RU2636346C1 - Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa - Google Patents
Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa Download PDFInfo
- Publication number
- RU2636346C1 RU2636346C1 RU2016126461A RU2016126461A RU2636346C1 RU 2636346 C1 RU2636346 C1 RU 2636346C1 RU 2016126461 A RU2016126461 A RU 2016126461A RU 2016126461 A RU2016126461 A RU 2016126461A RU 2636346 C1 RU2636346 C1 RU 2636346C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- repa
- recombinant
- coli
- seq
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 15
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 101000708016 Caenorhabditis elegans Sentrin-specific protease Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101000879203 Caenorhabditis elegans Small ubiquitin-related modifier Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000051619 SUMO-1 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims abstract description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 4
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims abstract 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 abstract description 7
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 101710082714 Exotoxin A Proteins 0.000 description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009062 ADP Ribose Transferases Human genes 0.000 description 2
- 108010049290 ADP Ribose Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101150003886 CRYZ gene Proteins 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101710088791 Elongation factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010000916 Fimbriae Proteins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010057852 Nicotine dependence Diseases 0.000 description 1
- 101710203389 Outer membrane porin F Proteins 0.000 description 1
- 101710160104 Outer membrane protein F Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 208000025569 Tobacco Use disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно получению и производству иммунобиологических препаратов, технологий продукции и очистки рекомбинантных белков из штаммов микроорганизмов и касается разработки нового способа получения рекомбинантного экзопротеина A Pseudomonas aeruginosa (rEPA), обладающего высокой иммуногенностью и адъювантными свойствами, применимого в качестве белкового носителя для связывания с различными антигенами при создании конъюгированных вакцин.The invention relates to biotechnology, namely the production and production of immunobiological preparations, production technologies and purification of recombinant proteins from strains of microorganisms and relates to the development of a new method for producing recombinant exoprotein A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) with high immunogenicity and adjuvant properties, applicable as a protein carrier for binding to various antigens to create conjugate vaccines.
Областью применения предлагаемого способа получения белка rEPA является биомедицина, разработка и создание иммуногенных композиций, в частности конъюгированных вакцин на основе белкового носителя rEPA, лабораторные биологические и медицинские исследования, использование иммуногенных конъюгатов для выработки антител против различных патогенов.The scope of the proposed method for producing rEPA protein is biomedicine, the development and creation of immunogenic compositions, in particular conjugated vaccines based on the rEPA protein carrier, laboratory biological and medical studies, the use of immunogenic conjugates to generate antibodies against various pathogens.
Рекомбинантный экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) представляет собой атоксическую форму экзотоксина А, состоящий из 613 аминокислот. Экзотоксин А (ЕРА) наиболее токсичный фактор вирулентности P. aeruginosa. Он относится к семейству токсинов АДФ-рибозилтрансфераз и имеет молекулярную массу около 67 кДа. Экзотоксин А, как и дифтерийный токсин, ингибирует синтез белка вследствие своей АДФ-рибозилтрансферазной активности (Pollack М., Young L.S. // Clin. Invest. - 1979. - V. 63. - P. 276-286). EPA содержит три главных домена: домен Ia и Ib - 1-252 аминокислотные остатки (рецепторсвязывающий), домен II - 253-404 аминокислотные остатки (трансмембранный), домен III - 405-613 аминокислотные остатки (каталитический НАД-рибозил трансферазный). Именно домен III ингибирует белковый синтез путем инактивации эукариотического фактора элонгации 2 (Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F. et al. // Procl. Atl. Acad. Sci. USA. - 1986. - V. 83. - 1320-1324).Recombinant exoprotein A Pseudomonas aeruginosa (rEPA) is an atoxic form of exotoxin A consisting of 613 amino acids. Exotoxin A (EPA) is the most toxic virulence factor of P. aeruginosa. It belongs to the toxin family of ADP-ribosyltransferases and has a molecular weight of about 67 kDa. Exotoxin A, like diphtheria toxin, inhibits protein synthesis due to its ADP-ribosyltransferase activity (Pollack M., Young L.S. // Clin. Invest. - 1979. - V. 63. - P. 276-286). EPA contains three main domains: domain Ia and Ib - 1-252 amino acid residues (receptor binding), domain II - 253-404 amino acid residues (transmembrane), domain III - 405-613 amino acid residues (catalytic NAD-ribosyl transferase). It is domain III that inhibits protein synthesis by inactivation of the eukaryotic elongation factor 2 (Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F. et al. // Procl. Atl. Acad. Sci. USA. - 1986. - V. 83. - 1320-1324).
Для детоксикации экзопротеина А методами генетической инженерии был сконструирован рекомбинантный токсоид (rEPA), который отличается от токсина дикого типа по трем остаткам: Ala179-Thr (в рецепторсвязывающем домене), Leu 552-Val и делеции Glu 553 (в каталитическом домене) (Killeen K.P., Collier R.J. / Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - V. 1138. - 162-166). Остаток глутаминовой кислоты в 553 положении был делетирован методом сайт-направленного мутагенеза (Lukac М., Pier G.B., Collier R.J. // Infect. Immun. - 1988. - V. 56, N. 12. - P. 3095-3098). Имеются также данные о том, что при химической модификации белка дикого типа в процессе конъюгации также происходит полная потеря токсичности (Cryz S.J. Jr., Sadoff J.С.,
