RU2639790C1

RU2639790C1 - System for address control of brain neurons of living free-moving animals based on frozen fiber-optical probe with multi-channel fibers

Info

Publication number: RU2639790C1
Application number: RU2016151257A
Authority: RU
Inventors: Константин Владимирович Анохин; Алексей Михайлович Желтиков; Ольга Игоревна Ивашкина; Матвей Сергеевич Почечуев; Марина Анатольевна Рощина; Андрей Борисович Федотов; Илья Валерьевич Федотов
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2017-12-22

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: system includes a laser excitation system, an optical response recording system, an openable optical fiber probe (OFP) based on multichannel optical fiber (MOF) with micron-sized lightguides, containing a module mounted on the animal's skull and a mating openable part providing its communication with optical excitation systems and recording of the optical response, in accordance with what is set forth in the claims. The OFP consists of two parts, the first made with a possibility of fixation on the animal's skull and contains a ceramic cylindrical ferrule with a short MOF section attached thereto. The second part of the probe contains a connector with another cylindrical ceramic ferrule and a long MOF section attached thereto. The second part of the probe is connected to a laser optical excitation system and a recording and monitoring system. The MOF sections contain at least one thousand coaxially located micron-size lightguides. The distal end of the first optical fiber section has a flat surface oblique at an angle of 30 to 60 degrees relative to the MOF axis, and MOF diameter is from 250 mcm to 600 mcm. When the method is implemented, laser radiation of a selected wavelength and power is generated, allowing to reach the photo activation threshold of cells containing genetically embedded photosensitive proteins. The laser radiation is focused by means of a scanning system and a focusing module into the selected lightguides of the long section of MOF located inside the connector in optical contact with the short MOF section attached to the animal's skull so that its distal end is located in the selected region of the animal's brain. The radiation generates a measurable fluorescence signal, it is transmitted through a probe to the optical recording and monitoring system with a computer, where the signals obtained are subjected to the appropriate analysis.EFFECT: group of inventions allows to obtain information on functioning of the individual brain cells and provide addressable influence thereon by a long-term series of experiments on the same animal in any brain structure, while providing reception of an optical signal from one and the same group of cells.6 cl, 4 dwg

Description

Область техникиTechnical field

Предлагаемое изобретение относится к волоконно-оптическим устройствам, предназначенным для получения оптических изображений глубоколежащих тканей головного мозга живых свободно движущихся лабораторных животных, с целью исследования функционально значимых нейрофизиологических процессов с клеточным разрешением и адресного воздействия на выделенные клетки.The present invention relates to fiber-optic devices designed to obtain optical images of deep-lying brain tissue of living freely moving laboratory animals, with the aim of studying functionally significant neurophysiological processes with cellular resolution and targeted effects on selected cells.

Уровень техникиState of the art

Оптические методы играют все более заметную роль в исследованиях нейрофизиологических и когнитивных функций, процессов формирования памяти, что связано с их эффективностью, высоким пространственным разрешением и малой инвазивностью. Оптическая микроскопия обеспечивает субклеточное разрешение, однако получение изображений возможно только для поверхностных тканей. Развитие современных методик конфокальной и нелинейно-оптической микроскопии позволяет увеличить глубину оптического контроля биологических тканей до величин порядка 1 мм, что является безусловно огромным достижением в области биовизуализации, однако не решает проблемы получение изображений более глубоко лежащих тканей, в частности, глубоко расположенных нейронных сетей в мозге живых животных. Одним из решений проблемы доставки возбуждающего оптического излучения и сбора оптического сигнала является применение волоконно-оптических эндоскопов, что позволяет ценой минимального вмешательства в морфологию и функциональные связи в мозге животных преодолеть проблемы исследований глубоко лежащих тканей.Optical methods play an increasingly prominent role in studies of neurophysiological and cognitive functions, processes of memory formation, which is associated with their efficiency, high spatial resolution and low invasiveness. Optical microscopy provides subcellular resolution, but imaging is only possible for surface tissues. The development of modern methods of confocal and nonlinear optical microscopy allows increasing the depth of optical control of biological tissues to values of the order of 1 mm, which is certainly a huge achievement in the field of bio-imaging, but it does not solve the problem of obtaining images of deeper tissues, in particular, deeply located neural networks in brain of live animals. One of the solutions to the delivery of exciting optical radiation and the collection of an optical signal is the use of fiber-optic endoscopes, which, at the cost of minimal interference with morphology and functional connections in the brain of animals, overcome the problems of studies of deep-lying tissues.

Одним из наиболее перспективных методов получения изображений биологических объектов и живых тканей в эндоскопическом режиме является использование многоканальных оптических световодов. Получение изображений через пучки волокон является одним из ранних изобретений эпохи современных оптических технологий (US 1751584, "Picture transmission" (1927); H.Z. Lamm, Instrumentenkd, 50, 579 (1930)). Идея передачи изображений с помощью пучков оптических волокон нашла дальнейшее развитие и в более поздних работах, см. например, US 2825260 A "Optical image forming devices", US 3043179 A "Fiber optical image transfer devices" или "Fiber optical image transfer devices" US 3043910. Однако, широкое применение этих идей стало возможно гораздо позднее.One of the most promising methods for obtaining images of biological objects and living tissues in endoscopic mode is the use of multichannel optical fibers. Obtaining images through bundles of fibers is one of the earliest inventions of the era of modern optical technologies (US 1751584, "Picture transmission" (1927); H.Z. Lamm, Instrumentenkd, 50, 579 (1930)). The idea of transmitting images using bundles of optical fibers was further developed in later works, see, for example, US 2,825,260 A “Optical image forming devices”, US 3,043,179 A “Fiber optical image transfer devices” or “Fiber optical image transfer devices” US 3043910. However, widespread application of these ideas became possible much later.

Волоконно-оптические флуоресцентные эндоскопы хорошо себя зарекомендовали как инструменты для минимально возмущающей визуализации глубоко лежащих структур биологических тканей, требуемых в задачах in vivo визуализации в живых свободноподвижных животных. Физический принцип оптического детектирования во всех описанных устройствах основывается на регистрации флуоресцентного отклика, что обычно предусматривает наличие биологических красителей или генетически встроенных маркеров, что накладывает условия на проведение экспериментов, в частности, связанных с выбором длин волн для возбуждения целевых биомаркеров. Настоящим прорывом в области использования волоконно-оптических зондов для исследования функциональных процессов в тканях головного мозга животных стали работы группы К. Диссерота (K. Deisseroth) из университета г. Стенфорда (США), которые фактически заложили новую дисциплину - оптогенетику. Суть оптогенетических методик заключается в целенаправленном генетическом маркировании нейронов головного мозга с целью изучения их функциональных свойств с помощью оптических и оптоволоконных методов, а также в возможности управления реакцией клеток на световое воздействие, что достигается за счет внедрения светочувствительных белков Channelrhodopsin в мембраны клеток. Группа К. Диссерота обладает рядом патентов в этой области, описывающих устройства и методы, которые позволяют не только измерять процессы, но и осуществлять обратную стимуляцию выбранных областей мозга оптическим излучением: US 9238150 «Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells», US 9458208 "Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto"; US 20160194624 "System for optical stimulation of targets cells"; US 9308392 Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system; US 9271674 "Optogenetic magnetic resonance imaging"; US 8401609 "System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics".Fiber-optic fluorescence endoscopes have established themselves well as tools for minimally disturbing visualization of deep-lying biological tissue structures required in in vivo visualization tasks in living free-moving animals. The physical principle of optical detection in all the described devices is based on the registration of the fluorescence response, which usually involves the presence of biological dyes or genetically integrated markers, which imposes conditions for experiments, in particular, related to the choice of wavelengths for excitation of target biomarkers. A real breakthrough in the use of fiber-optic probes for studying functional processes in animal brain tissues was the work of a group of K. Deisseroth from the University of Stanford (USA), which actually laid the foundation for a new discipline - optogenetics. The essence of optogenetic techniques consists in targeted genetic labeling of brain neurons in order to study their functional properties using optical and fiber-optic methods, as well as in the ability to control the response of cells to light exposure, which is achieved through the introduction of photosensitive Channelrhodopsin proteins into cell membranes. K. Disserot’s group has a number of patents in this field that describe devices and methods that not only measure processes, but also reverse stimulate selected brain regions with optical radiation: US 9238150 “Optical tissue interface method and apparatus for stimulating cells”, US 9458208 "Optically-based stimulation of target cells and modifications thereto"; US 20160194624 "System for optical stimulation of targets cells"; US 9308392 Materials and approaches for optical stimulation of the peripheral nervous system; US 9271674 "Optogenetic magnetic resonance imaging"; US 8401609 "System, method and applications involving identification of biological circuits such as neurological characteristics."

