RU2637371C2 - Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот - Google Patents
Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот Download PDFInfo
- Publication number
- RU2637371C2 RU2637371C2 RU2015149228A RU2015149228A RU2637371C2 RU 2637371 C2 RU2637371 C2 RU 2637371C2 RU 2015149228 A RU2015149228 A RU 2015149228A RU 2015149228 A RU2015149228 A RU 2015149228A RU 2637371 C2 RU2637371 C2 RU 2637371C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- histone
- cells
- fatty acid
- acid ester
- iodide
- Prior art date
Links
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 12
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 title description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 11
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 title description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 42
- -1 choline fatty acid ester Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 17
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108050005231 Histone H2A Proteins 0.000 claims description 36
- 102000017286 Histone H2A Human genes 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- NJSSWIYQGNCVTH-SNPVRQPZSA-N arachidonoylcholine Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C NJSSWIYQGNCVTH-SNPVRQPZSA-N 0.000 claims description 16
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- PVXGXBXEHLTWOE-SEYXRHQNSA-N oleoylcholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C PVXGXBXEHLTWOE-SEYXRHQNSA-N 0.000 claims description 4
- NWSQPBFJBOJAMX-UHFFFAOYSA-M 2-hexadecanoyloxyethyl(trimethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C NWSQPBFJBOJAMX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- DJUMTFDYYIXFOJ-BOSULEHESA-M [I-].C(CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC)(=O)OCC[N+](C)(C)C Chemical compound [I-].C(CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC)(=O)OCC[N+](C)(C)C DJUMTFDYYIXFOJ-BOSULEHESA-M 0.000 claims description 2
- ZCPNUVKSRUXQOL-UHFFFAOYSA-M trimethyl(2-octadecanoyloxyethyl)azanium;iodide Chemical compound [I-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C ZCPNUVKSRUXQOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- GVBOIWTXZCLZKP-WMPRHZDHSA-N 2-[(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-icosa-5,8,11,14,17-pentaenoyl]oxyethyl-trimethylazanium Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C GVBOIWTXZCLZKP-WMPRHZDHSA-N 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 28
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 73
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 22
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SGFBLYBOTWZDDE-UHFFFAOYSA-N Choline stearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C SGFBLYBOTWZDDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 3
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- ODYPFMHOOQOHEF-UHFFFAOYSA-N hexadecanoylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC[N+](C)(C)C ODYPFMHOOQOHEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- UOXBRDIJWSJUBX-SNPVRQPZSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z)-2-(dimethylamino)-2-hydroxydocosa-7,10,13,16-tetraen-3-one Chemical compound C(CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC)(=O)C(C)(O)N(C)C UOXBRDIJWSJUBX-SNPVRQPZSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SDBRXCGIZQXIEC-UHFFFAOYSA-N 2-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoyloxyethyl(trimethyl)azanium Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(=O)OCC[N+](C)(C)C SDBRXCGIZQXIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000003718 Dual-Luciferase Reporter Assay System Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000622060 Photinus pyralis Luciferin 4-monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000010936 aqueous wash Methods 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960002887 deanol Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, конкретно к способу внутриклеточной доставки активных веществ, и может быть использовано в медицине. Доставку генетического материала в эукариотические клетки осуществляют при помощи связывания в комплекс плазмидной ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А или Н2А-ТАТ в присутствии биодеградируемого липида, представленного холиновым эфиром жирной кислоты. В сравнении с невирусными аналогами изобретение позволяет с большей эффективностью доставлять генетический материал в представляющие интерес клетки эукариот. 11 з.п. ф-лы, 6 ил., 10 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой средство для доставки нуклеиновых кислот или их производных в клетки эукариот, в частности, для доставки геннотерапевтических препаратов для медицинских целей.
Предшествующий уровень техники
Одной из основных проблем при использовании геннотерапевтических препаратов в медицине остается доставка таких препаратов в клетки целевых органов. Используемые в практике и эксперименте способы доставки генетического материала можно разделить на вирусные и невирусные. В настоящее время в более чем в 70% случаев испытания геннотерапевтических препаратов проводят с использованием вирусных способов доставки. Достоинством вирусных систем является их высокая эффективность. Недостатками - иммуногенность и, в ряде случаев (аденоассоциированные вирусы), малая емкость для введения генетической информации. Высокая опасность встраивания вирусных векторов в геном клеток может приводить к возникновению рака и различных мутаций. Кроме того, выращивание вирусов довольно трудоемко и весьма дорого (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60. Mah et al. 2002. Clin Pharmacokinet, 2002, 41: 901-911. Giacca and Zacchigna. J Control Release, 2012, 161: 377-388. Balicki and Beutler. Medicine (Baltimore), 2002, 81: 69-86. Kovesdi et al. Curr Opin Biotechnol, 1997, 8: 583-589). Невирусные методы доставки генов имеют ряд преимуществ. Токсичность, патогенность или иммуногенность невирусных векторов ниже в сравнении с вирусными векторами. Использование невирусных методов характеризуется меньшей стоимостью, препараты на их основе проще изготовить и/или модифицировать определенным образом для достижения высокой специфичности. Главный недостаток невирусных способов доставки - меньшая эффективность трансфекции (Medina-Kauwe et al. Gene Ther, 2005, 12: 1734-1751). Поэтому основная цель, которая стоит перед разработчиками невирусных методов - сохранив перечисленные достоинства, приблизиться по эффективности к вирусным методам доставки.
