RU2635087C2 - Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов - Google Patents
Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2635087C2 RU2635087C2 RU2014136162A RU2014136162A RU2635087C2 RU 2635087 C2 RU2635087 C2 RU 2635087C2 RU 2014136162 A RU2014136162 A RU 2014136162A RU 2014136162 A RU2014136162 A RU 2014136162A RU 2635087 C2 RU2635087 C2 RU 2635087C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reaction
- acid
- group
- oxo
- regeneration
- Prior art date
Links
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 132
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims abstract description 58
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims abstract description 30
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 23
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 7
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000006727 (C1-C6) alkenyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 125000006552 (C3-C8) cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N (3beta,5beta,7alpha)-3,7-Dihydroxycholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 RUDATBOHQWOJDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 claims description 29
- RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N chenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-BSWAIDMHSA-N 0.000 claims description 27
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 26
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 26
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 26
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 25
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 25
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 25
- 229960001661 ursodiol Drugs 0.000 claims description 25
- 229960001091 chenodeoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 23
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 22
- 108010032887 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 21
- MIHNUBCEFJLAGN-RAEYQWLJSA-N 3alpha,7beta-dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 MIHNUBCEFJLAGN-RAEYQWLJSA-N 0.000 claims description 20
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 20
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 19
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 claims description 18
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 18
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 claims description 18
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 claims description 16
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 claims description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 14
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 claims description 14
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 150000002440 hydroxy compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 9
- 108010062875 Hydroxysteroid Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000011145 Hydroxysteroid Dehydrogenases Human genes 0.000 claims description 8
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 8
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 8
- MIHNUBCEFJLAGN-UHFFFAOYSA-N 12-oxo-chenodeoxycholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(=O)C2 MIHNUBCEFJLAGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 7
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 7
- 241001464870 [Ruminococcus] torques Species 0.000 claims description 7
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 claims description 6
- RHCPKKNRWFXMAT-RRWYKFPJSA-N 3alpha,12alpha-dihydroxy-7-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)[C@@H](O)C[C@@H]3[C@]21C RHCPKKNRWFXMAT-RRWYKFPJSA-N 0.000 claims description 5
- -1 C 6 sugars Chemical class 0.000 claims description 5
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 5
- MAFJMPFLJJCSTB-FQBQTYDJSA-N 7,12-dioxolithocholic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)C(=O)C[C@@H]3[C@]21C MAFJMPFLJJCSTB-FQBQTYDJSA-N 0.000 claims description 4
- RHCPKKNRWFXMAT-UHFFFAOYSA-N 7-oxodeoxycholic acid Natural products C1CC(O)CC2CC(=O)C3C4CCC(C(CCC(O)=O)C)C4(C)C(O)CC3C21C RHCPKKNRWFXMAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 4
- BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N ursocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-UTLSPDKDSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N dehydroepiandrosterone Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC=C21 FMGSKLZLMKYGDP-USOAJAOKSA-N 0.000 claims description 2
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 claims description 2
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UUEVFMOUBSLVJW-UHFFFAOYSA-N oxo-[[1-[2-[2-[2-[4-(oxoazaniumylmethylidene)pyridin-1-yl]ethoxy]ethoxy]ethyl]pyridin-4-ylidene]methyl]azanium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C1=CC(=C[NH+]=O)C=CN1CCOCCOCCN1C=CC(=C[NH+]=O)C=C1 UUEVFMOUBSLVJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 abstract 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 45
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 45
- 108010014831 7-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 21
- 108010007843 NADH oxidase Proteins 0.000 description 20
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 19
- JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N pentan-2-ol Chemical compound CCCC(C)O JYVLIDXNZAXMDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102100039358 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Human genes 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 12
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 241001468191 Lactobacillus kefiri Species 0.000 description 10
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 9
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 9
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 8
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 7
- 241000192130 Leuconostoc mesenteroides Species 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DXOCDBGWDZAYRQ-AURDAFMXSA-N 7-oxolithocholic acid Chemical compound C1C[C@@H](O)C[C@H]2CC(=O)[C@H]3[C@@H]4CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]4(C)CC[C@@H]3[C@]21C DXOCDBGWDZAYRQ-AURDAFMXSA-N 0.000 description 6
- 102000016912 Aldehyde Reductase Human genes 0.000 description 6
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 description 6
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 108010073927 12-alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 241000193457 Anaerocolumna aminovalerica Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- DXOCDBGWDZAYRQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5beta)-3-Hydroxy-7-oxocholan-24 -oic acid Natural products C1CC(O)CC2CC(=O)C3C4CCC(C(CCC(O)=O)C)C4(C)CCC3C21C DXOCDBGWDZAYRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical compound C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001147706 Clostridium sardiniense Species 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000428 Lactate Dehydrogenases Human genes 0.000 description 2
- 108010080864 Lactate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 2
