried out after the completion of the cultivation of spores in a liquid nutrient medium for a period from 24 to 72 days. Samples are prepared by chemical fixation with paraformaldehyde.
Анализ роста клеточной тест-системы осуществляют на стандартном инвертированном микроскопе, оборудованном видеокамерой для микроскопии в светлом поле, с помощью программных пакетов ImageJ.The analysis of the growth of the cell test system is carried out on a standard inverted microscope equipped with a video camera for microscopy in a bright field using ImageJ software packages.
В качестве показателя клеточной активности исследуемого вещества как регулятора роста растений используют долю проросших спор зеленых мхов от их общего числа в опытном и контрольном образцах. Проросшие споры зеленого мха определяют по формированию протонематического выроста.As an indicator of the cellular activity of the test substance as a plant growth regulator, the proportion of germinated spores of green mosses from their total number in the experimental and control samples is used. Germinated spores of green moss are determined by the formation of protonematic outgrowth.
Кандидаты в качестве регуляторов роста растений выбирают из группы низкомолекулярных соединений, состоящей из синтетических соединений, природных соединений, компонентов растительных экстрактов.Candidates as plant growth regulators are selected from the group of low molecular weight compounds, consisting of synthetic compounds, natural compounds, components of plant extracts.
Предлагается комплект скрининга регуляторов роста растений, для осуществления заявленного способа, включающий клеточную тест-систему в виде спор зеленых мхов, культуральный планшет и микроскоп.A set of screening plant growth regulators is proposed for implementing the claimed method, including a cell test system in the form of spores of green mosses, a culture plate and a microscope.
При этом микроскоп оборудован видеокамерой для микроскопии в светлом поле, а культуральный планшет содержит от 6 до 96 до лунок.The microscope is equipped with a video camera for microscopy in a bright field, and the culture plate contains from 6 to 96 wells.
Предлагается применение спор зеленых мхов для скрининга регуляторов роста растений заявленным способом.It is proposed to use spores of green mosses for screening plant growth regulators by the claimed method.
В настоящем изобретении споры зеленых мхов впервые используются как высокосинхронные, гомогенные одноклеточные модельные системы, основанные на культивировании фототрофных растительных клеток. Данная тест-система позволяет анализировать различные соединения в широких диапазонах концентраций. На основе предложенной системы скрининга проводится анализ биологической активности ростовых веществ при выводе одиночных клеток из состояния покоя, на стартовом этапе развития организма из одной клетки. Несмотря на значительный научный интерес и экспериментальный потенциал, споры зеленых мхов до последнего времени остаются невостребованными (и незапатентованными) как высокоэффективная и перспективная клеточная модель, которая может быть успешно реализована в тестах на биологическую активность химических агентов.In the present invention, green moss spores are used for the first time as highly synchronous, homogeneous unicellular model systems based on the cultivation of phototrophic plant cells. This test system allows the analysis of various compounds in a wide concentration range. On the basis of the proposed screening system, the analysis of the biological activity of growth substances is carried out during the removal of single cells from a state of dormancy, at the initial stage of development of the organism from one cell. Despite significant scientific interest and experimental potential, spores of green mosses until recently remain unclaimed (and not patented) as a highly efficient and promising cell model that can be successfully implemented in tests for the biological activity of chemical agents.
Заявленный способ скрининга позволяет решить техническую проблему, связанную с высокой гетерогенностью клеток, используемых в аналогичных системах.The claimed screening method allows to solve the technical problem associated with the high heterogeneity of cells used in similar systems.
В отличие от культур клеток семенных растений культура спор мхов, использованная в данном изобретении, является высокогомогенной клеточной тест-системой по таким параметрам, как плоидность, стабильность генетического материала, размер и форма клеток, а также по особенностям клеточной морфологии. Unlike seed plant cell cultures, the moss spore culture used in this invention is a highly homogeneous cell test system in terms of ploidy, stability of genetic material, cell size and shape, and also in terms of cell morphology.
