RU2639513C1 - Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) - Google Patents
Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639513C1 RU2639513C1 RU2016147542A RU2016147542A RU2639513C1 RU 2639513 C1 RU2639513 C1 RU 2639513C1 RU 2016147542 A RU2016147542 A RU 2016147542A RU 2016147542 A RU2016147542 A RU 2016147542A RU 2639513 C1 RU2639513 C1 RU 2639513C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pcr
- biochip
- tumor cells
- hybridization
- genome
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 title abstract 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 abstract 1
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 abstract 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 14
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 14
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 101000666382 Homo sapiens Transcription factor E2-alpha Proteins 0.000 description 9
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 description 8
- 101000823316 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 8
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 7
- 101000610107 Homo sapiens Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Proteins 0.000 description 7
- 101000718497 Homo sapiens Protein AF-10 Proteins 0.000 description 7
- 101000959489 Homo sapiens Protein AF-9 Proteins 0.000 description 7
- 102100040171 Pre-B-cell leukemia transcription factor 1 Human genes 0.000 description 7
- 102100026286 Protein AF-10 Human genes 0.000 description 7
- 102100039686 Protein AF-9 Human genes 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 102100033793 ALK tyrosine kinase receptor Human genes 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 102100024379 AF4/FMR2 family member 1 Human genes 0.000 description 5
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 101000833180 Homo sapiens AF4/FMR2 family member 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000591286 Homo sapiens Myocardin-related transcription factor A Proteins 0.000 description 5
- 101000925651 Homo sapiens Protein ENL Proteins 0.000 description 5
- 101001062093 Homo sapiens RNA-binding protein 15 Proteins 0.000 description 5
- 101100078258 Homo sapiens RUNX1T1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101000891113 Homo sapiens T-cell acute lymphocytic leukemia protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100034099 Myocardin-related transcription factor A Human genes 0.000 description 5
- 102100033813 Protein ENL Human genes 0.000 description 5
- 102100029244 RNA-binding protein 15 Human genes 0.000 description 5
- 101000702553 Schistosoma mansoni Antigen Sm21.7 Proteins 0.000 description 5
- 101000714192 Schistosoma mansoni Tegument antigen Proteins 0.000 description 5
- 102100040365 T-cell acute lymphocytic leukemia protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100036775 Afadin Human genes 0.000 description 4
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 4
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 description 4
- 102100039369 Epidermal growth factor receptor substrate 15 Human genes 0.000 description 4
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 4
- 101000928246 Homo sapiens Afadin Proteins 0.000 description 4
- 101000812517 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor substrate 15 Proteins 0.000 description 4
- 101001000104 Homo sapiens Myosin-11 Proteins 0.000 description 4
- 101001109719 Homo sapiens Nucleophosmin Proteins 0.000 description 4
- 101000583474 Homo sapiens Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein Proteins 0.000 description 4
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000596772 Homo sapiens Transcription factor 7-like 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100036639 Myosin-11 Human genes 0.000 description 4
- 102100022678 Nucleophosmin Human genes 0.000 description 4
- 102100031014 Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly protein Human genes 0.000 description 4
- 108700040655 RUNX1 Translocation Partner 1 Proteins 0.000 description 4
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 4
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 231100000005 chromosome aberration Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 7-imino-n,n-dimethylphenothiazin-3-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2SC3=CC(=[N+](C)C)C=CC3=NC2=C1 NALREUIWICQLPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710168331 ALK tyrosine kinase receptor Proteins 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008147 Core Binding Factor beta Subunit Human genes 0.000 description 2
- 108010060313 Core Binding Factor beta Subunit Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000996563 Homo sapiens Nuclear pore complex protein Nup214 Proteins 0.000 description 2
- 101000892338 Homo sapiens Protein AF1q Proteins 0.000 description 2
- 101000813738 Homo sapiens Transcription factor ETV6 Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102100033819 Nuclear pore complex protein Nup214 Human genes 0.000 description 2
- 108091008121 PML-RARA Proteins 0.000 description 2
- 102100040665 Protein AF1q Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108700019889 TEL-AML1 fusion Proteins 0.000 description 2
- -1 Tf1 polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102100039580 Transcription factor ETV6 Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008711 chromosomal rearrangement Effects 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010000890 Acute myelomonocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000004085 CLL/SLL Diseases 0.000 description 1
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002664 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000033835 Myelomonocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 101150093257 RUNX1T1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 208000011912 acute myelomonocytic leukemia M4 Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000018805 childhood acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011633 childhood acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002797 childhood leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000023738 chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 201000007919 lymphoplasmacytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины и касается выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов), определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей, с использованием обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).The invention relates to the field of genetics, molecular biology and medicine and relates to the identification of structural rearrangements of the genome of tumor cells (chimeric genes) that determine the choice of therapy and prognosis for acute leukemia in children, using reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) and subsequent hybridization with an oligonucleotide biological microchip (biochip).
Уровень техникиState of the art
Известен ряд способов определения структурных перестроек генома опухолевых клеток, в которых используются различные подходы.A number of methods are known for determining structural rearrangements of the genome of tumor cells, in which various approaches are used.
Цитогенетический анализ определяет различные структурные изменения генома, включая изменения числа хромосом, однако обладает низким разрешением, не способен выявлять скрытые (криптические) перестройки, не дает возможности установить молекулярную природу перестроенного участка. Метод заключается в окраске в очень кислой среде краской Гимзы (Giemsastain), в результате чего хромосомы приобретают специфическое неравномерное окрашивание в виде полос, которые принято называть G-бэндами. Каждая пара хромосом имеет свое специфическое окрашивание, которое изменяется в случае хромосомных аберраций (делеции, транслокации, инверсии). Несмотря на ограничения в аналитической чувствительности и доступности делящихся клеток в клиническом образце, этот метод продолжает предоставлять ценную информацию о перемещениях, а также числовые изменения в числе хромосомы и структуре [Fluorescence immunophenotypic and interphase cytogenetic characterization of nodal lymphoplasmacytic lymphoma./ Sargent RL, Cook JR, Aguilera NI, Surti U, Abbondanzo SL, Gollin SM, Swerdlow SH.// Am J Surg Pathol. - 2008 - Vol. 32. - P. 1643-53.; Chromosomal aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia: 15-year single center experience/ Jarosova M, Volejnikova J, Porizkova I, Holzerova M, Pospisilova D, Novak Z, Vrbkova J, Mihal V.//Cancer Genet. - 2016 – Vol. 209 - Р. 340-7].Cytogenetic analysis determines various structural changes in the genome, including changes in the number of chromosomes, but it has a low resolution, is not able to detect hidden (cryptic) rearrangements, and does not make it possible to establish the molecular nature of the rearranged region. The method consists in coloring in a very acidic environment Giemsastain's paint (Giemsastain), as a result of which the chromosomes acquire a specific uneven coloring in the form of bands, which are commonly called G-bands. Each pair of chromosomes has its own specific staining, which changes in the case of chromosomal aberrations (deletions, translocations, inversions). Despite limitations in the analytical sensitivity and availability of dividing cells in a clinical sample, this method continues to provide valuable information about movements, as well as numerical changes in the chromosome number and structure [Fluorescence immunophenotypic and interphase cytogenetic characterization of nodal lymphoplasmacytic lymphoma./ Sargent RL, Cook JR , Aguilera NI, Surti U, Abbondanzo SL, Gollin SM, Swerdlow SH.// Am J Surg Pathol. - 2008 - Vol. 32. - P. 1643-53 .; Chromosomal aberrations in childhood acute lymphoblastic leukemia: 15-year single center experience / Jarosova M, Volejnikova J, Porizkova I, Holzerova M, Pospisilova D, Novak Z, Vrbkova J, Mihal V. // Cancer Genet. - 2016 - Vol. 209 - R. 340-7].