Развитие оптических технологий привело к стремительному совершенствованию технологий и росту областей применения специальных типов оптических световодов, включая многосердцевинные, для целей получения изображений тканей с высоким пространственным разрешением [см., например, Hecht, J. (1999) City of Light: the Story of Fiber Optics, Oxford University Press, Oxford; S. Yashvinder et. al. Applied Optics, 38, 7133-7144 (1999); J. Knittel, et. al. Optics Communication, 188, 267-273 (2001); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 5, 935 (2008); K.K. Ghosh, et. al. Nature Methods 8, 871 (2011), W. Gobel, et. al. Opt. Lett. 29, 2521 (2004); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 2, 941-950 (2005); D. Yelin, et. al. Nature 443, 765 (2006)] Анализ этих работ демонстрирует заманчивые перспективы для систем получения изображений на основе оптических многоканальных световодов в задачах биофотоники. Современные технологии обеспечивают производство многоканальных волокон с малым размером световодных каналов порядка нескольких микрометров и большой плотностью самих каналов, что обеспечивает возможность получения изображения биологических тканей вплоть до клеточного. Относительно малый размер внешнего диаметра волокна позволяет осуществить проникновения вглубь ткани с минимальными повреждениями.The development of optical technologies has led to rapid technological improvements and the growth of applications for special types of optical fibers, including multi-core, for the acquisition of images of tissues with high spatial resolution [see, for example, Hecht, J. (1999) City of Light: the Story of Fiber Optics, Oxford University Press, Oxford; S. Yashvinder et. al. Applied Optics, 38, 7133-7144 (1999); J. Knittel, et. al. Optics Communication, 188, 267-273 (2001); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 5, 935 (2008); K.K. Ghosh, et. al. Nature Methods 8, 871 (2011), W. Gobel, et. al. Opt. Lett. 29, 2521 (2004); B.A. Flusberg, et. al. Nature Methods 2, 941-950 (2005); D. Yelin, et. al. Nature 443, 765 (2006)] An analysis of these works demonstrates attractive prospects for imaging systems based on optical multi-channel optical fibers in biophotonics problems. Modern technologies provide the production of multichannel fibers with a small size of light guide channels of the order of several micrometers and a high density of the channels themselves, which makes it possible to obtain images of biological tissues up to cell tissue. The relatively small size of the outer diameter of the fiber allows penetration deep into the tissue with minimal damage.

В патентах RU 2327202 и RU 2333526 описана идея реализации нейроэлектронного многоканального интерфейса на основе многоканальных оптических волокон. Оптические световоды служат для точной доставки оптического излучения к исследуемой области. На конце оптического волновода имеются набор оптоэлектронных преобразователей, которые позволяют генерировать электрическое поле и воздействовать им на нейронные ткани. Оптоэлектронные преобразователи обеспечивают электрическое воздействия на нейроны и нейронный сетей, однако основной задачей биофотоники является осуществление прямых оптических методов измерения и контроля.The patents RU 2327202 and RU 2333526 describe the idea of implementing a neuroelectronic multi-channel interface based on multi-channel optical fibers. Optical fibers are used for the accurate delivery of optical radiation to the studied area. At the end of the optical waveguide there is a set of optoelectronic converters that allow you to generate an electric field and act on neural tissues. Optoelectronic converters provide electrical effects on neurons and neural networks, but the main objective of biophotonics is the implementation of direct optical methods of measurement and control.

В заявке US 20080007733 "Volumetric endoscopic coherence microscopy using a coherent fiber bundle" рассматривается устройство с использованием многосердцевинного волокна для когерентной оптической томографии. Для заведения излучения в световодные каналы используется конфокальная сканирующая система. В качестве возбуждающего излучения используется либо перестраиваемый лазерный источник, либо источник слабокогерентного белого света, что необходимо для обеспечения методики когерентной оптической томографии.US 20080007733, Volumetric endoscopic coherence microscopy using a coherent fiber bundle, describes a multi-core fiber device for coherent optical tomography. For introducing radiation into the light guide channels, a confocal scanning system is used. Either a tunable laser source or a weakly coherent white light source is used as exciting radiation, which is necessary to ensure coherent optical tomography techniques.

В патентах KR 20140006464 и CN 102389288 представлены принципы конфокальной микроскопии с использованием многосердцевинного волокна для визуализации биологических тканей с улучшенным пространственным разрешением. В состав устройств входит оптическое многосердцевинное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Эти устройства содержат основные принципиальные элементы оптической схемы, содержащиеся и в данной заявке, однако отсутствует элементы конструкции зонда, обеспечивающие непосредственный контакт волокна с исследуемыми тканями, что резко сокращает круг решаемых задач в области исследования мозга.Patents KR 20140006464 and CN 102389288 disclose principles of confocal microscopy using multi-core fibers to visualize biological tissues with improved spatial resolution. The device includes an optical multi-core fiber, a laser source of excitation, a system for introducing radiation into a fiber based on scanning galvanic mirrors, and an optical registration system. These devices contain the basic principle elements of the optical scheme contained in this application, however, there are no probe design elements providing direct fiber contact with the tissues under study, which sharply reduces the range of tasks in the field of brain research.

Компания Mauna Kea Technologies (Франция) производит и использует в своих устройствах многоканальные оптические световоды, содержащие большое количество световодных сердцевин с размерами порядка нескольких микрометров. Компания обладает рядом патентов в этой области, в частности, в заявке US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", описаны устройство и принципиальные особенности получения изображений органов и тканей с клеточным разрешением с помощью многосердцевинного волоконно-оптического зонда. В состав устройства входит оптическое многосердцевинное волокно, лазерный источник возбуждения, система заведения излучения в волокно на основе сканирующих гальванических зеркал и оптическая система регистрации. Оптическое излучение заводится в отдельные каналы многосердцевинного волокна, и далее из свободного (дистального) торца волокна "точечно" возбуждает флуоресценцию исследуемых объектов. Сигнал флуоресценции передается в направлении "назад" в систему регистрацию, где происходит формирование изображения. Также в заявках Mauna Kea Technologies (Франция) US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", US 20120184842 "Method, an optical probe and a confocal microscopy system for inspecting a solid organ" описываются схемы реализации подобных устройств и конструктивные особенности устройств для исследования различных органов и биологических тканей с помощью многоканальных зондов, и, в частности, описывается устройство и методы для получения изображений нейронов мозга в режиме in vivo. Также в патентах Mauna Kea Technologies содержатся описание различных методик обработки изображений, получаемых из многосердцевинных волоконных зондов. В патенте US 8237131 "System and method for carrying out fibre-type multiphoton microscopic imaging of a sample" рассматриваются нелинейно-оптические методы с применением сверхкоротких лазерных импульсов для получения изображений тканей.Mauna Kea Technologies (France) manufactures and uses in its devices multi-channel optical fibers containing a large number of fiber-optic cores with dimensions of the order of several micrometers. The company has a number of patents in this area, in particular, in the application US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", describes the device and the fundamental features of obtaining images of organs and tissues with cell resolution using multi-core fiber optic probe. The device includes an optical multi-core fiber, a laser source of excitation, a system for introducing radiation into a fiber based on scanning galvanic mirrors, and an optical recording system. Optical radiation is injected into individual channels of a multi-core fiber, and then from the free (distal) end of the fiber “pointwise” excites fluorescence of the studied objects. The fluorescence signal is transmitted in the direction "back" to the registration system, where image formation takes place. Also, applications of Mauna Kea Technologies (France) US 20050242298 "Method and equipment for fiber optic high-resolution, in particular confocal, fluorescence imaging", US 20120184842 "Method, an optical probe and a confocal microscopy system for inspecting a solid organ" schemes for implementing such devices and design features of devices for studying various organs and biological tissues using multichannel probes, and, in particular, describes a device and methods for obtaining images of brain neurons in vivo. The Mauna Kea Technologies patents also describe various image processing techniques from multi-core fiber probes. US 8,237,131, "System and method for carrying out fiber-type multiphoton microscopic imaging of a sample", discusses nonlinear optical methods using ultrashort laser pulses to obtain tissue images.

Известен патент Mauna Kea Technologies US 9107575 "Apparatus and method for brain fiber bundle microscopy", описывающий устройство крепления на черепе животного имплантируемого отрезка оптического волокна, который можно рассматривать как прямой аналог настоящего изобретения. Устройство содержит отрезок оптического волокна, дистальных конец которого, располагаемый в мозге животного, имеет небольшой скос. Скос упрощает проникновение дистального конца волокна в мозг животного. Устройство позволяет отсоединять оптическое волокно в случае необходимости. Однако для наблюдения процессов в мозге животного оптическое волокно нужно вставить на выбранную глубину, причем сам процесс установки оптического волокна для наблюдения наблюдаемых ранее структур мозга должен производиться с точностью до 1 мкм, что трудно реализуемо на живых существах и травмирует клетки мозга при каждой установке волокна. Кроме того, в описанном изобретении предусмотрена возможность получения изображения клеток мозга, но отсутствует возможность обратного воздействия.Known patent Mauna Kea Technologies US 9107575 "Apparatus and method for brain fiber bundle microscopy", which describes a device for attaching to the skull of an animal an implantable segment of optical fiber, which can be considered as a direct analogue of the present invention. The device contains a piece of optical fiber, the distal end of which, located in the brain of the animal, has a small bevel. The bevel facilitates the penetration of the distal end of the fiber into the brain of the animal. The device allows you to disconnect the optical fiber if necessary. However, to observe processes in the animal’s brain, an optical fiber must be inserted to a selected depth, and the process of installing an optical fiber to observe previously observed brain structures must be accurate to 1 μm, which is difficult to implement on living creatures and injures brain cells with each fiber installation. In addition, the described invention provides for the possibility of obtaining images of brain cells, but there is no possibility of reverse exposure.