В отличие от прототипа, которым являются клетки бархатцев (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57–60. doi:10.1104/pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. (2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842–5. doi:10.1126/science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). “TDIF,” in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71–75. doi:10.1016/B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, E. T., and Woltering, E. J. (2017). Xylogenesis in zinnia (Zinnia elegans) cell cultures: unravelling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681–705. doi:10.1007/s00425-017-2656-1.), в предлагаемом изобретении упрощается и ускоряется процесс этап микроскопии клеток, связанный с проведением анализа клеточной структуры. В настоящем изобретении анализ биологической активности веществ проводится на основе регистрации изменений в клеточной морфологии, а именно формы клетки, которая изменяется в процессе образования клеточного выроста. Данный анализ позволяет быстро проводить регистрацию десятков и сотен клеток при небольших увеличениях светового микроскопа в светлом поле, при этом также возможна автоматизация процесса обработки изображений с помощью программных пакетов.In contrast to the prototype, which are marigold cells (Fukuda, H., and Komamine, A. (1980). Establishment of an Experimental System for the Study of Tracheary Element Differentiation from Single Cells Isolated from the Mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiol. 65, 57-60.doi: 10.1104 / pp.65.1.57; Ito, Y., Nakanomyo, I., Motose, H., Iwamoto, K., Sawa, S., Dohmae, N., et al. ( 2006). Dodeca-CLE peptides as suppressors of plant stem cell differentiation. Science 313, 842-5. Doi: 10.1126 / science.1128436; Kondo, Y., Hirakawa, Y., and Fukuda, H. (2013). " TDIF, ”in Handbook of Biologically Active Peptides (Elsevier), 71-75.doi: 10.1016 / B978-0-12-385095-9.00014-2; Iakimova, ET, and Woltering, EJ (2017). Xylogenesis in zinnia ( Zinnia elegans ) cell cultures: unraveling the regulatory steps in a complex developmental programmed cell death event. Planta 245, 681-705. doi: 10.1007 / s00425-017-2656-1.), the proposed invention simplifies and accelerates the process of the stage of cell microscopy, bound with the analysis of the cellular structure. In the present invention, the analysis of the biological activity of substances is carried out on the basis of registration of changes in cell morphology, namely, the shape of the cell, which changes during the formation of cell outgrowth. This analysis makes it possible to quickly register tens and hundreds of cells at low magnifications of a light microscope in a bright field, while it is also possible to automate the image processing process using software packages.
В заявленном изобретении отсутствует необходимость в проведении многостадийного процесса выделения клеток из растительных тканей, как это делается при получении культуры клеток бархатцев. В отличие от большинства модельных культивируемых клеток семенных растений и, в частности от модельной культуры клеток бархатцев Zinnia elegans, которая является прототипом тестовой клеточной системы данного изобретения, для получения спор зеленых мхов не требуется проводить специальных подготовительных этапов клеточной работы по обработке и культивированию растительного материала. Споры зеленых мхов образуются естественным путем в коробочках гаметофоров в количествах, достаточных для использования их в клеточных тест-системах. В настоящем изобретении разработан простой и эффективный способ получения водной клеточной суспензии на основе спор мхов, пригодной для проведения клеточных тестов на биологическую активность низкомолекулярных соединений.In the claimed invention there is no need to carry out a multistage process of isolating cells from plant tissues, as is done when obtaining a culture of marigold cells. Unlike most model cultured cells of seed plants and, in particular, from the model culture of cells of marigolds Zinnia elegans , which is the prototype of the test cell system of the present invention, to obtain spores of green mosses does not require special preparatory stages of cell work for processing and cultivating plant material. Green moss spores are formed naturally in gametophore capsules in quantities sufficient for use in cellular test systems. The present invention has developed a simple and effective method for preparing an aqueous cell suspension based on moss spores, suitable for carrying out cell tests for the biological activity of low molecular weight compounds.
Заявленное изобретение решает техническую проблему, связанную с полиплоидностью, гетерозиготностью и соматической вариативностью, которые свойственны культурам клеток семенных растений. В отличие от культивируемых клеток семенных растений, биологическая особенность спор зеленых мхов, используемых в данном изобретении, заключается в том, что они являются строго гаплоидными клетками.The claimed invention solves the technical problem associated with polyploidy, heterozygosity and somatic variability, which are inherent in seed plant cell cultures. Unlike cultured seed plant cells, the biological feature of the green moss spores used in this invention is that they are strictly haploid cells.
Заявленные изобретения иллюстрируются следующими рисунками.The claimed inventions are illustrated by the following figures.
На Фиг. 1 представлены изображения спор Physcomitrella patens.FIG. 1 shows images of the spores of Physcomitrella patens .
На Фиг. 2 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия абсцизовой кислоты на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens. FIG. 2 shows a diagram of the concentration dependence of the effect of abscisic acid on the germination of spores of Physcomitrella patens moss .
На Фиг. 3 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.FIG. 3 shows a diagram of the concentration dependence of the effect of the peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1 on the germination of spores of Physcomitrella patens moss.
На Фиг. 4 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида GFLVARPN, SEQ ID №2 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens.FIG. 4 is a diagram of the concentration dependence of the effect of the short peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2 on the spore germination of Physcomitrella patens moss spores.
На Фиг. 5 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens. FIG. 5 is a diagram of the concentration dependence of the effect of the IAEYTIKINEGG peptide, SEQ ID No. 3 on the spore germination of Physcomitrella patens moss spores .