С помощью FISH (флуоресцентной гибридизации insitu) возможно определение нормальной или аномальной локализации гена, числа его копий, а также структурных перестроек хромосомного аппарата опухолевой клетки. Зонд, меченный биотином или непосредственно флуоресцентным красителем, наносят на образец интерфазных клеток или метафазных пластинок, иммобилизованных на подложке или в твердом субстрате. Ядерную ДНК иммобилизованных клеток и меченный зонд предварительно денатурируют, далее происходит ренатурация последовательности ДНК ядра и зонда и образование гибридных дуплексов, в том случае если в ДНК ядра или хромосом имеется комплементарная зонду последовательность. Не полностью связанный и некомплементарный меченый зонд удаляют интенсивным промыванием препарата. Метод FISH является одним из базовых методов в молекулярной диагностике лейкозов. С помощью этого метода можно обнаружить криптические транслокации, что является его преимуществом по сравнению с цитогенетическим методом. Более высокая разрешающая способность позволяет выявлять изменения на субмикроскопическом уровне, например, определять делеции или амплификации участков хромосом, содержащих несколько генов, или даже один ген [Cytogenetic abnormalities detected by fluorescence in situ hybridization on paraffin-embedded chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma lymphoid tissue biopsy specimens./ Flanagan MB, Sathanoori M, Surti U, Soma L, Swerdlow SH.// Am J Clin Pathol. - 2008. - Vol. 130. - P. 620-7.; Soszynska K, Mucha B, Debski R, Skonieczka K, Duszenko E, Koltan A, Wysocki M, Haus O. The application of conventional cytogenetics, FISH, and RT-PCR to detect genetic changes in 70 children with ALL.Ann Hematol. 2008 Dec; 87(12):991-1002]. К недостаткам метода относится невозможность точного определения места слияния генов, необходимость в дорогостоящем оборудовании и расходных материалах, высокие требования к специалистам-исследователям.Using FISH (insitu fluorescence hybridization), it is possible to determine the normal or abnormal localization of a gene, the number of copies, as well as structural rearrangements of the chromosome apparatus of a tumor cell. A probe labeled with biotin or directly with a fluorescent dye is applied to a sample of interphase cells or metaphase plates immobilized on a substrate or in a solid substrate. The nuclear DNA of the immobilized cells and the labeled probe are pre-denatured, then the DNA sequence of the nucleus and the probe is renatured and hybrid duplexes are formed if there is a sequence complementary to the probe in the DNA of the nucleus or chromosomes. An incompletely coupled and incomplete labeled probe is removed by intensive washing of the preparation. The FISH method is one of the basic methods in the molecular diagnosis of leukemia. Using this method, cryptic translocations can be detected, which is its advantage over the cytogenetic method. Higher resolution allows detecting changes at the submicroscopic level, for example, to determine deletions or amplifications of chromosome regions containing several genes, or even one gene [Cytogenetic abnormalities detected by fluorescence in situ hybridization on paraffin-embedded chronic lymphocytic leukemia / small lymphocytic lymphoma lymphoid tissue biopsy specimens./ Flanagan MB, Sathanoori M, Surti U, Soma L, Swerdlow SH.// Am J Clin Pathol. - 2008. - Vol. 130. - P. 620-7 .; Soszynska K, Mucha B, Debski R, Skonieczka K, Duszenko E, Koltan A, Wysocki M, Haus O. The application of conventional cytogenetics, FISH, and RT-PCR to detect genetic changes in 70 children with ALL.Ann Hematol. 2008 Dec; 87 (12): 991-1002]. The disadvantages of the method include the impossibility of accurately determining the site of gene fusion, the need for expensive equipment and consumables, and high requirements for research specialists.
Использование нескольких флуоресцентных меток одновременно позволяет проводить многоцветную гибридизацию и определять широкий спектр хромосомных перестроек в одной клетке. Этот подход получил название спектрального кариотипирования (SKY, spectralcaryotyping) и удобен при анализе пациентов, имеющих сложный кариотип с множественными аберрациями [Betts DR, Stanchescu R, Niggli FK, Cohen N, Rechavi G, Amariglio N, Trakhtenbrot L. SKY reveals a high frequency of unbalanced translocations involving chromosome 6 in t(12;21)-positive acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 2008. 32(1):39-43].The use of several fluorescent labels simultaneously allows multicolor hybridization and a wide range of chromosomal rearrangements in one cell. This approach is called spectral karyotyping (SKY, spectralcaryotyping) and is useful in the analysis of patients with a complex karyotype with multiple aberrations [Betts DR, Stanchescu R, Niggli FK, Cohen N, Rechavi G, Amariglio N, Trakhtenbrot L. SKY reveals a high frequency of unbalanced
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко используется для выявления химерных генов при диагностике острых лейкозов. Сущность метода заключается в многократном избирательном увеличении определенного участка нуклеиновой кислоты. Существует большое количество методов обнаружения химерных генов, основанных на ПЦР. Анализ последовательностей химерных генов можно проводить как на уровне ДНК, так и на уровне РНК.Polymerase chain reaction (PCR) is widely used to identify chimeric genes in the diagnosis of acute leukemia. The essence of the method lies in the multiple selective increase in a specific section of a nucleic acid. There are a large number of methods for detecting chimeric genes based on PCR. Sequence analysis of chimeric genes can be carried out both at the DNA level and at the RNA level.
Для определения уникальных для пациента мест разрывов на уровне геномной ДНК используется длинная инвертированная ПЦР (LDI-PCR). Метод применяется в том случае, когда известен один из генов, вовлеченных в перестройку. Геномную ДНК фрагментируют с помощью рестриктаз, полученные фрагменты сшивают в кольцо и проводят серию ПЦР с различными праймерами, специфичными для разных участков известного гена. Секвенирование полученных ПЦР-продуктов позволяет идентифицировать второй ген-партнер [Meyer С, Schneider В, Reichel М, Angermueller S, Strehl S, Schnittger S, Schoch C, Jansen MW, van Dongen JJ, Pieters R, Haas OA, Dingermann T, Klingebiel T, Marschalek R. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. ProcNatlAcadSciUSA2005; 102(2):449-54]. С одной стороны, этот метод открывает возможности для очень специфичного анализа характерной для данного пациента перестройки. С другой стороны, такой анализ является трудоемким, длительным, требует высококвалифицированного персонала и не подходит для рутинной диагностики.Long inverted PCR (LDI-PCR) is used to identify breakdown sites unique to the patient at the genomic DNA level. The method is used when one of the genes involved in rearrangement is known. Genomic DNA is fragmented using restriction enzymes, the obtained fragments are crosslinked and a series of PCR is carried out with various primers specific for different regions of the known gene. Sequencing the resulting PCR products allows the identification of the second partner gene [Meyer C, Schneider B, Reichel M, Angermueller S, Strehl S, Schnittger S, Schoch C, Jansen MW, van Dongen JJ, Pieters R, Haas OA, Dingermann T, Klingebiel T, Marschalek R. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. ProcNatlAcadSciUSA2005; 102 (2): 449-54]. On the one hand, this method opens up possibilities for a very specific analysis of the restructuring characteristic of a given patient. On the other hand, such an analysis is time-consuming, lengthy, requires highly qualified personnel and is not suitable for routine diagnostics.