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 2
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- SBPPWJIDARICBS-PGCXOGMSSA-N (5r,5ar,8ar,9r)-5-[[(4ar,6r,7r,8r,8as)-7,8-dihydroxy-2-phenyl-4,4a,6,7,8,8a-hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxin-6-yl]oxy]-9-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-5a,6,8a,9-tetrahydro-5h-[2]benzofuro[6,5-f][1,3]benzodioxol-8-one Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4OC(OC[C@H]4O3)C=3C=CC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 SBPPWJIDARICBS-PGCXOGMSSA-N 0.000 description 1
- 108010070743 3(or 17)-beta-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 3alpha,7alpha-dihydroxy-12-oxo-5beta-cholanic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)C(=O)C1 MIHNUBCEFJLAGN-DMMBONCOSA-N 0.000 description 1
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2-pentanol Chemical compound CC(C)CC(C)O WVYWICLMDOOCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031025 Alanine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 description 1
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical group OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 102100034067 Dehydrogenase/reductase SDR family member 11 Human genes 0.000 description 1
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000864782 Homo sapiens Surfactant-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 1
- 244000025090 Lactobacillus sanfrancisco Species 0.000 description 1
- 235000013864 Lactobacillus sanfrancisco Nutrition 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 241000192003 Leuconostoc carnosum Species 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010036197 NAD phosphite oxidoreductase Proteins 0.000 description 1
- 108010014870 NADPH Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002247 NADPH Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000134861 Ruminococcus sp. Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030059 Surfactant-associated protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241001147775 Thermoanaerobacter brockii Species 0.000 description 1
- 241000186337 Thermoanaerobacter ethanolicus Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 1
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000911 decarboxylating effect Effects 0.000 description 1
- WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L disodium (S)-malate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](O)CC([O-])=O WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N etoac etoac Chemical compound CCOC(C)=O.CCOC(C)=O OJCSPXHYDFONPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007871 hydride transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005895 oxidative decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108010065742 rat 3 beta-hydroxy-delta 5-steroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000019265 sodium DL-malate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001394 sodium malate Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011916 stereoselective reduction Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, в частности, и NADP+/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в одной реакционной массе (реакций образования продукта), один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, a) в реакции регенерации, при которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, восстанавливают кислород или соединение общей формулы
где R1 - линейная или разветвленная (С1-С4)-алкильная группа или (С1-С4)-карбоксиалкильная группа, а b) в реакции регенерации, при которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, окисляют (С4-С8)-циклоалканол или соединение общей формулы 
где R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C1-C6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C1-C6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности С6-C12 арил, карбоксил, или (C1-С4) карбоксиалкил, в частности также циклоалкил, например С3-С8 циклоалкил, где окислительная реакция (реакции) и восстановительная реакция (реакции) протекают на одной и той же основной молекулярной цепи. Технический результат: создан способ регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, в частности, NADP+/NADPH для экономически эффективного осуществления двух или более катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций в одной реакционной массе. 13 з.п. ф-лы, 11 ил., 13 пр.
Description
Предпосылки создания изобретения
Настоящее изобретение относится к способу ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и NADP+/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в одной и той же реакционной массе (реакций образования продукта) один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме.
Предшествующий уровень техники
Катализируемые ферментами окислительно-восстановительные реакции используются в промышленности, например, в производстве хиральных спиртов, α-аминокислот и α-оксикислот. В промышленных окислительно-восстановительных реакциях преимущественно применяются кофакторы, например, NADH или NADPH. Особый интерес среди катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций представляют те, в которых окислительно-восстановительные кофакторы регенерируются в ходе реакции с помощью регенерационных систем. Это объясняется тем, что появляется возможность расходовать только каталитические количества дорогостоящих кофакторов (NAD(P)+/NAD(P)H). Наличие соответствующих дегидрогеназ и других ферментов привело к созданию различных систем регенерации кофакторов.
Известные системы можно классифицировать следующим образом: связанные ферментами, связанные субстратами, in vivo (системы регенерации природных кофакторов в живых организмах), фотохимические, химические и электроферментные. В заявленном способе используется связанная ферментами система регенерации. Преимущества связанных ферментами систем заключаются в высокой селективности, пригодности для получения различных продуктов и высокой степени повторного использования кофактора (полное число оборотов - TTN).
В середине 90-х годов первая система связанной ферментами регенерации кофакторов была задействована в промышленном масштабе в объеме нескольких тонн. В ней использовалась дегидрогеназа из Candida boidinii. В известных промышленных процессах, как правило, один окислительно-восстановительный фермент служит для синтеза продукта, а другой - для регенерации кофактора.
От таких способов следует отличать процессы, в которых в одной реакционной среде без промежуточного разделения имеют место две или более ферментных окислительно-восстановительных реакций, связанных с получением продукта, и две ферментные системы регенерации кофактора (одновременной или последовательной). В последнее время такие ферментные каскадные реакции, именуемые здесь совместными реакциями, привлекают большое внимание, поскольку они существенно сокращают производственные затраты, экономят время и снижают нагрузку на окружающую среду. Кроме того, ферментные каскады окислительно-восстановительных реакций облегчают преобразования, которые нелегко осуществить с помощью обычных химических реакций.