На Фиг. 6 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4 на процесс прорастания спор мха Polytrichum commune. FIG. 6 shows a diagram of the concentration dependence of the action of the short peptide WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID No. 4 on the germination of spores of the moss Polytrichum commune.
На Фиг. 7 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID №5 на процесс прорастания спор мха Atrichum undulatum. FIG. 7 shows a diagram of the concentration dependence of the action of the peptide IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID No. 5 on the germination of spores of moss Atrichum undulatum.
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is carried out as follows.
Клеточная тест-система представляет собой культуру спор мхов, которые культивируют в стандартных культуральных планшетах с числом лунок от 6 до 96 в специально подобранной жидкой питательной среде, разработанной путем модификации стандартной среды для культивирования зеленых мхов (Cove, D. J., Perroud, P.-F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136. doi:10.1101/pdb.prot5136).The cell test system is a culture of moss spores, which are cultured in standard culture plates with a number of wells from 6 to 96 in a specially selected liquid nutrient medium, developed by modifying the standard medium for the cultivation of green mosses (Cove, DJ, Perroud, P.-F ., Charron, AJ, McDaniel, SF, Khandelwal, A., and Quatrano, RS (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens . Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136.doi: 10.1101 / pdb .prot5136).
1) Культуру спор выделяют в лабораторных условиях из коробочек гаметофоров зеленых мхов (Physcomitrella patens, Atrichum undulatum, Polytrichum commune) которые собирают в естественной среде обитания или выращивают в контролируемых условиях на стандартных средах (Cove, D. J., Perroud, P.-F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136. doi:10.1101/pdb.prot5136). Споры выделяют из гаметофоров по методике, основанной на механическом разрушении зрелых коробочек (спорофитов) с одновременным переводом спор в водную суспензию в стерильной воде с последующий их очисткой путем центрифугирования. Выделенные споры депонируют в стерильной воде при температуре от 4 до 10°С на срок от 3 до 90 суток и используют для проведения опытов по тестированию низкомолекулярных соединений.1) The culture of spores is isolated in laboratory conditions from the capsules of gametophores of green mosses ( Physcomitrella patens , Atrichum undulatum, Polytrichum commune ) that are collected in their natural habitat or grown under controlled conditions on standard media (Cove, DJ, Perroud, P.-F., Charron, AJ, McDaniel, SF, Khandelwal, A., and Quatrano, RS (2009). Culturing the Moss Physcomitrella patens . Cold Spring Harb. Protoc. 2009, pdb.prot5136-pdb.prot5136.doi: 10.1101 / pdb.prot5136 ). Spores are isolated from gametophores using a technique based on mechanical destruction of mature capsules (sporophytes) with simultaneous transfer of spores into an aqueous suspension in sterile water, followed by their purification by centrifugation. The isolated spores are deposited in sterile water at a temperature of 4 to 10 ° C for a period of 3 to 90 days and are used to conduct experiments on testing low molecular weight compounds.
2) Культивирование спор проводят в стандартных планшетах, содержащих от 6 до 96 лунок, в которые вносят жидкую культуральную среду в объеме от 50 мкл до 4 мл которая содержит тестируемое соединение, добавленное в виде водной аликвоты в объеме от 2 до 100 мкл. В качестве контроля используют водную аликвоту без добавления тестируемого соединения.2) Cultivation of spores is carried out in standard plates containing from 6 to 96 wells, into which liquid culture medium is added in a volume of 50 μl to 4 ml, which contains the test compound added as an aqueous aliquot in a volume of 2 to 100 μl. An aqueous aliquot without addition of test compound was used as a control.
3) Культивирование спор проводят при температуре от 16 до 28°С в условиях фотопериода длиной от 8 до 20 ч.3) Cultivation of spores is carried out at a temperature of 16 to 28 ° C under conditions of a photoperiod of 8 to 20 hours.
4) После завершения культивирования спор в течение периода от 24 до 72 ч проводят анализ проб на стандартном инвертированном микроскопе, оборудованном видеокамерой для микроскопии в светлом поле. Для анализа пробы подготавливают путем химической фиксации с помощью параформальдегида, который добавляют в лунки культуральных планшетов виде 8% раствора в объеме от 50 мкл до 4 мл.4) After completion of the cultivation of the spores for a period of 24 to 72 hours, the samples are analyzed on a standard inverted microscope equipped with a video camera for microscopy in a bright field. For analysis, samples are prepared by chemical fixation with paraformaldehyde, which is added to the wells of culture plates in the form of an 8% solution in a volume of 50 μl to 4 ml.