Для определения химерных генов широко применяют обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР). Суть метода заключается в выявлении химерной РНК в опухолевых клетках на основе ее перевода с кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. Химерная кДНК далее может быть амплифицирована в стандартной ПЦР реакции со специфическими к данной перестройке праймерами [Detection of minimal residual disease in acute myelomonocytic leukemia with abnormal marrow eosinophils by nested polymerase chain reaction with allele specific amplification./
В диагностике хромосомных перестроек используют ОТ-ПЦР в реальном времени. Суть метода состоит в регистрации классической S-образной кривой накопления амплифицируемого продукта, в случае наличия соответствующей матрицы, содержащей транслокацию. Отсутствие S-образной кривой свидетельствует об отсутствии соответствующей химерной матрицы [Novel real-time polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of recurrent fusion genes in acute myeloid leukemia./ Dolz S,
Различные варианты постановки ПЦР в реальном времени описаны в ряде патентов. Китайский патент CN 102251031 (дата публикации 2013-07-24) основан на применении TaqMan MGB probe для определения ряда химерных генов: AML1-ETO, BCR-ABL190, BCR-ABL210, CBFb-MYH11(A), CBFb-MYH11(D), CBFb-MYH11(E), Е2А-РВХ1, MLL-AF4, PML-RARa (bcr1), PML-RARa(bcr2), PML-RARa(bcr3), SIL-TAL1 and TEL-AML1. В китайском патенте CN 102827937 (дата публикации 2014-03-19) описан метод для определения транслокаций в генах BCR-ABL, AML1-ETO и PML-RARa, а в CN 102925558 (дата публикации 2014-09-17), французском ЕР2204457 (дата публикации 2010-07-07) и корейском KR 1020060000840 (дата публикации 2014-09-17) только гена PML-RARA. Такое большое количество тест-систем, основанных на методе ПЦР в реальном времени, объясняется тем, что данный метод достаточно прост в освоении, часто не требует дополнительных навыков, но для его осуществления требуется приобретение дорогостоящего оборудования.Various real-time PCR setups are described in a number of patents. The Chinese patent CN 102251031 (publication date 2013-07-24) is based on the use of TaqMan MGB probe for determining a number of chimeric genes: AML1-ETO, BCR-ABL190, BCR-ABL210, CBFb-MYH11 (A), CBFb-MYH11 (D) , CBFb-MYH11 (E), E2A-PBX1, MLL-AF4, PML-RARa (bcr1), PML-RARa (bcr2), PML-RARa (bcr3), SIL-TAL1 and TEL-AML1. Chinese patent CN 102827937 (publication date 2014-03-19) describes a method for determining translocations in the BCR-ABL, AML1-ETO and PML-RARa genes, and in CN 102925558 (publication date 2014-09-17), French EP2204457 ( publication date 2010-07-07) and Korean KR 1020060000840 (publication date 2014-09-17) of the PML-RARA gene only. Such a large number of test systems based on real-time PCR is explained by the fact that this method is quite easy to learn, often does not require additional skills, but its implementation requires the purchase of expensive equipment.
В исследованиях природы рака для анализа свойств опухолевых клеток и классификации опухолей широкое применение нашли микрочипы [A diagnostic biochip for the comprehensive analysis of MLL translocations in acute leukemia./ Maroc N, Morel A, Beillard E, De La Chapelle AL, Fund X, Mozziconacci MJ, Dupont M, Cayuela JM, Gabert J, Koki A, Fert V, Hermitte F.//Leukemia.l - 2004. - Vol. 18. - P. 1522-1530; Development of a biochip-based assay integrated in a global strategy for identification of fusion transcripts in acute myeloid leukemia: a work flow for acute myeloid leukemia diagnosis./ Giusiano S1, Formisano-Treziny C, Benziane A, Maroc N, Picard C, Hermitte F, Taranger-Charpin C, Gabert J.// International Journal of Laboratory Hematology. - 2010. - Vol. 32. - P. 398-409.; A pipeline with multiplex reverse transcription polymerase chain reaction and microarray for screening of chromosomal translocations in leukemia./ Xiong FF, Li BS, Zhang CX, Xiong H, Shen SH, Zhang QH.// BioMed Research International. - 2013. - Vol. 2013].Microchips [A diagnostic biochip for the comprehensive analysis of MLL translocations in acute leukemia./ Maroc N, Morel A, Beillard E, De La Chapelle AL, Fund X, Mozziconacci have been widely used in studies of the nature of cancer for analyzing the properties of tumor cells and classifying tumors. MJ, Dupont M, Cayuela JM, Gabert J, Koki A, Fert V, Hermitte F. // Leukemia.l - 2004. - Vol. 18. - P. 1522-1530; Development of a biochip-based assay integrated in a global strategy for identification of fusion transcripts in acute myeloid leukemia: a work flow for acute myeloid leukemia diagnosis./ Giusiano S1, Formisano-Treziny C, Benziane A, Maroc N, Picard C, Hermitte F, Taranger-Charpin C, Gabert J. // International Journal of Laboratory Hematology. - 2010 .-- Vol. 32. - P. 398-409 .; A pipeline with multiplex reverse transcription polymerase chain reaction and microarray for screening of chromosomal translocations in leukemia./ Xiong FF, Li BS, Zhang CX, Xiong H, Shen SH, Zhang QH.// BioMed Research International. - 2013 .-- Vol. 2013].
Опубликовано несколько патентов и патентных заявок, в которых приведены различные технологии гибридизации с биочипами. Например, в американском патенте US 20030198977 (дата публикации 2003-10-23) разработан метод определения хромосомных транслокаций с образованием химерных генов E2A-Pbx1, MLL-AF4, AML1-ЕТО, BCR-ABL (P190), BCR-ABL1 (Р210), TEL-AML1, PML-RARA, CBFB-MYH11, SIL-TAL1 в единой реакционной смеси с использованием микрочипов. В китайском патенте CN 101955991 (дата публикации 2014-05-28) и патентной заявке WO 2011120398 (дата публикации 2011-10-06) ПЦР-продукты химерных генов, связанных с лейкемией, гибридизуют со смесью зондов для обнаружения флуоресцентных сигналов.Several patents and patent applications have been published that list various hybridization technologies with biochips. For example, in US patent US 20030198977 (publication date 2003-10-23), a method for determining chromosomal translocations with the formation of chimeric genes E2A-Pbx1, MLL-AF4, AML1-ETO, BCR-ABL (P190), BCR-ABL1 (P210) is developed , TEL-AML1, PML-RARA, CBFB-MYH11, SIL-TAL1 in a single reaction mixture using microarrays. In Chinese patent CN 101955991 (publication date 2014-05-28) and patent application WO 2011120398 (publication date 2011-10-06), the PCR products of chimeric genes associated with leukemia are hybridized with a mixture of probes for detecting fluorescent signals.