На основе рекомбинантного экзотоксина A P. aeruginosa разрабатывают и тестируют на иммуногенность ряд препаратов. Против тифозной инфекции создана и проходит клинические испытания конъюгированная вакцина, содержащая очищенный полисахарид Vi Salmonella enterica serovar Typhi с белком-носителем rEPA (Lin F.Y.C., Но V.A., Khiem Н.В. et al. // N. Engl. J. Med. - 2001. - V. 344, N. 17. - P. 1263-1269; US 20100239601 A1; Anwar E.., Goldberg E., Fraser A. et al. // Cochrane Database Syst. Rev. - 2014). Одной из новых разрабатываемых вакцин с белком-носителем rEPA против брюшного тифа является конъюгат О-специфического полисахарида S. enterica ser. Typhi (Zhehui P., Chao P., Peng S. et al. // Yi Chuan. - 2015. - V. 37, N. 5. - P. 473-479). Белок-носитель rEPA стимулировал выработку высокого иммунного ответа на связанные с ним полисахариды О P. aeruginosa в доклинических исследованиях конъюгированных вакцин (Cryz Jr. S.J., Furer E., Sadoff J.C. et al. // Infect. Immun. - 1986. V. 52, N. 1. - P. 161-165; Abu-baker N.F., Masoud H.A., Jaber B.M. // Dirasat, Pure Sciences. - 2008. - V. 35, N. 2. - P. 110-122.). Он также используется в качестве носителя для вакцины против Staphylococcus aureus типа 5 и типа 8 (Fattom A., Schneerson R., Szu S.C. et al. // Infection and immunity. - 1990. - V. 58, N. 7. - P. 2367-2374; Shinefield H., Black S., Fattom A. et al. // N. Engl. J. Med. - 2002. - V. 346, N. 7. - P. 491-496). Белок rEPA применяют в вакцинах против шигелл (Cohen D., Ashkenazi S., Green M.S. et al. // Lancet. - 1997. V. 349, N. 9046. - P. 155-159), энтерогеморрагической E. coli (Szu S.C., Ahmed A. // Microbiol. Spectr. - 2014, V. 2, N. 6. - P. 1-7), возбудителя холеры (Wade Т.K., Saksena R., Shiloach J. et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2006. V. 48, N. 2. - P. 237-251) и даже при лечении никотиновой зависимости (US 20110217320 A1). Кроме того, rEPA способствовал повышению титра антител на поверхностные белки-антигены малярийного плазмодия Plasmodium falciparum при применении конъюгированной вакцины против малярии (Qian F., Wu Y., Muratova О. et al. // Vaccine. - 2007. - V. 25, N. 20. - P. 3923-3933; Qian F. // Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi. - 2012. - V. 30, N. 6. - P. 442-445).Based on the recombinant exotoxin A P. aeruginosa, a number of drugs are developed and tested for immunogenicity. A conjugate vaccine containing purified Vi Salmonella enterica serovar Typhi polysaccharide with rEPA carrier protein (Lin FYC, But VA, Khiem N.V. et al. // N. Engl. J. Med. - 2001. - V. 344, N. 17. - P. 1263-1269; US 20100239601 A1; Anwar E., Goldberg E., Fraser A. et al. // Cochrane Database Syst. Rev. - 2014). One of the newly developed vaccines with the rEPA carrier protein against typhoid fever is the conjugate of the O-specific polysaccharide S. enterica ser. Typhi (Zhehui P., Chao P., Peng S. et al. // Yi Chuan. - 2015 .-- V. 37, N. 5. - P. 473-479). The rEPA carrier protein stimulated the production of a high immune response to its associated P. aeruginosa polysaccharides in preclinical studies of conjugate vaccines (Cryz Jr. SJ, Furer E., Sadoff JC et al. // Infect. Immun. - 1986. V. 52 , N. 1. - P. 161-165; Abu-baker NF, Masoud HA, Jaber BM // Dirasat, Pure Sciences. - 2008. - V. 35, N. 2. - P. 110-122.). It is also used as a vehicle for the vaccine against Staphylococcus aureus
Таким образом, широкое применение rEPA в качестве белкового носителя в разрабатываемых конъюгированных вакцинах обуславливает необходимость изобретения эффективного способа получения и очистки данного белка.Thus, the widespread use of rEPA as a protein carrier in the developed conjugate vaccines necessitates the invention of an effective method for the preparation and purification of this protein.
Известен способ получения rEPA в растворимой форме в клетках Pseudomonas fluorescens, включающий оптимизированную для экспрессии в клетках псевдомонад нуклеотидную последовательность белка, экспрессию с тегом для очистки (гексагистидин или глутатион-S-трансфераза или аналоги флуоресцентных белков YFP или GFP) и аффинную хроматографию (патент ЕР 2553102 А2). Однако данный способ не пригоден для продукции белка rEPA в клетках E. coli.A known method for producing soluble rEPA in Pseudomonas fluorescens cells, comprising a protein nucleotide sequence optimized for expression in pseudomonas cells, expression with a tag for purification (hexahistidine or glutathione S-transferase or analogues of fluorescent proteins YFP or GFP) and affinity chromatography ( 2553102 A2). However, this method is not suitable for the production of rEPA protein in E. coli cells.
Известны изобретения, описывающее получение плазмид и штаммов-продуцентов Е. coli гибридных рекомбинантных белков, включающих аминокислотные последовательности белка F наружной мембраны и экзотоксина А P. aeruginosa (патент RU 2529359 С2) и вариант экзотоксина А с белком пилином типа IV (патент US 7314625 В2). Также известен способ, в котором конструировали плазмиду, содержащую нуклеотидную последовательность белка ЕРА, модифицированную для детоксификации, содержащую замену N-концевого сигнального пептида на сигнальный пептид DsbA Е. coli и две дополнительные гликозилированнные консенсусные последовательности, а также вставку на С конце тега гексагистидина для получения биоконъюгатов полисахаридов Staphylococcus aureus с rEPA (патент WO 2015082571 А1). Однако в указанных патентах продукцию и очистку белка rEPA отдельно, без конъюгатов, не проводили.Known inventions that describe the production of plasmids and producer strains of E. coli hybrid recombinant proteins, including the amino acid sequences of the outer membrane protein F and P. aeruginosa exotoxin A (patent RU 2529359 C2) and exotoxin A variant with type IV pilin protein (US patent 7314625 B2 ) Also known is a method in which a plasmid was constructed containing the nucleotide sequence of the EPA protein modified for detoxification, comprising replacing the N-terminal signal peptide with the E. coli DsbA signal peptide and two additional glycosylated consensus sequences, as well as inserting a hexahistidine tag at the C end bioconjugates of Staphylococcus aureus polysaccharides with rEPA (patent WO 2015082571 A1). However, in these patents, the production and purification of rEPA protein separately, without conjugates, was not carried out.
Известен способ создания самореплицирующегося вектора без гена антибиотикорезистентности с целью получения рекомбинантного белка, включающий генно-инженерную интеграцию экспрессионной конструкции, продуцирующей rEPA, в бактериальную клетку Е. coli с последующей геномной экспрессией, но не была описана процедура выделения белка (патент WO 2010007246 А1).There is a method of creating a self-replicating vector without an antibiotic resistance gene in order to obtain a recombinant protein, which includes the genetic engineering integration of an expression construct producing rEPA into an E. coli bacterial cell with subsequent genomic expression, but the procedure for protein isolation has not been described (patent WO 2010007246 A1).