5) С помощью видеокамеры, которой оборудован микроскоп, получают изображения спор в лунках. Для анализа одной пробы ведется учет 800 спор. Анализ заключается в учете непроросших спор (с интактной оболочкой) и проросших спор. Прорастание спор идентифицируют по формированию протонематического выроста на месте разрыва оболочки споры (Cove, D. J., Perroud, P. F., Charron, A. J., McDaniel, S. F., Khandelwal, A., and Quatrano, R. S. (2009b). The moss Physcomitrella patens: A novel model system for plant development and genomic studies. Cold Spring Harb. Protoc. doi:10.1101/pdb.emo115; Cove, D., Bezanilla, M., Harries, P., and Quatrano, R. (2006). Mosses as model systems for the study of metabolism and development. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 497–520. doi:10.1146/annurev.arplant.57.032905.105338).5) With the help of a video camera, which is equipped with a microscope, images of spores in the wells are obtained. For the analysis of one sample, 800 disputes are recorded. The analysis consists in taking into account non-germinated spores (with an intact membrane) and germinated spores. Spore germination is identified by the formation of a protonematic outgrowth at the site of the spore membrane rupture (Cove, DJ, Perroud, PF, Charron, AJ, McDaniel, SF, Khandelwal, A., and Quatrano, RS (2009b). The moss Physcomitrella patens : A novel model system for plant development and genomic studies.Cold Spring Harb.Protoc.doi : 10.1101 / pdb.emo115; Cove, D., Bezanilla, M., Harries, P., and Quatrano, R. (2006). Mosses as model systems for the study of metabolism and development. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 497-520. doi: 10.1146 / annurev.arplant.57.032905.105338).
Так, на Фиг. 1 представлены изображения спор Physcomitrella patens. Различение проросших спор от непроросших спор ведется по наличию протонематического выроста. На Фиг. 1 проросшая спора обозначена цифрой 1. Непроросшие споры характеризуются наличием интактной (целостной, без разрывов) оболочки и эллипсоидной, близкой к сферической, формы. Проросшие споры отличаются по форме от непроросших спор по наличию протонематического выроста, который придает им грушевидную форму.Thus, in FIG. 1 shows images of the spores of Physcomitrella patens . Distinguishing between germinated spores from non-germinated spores is based on the presence of protonematic outgrowth. FIG. 1 germinated spore is indicated by the
6) Анализ процесса прорастания спор проводят с помощью программных пакетов ImageJ. В опытных образцах и в контрольных образцах ведут учет доли проросших и непроросших спор. Вывод о наличии ростовой активности делают на основе оценки достоверности разницы между опытными и контрольными образцами по доле проросших и непроросших спор при использовании стандартного математико-статистического аппарата и критериев значимости. Если в опытном образце доля проросших спор выше, чем в контрольном образце, то делают вывод о наличии у исследуемого вещества рост-активирующей активности. Если опытный образец показывает достоверно меньшую долю проросших спор по сравнению с контролем, то можно делать вывод об ингибирующем действии исследуемого вещества на рост и клеточную пролиферацию. При анализе ростовой активности веществ в различных концентрациях (несколько вариантов тестов с разными концентрациями исследуемого вещества) возможно применение аппарата дисперсионного анализа.6) Analysis of the spore germination process is carried out using ImageJ software packages. In experimental samples and in control samples, the proportion of germinated and non-germinated spores is recorded. The conclusion about the presence of growth activity is made on the basis of assessing the reliability of the difference between the experimental and control samples in terms of the proportion of germinated and non-germinated spores when using the standard mathematical-statistical apparatus and significance criteria. If the proportion of germinated spores in the test sample is higher than in the control sample, then it is concluded that the test substance has growth-activating activity. If the test sample shows a significantly lower proportion of germinated spores compared to the control, then we can conclude that the test substance has an inhibitory effect on growth and cell proliferation. When analyzing the growth activity of substances in different concentrations (several test options with different concentrations of the investigated substance), it is possible to use an analysis of variance apparatus.
Техническая сущность изобретений поясняется следующими примерами.The technical essence of the inventions is illustrated by the following examples.
Пример 1. В примере в качестве регулятора роста растений использовали абсцизовою кислоту.Example 1. In the example, abscisic acid was used as a plant growth regulator.
Абсцизовая кислота является сигнальным и стрессовым фитогормоном, который является ингибитором многих процессов, которые происходят при развитии растений, например при прорастании семян. На Фиг. 2 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия абсцизовой кислоты на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости, отмечено звездочкой. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 6ºC в течение 30 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 18 ч фотопериода в течение 42 ч в 12-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 2 мл в каждой лунке.Abscisic acid is a signaling and stress phytohormone that inhibits many processes that occur during plant development, for example, during seed germination. FIG. 2 shows a diagram of the concentration dependence of the effect of abscisic acid on the spore germination of Physcomitrella patens moss spores in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at 95% confidence level. The symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level, marked with an asterisk. Gametophores with capsules were obtained in vitro in laboratory conditions on a standard nutrient medium. Isolated spores were deposited at 6ºC for 30 days. Spores were cultured at 24 ° C under 18 h photoperiod for 42 h in 12-well plates in 2 ml liquid nutrient medium in each well.