Гелевые биочипы, которые давно и успешно разрабатываются в Лаборатории биологических микрочипов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, являются примером диагностических микрочипов низкой плотности. Метод гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидами включает амплификацию фрагментов ДНК и последующую гибридизацию флуоресцентно меченой ДНК мишени с аллель-специфичными олигонуклеотидами [Т.V. Nasedkina, V.S. Zharinov, Е.A. Isaeva et al., "Clinical Screening of Gene Rearrangements in Childhood Leukemia by Using a Multiplex Polymerase Chain Reaction-Microarray Approach," Clinical Cancer Research, vol. 9, no. 15, pp. 5620-5629, 2003.].Gel biochips, which have been successfully developed for a long time at the Laboratory of Biological Microchips of the Federal State Budgetary Institution of Science, Institute of Molecular Biology V.A. Engelhardt of the Russian Academy of Sciences, are an example of diagnostic microchips of low density. A hybridization method with allele-specific oligonucleotides involves the amplification of DNA fragments and subsequent hybridization of the fluorescently labeled target DNA with allele-specific oligonucleotides [T.V. Nasedkina, V.S. Zharinov, E.A. Isaeva et al., "Clinical Screening of Gene Rearrangements in Childhood Leukemia by Using a Multiplex Polymerase Chain Reaction-Microarray Approach," Clinical Cancer Research, vol. 9, no. 15, pp. 5620-5629, 2003.].
Используя метод ultra high-throughput sequencingChromPET в американском патенте US20120178635 (дата публикации 2012-07-12), выявляли хромосомные аберрации BCR-ABL1. Анализ обладает хорошей чувствительностью и специфичностью, но для его осуществления требуется приобретение дорогостоящего оборудования, расходных материалов и реактивов. В патентной заявке WO 1994026930 (дата публикации 1994-11-24) используют Northern и Southern блот для идентификации AF-9, AF-4, AF-6, AF-17. Данная технология не дешевая, трудоемкая и требует высокой квалификации персонала.Using the ultra high-throughput sequencingChromPET method in US patent US20120178635 (published date 2012-07-12), BCR-ABL1 chromosome aberrations were detected. The analysis has good sensitivity and specificity, but its implementation requires the purchase of expensive equipment, supplies and reagents. In patent application WO 1994026930 (publication date 1994-11-24), Northern and Southern blots are used to identify AF-9, AF-4, AF-6, AF-17. This technology is not cheap, time-consuming and requires highly qualified personnel.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задача настоящего изобретения состоит в создании способа выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток. Сущность изобретения заключается в обеспечении способа выявления хромосомных транслокаций в образцах костного мозга или периферической крови, которые приводят к образованию химерных генов и определяют выбор терапии и прогноз при острых лейкозах. Данный способ позволяет выявлять 22 хромосомные транслокации, которые являются наиболее информативными маркерами, определяющими различные подтипы заболевания, выбор терапии и прогноз у детей с острыми лейкозами.: ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; MLL/AFF1; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1; MLL/MLLT3; CBFB/MYH11; MLL/MLLT10; MLL/MLLT1; SIL/TAL1; MLL/MLLT4; NPM1/ALK; TCF3/HLF; MLL/ELL; MLL/EPS15; PICALM/MLLT10; MLL/MLLT11; DEK/NUP214; RBM15/MKL1; FUS/ERG.An object of the present invention is to provide a method for detecting structural rearrangements of the genome of tumor cells. The essence of the invention is to provide a method for detecting chromosomal translocations in samples of bone marrow or peripheral blood, which lead to the formation of chimeric genes and determine the choice of therapy and prognosis for acute leukemia. This method allows you to identify 22 chromosomal translocations, which are the most informative markers that determine the various subtypes of the disease, the choice of therapy and prognosis in children with acute leukemia .: ETV6 / RUNX1; BCR / ABL1p210; MLL / AFF1; BCR / ABL1p190; PML / RARA; RUNX1 / RUNX1T1; TCF3 / PBX1; MLL / MLLT3; CBFB / MYH11; MLL / MLLT10; MLL / MLLT1; SIL / TAL1; MLL / MLLT4; NPM1 / ALK; TCF3 / HLF; MLL / ELL; MLL / EPS15; PICALM / MLLT10; MLL / MLLT11; DEK / NUP214; RBM15 / MKL1; FUS / ERG.
Основными признаками данного изобретения являются ОТ-ПЦР с последующей ПЦР и гибридизацией на биочипе, содержащем набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.The main features of this invention are RT-PCR followed by PCR and hybridization on a biochip containing a set of immobilized oligonucleotide probes.
Первый важный признак изобретения - смесь специфических праймеров для обратной транскрипции, которая используется для получения кДНК на матрице РНК, выделенной из костного мозга или периферической крови пациента. Последовательность праймеров для обратной транскрипции приведена в табл. 1 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1-25).The first important feature of the invention is a mixture of specific reverse transcription primers, which is used to obtain cDNA on an RNA template isolated from a patient’s bone marrow or peripheral blood. The sequence of primers for reverse transcription is given in table. 1 and the List of sequences (SEQ ID NO: 1-25).
Второй важный признак изобретения - праймеры для специфичной амплификации последовательностей химерных генов, с помощью которых флуоресцентно меченый ПЦР-продукт нарабатывается только при наличии химерного транскрипта в образце. ПЦР осуществляется в 4 отдельных мультиплексных реакциях. Последовательности праймеров для проведения ПЦР приведены в табл. 2 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 26-75).The second important feature of the invention is the primers for the specific amplification of the sequences of chimeric genes, by which a fluorescently labeled PCR product is produced only in the presence of a chimeric transcript in the sample. PCR is carried out in 4 separate multiplex reactions. The sequence of primers for PCR are given in table. 2 and the List of sequences (SEQ ID NO: 26-75).
Третий важный признак изобретения - биочип, содержащий набор иммобилизованных олигонуклеотидных зондов, высоко специфичных и комплементарных участкам химерных генов, в том числе и в местах слияния генов. Последовательности зондов приведены в табл. 3 и Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 76-138). Олигонуклеотидные зонды иммобилизуются в ячейках гидрогелевого микрочипа, как описано в патенте RU 2206575 (дата публикации 2003-06-20) в концентрации 4000 мкМ. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов) приведена на Фиг. 1.The third important feature of the invention is a biochip containing a set of immobilized oligonucleotide probes that are highly specific and complementary to regions of chimeric genes, including at the sites of gene fusion. The probe sequences are shown in table. 3 and the List of sequences (SEQ ID NO: 76-138). Oligonucleotide probes are immobilized in the cells of the hydrogel microchip, as described in patent RU 2206575 (publication date 2003-06-20) at a concentration of 4000 μM. The arrangement of the probes in the cells of the biochip to identify structural rearrangements of the genome of tumor cells (chimeric genes) is shown in FIG. one.