Для эффективной невирусной доставки вектор должен обладать способностью конденсировать ДНК в более компактное состояние, обеспечивать эффективное прохождение через клеточные и ядерные мембраны, защищать транспортируемые нуклеиновые кислоты от действия нуклеаз и при этом не ингибировать транскрипцию ДНК. В качестве нуклеиновых кислот могут использоваться плазмиды. В отличие от рекомбинантных вирусов, плазмиды довольно просто конструировать и нарабатывать в больших количествах (Williams and Kingston. Cardiovasc Res, 2011, 91: 565-576). Существует две большие группы соединений, способных образовывать стабильные комплексы с нуклеиновыми кислотами - катионные липиды и катионные полимеры. Комплексы в обоих случаях образуются за счет электростатических взаимодействий между отрицательно заряженной ДНК и положительно заряженным носителем, в результате получаются компактные частицы, которые могут поглощаться клеткой, чаще всего путем эндоцитоза (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202. Wang et al. Сurr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). Использование катионных полимеров или липидов сопряжено с меньшей опасностью для организма и слабой иммуногенностью, комплексы на их основе проще и дешевле изготовить. Одним из основных недостатков этой группы веществ является то, что эффективные системы, как правило, высокотоксичны, а при снижении токсичности снижается и эффективность. Чем выше молекулярная масса полимера, тем компактнее комплекс и эффективнее трансфекция клеток, но при этом ниже биоразлагаемость, а следовательно, тем больше токсичность (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60; Jin et al. Theranostics, 2014, 4: 240-255). В ряде случаев совместное использование катионных липидов и полимеров позволяет уменьшить размер всего комплекса и увеличить поглощение препарата клеткой (Wang et al. Curr Pharm Biotechnol, 2013, 14: 46-60). Для доставки нуклеиновых кислот в клетку могут использоваться некоторые природные полимеры или их фрагменты, в частности белки и пептиды. Достоинствами природных полимеров является их биосовместимость и биоразлагаемость, низкая токсичность и иммуногенность, возможность химических модификаций по аминным и гидроксильным группам, также невысока стоимость получения таких соединений. В последние годы все больше внимания уделяется использованию для доставки ДНК в клетки природных заряженных белков и пептидов, в частности, так называемых, пептидов, проникающих в клетки (Cell-penetrating peptides - СРР). Полагают, что СРР проникают в клетки и в ядра энергонезависимым путем без участия поверхностных клеточных рецепторов (Wagstaff and Jans. Curr Med Chem, 2006, 13: 1371-1387; Gupta et al. Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57: 637-651; Morris et al. Curr Opin Biotechnol, 2000, 11: 461-466; Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Эти пептиды/белки при образовании комплекса с ДНК обеспечивают прямую трансдукцию в ядра клеток. Было показано, что СРР не обладают выраженными антигенными свойствами и их использование может значительно повысить эффективность доставки невирусных векторов (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-74717; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Процесс проникновения белков через клеточные мембраны обеспечивается специальными белок-трансдуцирующие домены (БТД) размером 10-30 остатков, обогащенными основными аминокислотами. СРР может связываться с доставляемой молекулой ковалентно или нековалетно - за счет электростатических взаимодействий (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). Нековалентное связывание является более выгодным так как такую конструкцию намного легче синтезировать и она более универсальна для доставки в клетки разных типов нуклеиновых кислот (Alhakamy et al. Ther Deliv, 2013, 4: 741-757). СРР при использовании их для доставки нуклеиновых кислот характеризуются высокой эффективностью трансфекции, невысокими токсичностью и иммуногенностью (Vasconcelos et al. Ther Deliv, 2013, 4: 573-591). Особое место в группе БТД белков занимают гистоны, роль которых в клетке заключается в связывании и компактизации ДНК. Гистоны представляют собой основные белки небольшого размера, представленные в ядрах эукариотических клеток в виде комплекса с геномной ДНК, которая благодаря гистонам упаковывается в специальные структурные образования - нуклеосомы. В состав нуклеосомы стандартно входят 4 гистона Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Нуклеосомы соединены между собой линкерной ДНК, с которой связан линкерный гистон H1. Было показано, что все четыре коровых гистона (Н2А, Н2В, Н3 и Н4), имеющие в своей структуре сигналы ядерной локализации, способны к прямой клеточной трансдукции и могут быть использованы как векторы для эффективной доставки ДНК в ядра клеток (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. FASEB J, 2008, 22: 2232-2242). Хотя гистон H1 не содержит сайта ядерной локализации, предполагается, что за его транспорт в ядро ответственна последовательность из нескольких положительно заряженных аминокислот. В исследованных случаях использование гистонов для доставки ДНК в клетки было эффективнее, чем у ряда других известных невирусных систем (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-7471; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). По имеющимся данным, наилучшей эффективностью в доставке плазмидной ДНК и обеспечении синтеза кодируемого ею продукта обладают гистоны Н2А и Н2В (Wagstaff and Jans. Biochem J, 2007, 406: 185-202; Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731; Kaouass et al. J Control Release, 2006, 113: 245-254). В большинстве работ для доставки ДНК в ядра используют гистоны, выделенные из тимуса теленка или других доступных тканей животных (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2000, 97: 11500-11504). Одним из путей развития данного направления является создание рекомбинантных гистонов, содержащих модификации, улучшающие их векторные свойства. Описано получение рекомбинантных гистонов Н2А и Н2В, каждый из которых представляет химерную молекулу гистона с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и дополнительными сайтами ядерной локализации (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). В работах данной группы показано, что такие белки способны проникать в клетки и переносить в клетки плазмидную ДНК, также показано, что сигнал ядерной локализации, присутствующий в структуре гистонов, слабее некоторых вирусных сигналов ядерной локализации (Wagstaff et al. Mol Ther, 2007, 15: 721-731). Механизм переноса генетического материала в клетки с помощью гистонов и СРР до конца не изучен. Было показано, что гистон Н2А содержит в своем составе сигнал ядерной локализации (NLS), что обеспечивает его трафик из цитоплазмы в ядро, кроме того, он обладает достаточно низкой иммуногенностью (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-7471). Определено, что N-концевая последовательность гистона Н2А, соответствующая первым 37 аминокислотным остаткам, способна конденсировать ДНК и обеспечивать трансфекцию клеток млекопитающих (Balicki et al. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99: 7467-71). Описано использование различных фрагментов гистона Н2А, полученного из тимуса теленка или синтезированных, для трансфекции клеток in vivo и in vitro для антираковой генной терапии (Pat. US 20040102606 A1). Было предложено для трансфекции клеток использовать гистоны Н3 и Н4 и их производные, выделенных из разных тканей животных, из культур клеток, а также рекомбинантных белки (Pat. WO 1999019502 A1). Гистоны, полученные разными способами, демонстрируют сходные результаты при трансфекции клеток. В патенте WO 2000015825 A1 в качестве трансфицирующего агента использовали выделенный из тканей суммарный гистон (смесь гистонов H1, Н2, Н3, Н4) или только гистон Н4. В патенте US 6180784 В1 описывается использование как выделенного из тканей, так и рекомбинантного гистона H1 для трансфекции клеток. В этом же патенте использовались и полученные из тканей гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Кроме того, показано, что добавление гистонов, преимущественно H1, к известным липидам, используемым для липофекции, значительно повышает уровень трансфекции нуклеиновых кислот.