Как показали результаты скрининга, абсцизовая кислота ингибирует процесс прорастания спор у мха в широком диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Практически полное подавление процесса прорастания спор наблюдается при концентрации абсцизовой кислоты 0,1 мкМ.As shown by the results of screening, abscisic acid inhibits the process of spore germination in moss in a wide concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Almost complete suppression of the spore germination process is observed at a concentration of abscisic acid of 0.1 μM.
В случае со спорами мха Physcomitrella patens было установлено явление торможения процесса их прорастания, что находится в физиологическом соответствии этого явления с ингибиторной природой фитогормона абсцизовая кислота. Способ скрининга биологической активности при помощи культуры спор мхов позволяет выявить биологическую активность известного фитогормона в сверхнизких диапазонах концентраций, что не было прежде показано другими доступными методами, например, в тестах на всхожесть и прорастание семян. In the case of spores of the moss Physcomitrella patens , the phenomenon of inhibition of the process of their germination was established, which is in physiological correspondence of this phenomenon with the inhibitory nature of the phytohormone abscisic acid. The method of screening biological activity using a culture of moss spores makes it possible to reveal the biological activity of a known phytohormone in ultra-low concentration ranges, which has not been previously shown by other available methods, for example, in tests for germination and germination of seeds.
Пример 2. В примере в качестве регулятора роста растений использовали короткий пептид RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1.Example 2. In the example, a short peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1 was used as a plant growth regulator.
Пептид RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 является хорошо изученным членом семейства растительных пептидов CLE (Arabidopsis thaliana, фрагмент белка Q9XF04, UniProt) и характеризуется тем, что подавляет рост корней и процессы деления клеток в побеговых апикальных меристемах.Peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1 is a well-studied member of the plant CLE peptide family ( Arabidopsis thaliana , protein fragment Q9XF04, UniProt) and is characterized by the fact that it inhibits root growth and cell division processes in the shoot apical meristems.
На Фиг. 3 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочными долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 4ºC в течение 36 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 12 ч фотопериода в течение 48 ч в 24-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 1 мл в каждой лунке. FIG. 3 shows a diagram of the concentration dependence of the effect of the peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1 on the process of spore germination of Physcomitrella patens moss in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at 95% confidence level. The symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level. Gametophores with capsules were obtained in vitro in laboratory conditions on a standard nutrient medium. The isolated spores were deposited at 4ºC for 36 days. Spores were cultured at 24 ° C under 12 h photoperiod for 48 h in 24-well plates in 1 ml liquid nutrient medium in each well.
Тестирование данного пептида на спорах мха Physcomitrella patens показало, что соединение ингибирует процесс прорастания спор мха при концентрациях от 10 пМ до 1 нМ. В иных изученных диапазонах выше и ниже приведенных концентраций данный пептид не оказывает существенного влияния на процесс прорастания спор мха. Детектирование ингибирующей активности пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens находится в соответствии с его физиологической активностью в растениях, направленной на подавление процессов деления клеток.Testing of this peptide on Physcomitrella patens moss spores has shown that the compound inhibits the germination of moss spores at concentrations from 10 pM to 1 nM. In other studied ranges above and below the indicated concentrations, this peptide does not significantly affect the germination of moss spores. Detection of the inhibitory activity of the peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1 on the spore germination of Physcomitrella patens moss spores is in accordance with its physiological activity in plants aimed at suppressing the processes of cell division.
Пример 3. В примере в качестве регулятора роста растений использовали пептид GFLVARPN, SEQ ID №2.Example 3. In the example, the peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2 was used as a plant growth regulator.
Пептид GFLVARPN, SEQ ID №2 является фрагментом малой субъединицы функционального фотосинтетического белка Рубиско мха Physcomitrella patens. Использование спор мха Physcomitrella patens позволило протестировать данный пептид на биологическую активность в широком диапазоне концентраций и установить его стимулирующий эффект при развитии нового организма мха из спор.Peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2 is a fragment of the small subunit of the functional photosynthetic protein Rubisco moss Physcomitrella patens . The use of moss spores Physcomitrella patens made it possible to test this peptide for biological activity in a wide range of concentrations and to establish its stimulating effect during the development of a new moss organism from spores.