Смеси специфических праймеров для обратной транскрипции, комплементарных 3'-участкам исследуемых химерных генов используются для получения кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов костного мозга или периферической крови. Набор праймеров для ПЦР используется для амплификации интересующих фрагментов с одновременным флуоресцентным мечением продукта. Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидными зондами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которого делается вывод о наличии химерного гена в исследуемом образце. Примеры картин гибридизации приведены на Фиг. 2.Mixtures of specific reverse transcription primers complementary to the 3 ′ regions of the chimeric genes under study are used to produce cDNA on an RNA template isolated from bone marrow or peripheral blood samples. A set of primers for PCR is used to amplify the fragments of interest with simultaneous fluorescence labeling of the product. Next, the hybridization of fluorescently labeled DNA fragments obtained by PCR is carried out with oligonucleotide probes immobilized in gel cells located on a plastic substrate. After hybridization and washing of the biochip, the obtained fluorescence pattern is analyzed, based on which it is concluded that the chimeric gene is present in the test sample. Examples of hybridization patterns are shown in FIG. 2.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг. 1. Схема биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов): (а) схема расположения ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений. В угловых позициях нанесены ячейки (М), содержащие флуоресцентный краситель Су5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.FIG. 1. A biochip diagram for revealing structural rearrangements of the genome of tumor cells (chimeric genes): (a) a cell layout diagram on a biochip; (b) the interpretation of the symbols. Cells (M) are deposited in the angular positions, containing the fluorescent dye Su5, which glows permanently, for orientation and control of the intensity of the glow.
Фиг. 2. Гибридизационные картины, полученные с помощью биочипа для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов). А - образец с транслокацией t(8;21) RUNX1/RUNX1T1; Б - контрольный образец, не несущий транслокацию.FIG. 2. Hybridization patterns obtained using a biochip to identify structural rearrangements of the genome of tumor cells (chimeric genes). A - sample with translocation t (8; 21) RUNX1 / RUNX1T1; B - control sample that does not carry translocation.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Для обеспечения оптимальных условий обратной транскрипции и ПЦР необходимо использовать специфические праймеры, отжиг которых на мишени происходит при одинаковой температуре (для каждого этапа), и они не образуют при этой температуре вторичных структур. Для оптимальной наработки необходимого для гибридизации на биочипе количества флюоресцентно-меченого ПЦР-продукта должны быть подобраны такие параметры как концентрации реагентов, состав мультиплексных реакций, временной и температурный режим обратной транскрипции и ПЦР. В результате проведенной работы подобраны праймеры для ОТ, условия ПЦР, которые позволяют осуществлять эффективную специфическую наработку фрагмента, соответствующего последовательностям химерных генов.To ensure optimal conditions for reverse transcription and PCR, it is necessary to use specific primers, annealing of which on the target occurs at the same temperature (for each stage), and they do not form secondary structures at this temperature. For optimal production of the amount of fluorescently labeled PCR product necessary for hybridization on a biochip, parameters such as reagent concentrations, composition of multiplex reactions, time and temperature regime of reverse transcription, and PCR should be selected. As a result of the work, primers for RT were selected, PCR conditions that allow effective specific production of the fragment corresponding to the sequences of chimeric genes.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе подбираются таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа химерные гены.Oligonucleotides for immobilization on a biochip are selected in such a way as to identify all the chimeric genes selected for analysis.
При дизайне ДНК-зондов руководствовались следующими принципами:The design of DNA probes was guided by the following principles:
1) последовательность зонда выбирали комплементарной «плюс» или «минус» - цепи ДНК, нарабатывающейся в ходе асимметричного этапа ПЦР, в зависимости от того, с какого праймера (прямого или обратного) было целесообразно проводить ассиметричную ПЦР;1) the probe sequence was chosen as complementary “plus” or “minus” - the DNA strand produced during the asymmetric PCR step, depending on which primer (direct or reverse) it was advisable to perform asymmetric PCR;
2) при выборе структур избегали стабильных вторичных структур - шпилек и димеров, т.к. их присутствие снижает эффективность гибридизации;2) when choosing structures, stable secondary structures - studs and dimers, were avoided, because their presence reduces the effectiveness of hybridization;
3) выбранная последовательность не должна быть комплементарной другим областям ПЦР-продукта, кроме целевой, либо другим ПЦР-продуктам, нарабатывающимся в мультиплексной ПЦР.3) the selected sequence should not be complementary to other areas of the PCR product, except the target, or to other PCR products produced in multiplex PCR.
На биочипе для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток (химерных генов) иммобилизовано 63 высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов (табл. 2 и Перечень последовательностей (SEQ ID NO: 76-138)), структура которых обеспечивает специфичное связывание с полностью комплементарными ДНК-мишенями. Зонды подобраны таким образом, что флюоресцентный сигнал наблюдается только в ячейках, с которых образовался совершенный дуплекс между олигонуклеотидным зондом и флюоресцентно-меченым ПЦР-продуктом.63 highly specific oligonucleotide probes (Table 2 and the List of sequences (SEQ ID NO: 76-138)), the structure of which provides specific binding to fully complementary target DNAs, were immobilized on a biochip to identify structural rearrangements of the genome of tumor cells (chimeric genes). The probes are selected in such a way that the fluorescent signal is observed only in cells from which a perfect duplex was formed between the oligonucleotide probe and the fluorescently-labeled PCR product.
Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Обратная транскрипция на матрице РНК для получения кДНК проводится со смесью специфических праймеров с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (Moloney Murine Leukemia Virus) - MMLV различных производителей. Наработка флюоресцентно меченных ПЦР-продуктов для последующей гибридизации на биочипе проводится посредством ПЦР, при этом в качестве матрицы для проведения реакции используется кДНК, полученная на этапе обратной транскрипции.Here is the sequence of analysis using this method. Reverse transcription on an RNA matrix for cDNA is performed with a mixture of specific primers using reverse transcriptase of Moloney Murine Leukemia Virus - MMLV from various manufacturers. The production of fluorescently labeled PCR products for subsequent hybridization on a biochip is carried out by PCR, and the cDNA obtained at the reverse transcription stage is used as a template for the reaction.
ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (Taq-полимераза, Tth-полимераза, Tf1-полимераза, Pfu-полимераза, Vent-полимераза, DeepVent-полимераза и другие коммерчески доступные ферменты, выделенные из термофилов), работающей в соответствующем буфере. Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ), при этом вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров, например QIAGEN Multiplex PCR Kit.PCR can be performed using any type of thermostable polymerase (Taq polymerase, Tth polymerase, Tf1 polymerase, Pfu polymerase, Vent polymerase, DeepVent polymerase and other commercially available enzymes isolated from thermophiles) operating in the appropriate buffer. To build a new chain, a mixture of dNTPs (dATP, dGTF, dTTP, dTTF) is added to the buffer, while dUTP can be used instead of dTTP. For PCR, ready-made commercially available kits containing all the necessary components except primers, for example, QIAGEN Multiplex PCR Kit, can be used.