В настоящее время системы доставки с использованием гистонов в качестве векторов только начинают разрабатываться. Одним из путей развития данного направления является создание рекомбинантных гистонов, содержащих модификации, улучшающие их векторные свойства. Большим преимуществом гистонов перед другими системами доставки генов является их низкая токсичность. Получение и использование рекомбинантных гистонов, в отличие от выделенных из тканей животных, позволяет стандартизовать процесс получения таких белков, а также дает широкие возможности для получения различных модифицированных форм гистонов. В частности, получение химерных белков, представляющих собой гистон и фрагмент другого СРР-пептида - ТАТ-белка. Пептид ТАТ, представляющий фрагмент регуляторного белка вируса иммунодифицита ВИЧ-1, исследован лучше других из негистоновых СРР (Green et al., Cell, 1988, 55: 1179-1188; Torchilin. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60: 548-558; Sawant and Torchilin, 2010, 6: 628-640). Фрагмент ТАТ-пептида, состоящий из 10-15 аминокислотных остатков, в настоящее время используется при создании комплексов ДНК с поликатионами (полиплексов) и вводят в состав липидных векторов (Kleemann et al. J Control. Release 2005, 109: 299-316). Показано, что введение TAT-пептида в состав полиплекса значительно увеличивает эффективность трансфекции (Morris et al. Nat Biotechnology 2001, 19: 1173-1176).
Как указано выше, использования катионных липидов совместно с ССР позволяет повысить стабильность образуемого комплекса, а также увеличивает эффективность трансфекций в случае невирусных конструкций. Например, комбинация катионного липосомального реагента DOSPER и гистона H1 повышает эффективность трансфекции кардиомиоцитов (Kott et al. Somatic Cell and Molecular Genetics, 1998, 24: 257-261). Однако подобные липосомальные реагенты являются чужеродными для организма и обычно высокотоксичны.
Приведенные данные указывают на определенные недостатки использования существующих соединений для трансфекции клеток. Требуется разработка новых более безопасных препаратов, сочетающих эффективные ДНК-связывающие свойства природных пистонов и стабилизирующих свойств биодеградируемых природных липидов.
Краткое изложение сущности изобретения
Данное изобретение решает задачу расширения номенклатуры конструкций для доставки терапевтически значимых нуклеиновых кислот в клетки эукариот. Поставленная задача решается путем получения рекомбинантного гистона Н2А и химерного гистона Н2А-ТАТ, представляющего собой слитно экспрессирующийся белок, содержащий гистон Н2А и ТАТ-пептид, и холинового эфира жирной кислоты для их конденсирования с ДНК с последующей доставкой образовавшихся комплексов в клетки эукариот. Это достигается путем конструирования экспрессионных плазмидных векторов, содержащих последовательности генов Н2А и Н2А-ТАТ человека, полученные с набором специфических праймеров, трансформации этими плазмидами клеток E.coli, экспрессии кодируемых белков, наработки рекомбинантных белков и их очистки. Липидный компонент представляет собой холиновый эфир жирной кислоты с длиной углеродной цепи от 16 до 22 атомов и включающих от 0 до 6 двойных связей. После совместной инкубации ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А или химерным белком Н2А-ТАТ, а также с рекомбинантным гистоном Н2А или химерным белком Н2А-ТАТ в присутствии липида проводится трансфекция эукариотических клеток.
Технический результат изобретения
Техническим результатом, обеспечиваемым настоящим изобретением, является эффективная доставка ДНК в клетки эукариот с помощью биодеградируемых рекомбинантных белков и липидов. В соответствии с изобретением в эукариотические клетки с помощью рекомбинантного гистона Н2А и химерного белка Н2А-ТАТ или в присутствии этих белков при добавлении холинового эфира жирной кислоты попадает ДНК и наблюдается синтез белков, гены которых входят в состав доставляемой ДНК.
Список нуклеотидных и аминокислотных последовательностей
1. Набор праймеров, используемых для клонирования гистона Н2А (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2); химерного белка Н2А-ТАТ (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4).
2. Аминокислотные последовательности белков гистонов Н2А - SEQ ID NO: 5 и H2A-TAT - SEQ ID NO: 6.
Изобретение иллюстрируют следующие фигуры
Фиг. 1. Схематическое изображение экспрессионных конструкций. CDS - фрагменты, соответствующие генам, кодирующим белки гистона Н2А или Н2А-ТАТ.
Фиг. 2. Формулы холиновых эфиров жирных кислот.