Так, на Фиг. 4 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида GFLVARPN, SEQ ID №2 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности. Символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 6ºC в течение 42 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 18 ч фотопериода в течение 36 ч в 12-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 2 мл в каждой лунке.Thus, in FIG. 4 shows a diagram of the concentration dependence of the action of the peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2 on the germination of spores of Physcomitrella patens moss in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at 95% confidence level. The symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level. Gametophores with capsules were obtained in vitro in laboratory conditions on a standard nutrient medium. The isolated spores were deposited at 6ºC for 42 days. Spores were cultured at a temperature of 24ºC under 18 h photoperiod for 36 h in 12-well plates in a 2 ml liquid nutrient medium in each well.
Как показали исследования, пептид GFLVARPN, SEQ ID №2 оказывает положительный эффект на прорастание спор Physcomitrella patens. При концентрации 10 пМ наблюдается максимальный эффект, который снижается как при снижении его концентрации, так и при повышении.Studies have shown that peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2 has a positive effect on spore germination Physcomitrella patens. At a concentration of 10 pM, the maximum effect is observed, which decreases both with a decrease in its concentration and with an increase.
Пример 4. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3, обнаруженный в составе пептидных пулов мха Physcomitrella patens. Example 4. In the example, the IAEYTIKINEGG peptide, SEQ ID No. 3, found in the peptide pools of Physcomitrella patens moss, was used as a potential plant growth regulator .
На Фиг. 5 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 на процесс прорастания спор мха Physcomitrella patens в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были получены в лабораторных условиях in vitro на стандартной питательной среде. Выделенные споры депонировали при температуре 8ºC в течение 30 суток. Споры культивировали при температуре 24ºC в условиях 16 ч фотопериода в течение 48 ч в 48-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 0,4 мл в каждой лунке.FIG. 5 shows a diagram of the concentration dependence of the effect of the short peptide IAEYTIKINEGG, SEQ ID No. 3 on the spore germination of Physcomitrella patens moss spores in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at the 95% probability level, the symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level. Gametophores with capsules were obtained in vitro in laboratory conditions on a standard nutrient medium. The isolated spores were deposited at 8ºC for 30 days. Spores were cultured at 24 ° C under 16 h photoperiod for 48 h in 48-well plates in 0.4 ml liquid nutrient medium in each well.
Как видно из диаграммы на фиг. 5, данный пептид, SEQ ID №3 не оказывает существенного действия на процесс прорастания спор мха в исследованном широком диапазоне концентраций. Данный вывод говорит о том, что протестированный пептид не активен в отношении растительных клеток, находящихся в стадии выхода из состояния покоя, что не исключает проявления его активности на других этапах развития растений. Приведенный пример подчеркивает специфичность тест-системы, а именно то, что споры мха Physcomitrella patens продемонстрировали чувствительность в отношении как известных фитогормонов абсцизовой кислоты и пептида RTVPSGPDPLHH, SEQ ID №1, так и нового пептида GFLVARPN, SEQ ID №2, но не продемонстрировали чувствительность к пептиду IAEYTIKINEGG, SEQ ID №3 в широком диапазоне концентраций.As seen from the diagram in FIG. 5, this peptide, SEQ ID No. 3, has no significant effect on the germination of moss spores in the studied wide concentration range. This conclusion suggests that the tested peptide is not active against plant cells that are in the stage of emerging from the dormant state, which does not exclude the manifestation of its activity at other stages of plant development. The above example emphasizes the specificity of the test system, namely that the spores of the moss Physcomitrella patens demonstrated sensitivity against both the known phytohormones abscisic acid and the peptide RTVPSGPDPLHH, SEQ ID No. 1, and the new peptide GFLVARPN, SEQ ID No. 2, but did not demonstrate sensitivity to the peptide IAEYTIKINEGG, SEQ ID No. 3 in a wide range of concentrations.
Пример 5. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4. Example 5. In the example, the peptide WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID No. 4 was used as a potential plant growth regulator .
На Фиг. 6 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия короткого пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4 на процесс прорастания спор мха Polytrichum commune в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были собраны в естественной среде обитания в Государственном заказнике Звенигородская биологическая станция МГУ им. М.В. Ломоносова. Выделенные споры депонировали при температуре 10ºC в течение 3-х суток. Споры культивировали при температуре 16ºC в условиях 8 ч фотопериода в течение 72 ч в 6-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 4 мл в каждой лунке. Данный пример показывает чувствительность спор мха Polytrichum commune к действию пептида WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID №4, который стимулирует их прорастание при низких концентрациях от 10 нМ до 10 фМ.FIG. 6 shows a diagram of the concentration dependence of the action of the short peptide WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID No. 4 on the germination of spores of the moss Polytrichum commune in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at the 95% probability level, the symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level. Gametophores with capsules were collected in their natural habitat in the State Reserve Zvenigorod Biological Station, Moscow State University. M.V. Lomonosov. The isolated spores were deposited at a temperature of 10ºC for 3 days. Spores were cultured at 16 ° C under 8 h photoperiod for 72 h in 6-well plates in 4 ml liquid nutrient medium in each well. This example demonstrates the sensitivity of polytrichum commune moss spores to the action of the peptide WVSLPGVLPVASGGIH, SEQ ID No. 4, which stimulates their germination at low concentrations from 10 nM to 10 fM.