На этапе ПЦР проходит амплификация ДНК-локусов, соответствующих только химерной кДНК. ПЦР проходит в 2 стадии: на первой амплификация целевых продуктов осуществляется с использованием комбинированных праймеров, состоящих из участка, комплементарного последовательности химерного гена, и короткой универсальной вставки на 5'-конце, на второй стадии в работу вступают универсальные праймеры, последовательности которых соответствует последовательностям универсальных вставок. ПЦР осуществляется в 4 мультиплексных реакциях. В мультиплексе №1 содержатся праймеры для выявления транслокаций MLL/AFF1; MLL/MLLT4; MLL/ELL; MLL/MLLT1; CBFB/MYH11 (SEQ ID NO: 26-35), в мультиплексе №2 - праймеры для контрольного гена ABL1 и праймеры для транслокаций MLL/MLLT10; PICALM/MLLT10; SIL/TAL1; DEK/NUP214; TCF3/HLF (SEQ ID NO: 36-51), в мультиплексе №3 - праймеры для транслокаций ETV6/RUNX1; BCR/ABL1p210; BCR/ABL1p190; PML/RARA; RUNX1/RUNX1T1; TCF3/PBX1 (SEQ ID NO: 52-63), в мультиплексе №4 - праймеры для транслокаций MLL/MLLT3; NPM1/ALK; MLL/EPS15; MLL/MLLT11; RBM15/MKL1; FUS/ERG (SEQ ID NO: 26-28, 64-73). Помимо локус-специфичных праймеров все мультиплексы содержат универсальные праймеры Т3 и Т7 (SEQ ID NO: 74-75) в ассиметричном соотношении (например, 1:50) для преимущественной наработки одноцепочечного продукта. В качестве флуоресцентной метки используется Су5-дУТФ, встраивающийся de novo в синтезируемую ДНК-цепь. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.At the PCR stage, amplification of DNA loci corresponding only to the chimeric cDNA takes place. PCR is carried out in 2 stages: at the first stage, the amplification of the target products is carried out using combined primers consisting of a plot complementary to the chimeric gene sequence and a short universal insert at the 5'-end; at the second stage, universal primers come into operation, the sequences of which correspond to universal sequences inserts. PCR is carried out in 4 multiplex reactions. The multiplex No. 1 contains primers for the detection of MLL / AFF1 translocations; MLL / MLLT4; MLL / ELL; MLL / MLLT1; CBFB / MYH11 (SEQ ID NO: 26-35), in multiplex No. 2, primers for the control gene ABL1 and primers for translations MLL / MLLT10; PICALM / MLLT10; SIL / TAL1; DEK / NUP214; TCF3 / HLF (SEQ ID NO: 36-51), in multiplex No. 3, primers for translations ETV6 / RUNX1; BCR / ABL1p210; BCR / ABL1p190; PML / RARA; RUNX1 / RUNX1T1; TCF3 / PBX1 (SEQ ID NO: 52-63), in multiplex No. 4, primers for MLL / MLLT3 translocations; NPM1 / ALK; MLL / EPS15; MLL / MLLT11; RBM15 / MKL1; FUS / ERG (SEQ ID NO: 26-28, 64-73). In addition to locus-specific primers, all multiplexes contain universal primers T3 and T7 (SEQ ID NO: 74-75) in an asymmetric ratio (for example, 1:50) for the preferential production of a single-chain product. As a fluorescent label, Su5-DUTP is used, which is inserted de novo into the synthesized DNA chain. Any fluorochrome without restriction (for example, FITC, Texas red, Su-3, etc.), as well as biotin, can also be used as a fluorescent label.
Для синтеза праймеров и олигонуклеотидных зондов используют такие химические подходы как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., при этом наиболее распространенным в настоящее время является фосфоамидитный синтез. Синтез праймеров осуществляется на автоматических ДНК/РНК синтезаторах, например производства фирмы «Applied Biosystems» (США). Олигонуклеотидные зонды модифицируются путем добавления к 5'- или 3'-концу активной группы, обеспечивающей иммобилизацию, в астоматическом или постсинтетически в ручном режиме. Например, при синтезе олигонуклеотидных зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США) на 3'-конец олигонуклеотидов вводится спейсер со свободной аминогруппой, используемый для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе.For the synthesis of primers and oligonucleotide probes, chemical approaches such as the phosphodiester method, the hydrophosphoryl method, etc. are used, with phosphoamidite synthesis being the most common at present. The primers are synthesized using automatic DNA / RNA synthesizers, for example, manufactured by Applied Biosystems (USA). Oligonucleotide probes are modified by adding to the 5'- or 3'-end of the active group that provides immobilization, in astomatic or postsynthetically in manual mode. For example, in the synthesis of oligonucleotide probes using the 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research), USA), a free amino group spacer is introduced at the 3'-end of the oligonucleotides, which is used for subsequent immobilization of the oligonucleotide on a biochip.
Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченных фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, которые представляют собой участки, соответствующие последовательностям участков химерных генов.Next, the hybridization of fluorescently labeled DNA fragments obtained during PCR is carried out with oligonucleotides immobilized in the gel cells, which are regions corresponding to sequences of regions of chimeric genes.
Гибридизация ПЦР-продукта с олигонуклеотидными зондами на биочипе может быть проведена в любом гибридизационном буфере, например в гуанидиновом или SSPE-буфере. Перед постановкой гибридизации ПЦР-продукт прогревают при 95°С в течение 5 мин., затем охлаждают на льду в течение 2 минут, после чего наносят гибридизационную смесь на биочип. Гибридизация проводится 8-14 ч. при 37°С. Отмывка биочипа после проведения гибридизации может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или более короткое время в дистиллированной воде [Molecular cloning: a laboratory manual / J.F. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2001].Hybridization of the PCR product with oligonucleotide probes on the biochip can be carried out in any hybridization buffer, for example, in a guanidine or SSPE buffer. Before hybridization, the PCR product is heated at 95 ° C for 5 minutes, then cooled on ice for 2 minutes, after which the hybridization mixture is applied to the biochip. Hybridization is carried out for 8-14 hours at 37 ° C. The washing of the biochip after hybridization can be carried out in any buffer known in the art with the addition of salt (SSC, SSPE, etc.) or for a shorter time in distilled water [Molecular cloning: a laboratory manual / J.F. Sambrook, D.W. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 2001].
ПЦР-продукт, нанесенный в гибридизационную камеру биочипа, в условиях (состав реакции, время и температура), при которых осуществляется гибридизация, образует совершенные дуплексы только с комплементарными ему олигонуклеотидными зондами. Сигнал флюоресценции детектируется только в ячейках, в которых образовался совершенный дуплекс. Таким образом, при наличии в образце химерного гена, происходит его амплификация в ходе ПЦР и специфичная гибридизация с зондами на биочипе.The PCR product deposited in the hybridization chamber of the biochip under the conditions (reaction composition, time and temperature) under which hybridization is carried out forms perfect duplexes only with oligonucleotide probes complementary to it. The fluorescence signal is detected only in cells in which a perfect duplex is formed. Thus, in the presence of a chimeric gene in the sample, it amplifies during PCR and specific hybridization with probes on the biochip.
После проведения гибридизации и отмывки биочипа проводится визуализация результатов гибридизации с помощью любой детектирующей системы, возбуждающей флюоресценцию и распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер, портативный анализатор биочипов и т.п. коммерчески доступные флуоресцентные анализаторы, например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва, Россия).After hybridization and washing of the biochip, the hybridization results are visualized using any detection system that excites fluorescence and recognizes a fluorescence signal (fluorescence microscope with a CCD camera, laser scanner, portable biochip analyzer, etc. commercially available fluorescence analyzers, for example, a portable analyzer biochips equipped with a CCD camera and special software manufactured by BIOCHIP-IMB LLC (Moscow, Russia).