Подавляющее большинство устройств и методов в нейрофотонике использует флуоресценцию маркерных красителей или белков для получения оптических изображений тканей. Безмаркерные химически селективные методики на основе регистрации комбинационного (рамановского) отклика исследуемых тканей в эндоскопическом режиме являются одним из важных направлений визуализации функциональной активности мозга с клеточным разрешением. Известен патент заявителя RU 2584922 (заявка 2014150676 от 15.12.2014 "Многоканальный оптоволоконный нейроинтерфейс для мультимодальной микроскопии мозга животных"), где описано устройство для получения мультиспектральных изображений на основе конфокального микроскопа и многоканального оптоволоконного зонда для исследования биологических тканей, в частности получения их изображений в эндоскопическом режиме. Основной особенностью устройств является наличие нескольких одночастотных лазерных источников возбуждения и спектрометра, обеспечивающих возможность мультиспектральных измерений сигналов различной природы (флуоресценции или спонтанного комбинационного рассеяния света). Основное отличие этого патента от предлагаемой заявки состоит в отсутствии размыкаемости зонда, внедряемого в мозг животного.The vast majority of devices and methods in neurophotonics use fluorescence of marker dyes or proteins to obtain optical images of tissues. Markerless chemically selective methods based on the registration of the Raman (Raman) response of the studied tissues in the endoscopic mode are one of the important directions in visualizing the functional activity of the brain with cellular resolution. Known patent of the applicant RU 2584922 (application 2014150676 dated 12/15/2014 "Multichannel fiber optic neurointerface for multimodal microscopy of animal brains"), which describes a device for obtaining multispectral images based on a confocal microscope and a multichannel fiber optic probe for studying biological tissues, in particular, obtaining images of them in biological tissues endoscopic mode. The main feature of the devices is the presence of several single-frequency laser excitation sources and a spectrometer, which provide the possibility of multispectral measurements of signals of various nature (fluorescence or spontaneous Raman scattering). The main difference between this patent and the proposed application is the lack of interruptibility of the probe introduced into the brain of the animal.

Необходимо, отметить другой альтернативный метод получения изображений с применением технологии GRIN линз (оптических устройств с градиентом показателя преломления перпендикулярного оси распространения излучения, что обеспечивает искривление его волнового фронта и возможность фокусировки). Компания Inscopix (США) обладает рядом патентов, в которых описывается принцип получения изображений объектов в эндоскопическом режиме с помощью оптических волокон и GRIN линзы на его дистальном конце: US 6760112 В2 "Grin-fiber lens based optical endoscopes, US 20140043462 "Systems and methods for distributed video microscopy"; или WO 2014071390 A1 "Miniaturized imaging devices, systems and methods". Качество изображений тканей, в том числе тканей головного мозга получается достаточно высоким, однако, для проведения измерений в мозге требуется серьезное хирургическое вмешательство, связанное с удалением значительной массы тканей, что ограничивает глубину и инвазивность данной методики.It is necessary to note another alternative method for obtaining images using GRIN lens technology (optical devices with a gradient of refractive index perpendicular to the axis of propagation of radiation, which ensures the curvature of its wavefront and the possibility of focusing). Inscopix (USA) has a number of patents that describe the principle of obtaining images of objects in endoscopic mode using optical fibers and a GRIN lens at its distal end: US 6760112 B2 "Grin-fiber lens based optical endoscopes, US 20140043462" Systems and methods for distributed video microscopy "; or WO 2014071390 A1" Miniaturized imaging devices, systems and methods. "The image quality of tissues, including brain tissue, is high enough, however, serious brain surgery is required to take measurements in the brain to remove significant mass tissues , which limits the depth and invasiveness of this technique.

Описанные выше методы получения изображений в глубоких слоях мозга обладают серьезными недостатками, связанными однократным и постоянным способом крепления зонда, что ограничивает их применение для исследования процессов формирования памяти и обучения живых свободноподвижных животных в ходе долговременных измерений. Также недостатком вышеприведенных технических решений является условие, что лабораторное животное должно постоянно содержаться в клетке в непосредственной близости от системы регистрации, а возможность проводить биологические эксперименты на протяжении длительного времени является ключевой для ряда методик исследований.The methods described above for obtaining images in the deep layers of the brain have serious drawbacks associated with a single and permanent method of attaching the probe, which limits their use for studying the processes of memory formation and training of living freely moving animals during long-term measurements. Another drawback of the above technical solutions is the condition that the laboratory animal must be kept in a cage in the immediate vicinity of the registration system, and the ability to conduct biological experiments for a long time is key to a number of research methods.

Эта проблема решается с помощью концепции размыкаемых устройств волоконных устройств (D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, J.L. Phillips, N.

, R. van Zessen, and G.D. Stuber, "Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits," Nature Protocols 7, 12-23 (2012). G.D. Stuber, D.R. Sparta, A.M. Stamatakis, W.A. van Leeuwen, J.E. Hardjopajinto, S. Cho, K.M. Tye, K.A. Kempadoo, F. Zhang, K. Deisseroth, and A. Bonci, "Excitatory transmission from the amygdale to nucleus accumbend facilitates reward seeking," Nature 475, 377-380 (2011). L.V. Doronina-Amitonova, I.V. Fedotov, О.I. Ivashkina, M.A. Zots, A.B. Fedotov, K.V. Anokhin, and A.M. Zheltikov, "Implantable fiber-optic interface for parallel multisite long-term optical dynamic brain interrogation in freely moving mice," Sci. Rep. 3, 3265.)This problem is solved using the concept of openable devices of fiber devices (DR Sparta, AM Stamatakis, JL Phillips, N.

, R. van Zessen, and GD Stuber, "Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits," Nature Protocols 7, 12-23 (2012). GD Stuber, DR Sparta, AM Stamatakis, WA van Leeuwen, JE Hardjopajinto, S. Cho, KM Tye, KA Kempadoo, F. Zhang, K. Deisseroth, and A. Bonci, "Excitatory transmission from the amygdale to nucleus accumbend facilitates reward seeking, "Nature 475, 377-380 (2011). LV Doronina-Amitonova, IV Fedotov, O.I. Ivashkina, MA Zots, AB Fedotov, KV Anokhin, and AM Zheltikov, "Implantable fiber-optic interface for parallel multisite long-term optical dynamic brain interrogation in freely moving mice," Sci. Rep. 3, 3265.)

Концепция размыкаемых нейроинтрфейсов отражена в заявке на патент US 2011224554 A1 «Optogenetic Fiber Optic Cannula and Adapted Fiber Optic Connector», в которой представлена концепция размыкаемого коннектора. В основе коннектора имеется канула, которая крепится на черепе исследуемого животного, в канулу вставляется две ферулы содержащие отрезки оптического волокна, при этом дистальный конец волокна первой ферулы опускается в исследуемую ткань, а другой конец оптически соединен с длинным концом волокна, закрепленной в ответной феруле. Оптический контакт обеспечивается за счет внешней канули. Длинный конец оптического волокна соединен с системой регистрации. При этом в феруле может содержаться несколько оптических волокон. Компания Optomak, Inc. (Канада) является обладателем этого и ряда патентов в области волоконных устройств для оптогенетики. В частности, в заявке US 20140226932 «Independent dual path optical rotary joint» описывается устройство, позволяющее вращать две части коннектора друг относительно друга, а в заявке на патент US 20150366437 «Image relaying cannula with detachable self-aligning connector» описан коннектор, увеличивающий точность позиционирования канули на черепе животного и более точное оптическое соединение.The concept of disconnectable neural interfaces is reflected in patent application US 2011224554 A1 "Optogenetic Fiber Optic Cannula and Adapted Fiber Optic Connector", which presents the concept of a disconnectable connector. The connector is based on the canula, which is attached to the skull of the animal under study, two ferules containing segments of the optical fiber are inserted into the canula, while the distal end of the fiber of the first ferula is lowered into the test tissue, and the other end is optically connected to the long end of the fiber fixed in the response ferula. Optical contact is provided by an external cannula. The long end of the optical fiber is connected to the recording system. In this case, the ferula may contain several optical fibers. Optomak, Inc. (Canada) holds this and several patents in the field of fiber devices for optogenetics. In particular, the application US 20140226932 "Independent dual path optical rotary joint" describes a device that allows two parts of the connector to rotate relative to each other, and the patent application US 20150366437 "Image relaying cannula with detachable self-aligning connector" describes a connector that increases accuracy positioning has sunk on the skull of the animal and a more accurate optical connection.