Известен по существу наиболее близкий к заявленному изобретению способ получения рекомбинантных вариантов экзотоксина А P. aeruginosa, но в нерастворимой фракции, с целью использования в качестве антигенов в иммунобиологических препаратах для диагностики, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых синегнойной палочкой. Данный способ предполагает создание штаммов-продуцентов: синтезирующий экзотоксин А; домен I экзотоксина А; экспрессирующий вариант, состоящий из доменов I и II; вариант, состоящий из доменов I, II и части домена III. Для очистки рекомбинантных белков в работе указывается металл-хелатная хроматография в денатурирующих условиях с использованием Ni-сефарозы High Performance (GE Healthcare), с выходом препаратов от 38,8% до 71,4% и степенью очистки не менее 66% (Исаков М.А. / Автореф. дис. к.б.н. - Москва: НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 2010 - 24 с.). Отличием данного способа от разработанного, является получение белка rEPA в нерастворимой форме, что существенно влияет на процедуру очистки белка.Known essentially closest to the claimed invention is a method for producing recombinant exotoxin A variants of P. aeruginosa, but in an insoluble fraction, with the aim of being used as antigens in immunobiological preparations for the diagnosis, prevention and treatment of diseases caused by Pseudomonas aeruginosa. This method involves the creation of producer strains: synthesizing exotoxin A; exotoxin A domain I; an expressing variant consisting of domains I and II; option consisting of domains I, II and part of domain III. For purification of recombinant proteins, metal chelate chromatography under denaturing conditions using High Performance Ni-Sepharose (GE Healthcare) is indicated in the work, with a yield of 38.8% to 71.4% and a degree of purification of at least 66% (Isakov M. A. / Abstract of thesis, Candidate of Biological Sciences - Moscow: Scientific Research Institute of Vaccines and Serums named after II Mechnikov, 2010 - 24 pp.). The difference between this method and the developed one is the production of rEPA protein in an insoluble form, which significantly affects the protein purification procedure.
Техническим результатом изобретения является создание эффективного способа получения рекомбинантного белка rEPA, позволяющего при экспрессии в клетках Е. coli повысить выход белка в растворимой форме и осуществить очистку солюбилизированного белка rEPA, пригодного для конъюгации с полисахаридами и другими антигенами в конъюгированных вакцинах.The technical result of the invention is the creation of an effective method for producing recombinant rEPA protein, which allows expression of E. coli cells to increase the yield of protein in soluble form and purify solubilized rEPA protein suitable for conjugation with polysaccharides and other antigens in conjugate vaccines.
Технический результат изобретения достигается за счет оптимизации последовательности ДНК, кодирующей рекомбинантный экзопротеин А P. aeruginosa, для достижения максимально эффективной трансляции белка в Е. coli.The technical result of the invention is achieved by optimizing the DNA sequence encoding the recombinant exoprotein A P. aeruginosa, to achieve the most efficient translation of the protein in E. coli.
Также технический результат изобретения достигается за счет конструирования векторной плазмиды, содержащей промоторную последовательность ДНК бактериофага Т7 и последовательности ДНК, кодирующие N-концевую область белкового продукта энхансера трансляции (аминокислотная последовательность MASMT), шесть аминокислотных остатков гистидинов для очистки белка металл-хелатной хроматографией, сайт расщепления протеазой SUMO и оптимизированную для трансляции в Е. coli последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок rEPA. Для жесткого блокирования фоновой продукции белка экспрессионные конструкции бактериофага Т7 содержат последовательность оператора.The technical result of the invention is also achieved by constructing a vector plasmid containing the T7 bacteriophage promoter DNA sequence and DNA sequences encoding the N-terminal region of the translation enhancer protein product (MASMT amino acid sequence), six amino acid residues of histidines for protein purification by metal chelate chromatography, cleavage site SUMO protease and DNA sequence optimized for translation into E. coli encoding the recombinant rEPA protein. To rigorously block background protein production, the expression constructs of the T7 bacteriophage contain an operator sequence.
Также технический результат достигается продукцией рекомбинантного белка rEPA слитого с пептидом SUMO в бактериях Е. coli штамма BL21 (DE3) при температуре 37°C, что обеспечивает накопление большого количества рекомбинантного белка в растворимой фракции.The technical result is also achieved by the production of the recombinant rEPA protein fused with the SUMO peptide in E. coli bacteria strain BL21 (DE3) at a temperature of 37 ° C, which ensures the accumulation of a large amount of recombinant protein in the soluble fraction.
Также технический результат изобретения достигается за счет высокоэффективной процедуры лизиса бактериальных клеток, предусматривающей обработку бактерий детергентом Triton Х-100 в концентрации 4%, что способствует сохранению белковой фракции в растворимом состоянии.The technical result of the invention is also achieved through a highly effective procedure for the lysis of bacterial cells, which involves treating bacteria with Triton X-100 detergent at a concentration of 4%, which helps to maintain the protein fraction in a soluble state.
Также технический результат изобретения достигается благодаря схеме хроматографической очистки, включающей этапы металл-хелатной хроматографии на колонке Talon (Clontech, США), заряженной ионами Со2+, ионнообменной и гель-фильтрационной хроматографии с конечным переводом фермента в буфер со значением pH 7,5.The technical result of the invention is also achieved thanks to the chromatographic purification scheme, including the steps of metal-chelate chromatography on a Talon column (Clontech, USA) charged with Co 2+ ions , ion-exchange and gel filtration chromatography with the final transfer of the enzyme to a buffer with a pH value of 7.5.
Отличием предлагаемого способа является получение rEPA на основе сконструированной синтетической последовательности ДНК, оптимизированной для продукции белка в Е. coli. Адаптация последовательности ДНК, кодирующей целевой белок, для продукции в Е. coli проводилась путем компьютерного анализа и включала замену кодонов нативного гена на кодоны, наиболее часто встречающиеся в белках с высоким уровнем продукции у организма-хозяина, анализ и совершенствование стабильности считываемой мРНК, удаление чрезмерной структурированности мРНК, удаление гомополимерных участков мРНК.The difference of the proposed method is to obtain rEPA based on the constructed synthetic DNA sequence, optimized for protein production in E. coli. The adaptation of the DNA sequence encoding the target protein for production in E. coli was carried out by computer analysis and included the replacement of codons of the native gene with the codons most often found in proteins with a high level of production in the host organism, analysis and improvement of the readability of mRNA, removal of excessive structuring of mRNA, removal of homopolymer sections of mRNA.
В предлагаемом техническом решении удаление N-концевого полипептида с восстановлением нативной последовательности белка rEPA обеспечивается за счет введенного в состав рекомбинантного белка сайта расщепления протеазой SUMO. Полипептид SUMO имеет аминокислотную последовательность DLDMEDNDIIEAHRE и служит для повышения растворимости белкового продукта. На N-конце рекомбинантного белка содержится короткая аминокислотная последовательность шести аминокислотных остатков гистидинов, не влияющая на свойства белка rEPA, но позволяющая удалить его из раствора адсорбцией на металл-хелатной смоле.In the proposed technical solution, the removal of the N-terminal polypeptide with the restoration of the native sequence of the rEPA protein is provided due to the SUMO protease cleavage site introduced into the recombinant protein. The SUMO polypeptide has the amino acid sequence DLDMEDNDIIEAHRE and serves to increase the solubility of the protein product. At the N-terminus of the recombinant protein, there is a short amino acid sequence of six histidine amino acid residues that does not affect the properties of the rEPA protein, but allows it to be removed from the solution by adsorption on a metal-chelate resin.