Изготовление биочипов может осуществляться посредством последовательного нанесения на поверхность подложки из стекла ячеек акриламидного геля, активации ячеек и иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов [Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. В качестве подложки кроме стекла может быть использован другой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик (Патент RU 2309959, опубликован 2007-11-10). Биочипы также могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами [Arrays of immobilized oligonucleotides--ontributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol. - 2003. - Vol.4. - P. 379-395].Biochips can be manufactured by sequentially applying acrylamide gel cells to the glass substrate surface, activating the cells and immobilizing the modified oligonucleotides in the cells [Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Hum Mutat. - 2002. - Vol. 19. - P. 343-360. Review]. In addition to glass, another material can be used as a substrate, including metal, flexible membranes and plastic (Patent RU 2309959, published 2007-11-10). Biochips can also be made by any other methods known to the person skilled in the art [Arrays of immobilized oligonucleotides - ontributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // Curr Pharm Biotechnol. - 2003. - Vol. 4. - P. 379-395].
Для изготовления биочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидов SEQ ID NO: 76-138, приведенный в Перечне последовательностей, а также в табл. 2. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биочипе может варьироваться в зависимости от удобства интерпретации результатов.For the manufacture of the biochip in the present invention uses a set of oligonucleotides SEQ ID NO: 76-138, shown in the List of sequences, as well as in table. 2. The location of specific oligonucleotide probes on the biochip may vary depending on the convenience of interpreting the results.
Далее приводятся примеры, которые показывают применение способа выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток, определяющих выбор терапии и прогноз при острых лейкозах у детей. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.The following are examples that show the application of a method for detecting structural rearrangements of the genome of tumor cells that determine the choice of therapy and prognosis for acute leukemia in children. It should be understood that the examples provided are for illustration only and are not intended to limit the scope of the claims expressed in the claims. Based on the present description, a person skilled in the art will be able to easily propose their own variants and modifications of the invention without departing from the general concept of the present invention and without involving their own inventive activity, so it should be understood that such variants and modifications will also be included in the scope of the claims of this inventions.
Пример 1. Амплификация участков химерных генов методом ОТ-ПЦР с целью получения флуоресцентно меченного ПЦР-продукта в количестве, неоходимом для гибридизации на биочипе.Example 1. Amplification of chimeric gene regions by RT-PCR in order to obtain a fluorescently labeled PCR product in an amount necessary for hybridization on a biochip.
Из костного мозга пацента, больного острым лейкозом, выделяли общую РНК с помощью набора RNeasy MiniKit (Qiagen, США).From the bone marrow of a patient with acute leukemia, total RNA was isolated using the RNeasy MiniKit kit (Qiagen, USA).
Проводили обратную транскипцию в объеме 25 мкл. РНК (2 мкг) инкубировали при 70°С в течение 5 мин со смесью специфичных праймеров (по 5 пикомоль каждого праймера на реакцию), затем проводили реакцию с обратной транскриптазой M-MLV («Силекс», Россия) 200 ед. на 25 мкл реакционной смеси, содержащей 25 ед. ингибитора РНКазы («Promega», США), по 1 мМ каждого dNTP («Силекс», Россия), 10 мМ дитиотрейтол, 50 мМТ рис-HCl, рН 8.3, 75 мМ KCl и 3 мМ MgCl2 при 42°С в течение 90 мин с последующей инактивацией при 70°С в течение 10 мин.Conducted reverse transcription in a volume of 25 μl. RNA (2 μg) was incubated at 70 ° C for 5 min with a mixture of specific primers (5 picomoles of each primer per reaction), then the reaction was performed with reverse transcriptase M-MLV (Sileks, Russia) 200 units. 25 μl of the reaction mixture containing 25 units. RNase inhibitor (Promega, USA), 1 mM each dNTP (Sileks, Russia), 10 mM dithiothreitol, 50 mM rice-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl and 3 mM MgCl 2 at 42 ° C for 90 min followed by inactivation at 70 ° C for 10 min.
Наработку ПЦР-продуктов, соответствующих последовательности контрольного гена ABL1 и исследуемых химерных генов проводили методом ПЦР в 4 реакциях. ПЦР проводили на приборе Dyad («Bio-Rad», США). ПЦР-смесь общим объемом 25 мкл включала в себя: 1×ПЦР-буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Тритон Х-100), 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из дНТФ («Силекс», Россия), 1 ед. акт. HotTaq-полимеразы («СибЭнзим», Россия), по 2 пмоль каждого локус-специфичного праймера, праймеры-адаптеры Т3 и Т7 по 1 и 50 пмоль соответственно, 1 мкл кДНК. Амплификацию проводили по следующей схеме: денатурация при 95°С (10 мин); 45 циклов: 94°С (30 с), 62°С (40 с), 72°С (30 с); 40 циклов: 94°С (30 с), 52°С (30 с), 72°С (20 с).The production of PCR products corresponding to the sequence of the control gene ABL1 and the studied chimeric genes was carried out by PCR in 4 reactions. PCR was performed on a Dyad instrument (Bio-Rad, USA). A PCR mixture with a total volume of 25 μl included: 1 × PCR buffer (67 mm Tris-HCl, pH 8.6, 166 mm (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.01% Triton X-100), 1.5 mm MgCl 2 0.2 mM each of dNTF (Sileks, Russia), 1 unit Act. HotTaq polymerases (SibEnzyme, Russia), 2 pmol of each locus-specific primer, T3 and T7 adapter primers of 1 and 50 pmol, respectively, 1 μl of cDNA. Amplification was carried out according to the following scheme: denaturation at 95 ° C (10 min); 45 cycles: 94 ° C (30 s), 62 ° C (40 s), 72 ° C (30 s); 40 cycles: 94 ° C (30 s), 52 ° C (30 s), 72 ° C (20 s).
Пример 2. Олигонуклеотидный биочип для выявления структурных перестроек генома опухолевых клеток.Example 2. Oligonucleotide biochip for detecting structural rearrangements of the tumor cell genome.
Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.Microchip immobilizing oligonucleotides are synthesized on a 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems, USA) using a standard phosphoamidite procedure. The 3'-end of the oligonucleotides contains a free amino group spacer, which is introduced into the oligonucleotide by synthesis using the 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research), USA). The addition of a fluorescent label to the free amino group oligonucleotides is carried out in accordance with the manufacturer's recommendations.
Биочип изготовляют методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее в патентах RU 2309959 (дата публикации 2007-11-10) и RU 2175972 (дата публикации 2001-11-20). Биочип содержит 63 иммобилизованных олигонуклеотидных зонда (SEQ ID NO: 76-138), список которых представлен также в табл.2. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1.The biochip is produced by the copolymerization of an oligonucleotide in an acrylamide gel, as described previously in the patents RU 2309959 (publication date 2007-11-10) and RU 2175972 (publication date 2001-11-20). The biochip contains 63 immobilized oligonucleotide probes (SEQ ID NO: 76-138), a list of which is also presented in Table 2. The cells are applied according to the circuit of FIG. one.