Таким образом, использование размыкаемых устройств является одним из магистральных направлений развития волоконных зондов для нейрофизиологии, однако, в описанных выше устройствах отсутствует возможность исследования тканей мозга с клеточным разрешением или они являются достаточно сильно инвазивными по отношению к живой ткани мозга животного.Thus, the use of disconnectable devices is one of the main directions in the development of fiber probes for neurophysiology, however, in the devices described above it is not possible to study brain tissue with cell resolution or they are quite invasive with respect to living brain tissue of the animal.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание системы адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого зонда и многоканальных волокон и, позволяющей с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку.The objective of the invention is the creation of a system for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals based on a probe and multichannel fibers and, with minimal invasiveness, to obtain optical images of brain tissue with cellular resolution and act on a separate targeted cell.

Для решения поставленной задачи предлагается система для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, содержащая лазерную систему оптического возбуждения, включающую, по крайней мере, два лазера с различными длинами волн и изменяемой мощностью, систему сканирования, модуль фокусировки, дихроичную делительную пластину, оптическую систему регистрации и контроля с управляющим компьютером, волоконно-оптический зонд, состоящий из двух частей с первой частью, выполненной с возможностью закрепления на черепе животного, содержащей первую керамическую цилиндрическую ферулу с закрепленным в ней первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, второй частью, содержащей коннектор со второй цилиндрической керамической ферулой и закрепленным в ней вторым длинным отрезком многоканального оптического волокна, при этом вторая часть зонда соединена с лазерной системой оптического возбуждения и системой регистрации и контроля, контактные поверхности первой и второй ферул выполнены плоскими, первый и второй отрезки многоканального волокна, содержащего не менее одной тысячи соосно расположенных световодов микронного размера, при этом плоскость контакта первой и второй керамических ферул расположена в керамическом коннекторе, дистальный конец первого отрезка оптического волокна имеет плоскую поверхность, скошенную на угол от 30 до 60 градусов относительно оси оптического волокна, диаметр многоканального оптического волокна составляет от 250 мкм до 600 мкм. Скос дистального конца оптоволокна определяется необходимостью достижения эффекта «ножа», что необходимо для более плавного раздвижения клеток при проникновении волокна в ткани мозга, что уменьшает инвазивность воздействия. Однако, наклон дистального конца оптоволокна на угол от 30 до 60 градусов относительно оси волокна в случае многосердцевинного волокна с тысячами световодов микронного размера обеспечивает не только увеличение объема исследуемой области, но предоставляет возможность контроля процессов, происходящих в разных слоях тканей головного мозга, в том числе имеющих существенно разную функциональную значимость. Система позволяет селективно возбуждать отдельные группы клеток и/или отдельные клетки мозга и получать флуоресцентные изображения с микронным разрешением. Две части волоконно-оптического зонда соединяют между собой только во время проведения измерений и визуализации нейронов за счет регистрации флуоресцентного отклика генетически встроенных меток. Сохранение части зонда на черепе животного обеспечивает доступ к одной и той же группе клеток мозга в течение длительного времени, а при отсутствии измерений животные могут жить в своих домашних клетках без возможности повредить длинный отрезок оптоволокна.To solve this problem, we propose a system for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals based on a breakable fiber-optic probe with multichannel fibers, containing a laser optical excitation system, including at least two lasers with different wavelengths and variable power, a scanning system, focusing module, dichroic dividing plate, optical registration and control system with a control computer, fiber-optic probe, consisting of two parts with a first part configured to be attached to the skull of an animal containing a first ceramic cylindrical ferula with a first short segment of multichannel optical fiber fixed therein, a second part containing a connector with a second cylindrical ceramic ferula and a second long segment of multichannel optical fiber fixed in it, the second part of the probe is connected to a laser optical excitation system and a registration and control system, the contact surfaces of the first and W A swarm of ferrules is made flat, the first and second segments of a multichannel fiber containing at least one thousand micron-sized coaxial optical fibers, the contact plane of the first and second ceramic ferul being located in the ceramic connector, the distal end of the first segment of the optical fiber has a flat surface, beveled at an angle from 30 to 60 degrees relative to the axis of the optical fiber, the diameter of the multi-channel optical fiber is from 250 microns to 600 microns. The bevel of the distal end of the optical fiber is determined by the need to achieve the “knife” effect, which is necessary for a more smooth extension of the cells when the fiber penetrates the brain tissue, which reduces the invasiveness of exposure. However, the inclination of the distal end of the optical fiber by an angle of 30 to 60 degrees relative to the axis of the fiber in the case of a multi-core fiber with thousands of micron-sized optical fibers provides not only an increase in the volume of the studied area, but also makes it possible to control processes occurring in different layers of brain tissue, including having significantly different functional significance. The system allows you to selectively excite individual groups of cells and / or individual brain cells and obtain fluorescence images with micron resolution. The two parts of the fiber-optic probe are interconnected only during the measurement and visualization of neurons by recording the fluorescence response of genetically integrated tags. Saving part of the probe on the skull of an animal provides access to the same group of brain cells for a long time, and in the absence of measurements, animals can live in their home cells without the possibility of damaging a long piece of fiber.

Плоскость контакта первой и второй ферул с отрезками многоканальных волокон составляет угол от 0 до 30 градусов относительно оси, перпендикулярной оси многоканального оптического волокна, контактные поверхности первой и второй ферул и отрезков многоканальных волокон полированы с точностью порядка 300 нм, что обеспечивает качественный оптический контакт между двумя частями нейроинтерфейса. Скол и полировка осуществляется под углом 0-30 градусов относительно плоскости перпендикулярной оси волокна. Скос в данном случае обеспечивает воспроизводимость и соосность соединения между отдельными сердцевинами волокна при актах замыкания/размыкания двух частей зонда. Такая конструкция также уменьшает механическое возмущение и сдвиг отдельных каналов волокна друг относительно друга при движении животного, что в конечном счете приводит к существенному улучшению стабильности и повышает качество получаемых флуоресцентных изображений.The plane of contact of the first and second ferul with segments of multichannel fibers is an angle from 0 to 30 degrees relative to the axis perpendicular to the axis of the multichannel optical fiber, the contact surfaces of the first and second ferul and segments of multichannel fibers are polished with an accuracy of about 300 nm, which ensures high-quality optical contact between two parts of the neural interface. Chipping and polishing is carried out at an angle of 0-30 degrees relative to the plane perpendicular to the fiber axis. In this case, the bevel provides reproducibility and coaxiality of the connection between the individual fiber cores during the acts of closing / opening of two parts of the probe. This design also reduces the mechanical disturbance and the shift of the individual fiber channels relative to each other during the movement of the animal, which ultimately leads to a significant improvement in stability and improves the quality of the obtained fluorescence images.

Масса первой части зонда не более 0,3 г, что не доставляет серьезных неудобств даже небольшим животным (таким как лабораторные мыши), что особенно важно, если зонд находится в разомкнутом состоянии, когда животные могут находиться в своих клетках.The mass of the first part of the probe is not more than 0.3 g, which does not cause serious inconvenience even to small animals (such as laboratory mice), which is especially important if the probe is in the open state, when the animals can be in their cells.

Система регистрации и контроля содержит конфокальную систему фильтрации излучения из отдельных волокон многоканального оптического волокна, включает полосовые фильтры, спектрометр, фотоэлектронные умножители или фотодиоды, электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь. Обработка сигнала осуществляется конфокальной системой для фильтрации излучения от разных отдельных каналов волокон. Важной частью всей архитектуры является система контроля на основе компьютера, используемая для анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга, а также управления мощностью лазерной системы накачки.The registration and control system contains a confocal system for filtering radiation from individual fibers of a multi-channel optical fiber, includes bandpass filters, a spectrometer, photoelectronic multipliers or photodiodes, an electronic control system, and an analog-to-digital converter. Signal processing is carried out by a confocal system for filtering radiation from different individual fiber channels. An important part of the whole architecture is a computer-based control system used to analyze the recorded signal, construct images of the studied brain area, and also control the power of the laser pump system.