Предлагаемое техническое решение предусматривает проведение нескольких этапов хроматографической очистки, включая металл-хелатную хроматографию на сорбенте Talon (Clontech, США), заряженном ионами Со2+, а также анионообменную и гель-фильтрационную хроматографии, обеспечивающих получение белка высокой чистоты (до 98% по данным денситометрии) в конечном буферном растворе со значением pH 7,5, пригодном для анализа активности и хранения белка.The proposed technical solution provides for several stages of chromatographic purification, including metal-chelate chromatography on a Talon sorbent (Clontech, USA) charged with Co 2+ ions , as well as anion exchange and gel filtration chromatography, providing high-purity protein (up to 98% according to densitometry) in a final buffer solution with a pH value of 7.5, suitable for analysis of activity and storage of protein.
Существенным достоинством предлагаемого способа получения рекомбинантного экзопротеина P. aeruginosa rEPA является получение высокого выхода очищенного белка (0,25 г с литра бактериальной культуры) в растворимой форме при культивировании продуцента Е. coli при 37°C за счет его химеризации с полипептидом SUMO.A significant advantage of the proposed method for producing recombinant P. aeruginosa rEPA exoprotein is the obtaining of a high yield of purified protein (0.25 g per liter of bacterial culture) in a soluble form when the producer E. coli is cultured at 37 ° C due to its chimerization with the SUMO polypeptide.
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.
Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рЕТ_rEPA на основе коммерчески доступной плазмиды pET22b(+). Для этого конструируют последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок rEPA, оптимизированную для продукции белка в Е. coli, и синтезируют данную последовательность при помощи ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров. На 5'-конец синтезированной последовательности при помощи ПЦР вводят фрагмент ДНК, кодирующий последовательность шести остатков гистидинов и полипептид SUMO и на 3'-конец последовательности при помощи ПЦР вводят стоп-кодон и сайт эндонуклеазы рестрикции XhoI. Полученный ПЦР-продукт расщепляют по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI и лигируют с расщепленной по соответствующим сайтам векторной плазмидной ДНК pET22b(+). Единичные клоны, содержащие плазмиду pET22b(+) со встроенной последовательностью ДНК получают электротрансформацией клеток штамма Е. coli DH12S.Recombinant plasmid DNA pET_rEPA was constructed based on the commercially available plasmid pET22b (+). To do this, construct a DNA sequence encoding a recombinant rEPA protein optimized for protein production in E. coli, and synthesize this sequence by PCR using overlapping primers. A DNA fragment encoding the sequence of six histidine residues and the SUMO polypeptide is introduced at the 5'-end of the synthesized sequence by PCR, and the stop codon and the XhoI restriction endonuclease site are introduced at the 3'-end of the sequence by PCR. The resulting PCR product is digested at the NdeI and XhoI restriction endonuclease sites and ligated to the pET22b (+) vector plasmid DNA digested at the corresponding sites. Single clones containing the plasmid pET22b (+) with an integrated DNA sequence are obtained by electrotransformation of cells of E. coli strain DH12S.
Плазмидой рЕТ_rEPA трансформируют клетки штамма Е. coli BL21(DE3) и получают единичные колонии продуцента рекомбинантного экзопротеина А Е. coli BL-rEPA. На основании аналитической экспрессии выделяют клоны-суперпродуценты белка. Проводят препаративную экспрессию белка клонов-суперпродуцентов. Для этого бактериальные клоны выращивают в течение ночи в среде 2xYT, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы, 10 мл ночной культуры помещают в 1 литр свежей среды, содержащей 0,1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и наращивают культуру до достижения 0,8 единиц оптической плотности. Индуцируют синтез белка добавлением 1 мМ ИПТГ. Экспрессию белка проводят при 37°C в течение 4 часов. Бактериальную биомассу собирают центрифугированием и хранят при температуре -70°C.The plasmid pET_rEPA transforms the cells of the strain E. coli BL21 (DE3) and obtain single colonies of the producer of the recombinant exoprotein A E. coli BL-rEPA. On the basis of analytical expression, clones of superproducers of the protein are isolated. The preparative expression of the protein of super producer clones is carried out. For this, bacterial clones are grown overnight in 2xYT medium containing 50 μg / ml ampicillin and 1% glucose, 10 ml of overnight culture is placed in 1 liter of fresh medium containing 0.1% glucose and 50 μg / ml ampicillin, and the culture is expanded to achieve 0.8 units of optical density. Protein synthesis is induced by the addition of 1 mM IPTG. Protein expression is carried out at 37 ° C for 4 hours. Bacterial biomass is collected by centrifugation and stored at -70 ° C.
Выделение белка rEPA из лизата культуры клеток проводят металл-хелатной хроматографией на колонке Talon (Clontech, США), заряженной кобальтом. Посадку белка на колонку осуществляют в буферном растворе, содержащем 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ хлорида натрия, pH 8,0. Элюируют белок с колонки тем же буфером, содержащим 250 мМ имидазола. Протеолиз для отщепления пептида SUMO проводят в течение 2 часов при комнатной температуре в массовом соотношении SUMO-rEPA к протеазе как 1:1000 в присутствии 1 мМ ДТТ. Удаление отщепленного пептида проводят на колонке с ионнообменной смолой DEAE-Sepharose (GE Healthcare, Великобритания) в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 20 мМ хлорида натрия. Элюцию с колонки проводят градиентом 0,5 М хлорида натрия в том же буфере. Доочищают полученный рекомбинантный белок гель-фильтрацией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare, Великобритания). На каждом этапе контроль степени очистки проводят с применением электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях.Isolation of the rEPA protein from the cell culture lysate was performed by metal-chelate chromatography on a Talon column (Clontech, USA) charged with cobalt. Protein landing on the column is carried out in a buffer solution containing 20 mM Tris-HCl, 200 mM sodium chloride, pH 8.0. Elute the protein from the column with the same buffer containing 250 mM imidazole. Proteolysis for cleavage of the SUMO peptide is carried out for 2 hours at room temperature in a mass ratio of SUMO-rEPA to protease as 1: 1000 in the presence of 1 mm DTT. The removal of the cleaved peptide is carried out on a DEAE-Sepharose ion exchange resin column (GE Healthcare, UK) in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 20 mM sodium chloride. Elution from the column is carried out with a gradient of 0.5 M sodium chloride in the same buffer. The resulting recombinant protein was further purified by gel filtration on a Superdex 200 column (GE Healthcare, UK). At each stage, control of the degree of purification is carried out using electrophoresis in SDS page under denaturing conditions.