Пример 3. Гибридизация меченного продукта на биочипеExample 3. Hybridization of the labeled product on the biochip
Реакционную смесь, полученную после проведения ПЦР, описанного в Примере 1, используют для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 44 мкл состояла из 6х SSPE («Promega», США), 2М раствора гуанидин-изотиоцианата и амплификата. Гибридизационную смесь денатурировали при 95°С 5 минут, охлаждали во льду 2 минуты, наносили на биочип и оставляли на 12 часов при 37°С. После проведения гибридизации биочип отмывали в 1x SSPE в течение 10 мин при комнатной температуре.The reaction mixture obtained after PCR described in Example 1 is used for hybridization on a biochip. The hybridization mixture with a total volume of 44 μl consisted of 6x SSPE (Promega, USA), 2M solution of guanidine-isothiocyanate and amplification. The hybridization mixture was denatured at 95 ° C for 5 minutes, cooled in ice for 2 minutes, applied to a biochip and left for 12 hours at 37 ° C. After hybridization, the biochip was washed in 1x SSPE for 10 min at room temperature.
Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизацииExample 4. Registration and interpretation of hybridization results
Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «Биочип-ИМБ». Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы Image Ware™ выходит за рамки настоящего изобретения.The hybridization pattern is recorded using a portable biochip analyzer equipped with a CCD camera manufactured by Biochip-IMB LLC. A description of an automatic image analysis algorithm using Image Ware ™ is beyond the scope of the present invention.
Пример картины гибридизации для образца с транслокацией t(8;21) RUNX1/RUNX1T1 приведен на Фиг. 2 (А). Наблюдается свечение ячеек, соответствующих последовательностям химерного гена RUNX1/RUNX1T1 и в ячейках, соответствующих последовательности контрольного гена ABL1. Пример картины гибридизации для контрольного образца без транслокации приведен на Фиг. 2 (Б). Наблюдается свечение ячеек только контрольного гена ABL1.An example of a hybridization pattern for a sample with translocation t (8; 21) RUNX1 / RUNX1T1 is shown in FIG. 2 (A). Luminescence of cells corresponding to the sequences of the chimeric RUNX1 / RUNX1T1 gene and in cells corresponding to the sequence of the control gene ABL1 is observed. An example of a hybridization pattern for a control sample without translocation is shown in FIG. 2 (B). The luminescence of cells of only the control gene ABL1 is observed.
Таблица 1. Последовательности праймеров для обратной транскипции Table 1. The sequence of primers for reverse transcription
Таблица 2. Последовательности праймеров для ПЦР Table 2. The sequence of primers for PCR
Таблица 3. Последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для иммобилизации в ячейках биочипа.Table 3. The sequence of oligonucleotide probes used for immobilization in the cells of the biochip.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147542A RU2639513C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016147542A RU2639513C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2639513C1 true RU2639513C1 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=63857276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016147542A RU2639513C1 (en) | 2016-12-05 | 2016-12-05 | Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639513C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210069431A (en) * | 2019-12-03 | 2021-06-11 | 연세대학교 산학협력단 | Primers for diagnosis of Leukemia, and method for diagnosis of Leukemia using the same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (en) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Method for identifying chromosomal translocations leading to the development of malignant blood diseases (leukoses), due to applying oligonucleotide biological microchip (biochip) |
-
2016
- 2016-12-05 RU RU2016147542A patent/RU2639513C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2286798C2 (en) * | 2004-07-08 | 2006-11-10 | Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук | Method for identifying chromosomal translocations leading to the development of malignant blood diseases (leukoses), due to applying oligonucleotide biological microchip (biochip) |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MITYAEVA O. N.Analysis of chromosome translocations involving MML by hybridization with an oligonucleotide microarray. Molecular Biology, 2004, Т. 38(3), с. 376-382. * |
| NASEDKINA Т. Diagnostics of Molecular Markers in Childhood Acute Leukaemia Using Biochips. INTECH Open Access Publisher.2011. * |
| NASEDKINA Т. et al. Jdentification of chromosomal translocation in leikemia by hybridization with oligonucleotide microarrays, Hematologica, 2002, v.87, pp.363-372. * |
| NASEDKINA Т. et al. Jdentification of chromosomal translocation in leikemia by hybridization with oligonucleotide microarrays, Hematologica, 2002, v.87, pp.363-372. NASEDKINA Т. Diagnostics of Molecular Markers in Childhood Acute Leukaemia Using Biochips. INTECH Open Access Publisher.2011. MITYAEVA O. N.Analysis of chromosome translocations involving MML by hybridization with an oligonucleotide microarray. Molecular Biology, 2004, Т. 38(3), с. 376-382. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210069431A (en) * | 2019-12-03 | 2021-06-11 | 연세대학교 산학협력단 | Primers for diagnosis of Leukemia, and method for diagnosis of Leukemia using the same |
| KR102280463B1 (en) * | 2019-12-03 | 2021-07-22 | 연세대학교 산학협력단 | Primers for diagnosis of Leukemia, and method for diagnosis of Leukemia using the same |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102292635B (en) | Selective processing of biological material on a microarray substrate | |
| EP3283641B1 (en) | Spatial mapping of molecular profiles of biological tissue samples | |
| US6500620B2 (en) | Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support | |
| CN108796058B (en) | Methods and products for local or spatial detection of nucleic acids in tissue samples | |
| JP6020164B2 (en) | Nucleic acid detection method | |
| JP2005502365A (en) | Genetic analysis of biological samples in an array of nucleic acids of expanded biological samples arranged in an array | |
| JP2007525998A (en) | Detection of STRP such as fragile X syndrome | |
| JP2024156848A (en) | Arrays and methods for detecting spatial information in nucleic acids - Patents.com | |
| CN102639714A (en) | Detection method of target nucleic acid | |
| CN105431738A (en) | Method for Establishing the Prognosis Prediction Model of Gastric Cancer | |
| JP2023547498A (en) | Generic cartridges and methods for multiplexed nucleic acid detection | |
| RU2639513C1 (en) | Method for detection of structural rearrangements of tumor cells (chemeric genes) genome, determining selection of therapy and prediction in acute leukosis in children, using ot-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| US20070254284A1 (en) | A nucleic acid detection method | |
| RU2609641C1 (en) | Method of analysis of somatic mutations in the bcr/abl chimeric gene using rt-pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| RU2549682C1 (en) | Method for analysis of somatic mutations in pi3k gene using lna-blocking multiplex pcr and subsequent hybridisation with oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| RU2539733C2 (en) | Set of differentiating nucleotides and biochip applicable in method for genetic typing of human y-chromosomes haplogroup markers: m130 (c), m145 (de) | |
| RU2674687C1 (en) | Method for analysis of somatic mutations in gnaq and gna11 genes using lna-blocking multiplex pcr and subsequent hybridization with oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| RU2286798C2 (en) | Method for identifying chromosomal translocations leading to the development of malignant blood diseases (leukoses), due to applying oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| WO2008088236A1 (en) | Method for genetically identifying a person according to the analysis of the single nucleotide polymorphism of a human genom by means of a oligonucleotide biological microchip (biochip) | |
| KR20220135719A (en) | Method and apparatus for spatial sequencing analysis using nucleic acids maintaining two-dimensional spatial information | |
| EP1207209A2 (en) | Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms | |
| EP2039780A1 (en) | Single-readout multiplexing of metagenes | |
| Dauphinot | An Introduction to Molecular Biology | |
| Han | SINGLE-CELL SEQUENCING | |
| De Preter et al. | P19: LDASS: a novel PCR-based amplification and labelling method for detection of genomic copy number changes using minute amounts of DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181114 Effective date: 20181114 |