Способ адресного контроля и управления отдельной клеткой или отдельной группой клеток мозга животного с помощью описанной выше системы, при котором генерируют лазерное излучение выбранной длины волны и мощности, позволяющее достигнуть порога фотоактивации клеток, содержащих генетически встроенные светочувствительные белки, фокусируют лазерное излучение посредством системы сканирования и модуля фокусировки в выбранные световоды длинного отрезка многоканального оптического волокна, находящегося внутри коннектора в оптическом контакте с первым коротким отрезком многоканального оптического волокна, закрепленным на черепе животного таким образом, что его дистальный конец расположен в выбранной области мозга животного, где лазерное излучение генерирует измеряемый сигнал флуоресценции, который передают через зонд в оптическую систему регистрации и контроля с управляющим компьютером, где обрабатывают полученные сигналы и строят флуоресцентные изображения клеток с последующим их анализом. Представленное устройство обеспечивает хроническое (постоянное, растянутое во времени) получение флуоресцентных изображений нейронов определенной области мозга. Для обеспечения возможности «обратного» оптического воздействия, клетки помимо флуоресцентных меток должны содержать другой тип генетически встроенных белков, которые обычно встраиваются в мембраны клеток (например, наиболее часто в задачах оптогенетики применяется каналородопсин) и обеспечивают возможность открытия ионных каналов. Поскольку для активации светочувствительных белков в общем случае требуется другая длина волны излучения накачки и гораздо большая мощность, то лазерная система должна обладать как минимум двумя лазерными источниками с различными длинами волн и мощностью, варьируемой в широких пределах. На начальных этапах измерения система регистрирует и обрабатывает флуоресцентные изображений выбранного участка мозга. При этом важно подчеркнуть, что измерения носят принципиально долговременный хронический характер.The method of targeted monitoring and control of a single cell or a separate group of animal brain cells using the system described above, in which laser radiation of a selected wavelength and power is generated, which allows reaching the photoactivation threshold of cells containing genetically integrated photosensitive proteins, focus laser radiation through a scanning system and a module focusing into selected optical fibers of a long segment of a multi-channel optical fiber located inside the connector in the optical con an act with the first short segment of a multichannel optical fiber fixed on the skull of the animal in such a way that its distal end is located in the selected area of the animal’s brain, where the laser radiation generates a measured fluorescence signal, which is transmitted through the probe to the optical recording and control system with a control computer, where process the received signals and build fluorescence images of cells with their subsequent analysis. The presented device provides chronic (constant, stretched in time) obtaining fluorescence images of neurons in a certain area of the brain. In order to provide the possibility of “reverse” optical exposure, the cells, in addition to fluorescence tags, must contain another type of genetically integrated proteins, which are usually embedded in cell membranes (for example, canalorodopsin is most often used in optogenetics) and provide the possibility of opening ion channels. Since the activation of photosensitive proteins in the general case requires a different pump radiation wavelength and much higher power, the laser system must have at least two laser sources with different wavelengths and power, which varies widely. At the initial stages of measurement, the system registers and processes fluorescence images of a selected area of the brain. It is important to emphasize that measurements are fundamentally long-term chronic.

В процессе анализа флуоресцентных изображений определяют функциональную активность клеток, выбирают целевую клетку или группу клеток, после чего подбирают параметры лазерного излучения, необходимого для обеспечения фотоактивации целевых клеток, за счет фокусировки лазерного излучение только на выбранные световые каналы многокального оптического волокна, осуществляемое с помощью компьютерного контроля. После этого снова принимают и обрабатывают оптические сигналы, строят и анализируют изменения флуоресцентных изображений клеток выбранной области мозга. Необходимо отметить, что устройство позволяет следить за функциональными изменениями в отдельных клетках и нейронных сетях, что отражается на поведении животного, формировании его памяти и др., поэтому необходимой задачей является осуществление параллельных нейрофизиолгических измерений и контроля поведения животного.In the process of analyzing fluorescence images, the functional activity of the cells is determined, the target cell or group of cells is selected, and then the parameters of the laser radiation necessary to ensure photoactivation of the target cells are selected by focusing the laser radiation only on the selected light channels of the multi-optical fiber carried out using computer control . After that, optical signals are received and processed again, and changes in fluorescence images of cells of a selected brain region are built and analyzed. It should be noted that the device allows you to monitor functional changes in individual cells and neural networks, which affects the behavior of the animal, the formation of its memory, etc., therefore, a necessary task is the implementation of parallel neurophysiological measurements and control the behavior of the animal.

Для фотоактивации клеток используют излучение или большей мощности, не менее чем на два порядка, и/или иной длины волны или импульсное лазерное излучение, достаточное для фотоактивации клеток, передают лазерное излучение к выбранной области мозга. В случае необходимости воздействия на определенную клетку в лазерной системе выбирают необходимую длину волну или гораздо большую мощность излучения накачки. Адресное воздействие на определенную область достигается за счет сканирования излучения только по определенным сердцевинам многоканального волокна, осуществляемого с помощью компьютерного контроля. Далее адресно передают лазерное излучение к выбранной клетке (или клеткам), при достижении порога срабатывания светочувствительного белка, он «открывает» канал в мембране клетки, позволяя катионам проникать внутрь нее, тем самым давая старт определенной функциональной активности клетки. Если в случае получения флуоресцентных изображений достаточно использовать мощности на уровне десятков и даже сотен микроватт (для уменьшения времени построения изображения), то для достижения порога активации светочувствительных белков требуется на два-три порядка большие мощности излучения, при этом длина волны лазера должна соответствовать спектру поглощения светочувствительного белка. Для этих целей также возможно использование импульсных лазерных источников, которые обеспечивают большую интенсивность света. Кроме того, использование больших мощностей или импульсных источников может привести к фоторазрушению выбранной области биологической ткани, что также может рассматриваться как аналог протокола хирургического вмешательства.For photoactivation of cells, radiation of a higher power of at least two orders of magnitude and / or a different wavelength or pulsed laser radiation sufficient for photoactivation of cells is used, laser radiation is transmitted to a selected area of the brain. If it is necessary to influence a specific cell in the laser system, the necessary wavelength or a much greater pump radiation power is selected. Targeted impact on a specific area is achieved by scanning radiation only at specific cores of a multichannel fiber, carried out using computer control. Then, laser radiation is targeted to the selected cell (or cells), when the threshold of photosensitive protein is reached, it “opens” the channel in the cell membrane, allowing cations to penetrate inside it, thereby giving a start to a certain functional activity of the cell. If in the case of obtaining fluorescence images, it is sufficient to use powers at the level of tens or even hundreds of microwatts (to reduce the time of imaging), then reaching the activation threshold of photosensitive proteins requires two to three orders of magnitude higher radiation powers, and the laser wavelength should correspond to the absorption spectrum photosensitive protein. For these purposes, it is also possible to use pulsed laser sources, which provide a greater light intensity. In addition, the use of high power or pulsed sources can lead to photodestruction of a selected area of biological tissue, which can also be considered as an analogue of the surgical intervention protocol.

Техническим результатом изобретения является разработка системы и способа для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами, позволяющими с минимальной инвазивностью получать оптические изображения тканей мозга с клеточным разрешением и воздействовать на отдельную адресно выбранную клетку или группу клеток. Созданная конструкция дает возможность проводить долговременный ряд экспериментов на одном и том же животном в любой структуре мозга и при этом сохранять уверенность в получении сигнала от одной и той же группы клеток, а также осуществлять обратное воздействие на выбранные клетки.The technical result of the invention is the development of a system and method for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals based on a breakable fiber-optic probe with multichannel fibers, which allow optical invasion of brain tissue with cellular resolution with minimal invasiveness and act on a single targeted cell or group of cells. The created design makes it possible to carry out a long-term series of experiments on the same animal in any structure of the brain and at the same time maintain confidence in receiving a signal from the same group of cells, as well as carry out a reverse effect on selected cells.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 представлена схема системы для адресного контроля нейронов мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами.In FIG. 1 shows a diagram of a system for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals based on a breakable fiber-optic probe with multichannel fibers.

На фиг. 2 представлен общий вид размыкаемого зонда, вживляемого в череп подопытного животного в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии.In FIG. 2 shows a general view of a probe to be implanted that is implanted in the skull of an experimental animal in a closed (a) and open (b) state.

На фиг. 3 представлены флуоресцентные изображения находящихся в водной среде тестовых полистироловых шариков размером порядка 7.5 мкм, полученные посредством предлагаемой системы.In FIG. 3 shows fluorescence images of test polystyrene beads in the aqueous medium of about 7.5 microns in size obtained by the proposed system.

На фиг. 4 представлены флуоресцентные изображения соматосенсорной коры головного мозга трансенгенных мышей линии Thy1-EGFP, полученные с помощью системы для адресного взаимодействия с нейронами мозга живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами.In FIG. Figure 4 shows fluorescence images of the somatosensory cerebral cortex of transgenic mice of the Thy1-EGFP line obtained with the help of a system for targeted interaction with the brain neurons of living free-moving animals based on an openable fiber-optic probe with multichannel fibers.

На фиг. 1 представлена схема устройства: 1 - лазерная система возбуждения, содержащая не менее двух лазерных источников с различными длинами волн и варьируемой мощностью (длины волн лазерных источников должны выбираться в соответствии со спектральными характеристиками генетически встроенных в нейроны биомаркеров и светочувствительных белков, а мощность излучения соответствующего источника должна быть достаточной для открытия ионных каналов в мембране клеток, в которую встроен светочувствительный белок); 2 - система сканирования на основе двух гальванозеркал для позиционирования излучения на отдельные сердцевины многоканального волокна, 3 - дихроичная делительная пластина, отделяющая излучение накачки от излучения флуоресценции, распространяющегося в обратном направлении; 4 - модуль фокусировки (объектив); 5 - длинный отрезок многоканального оптоволокна с ферулой 6 на конце; 7 - короткий отрезок многоканального оптоволокна, закрепляемый на черепе подопытного животного с ферулой 8 на конце; 9 - коннектор для жесткого соединения первой и второй частей размыкаемого зонда; 10 - конфокальная система, обеспечивающая точное выделение регистрируемого излучения флуоресценции от отдельных каналов оптоволокна; 11 - оптическая система регистрации (включающая полосовые фильтры и спектрометр, фотоэлектронные умножители (или фотодиоды), электронную систему управления, аналого-цифровой преобразователь); 12 - система контроля на основе компьютера для управления лазерной системой возбуждения, анализа регистрируемого сигнала, построения изображений исследуемой области мозга и управления мощностью лазеров.In FIG. 1 shows a diagram of the device: 1 - a laser excitation system containing at least two laser sources with different wavelengths and variable power (wavelengths of laser sources should be selected in accordance with the spectral characteristics of biomarkers and photosensitive proteins genetically embedded in neurons, and the radiation power of the corresponding source should be sufficient to open ion channels in the cell membrane into which the photosensitive protein is integrated); 2 — a scanning system based on two galvanic mirrors for positioning radiation on individual cores of a multichannel fiber; 3 — a dichroic dividing plate separating pump radiation from fluorescence radiation propagating in the opposite direction; 4 - focus module (lens); 5 - a long segment of multi-channel fiber with ferula 6 at the end; 7 - a short segment of multi-channel optical fiber, mounted on the skull of the experimental animal with ferula 8 at the end; 9 - connector for hard connection of the first and second parts of the probe to be disconnected; 10 - confocal system, providing accurate separation of the recorded fluorescence radiation from individual channels of the optical fiber; 11 - an optical recording system (including bandpass filters and a spectrometer, photoelectronic multipliers (or photodiodes), an electronic control system, an analog-to-digital converter); 12 is a computer-based monitoring system for controlling a laser excitation system, analyzing a recorded signal, imaging a region of the brain under study, and controlling laser power.