Выход рекомбинантного белка rEPA составляет 0,25 г с литра культуры.The yield of recombinant protein rEPA is 0.25 g per liter of culture.
Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:The invention is illustrated by the following graphic materials:
Фиг. 1. Синтетическая последовательность ДНК, оптимизированная для эффективной продукции белка rEPA в клетках Е. coli. А - последовательность ДНК SUMO-rEPA, В - аминокислотная последовательность SUMO-rEPA. С - полная последовательность плазмиды рЕТ_rEPA.FIG. 1. A synthetic DNA sequence optimized for efficient production of rEPA protein in E. coli cells. A is the DNA sequence of SUMO-rEPA, B is the amino acid sequence of SUMO-rEPA. C is the complete sequence of plasmid pET_rEPA.
Фиг. 2. Экспрессионная конструкция для продукции белка-партнера для конъюгации rEPA.FIG. 2. Expression design for partner protein production for rEPA conjugation.
Фиг. 3. Результаты выделения и очистки рекомбинантного белка rEPA из бактериальной биомассы.FIG. 3. The results of the isolation and purification of recombinant rEPA protein from bacterial biomass.
Дорожка 1 - маркер молекулярной массы SM0671 (Fermentas). Дорожка 2 - фьюжн-белок SUMO-rEPA, очищенный металл-хелатной хроматографией. Дорожка 3 - расщепление фьюжн-белка SUMO-rEPA протеазой SUMO. Дорожка 4 - белок rEPA, очищенный хроматографией на колонке DEAE-Sepharose. Дорожка 5 - белок rEPA после гель-фильтрационной хроматографии.
Фиг. 4. Результаты иммуноблоттинга рекомбинантного белка rEPA со специфичными к экзотоксину А P. aeruginosa антителами.FIG. 4. The results of immunoblotting of the recombinant rEPA protein with specific antibodies to exotoxin A P. aeruginosa.
Дорожка 1 - маркер молекулярной массы SM0671 (Fermentas). Дорожка 2 - белок rEPA.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.
Пример 1. Создание экспрессионной конструкции для продукции рекомбинантного белка rEPA в Е. coli.Example 1. The creation of an expression construct for the production of recombinant protein rEPA in E. coli.
Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рЕТ_rEPA на основе коммерчески доступной плазмиды pET22b(+) (Novagen, США). С помощью компьютерного анализа конструируют последовательность ДНК, кодирующую экзопротеин А P. aeruginosa - rEPA, оптимизированную для продукции белка в Е. coli и синтезируют данную последовательность при помощи ПЦР с перекрывающихся праймеров. На 5'-конец синтезированной последовательности с помощью ПЦР вводят фрагмент ДНК, кодирующий последовательность шести остатков гистидинов и сайт для протеазы SUMO, и на 3'-конец последовательности при помощи ПЦР вводят стоп-кодон и сайт эндонуклеазы рестрикции XhoI. Праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, содержат сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI и XhoI. Полученную ДНК расщепляют эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI, и затем лигируют с расщепленной по соответствующим сайтам и очищенной элюцией из агарозного геля векторной плазмидной ДНК pET22b(+). Единичные клоны, содержащие плазмиду pET22b(+) со встроенным фрагментом шести остатков гистидинов, последовательности SUMO и rEPA получают электротрансформацией клеток штамма Е. coli DH12S (Thermo Fisher Scientific, США). Клоны, содержащие инсерт длиной около 2000 п.н., идентифицируют при помощи ПЦР с праймеров Т7 forward и Т7 reverse (Sigma-Aldrich, США). Выделяют плазмидную ДНК и верифицируют корректность встроенной последовательности методом капиллярного секвенирования.Recombinant plasmid DNA pET_rEPA was constructed based on the commercially available plasmid pET22b (+) (Novagen, USA). Computer analysis was used to construct a DNA sequence encoding P. aeruginosa-rEPA exoprotein A optimized for protein production in E. coli and synthesize this sequence by PCR from overlapping primers. A DNA fragment encoding the sequence of six histidine residues and a SUMO protease site is introduced at the 5'-end of the synthesized sequence by PCR, and the stop codon and the XhoI restriction endonuclease site are introduced at the 3'-end of the sequence by PCR. The primers used for PCR amplification contain restriction endonucleases NdeI and XhoI. The resulting DNA was digested with restriction endonucleases NdeI and XhoI, and then ligated to the pET22b (+) vector plasmid DNA digested at the appropriate sites and purified by agarose gel elution. Single clones containing the plasmid pET22b (+) with an inserted fragment of six histidine residues, the SUMO and rEPA sequences are obtained by the electro-transformation of E. coli strain DH12S cells (Thermo Fisher Scientific, USA). Clones containing an insert of about 2000 bp in length were identified by PCR from T7 forward and T7 reverse primers (Sigma-Aldrich, USA). Plasmid DNA is isolated and the correctness of the inserted sequence is verified by capillary sequencing.
Пример 2. Получение продуцентов и продукция rEPA в Е. coli.Example 2. Obtaining producers and production of rEPA in E. coli.
Штамм-продуцент Е. coli BL-rEPA получают электротрансформацией компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) плазмидой рЕТ_rEPA.The E. coli BL-rEPA producing strain is obtained by electrotransformation of competent E. coli BL21 (DE3) cells with the plasmid pET_rEPA.
Проводят аналитическую экспрессию единичных клонов BL21 (DE3), несущих плазмиду рЕТ_rEPA. Для этого единичные колонии Е. coli BL-rEPA выращивают в течение ночи при 37°C в 5 мл среды 2xYT с добавлением 1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, засевают 100 мкл ночной культуры в 10 мл среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина и выращивают при 37°C в течение 3 часов. Экспрессию белка индуцируют добавлением ИПТГ до 1 мМ, экспрессию проводят 4 часа при температуре 37°C. Бактериальные клетки собирают центрифугированием при 3000 g в течение 10 минут, лизируют, затем анализируют уровень экспрессии белка rEPA электрофорезом в денатурирующих условиях в 12% полиакриламидном геле.Analytical expression of single BL21 clones (DE3) carrying the pET_rEPA plasmid was performed. For this, single colonies of E. coli BL-rEPA were grown overnight at 37 ° C in 5 ml of 2xYT medium supplemented with 1% glucose and 50 μg / ml ampicillin, 100 μl of overnight culture in 10 ml of 2xYT medium containing 0.1 % glucose and 50 μg / ml ampicillin and grown at 37 ° C for 3 hours. Protein expression is induced by the addition of IPTG to 1 mM, expression is carried out for 4 hours at a temperature of 37 ° C. Bacterial cells are harvested by centrifugation at 3000 g for 10 minutes, lysed, then the level of expression of the rEPA protein is analyzed by electrophoresis under denaturing conditions in a 12% polyacrylamide gel.