Фиг. 3. Активность люциферазы после трансфекции клеток линии НТ1080 плазмидой pCMV-Luc с рекомбинантными гистонами Н2А и Н2А-ТАТ.
По оси ординат приведены значения люминесценции в условных единицах. По оси абсцисс обозначены весовые соотношения плазмиды и конденсирующего белка, используемого для образования комплекса при трансфекции. Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью белка гистона Н2А, Н2А-ТАТ – клетки, трансфицированные с помощью химерного белка Н2А-ТАТ. Плазмида - трансфекция с помощью «голой» плазмиды.
Фиг. 4. Активность люциферазы после трансфекции клеток линии HT1080 плазмидой pCMV-Luc с рекомбинантным гистоном Н2А в присутствии арахидоноилхолина (АХ). По оси ординат приведены значения люминесценции в условных единицах. По оси абсцисс обозначены весовые соотношения плазмиды и конденсирующего белка, используемого для образования комплекса при трансфекции. Гис Н2А – клетки, трансфицированные только с помощью белка гистона Н2А, Гис Н2А+АХ – клетки, трансфицированные с помощью белка гистона Н2А и араходоноилхолина. Пл+АХ – клетки, трансфицированные только с помощью араходоноилхолина.
Фиг. 5. Результаты теста на цитотоксичность HSVtk в присутствии ганцикловира. Плазмида CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3. Клетки линии НТ1080, трансфекция с помощью гистона Н2А. По оси ординат приведен процент выживших клеток. По оси абсцисс обозначены концентрации ганцикловира (GCV). HSVtk - тимидинкиназа вируса простого герпеса (Herpes Simplex Virus timidine kinase). Н/тр - нетрансфицированные контрольные клетки. LFA – клетки, трансфицированные с помощью Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А.
Фиг. 6. Результаты теста на цитотоксичность FCU1 в присутствии 5-FC. Плазмида CMV -FCY11-FUR1-pGL3. Клетки линии HT1080, трансфекция с помощью гистона Н2А и липида. По оси ординат приведен процент выживших клеток. По оси абсцисс обозначены концентрации 5-фторцитозина в мкМ (5-FC). FCUI - цитозин дезаминаза. Н/тр - нетрансфицированные контрольные клетки. LFA – клетки, трансфицированные с помощью Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Гис Н2А – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А. Гис Н2А+АХ – клетки, трансфицированные с помощью гистона Н2А в присутствии араходоноилхолина (АХ).
Изобретение иллюстрируют, но не исчерпывают примеры.
Пример 1. Создание конструкции, содержащей фрагмент гистона Н2А человека
Фрагмент кДНК получен ПЦР-амплификацией с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, несущих последовательности, комплиментарные сайтам рестрикции NdeI и HindIII - H2Afor (SEQ ID NO: 1; GTTAGCATATGTCGGGACGTGGCAAGC) и H2Arev (SEQ ID NO: 2; ACTAAGCTTC TACTTGCCCTTGG CCTTGT). В качестве матрицы используют кДНК из лимфоцитов человека. Фрагмент длиной 393 п.о. очищают методом электрофореза в агарозном геле и клонируют в экспрессионную плазмиду рЕТ-30а(+) (Novagen, США, il.biochem.uhttp:// siowa.edu/vectors/pET/pET-30a_map.pdf), гидролизованную эндонуклеазами NdeI и HindIII. Полученную конструкцию Н2А-рЕТ секвенируют для исключения ошибок работы Taq-полимеразы (ЗАО «Евроген», Россия). Полученная конструкция на основе вектора рЕТ-30а(+) несет фрагмент гена гистона Н2А человека (Н2А) под контролем раннего промотора фага Т7. Участок 5'-концевой части плазмиды, кодирующий синтез гексагистидинового пептида, тромбина и энтерокиназы удаляют при клонировании (Фиг. 1).
Пример 2. Создание конструкции, содержащей фрагмент гистона Н2А человека и фрагмент регуляторного белка ТАТ вируса иммунодифицита ВИЧ-1
Фрагмент гистона Н2А амплифицируют с помощью набора праймеров, несущих последовательности, комплиментарные сайтам рестрикции NdeI и HindIII - SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, один праймер комплиментарен последовательности гистона и обратный праймер комплиментарен последовательности ТАТ-фрагмента и 3'-области гистона Н2А - TATfor (SEQ ID NO: 3; TATACATATGTCGGGACGTGGCAAG) и TATrev - (SEQ ID NO: 4; ACTAAGCTTCTAACGGCGACGCTGGCGACGTTTCTTACGACCGTACTTGCCCTTGGCCTTGTGG). В качестве матрицы используют конструкцию, описанную в примере 1. Фрагмент длиной 435 п.о. очищают методом электрофореза в агарозном геле и клонируют в экспрессионную плазмиду рЕТ-30а(+). Определение нуклеотидной последовательности подтверждает структуру химерного гена Н2А-ТАТ.