Пример 6. В примере в качестве потенциального регулятора роста растений использовали пептид IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID №5. Example 6. In the example, the peptide IAEIPTQKPAADVQFGSL, SEQ ID No. 5 was used as a potential plant growth regulator .
На Фиг. 7 приведена диаграмма концентрационной зависимости действия пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ I D № 5 на процесс прорастания спор мха Atrichum undulatum в диапазоне концентраций от 0.1 мкМ до 1 фМ. Доверительные интервалы построены при 95% уровне вероятности, символом «*» указана разность между средними выборочных долей в опытных образцах и контрольном существенно на 5% уровне значимости. Гаметофоры с коробочками были собраны в естественной среде обитания в Государственном заказнике Звенигородская биологическая станция МГУ им. М.В. Ломоносова. Выделенные споры депонировали при температуре 4°C в течение 90 суток. Споры культивировали при температуре 28ºC в условиях 20 ч фотопериода в течение 24 ч в 96-луночных планшетах в жидкой питательной среде объемом 50 мкл в каждой лунке. Данный пример показывает чувствительность спор мха Atrichum undulatum к действию пептида IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ I D № 5, который стимулирует их прорастание при концентрациях от 10 нМ до 10 фМ.FIG. 7 shows a diagram of the concentration dependence of the action of the peptide IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ ID No. 5 on the spore germination of Atrichum undulatum moss spores in the concentration range from 0.1 μM to 1 fM. Confidence intervals are plotted at the 95% probability level, the symbol "*" indicates the difference between the average sample shares in the test samples and the control, significantly at the 5% significance level. Gametophores with capsules were collected in their natural habitat in the State Reserve Zvenigorod Biological Station, Moscow State University. M.V. Lomonosov. The isolated spores were deposited at 4 ° C for 90 days. The spores were cultured at a temperature of 28ºC under a 20 h photoperiod for 24 h in 96-well plates in a liquid nutrient medium with a volume of 50 μl in each well. This example shows the sensitivity of Atrichum undulatum moss spores to the action of the peptide IAEIPTQKPAADVQFGSL, S EQ ID No. 5, which stimulates their germination at concentrations from 10 nM to 10 fM.
Таким образом, приведенные данные по скринингу низкомолекулярных соединений, включая фитогормоны и пептиды, на спорах мха показывают высокую чувствительность и специфичность гомогенной клеточной тест-системы, применимость заявленного способа скрининга и системы скрининга для анализа биологической активности в широком диапазоне низких концентраций регуляторов роста растений. Аналогичные данные были получены при использовании спор ряда других видов зеленых мхов: Atrichum tenellum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata, Pottia intermedia, Weissia brachycarpa.Thus, the presented data on the screening of low molecular weight compounds, including phytohormones and peptides, on moss spores show the high sensitivity and specificity of the homogeneous cell test system, the applicability of the claimed screening method and the screening system for the analysis of biological activity in a wide range of low concentrations of plant growth regulators. Similar data were obtained using a spore number of other species of mosses: Atrichum tenellum, Barbula unguiculata, Bryum argenteum, Ceratodon purpureus, Ditrichum pusillum, Ephemerum serratum, Fissidens bryoides, Fissidens exilis, Funaria hygrometrica, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium sphaericum, Polytrichum juniperinum, Pottia truncata , Pottia intermedia , Weissia brachycarpa .
К преимуществам заявленного способа высокопроизводительного скрининга регуляторов роста растений и системы скрининга, предлагаемых в настоящем изобретении, является 1) невысокая стоимость комплекса работ и расходных материалов, 2) высокая производительность и высокий потенциал для автоматизации (роботизации) процесса, 3) короткие сроки получения ответной реакции (от 1 до 3 суток), 4) высокая стандартизируемость процесса тестирования - все материалы для тестирования подготавливаются в стандартных условиях, споры являются клеточным материалом, полученным в контролируемых условиях.The advantages of the claimed method of high-throughput screening of plant growth regulators and the screening system proposed in the present invention are 1) low cost of a set of works and consumables, 2) high productivity and high potential for automation (robotization) of the process, 3) short response times (from 1 to 3 days), 4) high standardization of the testing process - all materials for testing are prepared under standard conditions, spores are cellular material obtained under controlled conditions.