Однако осуществить одновременно несколько реакций (окисления и восстановления) в одной совместной реакции с параллельной регенерацией кофактора затруднительно, поскольку часто для отдельных преобразований требуются совершенно разные условия реакции. На сегодняшний день выполнено незначительное число опытов ведения совместных реакций, включающих окислительные и восстановительные реакции с задействованными системами регенерации кофакторов.
В литературе (Advanced Synth. Catal., 2008, Volume 351, Issue 9, p. 1303-1311) описана экспериментальная совместная реакция с участием 7α-гидроксистероид-дегидрогеназы, (HSDH), 7β-HSDH и 12α-HSDH. В этом процессе окисление, как региоселективное, так и стереоселективное, имеет место в положениях 7 и 12 холевой кислоты, с последующим регио- и стереоселективным восстановлением в положении 7. При этом системами регенерации кофактора служат как лактат-дегидрогеназа (NAD+-зависимая), так и глюкозо-дегидрогеназа (NADP+-независимая). Косубстратами являются пируват и глюкоза. Хотя изначально этот процесс замышлялся как совместный, в конце его окислительные и восстановительные реакции выполняются раздельно. При этом разделение этапов окисления и восстановления осуществляют в так называемом реакторе типа «чайный пакет» или в мембранном реакторе. Такое разделение необходимо, чтобы избежать образования побочных продуктов ввиду низкой селективности NADPH-глюкозо-дегидрогеназы по отношению к кофактору. Однако в ходе совместной реакции NADP+ в глюкозо-дегидрогеназе частично преобразуется в NAD+, что препятствует окислению. В описанном способе используется всего 12.5 мМ (~0,5%) субстрата - холевой кислоты, что делает способ неинтересным с экологической точки зрения.
Более того, описана также попытка осуществить дерацемизацию рацематов вторичных спиртов через промежуточный прохиральный кетон с использованием совместной реакции (J. Am. Chem. Soc, 2008, Volume 130, p. 13969-13972). Дерацемизацию вторичных спиртов осуществляют через две спиртовые дегидрогеназы (S- и R-специфичные), обладающие различной специфичностью по отношению к кофактору. В данной системе NADP регенерируют NADPH-оксидазой (создающей перекись водорода), a NADH - формиатной дегидрогеназой. Косубстратами служат формиат и кислород. В этой системе используют 4 фермента, а стадии окисления и восстановления не разделяются. Недостатком способа является крайне низкая концентрация используемого субстрата - 0.2-0.5%, что непригодно для промышленных масштабов.
Еще одна совместная реакция описана в WO 2009/121785 А2. Здесь стереоизомер оптически активного вторичного спирта окисляют до кетона, а затем восстанавливают до соответствующего оптического антипода с применением двух спиртовых дегидрогеназ, имеющих противоположную стереоселективность и различную специфичность по отношению к кофактору. Кофакторы регенерируют с помощью так называемой «системы переноса гидрида», с только одним дополнительным ферментом. Для регенерации кофакторов используют различные ферменты, например, формиат-дегидрогеназу, глюкозо-дегидрогеназу, лактат-дегидрогеназу. Недостатком данного процесса является низкая концентрация субстратов.
Общим недостатком известных ферментных совместных способов с участием систем регенерации кофакторов является очень низкая концентрация субстрата, недостаточная для промышленных процессов.
Напротив, уже известны многие индивидуальные ферментные окислительно-восстановительные реакции, в которых используются системы регенерации кофакторов. Описаны опыты с цельными микроорганизмами, лизатами клеток или выделенными ферментами, которым сопутствует регенерация NAD(P)H или NAD(P)+. К известным ферментным системам регенерации кофакторов относятся, например, формиат-дегидрогеназа для NADH (косубстратом служит формиат), спиртовая дегидрогеназа из Pseudomonas sp. для NADH (косубстратом служит 2-пропанол), гидрогеназа для NADH и NADPH (косубстратом служит Н2), глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа из L. mesenteroides для NADPH (косубстратом служит глюкоза-6-фосфат), глюкозо-дегидрогеназа для NADH и NADPH (косубстратом служит глюкоза), NADH оксидаза для NADH (косубстратом служит О2) и фосфит-дегидрогеназа для NADH (косубстратом служит фосфит).
В качестве примера можно привести использование таких индивидуальных окислительно-восстановительных реакций в производстве хиральных гидроксисоединений, начиная с соответствующих прохиральных кетосоединений. Здесь кофактор регенерируют с помощью дополнительного фермента. Общим для этих способов является то, что реакция восстановления протекает изолированно и что регенерируется NAD(P)H (см., например, ЕР 1152054).