Пример 3. Культивирование клеток и очистка рекомбинантного гистона Н2А
Плазмидой Н2А-рЕТ трансформируют клетки штамма E.coli BL21(DE3) (Novagen, США). Выросшие на селективной агаризованной среде LB с канамицином (30 мг/мл) колонии переносят в жидкую питательную среду LB с канамицином и культивируют при 37°С до оптической плотности OD600-0,3-0,5. Затем к культуре добавляют индуктор экспрессии изопропил-β,D-галактотиопиранозид (IPTG) до концентрации 1 мМ и культивируют бактерии при 37°С в течение 3 часов. После этого клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в лизирующем буфере (50 мМ трис HCl, рН 9,0, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF) и разрушают при помощи ультразвукового дезинтегратора (Labsonic Ρ, Sartorius, США, цикл 0,5 сек, амплитуда - 50%) в течение 20 мин при 4°С. Лизат центрифугируют 12 минут при 12000 g. Полученный после разрушения клеток супернатант разбавляют в 2 раза водой, доводят значение рН до 9,0 и фильтруют через фильтры с размером пор 0,45 мкм (HAWP04700, Millipore, США). Для очистки рекомбинантного гистона Н2А используют хроматографию на колонке ХK 16/20 (GE Healthcare, США) с 25 мл катионнообменного сорбента SP Sepharose HP (GE Healthcare, США). Элюцию очищенного белка проводят буфером 50 мМ трис HCl, рН 9,0, 5 мМ ЭДТА, содержащим 500 мМ NaCl. На следующей стадии очистку белка осуществляют с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Диасорб-130-С16Т 7 мкм, 16×250 мм (БиоХимМак, Россия). К 70 мл белкового раствора, полученного после ионообменной хроматографии, добавляют 7 мл ацетонитрила и 80 мкл 100% TFA и наносят на колонку. Хроматографию осуществляют в градиенте 80% ацетонитрила (от 10 до 60%) в 0.1% TFA. Фракции, содержащие целевой белок с чистотой более 99%, объединяют и лиофильно высушивают на центробежном концентраторе CentriVap Acid-Resistant System (Labconco Corp, США). Очищенный рекомбинантный гистон анализируют с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Prosphere С-18 300 Α 5μ, 150×4.6 мм в градиенте 80% ацетонитрила (8-64%), 0.1% ТФУ при скорости потока 0.75 мл/мин с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1200 с времяпролетным масс-спектрометрическим детектором ESI-TOF (LS/MS) Agilent 6224. Для рекомбинантного гистона Н2А была определена молекулярная масса 13976,5 Да. Аминокислотная последовательность полученного белка - SEQ ID NO: 5. Чистоту препарата определяют методом денатурирующего электрофореза в 15% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси G250.
Пример 4. Культивирование клеток и очистка химерного белка Н2А-ТАТ
Культивирование клеток, трансформированных плазмидой Н2А-ТАТ-рЕТ, синтез химерного белка Н2А-ТАТ, очистку и анализ полученного продукта проводят так же, как в примере 3. Аминокислотная последовательность белка Н2А-ТАТ - SEQ ID NO: 6).
Пример 5. Синтезы липидов
Синтез арахидоноилхолин иодида
Синтез арахидоноилдиметиламиноэтанола (AA-DMAE) проводят следующим образом.
К раствору арахидоновой кислоты (80.4 мг, 0.26 ммоль) в 1.5 мл перегнанного над Р2О5 хлороформа, прибавляют 45 мкл диизопропилкарбодиимида (0.28 ммоль), 32 мг диметиламинопиридина (0.28 ммоль) и 29 мкл диметиламиноэтанола (0.28 ммоль). Колбу с реакционной смесью перемешивают при 0°С 3 часа и затем оставляют на 17 часов под аргоном. Кристаллический осадок отфильтровывают. Органический слой упаривают на роторном испарителе, остаток растворяют в этилацетате и проводят экстракцию, добавляя 3 мл NaHSO4, в первую водную промывку. Далее проводят хроматографическую очистку целевого продукта, используя систему В. Собрали 57.9 мг (50% от теор.) AA-DMAE. Rf=0.34 (бензол : этил ацетат, 6:1).
1Н-ЯМР (CDCl3; м.д., J, Гц) 0.87 (3Н, т, J6.8, Н20), 1.28 (4Н, м, Н18; Н19), 1.33 (2Н, м, Н17), 1.66 (2Н, квинт, J7.5, Н3), 2.01 (2Н, дт, J 6.4; 7.6, Н16), 2.08 (2Н, дт, J 6.5; 6.8, Н4), 2.21 (2Н, с, Н3`), 2.26 (2Н, т, J7.6; Н2), 2.48 (2Н, т, J6.2; H2`), 2.75 (6Н, м, Н7, Н10, Н13), 4.09 (2Н, т, J6; Н1`), 5.29 (8Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н14, Н15).
Масс-спектр: C24H41NO2 [М]+ 375.3137 (вычислено), 376.3299 [М+Н]+
Синтез арахидоноилхолина
К раствору 46 мг (0.12 ммоль) AA-DMAE в 500 мкл ацетона, перегнанного над Р2О5, прибавляют избыток метил иодида (30 мкл) (по 3 экв. на каждую группу) и оставляют на 40 мин под аргоном, затем упаривают на роторном испарителе и высушивают в вакууме масляного насоса. Собрали 54.4 мг (94% от теор.) арахидоноилхолина. Rf=0.28 (хлороформ: метанол, 5:1).
1Н-ЯМР (CDCl3; м.д., J, Гц) 0.84 (3Н, т, J6.7, Н20), 1.25 (4Н, м, H18; H19), 1.31 (2Н, м, H17), 1.66 (2Н, квинт, J7.5, Н3), 2.01 (2Н, дт, J7.0;7.8, Н16), 2.07 (2Н, дт, J68;7.6, Н4), 2.36 (2Н, т, J7.6; Н2), 2.76 (6Н, м, Н7, Н10, Н13), 3.51 (2Н, с, Н3`), 4.07 (2Н, т, м, Н2`), 4.55 (2Н, т., Н1`), 5.32 (8Н, м, Н5, Н6, Н8, Н9, H11, Н12, Н14, Н15).
Замену иодида на хлорид или бромид осуществляют стандартным ионным обменом с избытком желаемого иона с использованием растворов хлорида или бромида натрия.
Синтез докозагексаноилхолин иодида
Синтез докозагексаеноилхолина (DHA-CLH) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 50 мг (0.15 ммоль) докозагексаеновой кислоты.
Выход DHA-DMAE составляет 30 мг (49.3%).