Для проведения электрофореза равные аликвоты клеток разных клонов центрифугируют при 3000 g 15 минут, и разделяют на растворимую и нерастворимую фракции белка. Для этого осажденные клетки растворяют в 200 мкл буфера 10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 100 мМ хлорид натрия. Клетки последовательно лизируют добавлением лизоцима (конечная концентрация 20 мкг/мл), Тритон Х-100 до 0,5%, 1 мМ MgCl2 и ДНКазы (конечная концентрация в растворе 10 мкг/мл), и центрифугируют при 18000 g в течение 15 мин. Супернатант, содержащий растворимую фракцию белка отбирают, аликвоту объемом 10 мкл смешивают с 5 мкл буфера для нанесения пробы в ПААГ (50 мМ Трис-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,1% бромфенолового синего, 10% глицерола, 5% меркаптоэтанола), нагревают смесь в течение 5 минут при 100°C, и наносят на гель. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике Лэммли, и сканируют с помощью денситометра Typhoon FLA9500 (Healthcare, Великобритания). Клоны, обнаруживающие наибольший выход белка (образование на геле яркой полосы с молекулярной массой 85 кДа) отбирают для дальнейшей работы, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают на -70°C для хранения.For electrophoresis, equal aliquots of cells of different clones are centrifuged at 3000 g for 15 minutes, and divided into soluble and insoluble fractions of the protein. For this, the precipitated cells are dissolved in 200 μl of 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 100 mM sodium chloride. Cells are sequentially lysed by adding lysozyme (
Для препаративной экспрессии штаммы-суперпродуценты Е. coli BL-rEPA выращивают в течение ночи при 37°C с добавлением 1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина на среде 2xYT, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина и выращивают при 37°C до достижения 0,8 единиц оптической плотности. Добавляют ИПТГ до 1 мМ, и проводят экспрессию в течение 4 часов при 37°C. Далее клетки собирают центрифугированием при 3000 g 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°C до этапа выделения белка.For preparative expression, E. coli BL-rEPA super-producer strains are grown overnight at 37 ° C with 1% glucose and 50 μg / ml ampicillin in 2xYT medium, 10 ml of overnight culture in 1000 ml of 2xYT medium containing 0.1 % glucose and 50 μg / ml ampicillin and grown at 37 ° C to achieve 0.8 units of optical density. IPTG up to 1 mM was added and expression was performed for 4 hours at 37 ° C. The cells are then harvested by centrifugation at 3000 g for 10 minutes and stored as frozen pellets at a temperature of -70 ° C until the protein isolation step.
Пример 3. Выделение и очистка белка rEPA из бактериальной биомассы.Example 3. Isolation and purification of rEPA protein from bacterial biomass.
Все этапы выделения рекомбинантного белка rEPA проводят при температуре +4°C. 50 г биомассы суспендируют в 200 мл раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 200 мМ хлорида натрия и ингибитор протеаз Complete (Roche Life Sciences, США), а затем проводят лизис бактериальных клеток. Для этого обрабатывают клеточную суспензию лизоцимом (20 мкг/мл) в течение 10 минут при температуре 4°C, затем добавляют к суспензии Triton Х-100 до концентрации 4%, выдерживают на холоде не менее 10 минут, после чего разрушают ДНК и РНК в образовавшейся смеси добавлением ДНКазы и РНКазы до концентрации 10 мкг/мл каждого фермента в присутствии 1 мМ MgCl2, выдерживают при комнатной температуре 15 минут. Полученный клеточный лизат центрифугируют в течение 20 минут при 18000 g.All stages of the isolation of the recombinant rEPA protein are carried out at a temperature of + 4 ° C. 50 g of biomass are suspended in 200 ml of a solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM sodium chloride and Complete protease inhibitor (Roche Life Sciences, USA), and then bacterial cells are lysed. To do this, the cell suspension is treated with lysozyme (20 μg / ml) for 10 minutes at 4 ° C, then added to a Triton X-100 suspension to a concentration of 4%, kept in the cold for at least 10 minutes, after which DNA and RNA are destroyed the resulting mixture by adding DNase and RNase to a concentration of 10 μg / ml of each enzyme in the presence of 1 mm MgCl 2 , incubated at room temperature for 15 minutes. The resulting cell lysate was centrifuged for 20 minutes at 18,000 g.
Для подготовки колонки с металл-хелатным сорбентом, заряженным ионами кобальта, 2 мл металл-хелатной смолы Talon Superflow помещают в колонку Tricorn 5×100 (GE Healthcare, Великобритания) и промывают 20 объемами деионизированной воды, затем уравновешивают буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия. Осветленный лизат наносят на металл-хелатную смолу на скорости 1 мл/мин, промывают колонку буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия. Элюцию проводят буфером 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия, содержащим 250 мМ имидазола.To prepare a column with a cobalt-charged metal chelate sorbent, 2 ml of Talon Superflow metal-chelate resin was placed in a
Очищенный фьюжн белок SUMO-rEPA расщепляют протеазой SUMO. Протеазу добавляют к раствору белка в буфере 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 200 мМ хлорида натрия с добавлением 1 мМ ДТТ. Массовое соотношение белка SUMO-rEPA к протеазе SUMO составляет 1:1000. Протеолиз проводят при комнатной температуре в течение 2 часов. Расщепление белка контролируют денатурирующим электрофорезом в 12% ПААГ (Фиг. 3, дорожка 3).Purified fusion protein SUMO-rEPA is digested with SUMO protease. The protease is added to a protein solution in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 200 mM sodium chloride with 1 mM DTT added. The mass ratio of SUMO-rEPA protein to SUMO protease is 1: 1000. Proteolysis is carried out at room temperature for 2 hours. Protein cleavage is monitored by denaturing electrophoresis in 12% PAG (Fig. 3, lane 3).