На фиг. 2 представлен общий вид размыкаемого зонда в замкнутом (а) и разомкнутом (б) состоянии: первая часть зонда выполнена в виде керамической ферулы 8, закрепляемой с помощью специального клея на кости черепа подопытного животного 13, и короткого отрезка многоканального оптоволокна 7, при этом дистальный конец многоканального оптоволокна 7 выходит за пределы корпуса ферулы 8 в мозг подопытного животного, а второй конец многоканального оптоволокна 7 находится в феруле 8 и с помощью коннектора 9 механически и оптически присоединяется ко второй части зонда. Вторая часть зонда содержит длинный отрезок многоканального оптоволокна 5, который закреплен с одного конца в керамической феруле 6. Керамический коннектор 9 связывает ферулы 6 и 8, и обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна. Внутренний диаметр керамической ферулы 8 соответствует внешнему диаметру оптического волокна 7 для точного позиционирования и герметичного закрепления (вклеивания). Во время проведения исследований обе части зонда соединяются между собой с помощью коннектора 9, который в разомкнутом состоянии остается на феруле 6.In FIG. 2 shows a general view of a probe to be opened in a closed (a) and open (b) state: the first part of the probe is made in the form of a ceramic ferule 8, fixed with special glue to the bones of the skull of the experimental animal 13, and a short segment of multichannel optical fiber 7, while the end of the multi-channel optical fiber 7 extends beyond the body of the ferula 8 into the brain of the experimental animal, and the second end of the multi-channel optical fiber 7 is located in the ferula 8 and is connected mechanically and optically to the second part using the connector 9 a probe. The second part of the probe contains a long segment of multi-channel optical fiber 5, which is fixed at one end in a ceramic ferula 6. A ceramic connector 9 connects the ferrules 6 and 8, and provides a rigid mechanical connection and optical contact between the long 5 and short 7 segments of the multi-channel optical fiber. The inner diameter of the ceramic ferula 8 corresponds to the outer diameter of the optical fiber 7 for precise positioning and tight fixing (gluing). During the research, both parts of the probe are interconnected using a connector 9, which in the open state remains on the ferrule 6.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Рассмотрим пример применения заявленной системы для получения изображений тестовых объектов и тканей головного мозга свободно движущихся животных (работы проводились в МГУ имени М.В. Ломоносова, схема системы для адресного контроля представлена на фиг. 1). Отличительной особенностью представленных экспериментов является использование преимуществ системы для получения изображений мозга тканей с генетически встроенными флуоресцентными маркерами живых свободноподвижных животных на основе размыкаемого волоконно-оптического зонда с многоканальными волокнами. Размыкаемая конструкция зонда (также употребимым в данном случае является термин - нейроинтерфейс) является ключевым преимуществом при проведении экспериментов по долговременной регистрации нейронной активности, структурных и морфологических изменений внутри живого мозга с клеточным разрешением. При этом благодаря небольшому весу и компактному размеру вживляемой части зонда между измерениями животные могут жить в обычных условиях, не испытывая дополнительного стресса.Consider an example of the application of the claimed system for obtaining images of test objects and brain tissue of freely moving animals (work was carried out at Lomonosov Moscow State University, a diagram of the system for address control is shown in Fig. 1). A distinctive feature of the presented experiments is the use of the advantages of the system for obtaining images of tissue brain with genetically integrated fluorescent markers of living free-moving animals based on a breakable fiber-optic probe with multichannel fibers. The disconnectable probe design (the term neurointerface is also used in this case) is a key advantage in experiments on the long-term registration of neural activity, structural and morphological changes inside the living brain with cell resolution. Moreover, due to the light weight and compact size of the implantable part of the probe between measurements, animals can live in normal conditions without experiencing additional stress.

Используемый зонд состоит из двух отрезков многоканального оптического волокна, содержащего порядка 6000 тысяч световодных сердцевин (каналов). Диаметр каждого канала порядка 1.5 мкм. Расстояние между центрами каналов приблизительно Λ≈3.6±0.3 мкм. Общий диаметр волокна 300 мкм. Числовая апертура NA индивидуального канала на длине волны 473 нм составляет величину около NA≈0.27. Первая часть нейроинтерфейса, состоящая из ферулы 8 и короткого отрезка многоканального волокна 7, позиционируется и фиксируется на голове анестезированного животного с помощью стереотаксиса, при этом дистальный конец многоканального волокна 7 через отверстие в черепе опускается на определенную глубину в мозг животного. Вторая размыкаемая часть зонда состоит из длинного отрезка многоканального волокна 5 и керамической ферулы 6. Длинный 5 и короткий 7 отрезки многоканального волокна являются эквивалентными по структуре. Длина отрезка 5 выбирается таким образом, чтобы обеспечить проведение долговременных экспериментов на животном и обеспечить ему свободное перемещение в пределах как минимум одного квадратного метра. Вторая часть зонда соединена с первой с помощью керамического коннектора 9, который обеспечивает жесткое механическое соединение и оптический контакт между длинным 5 и коротким 7 отрезками многоканального оптического волокна и в разомкнутом состоянии остается прикрепленным к феруле 6. Все время между экспериментами животное может жить в нормальных условиях с первой частью зонда (вес не более 0.3 грамма), что не влияет на нормальную жизнь таких мелких подопытных животных как мыши. Дистальный торец многоканального волокна 7 был скошен под углом 30 градусов по отношению к оси волокна 7 с помощью скалывателя, а затем полировался с грубостью порядка 300 нм. Подобная архитектура скола помогает уменьшить механические повреждения при прохождении волокна вглубь слоев мозга, а также увеличивает площадь сбора флуоресцентного сигнала и позволяет одновременно контролировать отдельные нейроны в различных слоях тканей головного мозга животных. Для реализации функции размыкаемости и обеспечения качественного оптического контакта процедура изготовления обеих частей зонда заключалась в следующем: обе части многоканального волокна 5 и 7, закрепленные соответственно в ферулы 6 и 8, скалывались у основания ферул, а затем полировались вместе с ними для обеспечения заданного качества оптического контакта. Механическое соединение двух частей обеспечивалось керамическим коннектором 9.The probe used consists of two segments of a multichannel optical fiber containing about 6,000 thousand light-guide cores (channels). The diameter of each channel is about 1.5 μm. The distance between the centers of the channels is approximately Λ≈3.6 ± 0.3 μm. The total fiber diameter is 300 microns. The numerical aperture NA of an individual channel at a wavelength of 473 nm is about NA≈0.27. The first part of the neurointerface, consisting of ferula 8 and a short segment of multichannel fiber 7, is positioned and fixed on the head of the anesthetized animal using stereotaxis, while the distal end of the multichannel fiber 7 through a hole in the skull is lowered to a certain depth in the animal’s brain. The second disconnectable part of the probe consists of a long segment of multi-channel fiber 5 and ceramic ferula 6. Long 5 and short 7 segments of multi-channel fiber are equivalent in structure. The length of section 5 is selected in such a way as to ensure long-term experiments on the animal and to ensure free movement within at least one square meter. The second part of the probe is connected to the first using a ceramic connector 9, which provides a rigid mechanical connection and optical contact between the long 5 and short 7 segments of the multichannel optical fiber and in the open state remains attached to ferula 6. All the time between experiments, the animal can live under normal conditions with the first part of the probe (weight not more than 0.3 grams), which does not affect the normal life of such small experimental animals as mice. The distal end face of the multi-channel fiber 7 was beveled at an angle of 30 degrees with respect to the axis of the fiber 7 using a cleaver, and then polished with a roughness of the order of 300 nm. Such a cleaved architecture helps to reduce mechanical damage during the passage of fiber deeper into the layers of the brain, and also increases the collection area of the fluorescent signal and allows you to simultaneously control individual neurons in various layers of animal brain tissue. To realize the opening function and ensure high-quality optical contact, the manufacturing procedure of both parts of the probe was as follows: both parts of the multichannel fiber 5 and 7, fixed in ferrules 6 and 8, respectively, were chipped off at the base of the ferrules, and then polished together with them to ensure a given optical quality contact. The mechanical connection of the two parts was provided by a ceramic connector 9.