Описаны ферментные процессы с использованием гидроксистероидных дегидрогеназ в сочетании с системой регенерации кофактора, которые протекают при повышенных концентрациях субстрата (> около 1%) (ЕР 1731618; WO 2007/118644; Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011 Volume 90 p. 127-135). В таких способах кофакторы NAD(P)H или NAD(P) регенерируют с помощью различных ферментов, например, лактат-дегидрогеназы (косубстратом служит пируват), спиртовой дегидрогеназы из Т. brockii (косубстратом служит изопропанол), спиртовой дегидроненазы из L. brevis, L. minor, Leuconostoc carnosum, Т. ethanolicus, Clostridium beijerinckii. Однако эти известные способы относятся только к изолированным одиночным реакциям окисления гидроксисоединения или восстановления оксосоединения.
Уже была описана система регенерации кофактора для NADH с использованием малат-дегидрогеназы («малатного фермента») (Can. J. Chem. Eng. 1992, Volume 70, p. 306-312). В этой публикации речь идет о восстановительном аминировании пирувата аланин-дегидрогеназой. Пируват, образующийся при регенерации кофактора, далее используют в реакции образования продукта.
В WO 2004/022764 также описана регенерация NADH малат-дегидрогеназой. В отличие от предыдущей публикации, пируват, образующийся при окислительном декарбоксилировании малата, далее не используется.
Описан пример ферментного восстановления D-ксилозы до ксилита с применением системы регенерации кофактора (FEBS J., 2005, Volume 272, р. 3816-3827). Ферментом, регенерирующим кофактор, служит NADPH-зависимый мутант фосфит-дегидронегазы из Pseudomonas sp. Здесь также имеет место одиночная реакция образования целевого продукта.
Опубликованы и другие примеры ферментативного получения обогащенных хиральными энантиомерами органических соединений - спиртов, аминокислот и т.п. (Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650; US 7,163,815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; ЕР 1285962). В этих системах ферментом, регенерирующим кофактор, служит NAD(P)H-зависимая оксидаза из Lactobacillus brevis или Lactobacillus sanfranciscensis. Речь идет подобным образом об одиночной реакции образования целевого продукта.
В WO 2011/000693 описаны 17-бета-гидроксистероид-дегидрогеназа и способ, позволяющие осуществить окислительно-восстановительные реакции в положении 17 4-андростен-3,17-диона. Это опять-таки одиночная восстановительная реакция. Все рассмотренные индивидуальные реакции окисления или восстановления не обладают преимуществами совместной реакции - низкой себестоимостью за счет экономии времени и материалов и лучшей кратностью оборота за счет ферментных каскадных реакций.
Задача изобретения и описание способа
Задачей настоящего изобретения является создание способа регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, например, и NADP+/NADPH для экономически эффективного осуществления двух или более катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций в одной реакционной массе.
В соответствии с изобретением поставленная задача достигается тем, что в указанном выше способе ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, например, и NADP+/NADPH, путем совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций в одной реакционной массе (реакций образования целевого продукта) один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, указанный способ отличается тем, что
а) в реакции регенерации, при которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, восстанавливают кислород или соединение общей формулы
где R1 - линейная или разветвленная (С1-С4-алкильная группа или (С1-С4)-карбоксиалкильная группа, а
b) в реакции регенерации, в которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, окисляют (С4-С8)-циклоалканол или соединение общей формулы
где R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C1-С6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C1-С6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности, С6-С12 арил, карбоксил или (С1-С4) карбоксиалкил, в частности, циклоалкил, например, С3-C8 циклоалкил.
Способ, заявленный в настоящем изобретении, также называется «способом в соответствии с настоящим изобретением».
В ином аспекте в соответствии с настоящим изобретением заявлен способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, например, и NADP+/NADPH, путем совместной реакции, где в результате по меньшей мере двух дальнейших катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций в той же реакционной массе (реакций образования целевого продукта) один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, отличающийся тем, что
a) в ходе регенерации окисленного кофактора восстанавливают соединение общей формулы
где R1 - замещенная или незамещенная С1-С4 алкильная группа, а
b) в ходе регенерации восстановленного кофактора окисляют соединение общей формулы
где R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей
1) - H,
2) - (С1-С6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным,
3) - (C1-С6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и выборочно содержит от одной до трех двойных связей,
4) - циклоалкил, в частности, С3-C8 циклоалкил.
5) - арил, в частности, С6-С12 арил,
6) - (С1-С4) карбоксиалкил, а в случае, если соединение формулы I является пируватом, и выборочно, также карбоксил.
В еще одном аспекте в способе в соответствии с изобретением R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (С1-С6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C1-С6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности, С6-С12 арил, карбоксил или (С1-С4) карбоксиалкил.
По сравнению с уровнем техники способ в соответствии с изобретением существенно усовершенствует процессы, в которых соединения подвергаются как ферментному окислению, так и восстановлению, поскольку позволяет вести необходимые реакции окисления и восстановления, а также сопутствующие реакции регенерации кофактора, в одной реакционной массе, используя гораздо более высокие, чем в известных способах, концентрации субстрата.
В способе в соответствии с данным изобретением используются кофакторы NADH и/или NADPH. NAD+ означает окисленную форму, a NADH - восстановленную форму никотинамидаденин динуклеотида, тогда как NADP+ означает окисленную форму, a NADPH - восстановленную форму никотинамидаденин динуклеотидфосфата.