Масс-спектр: C26H41NO2 [М]+ 399.314 (вычислено), 400.329 [М+Н]+ (измерено)
Выход DHA-CLN 25.3 мг (62.2%).
Синтез олеоилхолин иодида
Синтез олеоилхолина (Ol-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 127 мг (0.45 ммоль) олеиновой кислоты. Выход Ol-DMAE составляет 93 мг (46.8% от теоретического). Масс-спектр: C22H43NO2 [М]+ 353.329 (вычислено), 354.318 [М+Н]+ (измерено). Выход Ol-CLN - 70%.
Синтез пальмитоилхолин иодида
Синтез пальмитоилхолина (Pt-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.58 ммоль) пальмитиновой кислоты. Выход Pt -DMAE составляет 104 мг (54.3% от теоретического).
Масс-спектр: C20H41NO2 [М]+ 327.314 (вычислено), 328.299 [М+Н]+ (измерено).
Выход Pt-CHL 75%.
Синтез стеароилхолин иодида
Синтез стеароилхолина (St-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.52 ммоль) стеариновой кислоты. Выход St-DMAE составляет 109 мг (58.1% от теоретического).
Масс-спектр: C22H45NO2 [М]+ 355.345 (вычислено), 356.338 [М+Н]+ (измерено)
Выход St-CHL 80%
Синтез линолеоилхолин иодида
Синтез линолеоилхолина (Ln-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.54 ммоль) линолевой кислоты. Выход Ln -DMAE составляет 87 мг (46.2% от теоретического).
Масс-спектр: C22H41NO2 [М]+ 351.314 (вычислено), 352.319 [М+Н]+ (измерено)
Выход Ln-CHL 65%.
Синтез линоленоилхолин иодида
Синтез линоленоилхолина (Lnn-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.54 ммоль) линоленовой кислоты. Выход Lnn -DMAE составляет 101 мг (53.6% от теоретического).
Масс-спектр: C22H39NO2 [М]+ 349.298 (вычислено), 350.312 [М+Н]+ (измерено)
Выход Lnn-CHL 63%.
Синтез эйкозапенаеноилхолин иодида
Синтез эйкозапенаеноилхолина (EPA-CHL) осуществляют как описано для арахидоноилхолина. В реакцию берут 150 мг (0.49 ммоль) эйкозапентаеновой кислоты.
Выход EPA-DMAE составляет 87 мг (42.6% от теоретического).
Масс-спектр: C24H39NO2 [М]+ 373. 298 (вычислено), 374.322 [М+Н]+ (измерено)
Выход EPA-CHL 60%
Пример 6. Трансфекция клеток комплексом плазмидной ДНК с различными вариантами положительно заряженных белков (гистоны Н2А, Н2А-ТАТ)
Трансфекцию проводят в 24-луночной плашке. Используют смесь плазмид pCMV-Luc/ pRL-TK в соотношении 9:1, несущих гены люциферазы Photinus pyralis под контролем раннего промотора цитомегаловируса и люциферазы Renilla reniformis под контролем промотора тимидин киназы вируса простого герпеса (Promega, США). Клетки линии НТ1080 (фибросаркома человека) (АТСС, CCL-121, США) рассевают по 100000 в лунку в среде ДМЕМ (Dulbecco's modified Eagle's medium) без антибиотика, инкубируют 24 часа при 37°С в 5% СО2. В пробирке смешивают 1 мкг плазмиды с 10 мкг (или 25 мкг, 50 мкг) гистона и добавляют до 100 мкл PBS. Исходная концентрация гистона и плазмиды в PBS составляет соответственно 2 мкг/мкл и 1 мкг/мл. Смесь гистона и плазмиды инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 100 мкл среды OPTI-MEM, перемешивают и переносят смесь в лунки планшета. Инкубируют 3 часа при 37°С в 5% СО2, отбирают трансфекционную смесь и добавляют 0,5 мл ростовой среды ДМЕМ без антибиотика. Через 48 часов проводят анализ люциферазной активности с помощью набора "Dual-Luciferase Reporter Assay System" (Promega, США). Полученные результаты представлены на Фиг. 3. Люциферазная активность при трансфекции плазмиды pCMV-Luc с рекомбинантными белками Н2А и Н2А-ТАТ одинакова, и значительно превышает трансфекцию плазмидой без гистона («голой» плазмидой).
Пример 7. Трансфекция клеток комплексом плазмидной ДНК с рекомбинантным гистоном Н2А в присутствии липида арахидоноилхолина
Трансфекцию проводят в 24-луночной плашке как описано в п. 6. При приготовлении комплекса ДНК-гистон одновременно добавляют арахидоноилхолин, конечная концентрация которого составляла от 1 мкМ до 10 мкМ, что соответствовало соотношению по заряду липида к плазмиде от 1:1 до 10:1. Добавление липида демонстрирует увеличение активности люциферазы, причем наибольший эффект достигается при низких концентрациях гистона (Фиг. 4). Использование одного липида без белков не приводит к заметной трансфекции клеток различными плазмидами.
Добавление арахидоноилхолина при увеличении количества гистонов не приводит к сильному увеличению люциферазной активности.
Добавление арахидоноилхолина одновременно с гистоном к плазмидной ДНК приводит к увеличению трансфекции более чем в 10 раз и снижению количества используемого гистона.