В тестовых экспериментах для проверки возможности и качества получаемых изображений через размыкаемый оптический зонд, лазерное излучение с длиной волны 473 нм заводилось в индивидуальные каналы длинного (80 см) отрезка 5 многоканального оптоволокна с помощью гальваносканера 2 и системы фокусировки 4, затем за счет оптического контакта, обеспечиваемого конструкцией размыкаемого оптического зонда (Фиг. 2), передавалось в каналы 10 мм отрезка волокна 7. Далее это излучение оптической накачки выходило из отдельных каналов дистального торца этого отрезка волокна 7 и возбуждало флуоресценцию находящихся в водном растворе 7.5 мкм полистироловых шариков, покрытых маркерным красителем. Излучение флуоресценции в зеленой области спектра (520-540 нм) собиралось тем же волокном 7, передавалось в обратном направлении через соединенные короткий 7 и длинный 5 отрезки многоканального волокна, далее отделялось дихроичным зеркалом 3 от излучения накачки и передавалось в систему регистрации, где строилось изображение полистироловых шариков (результаты представлены на Фиг. 3). Отметим, что размеры полистироловых шариков сопоставимы с размерами нейронов, т.е. в результате наши тестовые эксперименты продемонстрировали возможность получения изображений флуоресцирующих объектов с масштабами порядка размеров клеток и даже менее. Поскольку в данной реализации скос на конце волокон, закрепленных в керамические ферулы 6, 8 и соединяемых с помощью коннектора 9 отсутствовал (плоскости концов оптических волокна с ферулами полировались под углами 90 градусов относительно оси волокон), то сохранялась возможность поворота двух частей зонда (двух ферул с волокнами) друг относительно друга. Как видно из Фиг. 3, вращение длинного оптоволокна относительно короткого приводит к флуктуации качества изображения и его повороту. Очевидно, что при повороте соосность индивидуальных каналов может нарушаться относительно начальной, однако сохраняется достаточно хорошее оптичское качество соединения двух отрезков волокна, кроме того большое количество каналов в среднем компенсирует рассогласование начальной соосности индивидуальных каналов. Полировка торцов волокон с ферулами под определенным углом (наличие скоса) повышает сложность технологической обработки, однако позволяет реализовать большую точность механического соединения и соосность индивидуальных каналов в процессе размыкания/замыкания двух частей оптического зонда, что в результате повышает воспроизводимость получаемых изображений.In test experiments, to verify the feasibility and quality of the images obtained through an interruptible optical probe, laser radiation with a wavelength of 473 nm was injected into individual channels of a long (80 cm) segment 5 of multichannel optical fiber using a galvanic scanner 2 and focusing system 4, then due to optical contact, provided by the design of the interruptible optical probe (Fig. 2), it was transmitted to the channels of 10 mm of the fiber segment 7. Further, this optical pump radiation came out of the individual channels of the distal end a fiber length of 7 and exciting fluorescence in aqueous solution are 7.5 micron polystyrene beads coated with a marker dye. The fluorescence radiation in the green spectral region (520–540 nm) was collected by the same fiber 7, transmitted in the opposite direction through the connected short 7 and long 5 segments of the multichannel fiber, then it was separated by a dichroic mirror 3 from the pump radiation and transmitted to the registration system where the image was built polystyrene beads (the results are presented in Fig. 3). Note that the sizes of polystyrene balls are comparable to the sizes of neurons, i.e. as a result, our test experiments demonstrated the possibility of obtaining images of fluorescent objects with scales on the order of cell sizes or even less. Since in this implementation there was no bevel at the end of the fibers fixed in ceramic ferrules 6, 8 and connected using the connector 9 (the plane of the ends of the optical fibers with the ferrules was polished at 90 degrees from the fiber axis), the possibility of turning two parts of the probe (two ferrules) remained with fibers) relative to each other. As can be seen from FIG. 3, rotation of a long optical fiber relatively short leads to fluctuations in image quality and its rotation. Obviously, during rotation, the alignment of individual channels can be violated relative to the initial one, however, a fairly good optical quality of the connection of two fiber segments is preserved, in addition, a large number of channels on average compensates for the mismatch in the initial alignment of individual channels. Polishing the ends of the fibers with ferrules at a certain angle (the presence of a bevel) increases the complexity of the processing, however, it allows for greater precision of the mechanical connection and alignment of the individual channels during the opening / closing of two parts of the optical probe, which as a result increases the reproducibility of the resulting images.

В условиях реальных экспериментов с живыми животными были использованы трансгенные мыши линии Thy1-EGFP. В соответствии с разработанной процедурой вживления первая часть нейроинтерфейса позиционировалась на определенной части черепа животного и дистальный конец оптоволокна опускался на определенную глубину исследуемой области мозга животного. Для возбуждения мы также использовали непрерывное излучение с длиной волны 473 нм, которое аналогично описанной выше процедуре измерений возбуждало флуоресценцию маркерного белка EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) в мозге бодрствующего свободноподвижного животного. Флуоресцентный сигнал от биомаркеров в зеленой области спектра собирался тем же самым волокном, передавался в обратном направлении, поступал в систему регистрации, где анализировался с помощью компьютера. На Фиг. 4 а, б представлены типичные фотографии соматосенсорной коры мозга трансгенной мыши линии Thy1-EGFP, полученные с помощью разработанной нами системы. На этих фотографиях видны индивидуальные клетки, при этом особенности расположения клеток восспроизводимы от реализации к реализации в масштабах нескольких дней. Таким образом, эксперименты продемонстрировали высокий потенциал применения размыкаемого зонда для визуализации с высоким пространственным разрешением нейронов генетически кодированных тканей головного мозга бодрствующих и свободно двигающихся животных.In real experiments with live animals, transgenic mice of the Thy1-EGFP line were used. In accordance with the developed implantation procedure, the first part of the neurointerface was positioned on a certain part of the animal’s skull and the distal end of the optical fiber fell to a certain depth of the studied area of the animal’s brain. For excitation, we also used continuous radiation with a wavelength of 473 nm, which, similarly to the measurement procedure described above, excited the fluorescence of the EGFP marker protein (Enhanced Green Fluorescence Protein) in the brain of an awake free-moving animal. The fluorescent signal from biomarkers in the green region of the spectrum was collected by the same fiber, transmitted in the opposite direction, entered the registration system, where it was analyzed using a computer. In FIG. Figures 4a and 4b show typical photographs of the somatosensory cortex of the transgenic mouse Thy1-EGFP line obtained using our system. In these photographs, individual cells are visible, while the features of the arrangement of cells are reproducible from implementation to implementation on the scale of several days. Thus, the experiments showed a high potential for using a probe for imaging with high spatial resolution of neurons of genetically encoded brain tissues of awake and freely moving animals.