Катализируемые ферментами окислительно-восстановительные реакции, которые не связаны с регенерацией кофактора, а в способе в соответствии с изобретением участвуют в образовании целевого продукта, называются «окислительными реакциями» и «восстановительными реакциями». «Окислительные реакции» и «восстановительные реакции» объединены термином «реакции образования продукта». В способе в соответствии с данным изобретением в каждом случае имеет место по меньшей мере одна окислительная реакция и по меньшей мере одна восстановительная реакция.
Если NAD+ служит кофактором для окислительной реакции (реакций), то NADPH является кофактором для восстановительной реакции (реакций). Если NADP+ служит кофактором для окислительной реакции (реакций), то NADH является кофактором для восстановительной реакции (реакций).
В способе в соответствии с настоящим изобретением окислительную реакцию (реакции) и восстановительную реакцию (реакции) можно вести хронологически параллельно или в хронологической последовательности, предпочтительно хронологически параллельно в одной реакционной массе.
Соединения, используемые для получения целевого продукта, далее называются субстратами. Соединения, которые реагируют при регенерации кофакторов, далее называются косубстратами.
В способе в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться один или несколько субстратов. При этом окислительные и/или восстановительные реакции могут протекать как на одном субстрате (основной молекулярной цепи), так и на разных субстратах, предпочтительно на одном субстрате. Далее, в способе в соответствии с настоящим изобретением восстановительные и/или окислительные реакции могут протекать на одной или разных функциональных группах.
Способ в соответствии с настоящим изобретением пригоден для разнообразных реакций, например, для инверсии конфигурации стереоизомерных гидроксисоединений путем окисления до соответствующего кетона с последующим восстановлением до противоположного стереоспецифического гидроксисоединения.
Процесс, в котором для образования продукта используются две или более ферментные окислительно-восстановительные реакции, а две ферментные системы для регенерации кофакторов действуют в одной реакционной массе без выделения промежуточных соединений, здесь называется «совместной реакцией».
Если здесь упоминается какая-либо кислота или соль кислоты, подразумеваются ее соответствующие неназванные соединения. Подобным образом упоминание кислот, в частности, желчных кислот, подразумевает все производные эфиры таких кислот. Далее, упоминание какого-либо вещества подразумевает наличие защитных групп, в т.ч. частичных.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что окислительная реакция и восстановительная реакция протекают хронологически параллельно.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что окислительная реакция и восстановительная реакция протекают на одной основной молекулярной цепи.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в качестве соединения формулы I (2-оксокислоты) используют пируват (косубстрат), который восстанавливают до лактата с помощью лактат-дегидрогеназы, т.е. в реакции регенерации, при которой восстановленный кофактор возвращают в исходную окисленную форму, пируват восстанавливают до лактата с помощью лактат-дегидрогеназы.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в качестве соединения формулы II (вторичного спирта) используют 2-пропанол (изопропиловый спирт, IPA) (косубстрат), который окисляют до ацетона с помощью спиртовой дегидрогеназы, т.е. в реакции регенерации, при которой окисленный кофактор возвращают в исходную восстановленную форму, 2-пропанол окисляют до ацетона с помощью спиртовой дегидрогеназы.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что используют кислород, восстановленный с помощью NADH оксидазы.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в качестве вторичного спирта используют малат (косубстрат), который окисляют до пирувата и СО2 с помощью декарбоксилирующей оксалоацетат малат-дегидрогеназы («малатного фермента»), т.е. в реакции регенерации, при которой окисленный кофактор возвращают в исходную восстановленную форму, малат окисляют до пирувата и СО2 с помощью с помощью малат-дегидрогеназы.