Пример 8. Эффективность трансфекции клеток линии HT1080 плазмидой pEGFP-N1 с помощью рекомбинантного гистона Н2А и липида арахидоноилхолина
Трансфекцию проводят в 6 луночной плашке. Используют плазмидный вектор pEGFP-N1 (Clontech, США), несущий в своем составе ген репортерного зеленого флуоресцентного белка под контролем раннего промотора цитомегаловируса (CMV). Образование комплексов плазмиды и гистонов в присутствии или отсутствии арахидоноилхолина, проводят аналогично описанному в пп. 6 и 7. В каждую ячейку вносят комплекс, состоящий из 4 мкг плазмиды pEGFP-N1, смешанной в описанных выше соотношениях с конденсирующим белком и липидом. Через 48 часов клетки фотографируют, затем клетки собирают, промывают PBS и анализируют на проточном флуориметре. Результаты были аналогичны эффектам, полученным с плазмидами pCMV-Luc/ pRL-TK. Уровень трансфекции при использовании рекомбинантных белков Н2А и Н2А-ТАТ составляет 7-15%. Уровень трансфекции значительно увеличивается при добавлении липида арахидоноилхолина.
Пример 9. Тест на цитотоксичность HSVtk в присутствии ганцикловира после трансфекции клеток линии OSA плазмидной ДНК в комплексе с рекомбинантным гистоном Н2А
Клетки линии OSA (остеосаркома человека) трансфицируют с помощью рекомбинантного гистона Н2А плазмидой CMV-HSVtk-mGMCSF-pGL3, несущей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) мыши под контролем раннего промотора цитомегаловируса, в шестилуночных планшетах. В качестве положительного контроля клетки той же лиинии трансфицируют плазмидой CMV-HSVtk- mGM-CSF-pGL3 с помощью широко применяемого трансфекционного агента - Липофектамина 2000 (Invitrogen, США). Спустя 48 часов после трансфекции к клеткам добавляют раствор ганцикловира («Cymeven, Roche», Швейцария) в среде DMEM/F12 (1:1) с антибиотиками в концентрации 0, 12,5, 50 и 200 мкМ. Через 216 часов после добавления ганцикловира проводят MTS -тест с целью определения количества живых клеток (Promega, США). Результаты проведенного эксперимента приведены на Фиг. 5. Использовании клеток линии OSA показывает, что выживаемость контрольной группы клеток (нетрансфицированные клетки) при концентрации ганцикловира от 0 до 200 мкМ около 100%, выживаемость клеток, трансфицированных комплексом плазмиды CMV-HSVtk-mGM-CSF-pGL3 и гистона Н2А снижается при концентрации ганцикловира выше 12,5 мкМ.
Данный эксперимент свидетельствует о возможности использования рекомбинантных гистонов для доставки в клетки терапевтических конструкций, содержащих суицидальные гены.
Пример 10. Тест на цитотоксичность FCU1 в присутствии 5-FC после трансфекции клеток HT1080 плазмидной ДНК в комплексе с рекомбинантным гистоном Н2А и липидом арахидоноилхолином
Клетки линии HT1080 (фибросаркома человека) трансфицируют в шестилуночных планшетах плазмидой CMV-FCY11-FUR1-pGL3, несущей химерную конструкцию FCY11-FUR1, под контролем раннего промотора цитомегаловируса, с помощью рекомбинантного гистона Н2А и рекомбинантного гистона Н2А в присутствии липида арахидоноилхолина. В качестве контроля используют нетрансфицированные клетки той же линии и клетки, трансфицированные с помощью липофектамина. Спустя 48 часов после трансфекции к клеткам добавляют раствор 5-фторцитозина («Sigma-Aldrich», США) в среде DMEM/F12 с антибиотиками в концентрации 0, 10, 50, 200 и 500 мкМ. Через 216 часов после добавления 5-фторцитозина проводят MTS -тест. Результаты проведенного эксперимента приведены на Фиг. 6. Было показано, что выживаемость контрольной группы клеток (нетрансфицированные клетки) при концентрации 5-фторцитозина от 0 до 500 мкМ была около 100%, выживаемость клеток, трансфицированных комплексами плазмиды CMV -FCY11-FUR1-pGL3 с гистоном Н2А или с гистоном Н2А и араходоноилхолином, снижается на 40% при концентрации 5-фторцитозина выше 200 мкм. Добавление арахидоноилхолина не влияло на процент выживаемости клеток. Данный эксперимент подтверждает возможность использования гистонов и природных липидов для доставки терапевтических конструкций, содержащих суицидальные гены.
SEQUENCE LISTING
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биоорганической химии им. М.А. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова Российской академии наук
Federal'noe gosudarstvennoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki
Institut bioorganicheskoi chemii Rossiiskoi akademii nauk
<120> ГИСТОНЫ И БИОДЕГРАДИРУЕМЫЕ ЛИПИДЫ КАК СРЕДСТВО ДЛЯ
ДОСТАВКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКИ ЭУКАРИОТ
<130> IBOC
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Primer H2A forward
<400> 1
GTTAGCATAT GTCGGGACGT GGCAAGC 27
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Primer H2A revers
<400> 2
ACTAAGCTTC TACTTGCCCT TGGCCTTGT 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Primer H2A-TAT forward
<400> 3
TATACATATG TCGGGACGTG GCAAG 25
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> misc_feature
<223> Primer H2A-TAT forward
<400> 4
ACTAAGCTTC TAACGGCGAC GCTGGCGACG TTTCTTACGA CCGTACTTGC CCTTGGCCTT 60
GTGG 64
<210> 5
<211> 129
<212> Protein
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Recombinant histone H2A
<400> 5
SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60
EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120
ESHHKAKGK 129
<210> 6
<211> 140
<212> Protein
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant protein H2A-TAT
<400> 6
SGRGKQGGKA RAKAKSRSSR AGLQFPVGRV HRLLRKGNYA ERVGAGAPVY AAVLEYLTA 60
EILELAGNAA RDNKKTRIIP RHLQLAIRND EELNKLLGRV TIAQGGVLPN QAVLLPKKT 120
ESHHKAKGKY GRKKRRQRRR 140
Claims (12)
1. Способ доставки плазмидной ДНК в эукариотические клетки, включающий смешивание плазмидной ДНК с рекомбинантным гистоном и холиновым эфиром жирной кислоты с длиной углеродной цепи от 16 до 22 атомов, включающих от 0 до 6 двойных связей, и инкубирование эукариотических клеток с полученной смесью.