Для реализации не только возможности получения изображений, но и оптического (оптогенетического) контроля индивидуальных клеток, эти клетки должны быть генетически кодированы не только флуоресцентными маркерами, но дополнительно содержать светочувствительные белки другого типа. Наиболее распространенным светочувствительным белком является каналородопсин-2 (Channelrhodopsin-2). Этот белок встраивается в мембрану клетки и при воздействии синего света достаточной мощности происходит реакция - в мембране клетки открывается канал для проникновения внутрь нее катионов. Проникновение катионов (например, Са⁺) в цитоплазму клетки приводит к запуску определенной функциональной активности клетки. Таким образом, свет является своеобразным триггером, запускающим ту или иную биохимическую реакцию в нейронах, что приводит к определенной функциональной реакции животного (как уже было отмечено, эта методика в узком смысле составляет определение оптогенетики). Светочувствительный белок Channelrhodopsin-2 и флуоресцентный маркер EGFP обладают перекрывающимися спектрами поглощения, поэтому для возбуждения флуоресценции и активации каналородопсина требуется применение лазерного источника в синей области спектра. В случае использования лазера на длине волны 473 нм его спектральные характеристики принципиально допускают возможность одновременного возбуждения обоих типов белков. Однако, для получения изображений с помощью флуоресцентных маркеров мощность используемого излучения на длине волны 473 нм не превышает величины 0.2-0.3 мВт, в то время как для достижения порога открытия ионных каналов требуются гораздо более высокие мощности. Учитывая, что клетка располагается на некотором расстоянии от поверхности дистального торца волокна, и также принимая во внимание дифракционную расходимость излучения и наличие рассеивающей ткани, мощность используемых источников для обеспечения достижения порога «срабатывания» каналородопсиновых клеток (приблизительно 1 мВт/мм²) должна быть высокой (в нашей системе предусмотрено наличие мощных лазерных источников до 200 мВт. (Принципиально мощность ограничивается пробоем оптических элементов, в частности, каналов оптоволокна, или нежелательным фоторазрушением биологической ткани.) Т.е. мощность излучения для флуоресцентной визуализации клеток и мощность излучения для инициирования функционального отклика клеток, содержащих каналородопсин, должна отличаться на 2-3 порядка. Это диктует использование лазерных источников достаточно высокой мощности с системой управления (возможно использование несколько источников). Необходимо отметить обязательное наличие обратной связи: анализируя полученные изображения, экспериментатор должен определить, какой определенную клетку (или группу клеток) он должен активировать и с помощью системы сканирования (гальваносканера), излучение заводится только в те сердцевины многоканального волокна, которые в результате адресно облучают выделенную целевую клетку (или клетки).In order to realize not only the possibility of obtaining images, but also the optical (optogenetic) control of individual cells, these cells must be genetically encoded not only by fluorescent markers, but additionally contain photosensitive proteins of a different type. The most common photosensitive protein is canalorodopsin-2 (Channelrhodopsin-2). This protein is embedded in the cell membrane and when exposed to blue light of sufficient power, a reaction occurs - a channel is opened in the cell membrane for cations to penetrate inside it. The penetration of cations (for example, Ca ⁺ ) into the cytoplasm of the cell leads to the launch of a certain functional activity of the cell. Thus, light is a kind of trigger that triggers one or another biochemical reaction in neurons, which leads to a certain functional reaction of the animal (as already noted, this technique in the narrow sense makes up the definition of optogenetics). The photosensitive Channelrhodopsin-2 protein and the EGFP fluorescent marker have overlapping absorption spectra; therefore, the use of a blue laser source is required to excite fluorescence and activate channelorodopsin. In the case of using a laser at a wavelength of 473 nm, its spectral characteristics fundamentally allow the possibility of simultaneous excitation of both types of proteins. However, to obtain images using fluorescent markers, the power of the used radiation at a wavelength of 473 nm does not exceed 0.2-0.3 mW, while much higher powers are required to reach the threshold for opening ion channels. Given that the cell is located at a certain distance from the surface of the distal end of the fiber, and also taking into account the diffraction divergence of the radiation and the presence of scattering tissue, the power of the sources used to ensure that the threshold of “response” of the canal rhodopsin cells (approximately 1 mW / mm ² ) must be high (Our system provides for the presence of powerful laser sources up to 200 mW. (In principle, the power is limited by the breakdown of optical elements, in particular, optical fiber channels, or desirable photodestruction of biological tissue.) That is, the radiation power for fluorescence imaging of cells and the radiation power for initiating the functional response of cells containing canalorodopsin should differ by 2-3 orders of magnitude. This dictates the use of sufficiently high power laser sources with a control system (it is possible to use several sources.) It is necessary to note the obligatory presence of feedback: analyzing the images obtained, the experimenter must determine which it must also activate a testicle (or a group of cells) with the help of a scanning system (galvanoscanner), the radiation is delivered only to those cores of the multichannel fiber, which as a result address the selected target cell (or cells).

Другой возможностью раздельной реализации процессов получения изображения и адресного воздействия на клетки нейронов является использование генетически встроенных белков, обладающих различными спектрами поглощения. Например, светочувствительный белок галородопсин может использоваться для ингибирования нейронов, и при этом он обладает максимумом светопоглощения в районе 590 нм, а маркерный белок EGFP в области 480 нм. Таким образом, лазерная система должна обладать как минимум двумя лазерными источниками с различными длинами волн. При этом необходимо отметить, что в общем случае длина волны источников лазерного излучения и мощность должны соответствовать свойствам используемых генетически встроенных маркеров и светочувствительных белков, т.е. подстраиваться под определенную задачу (или наоборот, надо подбирать и создавать определенную комбинацию генетически встроенных маркеров под имеющиеся возможности лазерной системы).Another possibility of separate implementation of the processes of image acquisition and targeted action on neuron cells is the use of genetically integrated proteins with different absorption spectra. For example, the photosensitive protein halorodopsin can be used to inhibit neurons, and at the same time it has a maximum light absorption in the region of 590 nm, and the marker protein EGFP in the region of 480 nm. Thus, the laser system must have at least two laser sources with different wavelengths. It should be noted that in the general case, the wavelength of the laser radiation sources and power should correspond to the properties of the used genetically integrated markers and photosensitive proteins, i.e. adapt to a specific task (or vice versa, you need to select and create a certain combination of genetically integrated markers according to the available capabilities of the laser system).

Реализуемая методика волоконно-оптической эндоскопии с помощью разработанного устройства и способа имеет важные преимущества по сравнению со стандартной оптической визуализацией, поскольку обеспечивает получение флуоресцентных изображений тканей с клеточным разрешением и позволяет проникать в исследуемую область головного мозга на практически неограниченную глубину. При этом сохраняется возможность движения животного и контроля его активности. Размыкаемая конструкция волоконно-оптического зонда обеспечивает проведение длительных экспериментов с сохранением доступа к одной и той же группе нейронов, лежащей в глубоких слоях мозга живого животного, что позволяет осуществлять хроническое оптическое зондирование геномной активности нейронов. В ходе представленных экспериментов мы демонстрируем возможность получения флуоресцентных изображений тканей головного мозга подопытных свободно двигающихся животных с клеточным разрешением с помощью реализованного устройства на основе волоконно-оптического размыкаемого зонда с многоканальными волокнами.The implemented technique of fiber-optic endoscopy using the developed device and method has important advantages compared to standard optical imaging, since it provides fluorescence images of tissues with cell resolution and allows penetration into the studied region of the brain to an almost unlimited depth. At the same time, the possibility of animal movement and control of its activity remains. The split design of the fiber-optic probe provides long-term experiments while maintaining access to the same group of neurons lying in the deep layers of the brain of a living animal, which allows chronic optical probing of the genomic activity of neurons. In the course of the presented experiments, we demonstrate the possibility of obtaining fluorescence images of brain tissue of experimental freely moving animals with cellular resolution using an implemented device based on a fiber optic breakable probe with multichannel fibers.

Claims

1. A system for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals based on an openable fiber-optic probe with multichannel fibers, comprising a scanning system based on two galvanic mirrors with the ability to position radiation on individual cores of a multichannel fiber connected to a dichroic dividing plate separating the pump radiation from the radiation of fluorescence, propagating in the opposite direction, and with the focusing module - lens, with the possibility of transmitting laser radiation through optical contact; a confocal system associated with the scanning system, which ensures the accurate separation of the recorded fluorescence radiation from individual optical fiber channels; an optical recording system, which includes bandpass filters and a spectrometer, photoelectronic multipliers or photodiodes, an electronic control system, an analog-to-digital converter; and a related computer-based monitoring system with the ability to control a laser excitation system, analyze the recorded signal, construct images of the brain region under study and control the laser power, as well as a laser optical excitation system comprising at least two lasers with different wavelengths and variable power; a fiber optic probe, consisting of two parts with a first part configured to be mounted on the animal’s skull containing the first ceramic cylindrical ferula with the first short segment of the multichannel optical fiber fixed in it, the second part containing the connector with the second cylindrical ceramic ferula and fixed in her second long segment of a multi-channel optical fiber, while the second part of the probe is connected to a laser optical excitation system and a recording system and control, the contact surfaces of the first and second ferrules are made flat, the first and second segments of the multichannel fiber contain at least one thousand micron sized optical fibers, the contact plane of the first and second ceramic ferul is located in the ceramic connector, the distal end of the first segment of the optical fiber has a flat surface, beveled at an angle of 30 to 60 degrees relative to the axis of the optical fiber, the diameter of the multi-channel optical fiber is from 250 μm to 600 μm.

2. The system according to p. 1, characterized in that the contact plane of the first and second ferul with segments of multichannel fibers is an angle from 0 to 30 degrees relative to the axis perpendicular to the axis of the multichannel optical fiber, the contact surfaces of the first and second ferul and segments of multichannel fibers are polished with accuracy of the order of 300 nm.

3. The system according to claim 1, characterized in that the mass of the first part of the probe is not more than 0.3 g.

4. A method for targeted monitoring of brain neurons of living free-moving animals using the system of claim 1, wherein the laser radiation of a selected wavelength and power is generated, which allows reaching the photoactivation threshold of cells containing genetically integrated photosensitive proteins, focus the laser radiation through a scanning system and a focus module into selected optical fibers of a long segment of a multichannel optical fiber located inside the connector in optical contact with the first short segment of a global optical fiber fixed to the animal’s skull so that its distal end is located in a selected area of the animal’s brain, where the laser radiation generates a measured fluorescence signal, which is transmitted through a probe to an optical recording and control system with a control computer, where the received signals are processed and built fluorescence images of cells with their subsequent analysis.

5. The method according to p. 5, characterized in that during the analysis of fluorescence images determine the functional activity of the cells, select the target cell or group of cells, and then select the parameters of the laser radiation necessary to ensure photoactivation of the cells, followed by irradiation of the target cells, and then receive and process optical signals, followed by analysis of changes in fluorescence images of cells in a selected area of the brain.

6. The method according to p. 5, characterized in that for photoactivation of the cells using radiation or higher power, not less than two orders of magnitude, and / or a different wavelength or pulsed laser radiation, sufficient for photoactivation of the cells.