В этом варианте образующийся пируват вступает в последующую окислительно-восстановительную реакцию, которая не связана с образованием целевого продукта, а представляет собой реакцию регенерации второго кофактора.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что его используют для проведения по меньшей мере одной окислительной реакции и по меньшей мере одной восстановительной реакции соответственно в той же реакционной массе на соединениях общей формулы
где
R4 - водород, метальная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R5 - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метальная группа,
R6 - водород или гидроксигруппа,
R7 - водород, -COR13, где R13 - С1-С4 алкильная группа, незамещенная или замещенная гидроксигруппой, или С1-С4 карбоксиалкильная группа, замещенная, в частности, гидроксигруппой или незамещенная,
или R6 и R7 вместе представляют собой оксогруппу,
R8 - водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R9 - водород, метильная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R10 - водород, метильная группа или галоген,
R11 - водород, метильная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галоген, а
R12 - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метильная группа,
где структурный элемент
означает бензольное кольцо или кольцо, содержащее 6 атомов углерода и 0, 1 или 2 С-С-двойные связи;
причем субстрат (субстраты) предпочтительно присутствуют в концентрации <5 мас. % в реакционной массе для восстановительной реакции (реакций), связанных с образованием целевого продукта.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что имеет место ферментное преобразование дегидроэпиандростерона (DHEA) формулы
в тестостерон формулы
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что ферментная эпимеризация гидроксистероидного соединения 3α,7α-дигидрокси-5β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты, CDC) формулы
происходит путем окисления до кетолитохолевой кислоты (KLC) формулы
и восстановления до 3α,7β-дигидрокси-5β-холановой кислоты (урсодеоксихолевой кислоты, UDC) формулы
например, с использованием двух противоположных стереоспецифических гидроксистероидных дегидрогеназ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что его используют для ферментной эпимеризации гидроксистероидного соединения 3α,7α,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты (холевой кислоты) формулы
путем либо
А) окисления с получением 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-CDC) формулы
которая далее реагирует с получением 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы
и последующего восстановления до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы
либо
В) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы
с последующим ферментным окислением с получением 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы XI и последующим восстановлением до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII, либо
С) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы XIII с последующим ферментным восстановлением до 3α,7β,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты формулы
и с последующим окислением с получением стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII;
либо
с помощью любой комбинации А), В) и/или С),
например, с использованием 3 стереоспецифичных гидроксистероидных дегидрогеназ, 2 из которых обладают противоположной стереоспецифичностью.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в качестве субстрата используют С5- или С6-сахар, например, способ используют для изомеризации С5- или С6-сахаров.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что изомеризацию глюкозы осуществляют путем восстановления до сорбита и окисления до фруктозы, например, способ используют для изомеризации глюкозы путем ее восстановления до сорбита и последующего окисления до фруктозы.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно осуществляют в водной системе, где субстрат для реакции восстановления и окисления частично присутствует в нерастворенном состоянии в виде суспензии и/или в виде второй жидкой фазы.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что субстрат (субстраты) для окислительной реакции (реакций), связанных с получением продукта, вводят в реакционную массу в концентрации по меньшей мере 5 мас. % и более, предпочтительно 7 мас. % и более, особенно предпочтительно 9 мас. % и более, в пределах от 5 до 20 мас. %, например, 5-15 мас. %, например, 5-12 мас. %, например, 5-10 мас. %.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что в реакциях получения продукта в целом достигается конверсия >70%, в частности, >90%.
В способе в соответствии с настоящим изобретением в водную систему можно добавлять буфер. Пригодными буферами являются, например, фосфат калия, Tris-HCl и глицин с pH от 5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. В дополнение или вместо них в систему можно вводить для стабилизации ферментов ионы, например, Mg2+, или другие добавки. В способе в соответствии с настоящим изобретением концентрация введенных кофакторов NAD(P)+ и NAD(P)H обычно составляет от 0.001 мМ до 10 мМ, предпочтительно от 0.01 мМ до 1 мМ.
В зависимости от используемых ферментов способ в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять при температуре от 10°С до 70°С, предпочтительно от 20°С до 45°С.
Гидроксистероидные дегидрогеназы (HSDH) - это ферменты, которые катализируют окисление гидроксигрупп в соответствующие кетогруппы или, наоборот, восстановление кетогрупп до соответствующих гидроксигрупп в стероидном скелете.
Пригодные гидроксистероидные дегидрогеназы, которые могут использоваться для окислительно-восстановительных реакций на гидроксистероидах, - это, например, 3α-HSDH, 3β-HSDH, 7α-HSDH, 7β-HSDH или 17β-HSDH.
Пригодные ферменты с активностью 7α-HSDH можно получить, например, из Clostridia (Clostridium absonum, Clostridium sordelii), Escherichia coli или Bacteroides fragilis.
Пригодные ферменты с активностью 7β-HSDH можно получить, например, из Ruminococcus sp. или Clostridium absonum.
Пригодные лактат-дегидрогеназы можно получить, например, из Oryctolagus cuniculus.
Пригодные спиртовые дегидрогеназы можно получить, например, из Lactobacillus kefir.
Пригодную ксилозо-редуктазу можно получить, например, из Candida tropicalis.
Пригодные сорбит-дегидрогеназы можно получить, например, из печени овец, Bacillus subtilis или Malus domestica.
Пригодные NADH-оксидазы можно получить, например, из Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans, Clostridium aminovalericum.
В способе в соответствии с настоящим изобретением ферменты преимущественно используются как белки, имеющие рекомбинантную сверхпродукцию в Е. coli, а лизаты соответствующих клеток преимущественно используются повторно без дальнейшей очистки. Поэтому единица фермента 1 U соответствует количеству фермента, необходимому для реакции с 1 мкмолем субстрата в минуту.
Описание чертежей
На фиг. 1 представлена схема реакции эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту через промежуточную 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и пируват.
На фиг. 2 представлена схема реакции эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту через промежуточную 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют малат и пируват.
На фиг. 3 представлена схема реакции эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту через промежуточную 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и кислород.
На фиг. 4 представлена схема реакции изомеризации глюкозы в фруктозу, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и пируват.
На фиг. 5 представлена схема реакции изомеризации глюкозы в фруктозу, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и кислород.