2. Способ по п. 1, где в качестве рекомбинантного гистона используют гистон Н2А, смешанный с холиновым эфиром жирной кислоты в заданном соотношении.
3. Способ по п. 1, где в качестве рекомбинантного гистона используют химерный гистон Н2А-ТАТ, смешанный с холиновым эфиром жирной кислоты.
4. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют арахидоноилхолин иодид.
5. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют арахидоноилхолин.
6. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют докозагексаноилхолин иодид.
7. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют олеоилхолин иодид.
8. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют пальмитоилхолин иодид.
9. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют стеароилхолин иодид.
10. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют линолеоилхолин иодид.
11. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют линоленоилхолин иодид.
12. Способ по пп. 2 и 3, где в качестве холинового эфира жирной кислоты используют эйкозапентаеноилхолин иодид.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149228A RU2637371C2 (ru) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149228A RU2637371C2 (ru) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015149228A RU2015149228A (ru) | 2017-05-22 |
| RU2637371C2 true RU2637371C2 (ru) | 2017-12-04 |
Family
ID=58877831
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015149228A RU2637371C2 (ru) | 2015-11-17 | 2015-11-17 | Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2637371C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999019502A1 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-22 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| US20060008464A1 (en) * | 2002-04-08 | 2006-01-12 | Chaim Gilon | Histone conjugates and uses thereof |
| WO2008001370A2 (en) * | 2006-06-28 | 2008-01-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Caspase-8 and inflammation, infection and wound healing |
-
2015
- 2015-11-17 RU RU2015149228A patent/RU2637371C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999019502A1 (en) * | 1997-10-10 | 1999-04-22 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Transfection system for the transfer of nucleic acids into cells |
| US20060008464A1 (en) * | 2002-04-08 | 2006-01-12 | Chaim Gilon | Histone conjugates and uses thereof |
| WO2008001370A2 (en) * | 2006-06-28 | 2008-01-03 | Yeda Research And Development Co. Ltd | Caspase-8 and inflammation, infection and wound healing |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KOTT М. et al. A new efficient method for transfection of neonatal cardiomyocytes using histone h1 in combination with dosper liposomal transfection reagent, Somatic cell and molecular genetics, 1998, n. 24, p. 257-261. * |
| MORRIS М. et al. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells, Nat. Biotechnol, 2001, n.19, p. 1173-1176. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015149228A (ru) | 2017-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Islam et al. | Biomaterials for mRNA delivery | |
| Habrant et al. | Design of ionizable lipids to overcome the limiting step of endosomal escape: application in the intracellular delivery of mRNA, DNA, and siRNA | |
| JP6298039B2 (ja) | 人工核酸分子 | |
| Tavernier et al. | mRNA as gene therapeutic: how to control protein expression | |
| JP2023161039A (ja) | ｍＲＮＡの細胞内送達のためのペプチドおよびナノ粒子 | |
| Kaouass et al. | Histonefection: Novel and potent non-viral gene delivery | |
| JP7592493B2 (ja) | 治療用タンパク質の標的細胞に特異的な産生のための、および、標的細胞に関連する疾患、疾病、または障害の処置のための、融合性脂質ナノ粒子、および、融合性脂質ナノ粒子の製造方法と使用方法 | |
| CN104768967A (zh) | 细胞穿透性肽、包含该肽的缀合物、及包含该缀合物的组合物 | |
| CN119731321A (zh) | 通过靶向基因阻遏减少低密度脂蛋白的组合物、系统和方法 | |
| Wang et al. | Incorporation of histone derived recombinant protein for enhanced disassembly of core-membrane structured liposomal nanoparticles for efficient siRNA delivery | |
| Yamada et al. | Validation of the use of an artificial mitochondrial reporter DNA vector containing a Cytomegalovirus promoter for mitochondrial transgene expression | |
| Majidi et al. | Development of novel recombinant biomimetic chimeric MPG-based peptide as nanocarriers for gene delivery: Imitation of a real cargo | |
| NZ521564A (en) | Compositions for drug delivery | |
| Liu et al. | Peptide and aptamer decorated delivery system for targeting delivery of Cas9/sgRNA plasmid to mediate antitumor genome editing | |
| JP2002316997A (ja) | 目的とするアニオン性物質を細胞に導入するための複合体 | |
| Liu et al. | Delivery of miRNA‐29b using R9‐LK15, a novel cell‐penetrating peptide, promotes osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells | |
| Liu et al. | Reversal of tumor malignization and modulation of cell behaviors through genome editing mediated by a multi-functional nanovector | |
| WO2019018660A1 (en) | GENE TRANSFER SYSTEMS FOR ENGINEERING STEM CELLS | |
| CN105999227B (zh) | FOXM1蛋白氮端（1-234 aa）的表达及其用途 | |
| JP2011504375A (ja) | 細胞の中に核酸を導入する医薬組成物及びその方法 | |
| RU2637371C2 (ru) | Гистоны и биодеградируемые липиды как средство для доставки нуклеиновых кислот в клетки эукариот | |
| US20070098702A1 (en) | Recombinant protein polymer vectors for systemic gene delivery | |
| US10933027B1 (en) | Expanded pore particles and delivery methods thereof | |
| US20230332181A1 (en) | Conjugate systems and methods of use thereof | |
| KR102679172B1 (ko) | 질환 세포-특이적인 miRNA에 의해 세포 생리 활성 조절 물질의 활성을 조절하는 복합체 및 이를 CRISPR/Cas 시스템에 적용한 질환 특이적 유전자 조작용 복합체 |