Рекомбинантный белок rEPA отделяют от отщепленного пептида SUMO и продуктов гидролиза ионообменной хроматографией. Стадию очистки проводят на колонке, упакованной 2 мл ионообменной смолы DEAE Sepharose (GE Healthcare, Великобритания). Сорбент промывают 20 объемами буфера Б: 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 500 мМ хлорида натрия, затем уравновешивают буфером А: 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 20 мМ хлорида натрия. Белковый элюат, полученный на стадии металл-хелатной хроматографической очистки, разводят 1:20 Буфером А и наносят на колонку на скорости 1 мл/мин. Колонку промывают 10 объемами Буфера А. Элюцию белка осуществляют градиентом Буфера Б от 0% до 100% в течение 40 минут при скорости потока 1 мл/мин. Фракции, содержащие белок rEPA, идентифицируют электрофорезом в 12% ПААГ (Фиг. 3, дорожка 4), концентрируют при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra-15 (Millipore, США).The recombinant rEPA protein is separated from the cleaved SUMO peptide and hydrolysis products by ion exchange chromatography. The purification step is carried out on a column packed with 2 ml of DEAE Sepharose ion exchange resin (GE Healthcare, UK). The sorbent is washed with 20 volumes of buffer B: 20 mm Tris-HCl, pH 7.5, 500 mm sodium chloride, then balance with buffer A: 20 mm Tris-HCl, pH 7.5, 20 mm sodium chloride. The protein eluate obtained in the metal-chelate chromatographic purification step is diluted 1:20 with Buffer A and applied to the column at a speed of 1 ml / min. The column is washed with 10 volumes of Buffer A. The protein is eluted with a gradient of Buffer B from 0% to 100% for 40 minutes at a flow rate of 1 ml / min. Fractions containing rEPA protein were identified by electrophoresis in 12% PAG (Fig. 3, lane 4), concentrated using Amicon Ultra-15 centrifuge concentrators (Millipore, USA).
Сконцентрированный белок rEPA доочищают с применением эксклюзионной хроматографии на колонке Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной фосфатно-солевым буфером (1,7 мМ KH2PO4, 5 мМ Na2HPO4 150 мМ NaCl, pH 7,4). Белковый элюат, полученный на предыдущей стадии, после концентрирования наносят на колонку в объеме 1 мл через петлю инжектора. После снятия всех фракций повторяют нанесение пробы до тех пор, пока не очистят весь объем элюата. В случае получения сложной хроматографической картины каждую фракцию собирают в отдельную пробирку. Фракции, содержащие очищенный рекомбинантный белок определяют денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле (Фиг. 3, дорожка 5), объединяют, концентрируют и измеряют концентрацию белка. Окрашенный гель сканируют в денситометре и определяют сравнительную интенсивность окрашивания полос. Рекомбинантный экзопротеин rEPA хранят в аликвотах при температуре -70°C в присутствии 30% глицерина. Выход рекомбинантного белка rEPA составляет 0,25 г с литра культуры.The concentrated rEPA protein was further purified by size exclusion chromatography on a Superdex 200 column (GE Healthcare) equilibrated with phosphate-buffered saline (1.7 mM KH 2 PO 4 , 5 mM Na 2 HPO 4 150 mM NaCl, pH 7.4). The protein eluate obtained in the previous step, after concentration, is applied to the column in a volume of 1 ml through an injector loop. After removing all fractions, the application is repeated until the entire volume of the eluate is purified. In the case of obtaining a complex chromatographic picture, each fraction is collected in a separate tube. Fractions containing purified recombinant protein are determined by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (FIG. 3, lane 5), pooled, concentrated, and measured protein concentration. The stained gel is scanned in a densitometer and the comparative intensity of the staining of the bands is determined. Recombinant exoprotein rEPA is stored in aliquots at a temperature of -70 ° C in the presence of 30% glycerol. The yield of recombinant protein rEPA is 0.25 g per liter of culture.
Пример 4. Анализ корректности рекомбинантного белка rEPAExample 4. The analysis of the correctness of the recombinant protein rEPA
Для подтверждения соответствия рекомбинантного белка rEPA нативному белку ЕРА используют метод иммуноблоттинга с поликлональными кроличьими антителами против экзотоксина А P. aeruginosa (Sigma, США). Очищенный белок rEPA в количестве 2 мкг вносят в лунку 12% ПААГ и подвергают электрофорезу в денатурирующих условиях. По окончании электрофореза ПААГ помещают в сэндвич для блоттинга для переноса белков из геля на PVDF мембрану Hybond-P (GE Healthcare, Великобритания). Перенос белков на мембрану проводят в буфере 50 мМ Трис-основание, 38 мМ глицина, 10% этилового спирта в течение часа при напряжении электрического поля 100 V с охлаждением раствора для переноса. По окончании переноса мембрану вынимают и погружают в обезжиренное молоко (МДЖ не более 0,5%) на 40 минут для блокировки свободных валентностей мембраны. Затем мембрану трижды отмывают фосфатно-солевым буфером (1,7 мМ KH2PO4, 5 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Погружают мембрану в раствор кроличьих поликлональных антител против экзотоксина А Р. aeruginosa (Sigma, США) с разведением антител в фосфатно-солевом буфере 1:20000 (в соответствии с инструкцией производителя). Инкубируют в течение 1 ч при 37°C на орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при 300 об./мин. Отмывают трижды в фосфатно-солевом буфере с добавлением 0,05% Твин-20. Отмытую мембрану помещают в раствор козьих антител к иммуноглобулинам класса G кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена (Sigma, США), в фосфатно-солевом буфере в разведении 1:80000 (в соответствии с инструкцией производителя). Инкубируют мембрану в растворе конъюгата в течение 40 минут при 37°C с перемешиванием на орбитальном шейкере при 300 об./мин. Отмывают мембрану шестикратно фосфатно-солевым буфером с добавлением 0,05% Твин-20. Проявляют связавшиеся со специфическими антителами против экзотоксина А Р. aeruginosa молекулы конъюгата козьих антител с пероксидазой хрена, погружая мембрану в 1% раствор диаминобензидина, содержащий NiCl2, CoCl2 и 0,001% Н2О2. Выдерживают мембрану в проявляющем растворе до развития окраски (но не более 5 минут), не допуская фонового окрашивания мембраны. Для остановки реакции мембрану вынимают из окрашивающего раствора и погружают в деионизированную воду, после чего просушивают с помощью фильтровальной бумаги. Результаты иммуноблоттинга для рекомбинантного белка rEPA показаны на Фиг. 4.To confirm the correspondence of the recombinant rEPA protein to the native EPA protein, the method of immunoblotting with polyclonal rabbit antibodies against P. aeruginosa exotoxin A (Sigma, USA) is used. Purified rEPA protein in an amount of 2 μg was added to a well of 12% PAG and subjected to electrophoresis under denaturing conditions. At the end of electrophoresis, PAAG is placed in a sandwich for blotting to transfer proteins from the gel to the Hybond-P PVDF membrane (GE Healthcare, UK). The transfer of proteins to the membrane is carried out in a buffer of 50 mm Tris base, 38 mm glycine, 10% ethanol for one hour at an electric field voltage of 100 V with cooling the solution for transfer. At the end of the transfer, the membrane is removed and immersed in skim milk (MF no more than 0.5%) for 40 minutes to block the free valencies of the membrane. Then the membrane is washed three times with phosphate-buffered saline (1.7 mM KH 2 PO 4 , 5 