На фиг. 6 представлена схема реакции эпимеризации холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту через промежуточные 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту и 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и пируват.
На фиг. 7 представлена схема реакции эпимеризации холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту через промежуточные 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту и 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и кислород.
На фиг. 8 и фиг. 9 представлены схемы реакции эпимеризации холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту через промежуточные 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту и 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановую кислоту, причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол, пируват и кислород.
На фиг. 10 представлены возможные схемы реакции эпимеризации холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту через различные промежуточные соединения и с различными системами регенерации кофакторов. Для регенерации NAD+ используют либо лактат-дегидрогеназу (субстратом служит пируват), либо NADH-оксидазу (субстратом служит кислород). Для регенерации NADPH используют спиртовую дегидрогеназу (субстратом служит изопропанол).
На фиг. 11 представлена схема реакции эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту через промежуточную 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановую кислоту (7-кетолитохолевую кислоту = 7K-LCA=KLC), причем для регенерации кофактора используют 2-пропанол и 2-пентанол (то и другое для спиртовой дегидрогеназы), а также пируват (для лактат-дегидрогеназы) и кислород (для NADH-оксидазы).
На чертежах приняты следующие сокращения:
| BsSDH | сорбит-дегидрогеназа из Bacillus subtilis |
| СА = | 3α,7α,12α-тригидрокси-5β-холановая кислота |
| 7β-СА = | 3α,7β,12α-тригидрокси-5β-холановая кислота |
| Саохо | NADH-оксидаза из Clostridium aminovalericum |
| CDC, CDCA | 3α,7α-дигидрокси-5β-холановая кислота |
| CtXR | ксилозо-редуктаза из Candida tropicalis |
| 7α-HSDH | 7α-гидроксистероидная дегидрогеназа |
| 7β-HSDH | 7β-гидроксистероидная дегидрогеназа |
| 12α-HSDH = | 12α-гидроксистероидная дегидрогеназа |
| KLC | 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановая кислота |
| 7K-LCA = | 3α-гидрокси-7-оксо-5β-холановая кислота |
| LacDH | NAD(Н)-зависимая лактат-дегидрогеназа |
| LkADH | NADP(Н)-зависимая спиртовая дегидрогеназа из Lactobacillus kefir |
| Lmoxid = | NADH-оксидаза из Leuconostoc mesenteroides |
| MalDH | NADP(Н)-зависимая малат-дегидрогеназа из Е. coli |
| 7охо-СА = | 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановая кислота |
| 12oxo-CDC = | 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановая кислота |
| 12oxo-KLC = | 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановая кислота |
| 12oxo-UDC = | 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановая кислота |
| SISDH | сорбит-дегидрогеназа из печени овец |
| SmOxo | NADH-оксидаза из Streptococcus mutans |
| UDC. UDCA | 3α,7β-дигидрокси-5β-холановая кислота |
В нижеследующих примерах все данные о температуре приведены в градусах Цельсия (°С). Использованы следующие сокращения:
| EtOAc | этилацетат |
| h | час(часы) |
| IPA | изопропиловый спирт (2-пропанол) |
| МеОН | метанол |
| Rt | комнатная температура |
Пример 1
Эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и спиртовой дегидрогеназы кофакторов
Используют 0.5 мл загрузки, включающей 50 мг хенодеоксихолевой кислоты, 12 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 6 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 0.5 мМ NAD+ и 0.3 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 6 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы и 350 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 6 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и поначалу 2.4 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону урсодеоксихолевой кислоты. Через 6 часов дополнительно дозируют 1.6 мас. % IPA, через 16 часов - еще 2.4 мас. % IPA, через 24 часа - 3.9 мас. % IPA и через 40 часов - 0.8 мас. % IPA. Кроме того, через 24 часа добавляют 20 мкл 4-метил-2-пентанола. Через 46 часов добавляют 200 мкл 2-пентанола и 1.6 мас. % IPA. Через 48 часов доля урсодеоксихолевой кислоты среди всех желчных кислот в реакционной смеси составляет >97%.
Пример 2
Эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и малат-дегидрогеназы кофакторов
Используют 0.5 мл загрузки, включающей 50 мг хенодеоксихолевой кислоты, 20 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 20 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 1 мМ NAD+ и 1 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 10 U лактат-дегидрогеназы (фирмы Sigma-Aldrich), а для запуска реакции - 16.5 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 20 U рекомбинантной малат-дегидрогеназы из Escherichia coli и 320 мМ малата натрия. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать выделению образующегося СО2. Через 16 часов и через 40 часов дополнительно дозируют 20 U 7α-HSDH и 10 U лактат-дегидрогеназы. Через 20, 24, 44 и 48 часов дополнительно дозируют 10 U 7β-HSDH. Наконец, через 40 часов добавляют 10 U малат-дегидрогеназы. Через 72 часа доля урсодеоксихолевой кислоты среди всех желчных кислот в реакционной смеси составляет около 90%.