Claims (12)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019127973A RU2740004C1 (en) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019127973A RU2740004C1 (en) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2740004C1 true RU2740004C1 (en) | 2020-12-30 |
Family
ID=74106503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019127973A RU2740004C1 (en) | 2019-09-05 | 2019-09-05 | Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2740004C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU835395A1 (en) * | 1977-04-27 | 1981-06-07 | Предприятие П/Я Р-6225 | Plant growth regulator |
| RU2298182C2 (en) * | 2001-05-30 | 2007-04-27 | Биолекс, Инк. | Uses duckweed for high-productivity screening |
-
2019
- 2019-09-05 RU RU2019127973A patent/RU2740004C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU835395A1 (en) * | 1977-04-27 | 1981-06-07 | Предприятие П/Я Р-6225 | Plant growth regulator |
| RU2298182C2 (en) * | 2001-05-30 | 2007-04-27 | Биолекс, Инк. | Uses duckweed for high-productivity screening |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Decker E.L. et al. Moss Systems Biology en Route: Phytohormones in Physcomitrella Development // Plant Biol., 8, 2006, стр.397-406. * |
| Takezawa D. et al, ABA in bryophytes: how a universal growth regulator in life became a plant hormone? // J Plant Res, 2011, 124, стр.437-453. * |
| VUJICIC M.M. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica SERBICA, 41 (1), 2017, стр.11-15. * |
| VUJICIC M.M. et al. Effect of ABA treatment on activities of antioxidative enzymes in selected bryophyte species // Botanica SERBICA, 41 (1), 2017, стр.11-15. Takezawa D. et al, ABA in bryophytes: how a universal growth regulator in life became a plant hormone? // J Plant Res, 2011, 124, стр.437-453. Decker E.L. et al. Moss Systems Biology en Route: Phytohormones in Physcomitrella Development // Plant Biol., 8, 2006, стр.397-406. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Emons | Somatic embryogenesis: cell biological aspects | |
| Von Arnold et al. | Developmental pathways of somatic embryogenesis | |
| Yang et al. | Regulation of somatic embryogenesis in higher plants | |
| Vrinten et al. | Characterization of cDNAs expressed in the early stages of microspore embryogenesis in barley (Hordeum vulgare) L. | |
| Yang et al. | Direct somatic embryogenesis from pericycle cells of broccoli (Brassica oleracea L. var. italica) root explants | |
| Tsutsui et al. | Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis | |
| WO2009038416A2 (en) | Plant stem cell line derived from quiescent center and method for isolating the same | |
| CN113322261A (en) | Application of soybean ABC transporter gene GmALS3 in breeding of low-phosphorus-resistant and aluminum-toxicity-resistant plants | |
| CN108546670A (en) | A kind of method for transformation of the preparation method of Sorghum Protoplast and the protoplast of preparation | |
| Wang et al. | Expression and functional analysis of VviABCG14 from Vitis vinifera suggest the role in cytokinin transport and the interaction with VviABCG7 | |
| Clements et al. | Characterization of a non‐abscission mutant in Lupinus angustifolius. I. Genetic and structural aspects | |
| CN104098664A (en) | Aapplication of arabidopis thaliana calmodulin combined protein gene ATIQM2 in flowering regulation | |
| Tavano et al. | In vitro organogenesis of Citrus volkameriana and Citrus aurantium | |
| RU2740004C1 (en) | Method for screening plant growth regulators and kit for screening based on the claimed method | |
| CN108841982B (en) | Molecular identification marker and maintainer breeding method of fertile cytoplasm of P. chinensis | |
| Cheng et al. | Transcription factor PagERF110 inhibits leaf development by direct regulating PagHB16 in poplar | |
| Raghavan | Induction of vivipary in Arabidopsis by silique culture: implications for seed dormancy and germination | |
| CN108624547B (en) | A method for isolating guard cells of monocotyledonous plants | |
| Komamine et al. | 2004 SIVB Congress Symposium Proceeding: Mechanisms of somatic embryogenesis in carrot suspension cultures—Morphology, physiology, biochemistry, and molecular biology | |
| Da Costa et al. | Studies on the induction of embryogenic globular structures in Opuntia ficus-indica | |
| Smith et al. | The molecular biology of plant development | |
| RU2737741C1 (en) | Method for screening potential plant growth regulators based on green moss shoots and a screening system based on the disclosed method | |
| Germana et al. | Preliminary results on the effect of magnetic fields on anther culture and pollen germination of Citrus clementina Hort. ex Tan | |
| Tsutsui et al. | Micrografting device for testing environmental conditions for grafting and systemic signaling in Arabidopsis | |
| Leitch et al. | In vitro systems for the study of wood formation |