mM Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4). Immerse the membrane in a solution of rabbit polyclonal antibodies against exotoxin A of P. aeruginosa (Sigma, USA) with dilution of antibodies in phosphate-buffered saline 1: 20,000 (in accordance with the manufacturer's instructions). Incubated for 1 h at 37 ° C on an orbital shaker (Elmi, Latvia) at 300 rpm. Washed three times in phosphate-buffered saline with the addition of 0.05% Tween-20. The washed membrane is placed in a solution of goat antibodies to rabbit class G immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase (Sigma, USA) in phosphate-saline buffer at a dilution of 1: 80,000 (in accordance with the manufacturer's instructions). The membrane is incubated in the conjugate solution for 40 minutes at 37 ° C with stirring on an orbital shaker at 300 rpm. The membrane is washed six times with phosphate-buffered saline with the addition of 0.05% Tween-20. The goat antibodies with horseradish peroxidase conjugate molecules bound to specific antibodies against exotoxin A of P. aeruginosa are shown by immersing the membrane in a 1% diaminobenzidine solution containing NiCl 2 , CoCl 2 and 0.001% H 2 O 2 . The membrane is kept in the developing solution until the color develops (but not more than 5 minutes), avoiding background staining of the membrane. To stop the reaction, the membrane is removed from the staining solution and immersed in deionized water, and then dried with filter paper. Immunoblot results for the recombinant rEPA protein are shown in FIG. four.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016126461A RU2636346C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016126461A RU2636346C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2636346C1 true RU2636346C1 (en) | 2017-11-22 |
Family
ID=63853303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016126461A RU2636346C1 (en) | 2016-07-01 | 2016-07-01 | Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2636346C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024263059A1 (en) * | 2023-06-21 | 2024-12-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Fusion precursor proteins of peptide immunogens as components of a covid-19 vaccine |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2553102A2 (en) * | 2010-03-30 | 2013-02-06 | Pfenex Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
| WO2015082571A1 (en) * | 2013-12-04 | 2015-06-11 | Glycovaxyn Ag | Prevention of staphylococcus aureus infections by glycoprotein vaccines synthesized in escherichia coli |
-
2016
- 2016-07-01 RU RU2016126461A patent/RU2636346C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2553102A2 (en) * | 2010-03-30 | 2013-02-06 | Pfenex Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
| WO2015082571A1 (en) * | 2013-12-04 | 2015-06-11 | Glycovaxyn Ag | Prevention of staphylococcus aureus infections by glycoprotein vaccines synthesized in escherichia coli |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DOUGLAS C. M. et al. Exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa: Active, Cloned Toxin Is Secreted into the Periplasmic Space of Escherichia coli // JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, vol. 169, No. 11, p. 4962-4966. * |
| LORY S. et al. Expression and Secretion of the Cloned Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A by Escherichia coli // JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 1988, vol. 170, No. 2, p. 714-719. DOUGLAS C. M. et al. Exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa: Active, Cloned Toxin Is Secreted into the Periplasmic Space of Escherichia coli // JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Nov. 1987, vol. 169, No. 11, p. 4962-4966. * |
| ИСАКОВ М. А. Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств. Автореф. дис. на соискание уч. степ. к.б.н. М., - 2010, 24 c.. * |
| ИСАКОВ М. А. Получение рекомбинантных атоксичных форм экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa и изучение их иммунобиологических свойств. Автореф. дис. на соискание уч. степ. к.б.н. М., - 2010, 24 c.. LORY S. et al. Expression and Secretion of the Cloned Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A by Escherichia coli // JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 1988, vol. 170, No. 2, p. 714-719. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024263059A1 (en) * | 2023-06-21 | 2024-12-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Fusion precursor proteins of peptide immunogens as components of a covid-19 vaccine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| St Geme, Iii et al. | Secretion of the Haemophilus influenzae HMW1 and HMW2 adhesins involves a periplasmic intermediate and requires the HMWB and HMWC proteins | |
| US9802987B2 (en) | Immunogenic fusion polypeptides | |
| US10287330B2 (en) | Methods and compositions relating to CRM197 | |
| JP7042305B2 (en) | Codon-optimized polynucleotide for high-level expression of CRM197 | |
| JPH09500538A (en) | High level expression, purification and regeneration of Neisseria meningitidis outer membrane group B porin protein | |
| JP2001204482A (en) | Structural gene of pneumococcal protein | |
| EP3113800A1 (en) | Enhanced production of recombinant crm197 in e. coli | |
| JPH04506005A (en) | Expression of tetanus toxin fragment C | |
| Knoot et al. | A minimal sequon sufficient for O-linked glycosylation by the versatile oligosaccharyltransferase PglS | |
| CA2915253A1 (en) | Bacterial hyaluronidase and process for its production | |
| RU2636346C1 (en) | Method for obtaining of recombinant exoprotein of a pseudomonas aeruginosa | |
| Shpigel et al. | Production and Purification of a Recombinant Human Hsp60 Epitope Using the Cellulose-Binding Domain InEscherichia Coli | |
| Robertson et al. | Membrane directed expression in Escherichia coli of BBA57 and other virulence factors from the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi | |
| PL181695B1 (en) | Method of expression of the Haemophilus influenzae type b outer membrane protein (Hib-P2) in E.coli cells, vaccine against Haemophilus influenzae type borase expression vectors PL | |
| AU779056B2 (en) | Recombinant iron uptake proteins | |
| RU2617934C1 (en) | Method for bacterial lipopolysaccharides recombinant phosphatase producing | |
| RU2546875C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON CFP10-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pCFP10-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pCFP10-DBD] STRAIN; CFP10-DBD CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION | |
| AU2001256032B2 (en) | Co-expression of recombinant proteins | |
| AU2024229999A1 (en) | Compositions and methods for producing glycoconjugate polypeptides having isopeptide bonds with a second polypeptide partner and uses thereof | |
| RU2627602C2 (en) | METHOD TO OBTAIN CHEMERIC RECOMBINANT PROTEIN fliC:pagN | |
| RU2634385C1 (en) | Method for obtaining of recombinant peptidoglycan-associated lipoprotein (pal) legionella pneumophila | |
| WO2014163176A1 (en) | Method for producing ny-eso-1 protein | |
| RU2575621C1 (en) | STRAIN-PRODUCER OF METHIONINE-FREE CRM197 BASED ON CELLS E. coli BL21 (DE3) | |
| JPH0411892A (en) | Protein of streptokinases, corresponding gene, corresponding plasmid recombinant, corresponding character transformant and production thereof | |
| Faludi et al. | Production and purification of low calcium response protein H of Chlamydophila pneumoniae |