Пример 3
Эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от NADH-оксидазы и спиртовой дегидрогеназы кофакторов
Используют 0.5 мл загрузки, включающей 50 мг хенодеоксихолевой кислоты, 12 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 7.5 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 1 мМ NAD+ и 1 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 20 U рекомбинантной NADH-оксидазы из Clostridium aminovalericum. Для регенерации NADPH используют 5 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и поначалу 2% мас. IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 6) при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону урсодеоксихолевой кислоты. Через 18 часов, 22 часа, 26 часов и 41 час дополнительно дозируют по 2 мас. % IPA, а через 41 час и 48 часов - еще по 5% IPA. Через 24 часа добавляют 20 U NADH-оксидазы, а через 41 час - 7,5 U 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы и 5 U спиртовой дегидрогеназы. Через 48 часов доля урсодеоксихолевой кислоты среди всех желчных кислот в реакционной смеси составляет около 95-98%.
Пример 4
Переработка и анализ желчных кислот
По завершении реакций, описанных в примерах 1-3, реакционную смесь экстрагируют EtOAc. Затем растворитель удаляют выпариванием. Выпаренный осадок растворяют в смеси МеОН:ацетонитрил:буферный фосфат натрия с рН 3, 0.78 г/л (40:30:37) и контролируют конверсию хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту высокоточной жидкостной хроматографией. Для этого используют сепарационную колонку с обратной фазой (ZORBAX®Eclipse® XDB С18, расход 0.8 мл/мин) и детектор рефракции света (RID) модели Agilent 1260 Infinity®, оба фирмы Agilent Technologies Inc.
Пример 5
Конверсия глюкозы в фруктозу с помощью ксилозо-редуктазы и сорбит-дегидрогеназы при использовании спиртовой дегидрогеназы для регенерации NADPH и лактат-дегидрогеназы для регенерации NAD+
Загрузка 0.5 мл содержит 50 мг/мл глюкозы и 6 U/мл рекомбинантной ксилозо-редуктазы из Candida tropicalis (сверхпродуцированной в E. coli BL21 (DE3)) и 0.1 мМ NADP+. Для регенерации кофактора добавляют 7% IPA и рекомбинантную спиртовую дегидрогеназу из Lactobacillus kefir (сверхпродуцированную в E. coli BL21 (DE3)). Ферменты применяют в виде лизатов клеток. Реакцию проводят в течение 24 часов при 40°С и рН 9 (50 мМ буфера Tris-HCl) в открытой системе с непрерывным перемешиванием (900 об/мин). Открытость системы позволяет удалять ацетон, что способствует сдвигу реакции в сторону образования сорбита. В открытой системе вода и IPA также испаряются, поэтому их дополнительно дозируют через 6 часов и через 21 час. Таким образом, в системе постоянно поддерживается общий объем 0.5 мл и концентрация IPA 7 об. %. Через 24 часа реакционную массу инкубируют в вакууме при 60°С с целью инактивации ферментов и испарения органических растворителей. После охлаждения до комнатной температуры добавляют рекомбинантную сорбит-дегидрогеназу из Bacillus subtilis (сверхпродуцированную в E. coli BL21 (DE3)) в конечной концентрации 5 U/мл, ZnCb в конечной концентрации 1 мМ и NAD+ в конечной концентрации 0.1 мМ. Для регенерации кофактора используют 5 U/мл (конечная концентрация) лактат-дегидрогеназы из мышечной массы кролика (фирмы Sigma Aldrich) и 300 мМ пирувата. Загрузку доливают водой до объема 0.5 мл. Реакцию проводят еще 24 часа при 40°С в закрытой системе с непрерывным перемешиванием (900 об/мин). Достигается конверсия D-глюкозы в D-фруктозу >90%.
Пример 6
Конверсия глюкозы в фруктозу с помощью ксилозо-редуктазы и сорбит-дегидрогеназы при использовании спиртовой дегидрогеназы для регенерации NADPH и NADH-оксидазы для регенерации NAD+
Загрузка 0.5 мл содержит 50 мг/мл глюкозы, 6 U/мл рекомбинантной ксилозо-редуктазы из Candida tropicalis (сверхпродуцированной в E.coli BL21 (DE3)) и 0.1 мМ NADP+. Для регенерации кофактора добавляют 7 об. % IPA и рекомбинантную спиртовую дегидрогеназу из Lactobacillus kefir (сверхпродуцированную в E. coli BL21 (DE3)). Ферменты применяют в виде лизатов клеток. Реакцию проводят в течение 24 часов при 40°С и рН 8 (50 мМ буфера Tris-HCl) в открытой системе с непрерывным перемешиванием (900 об/мин). Открытость системы позволяет удалять ацетон, что способствует сдвигу реакции в сторону образования сорбита. В открытой системе вода и IPA также испаряются, поэтому их дополнительно дозируют через 6 часов и через 21 час. Таким образом, в системе постоянно поддерживается общий объем 0.5 мл и концентрация IPA 7 об. %. Через 24 часа реакционную массу инкубируют в вакууме при 60°С с целью инактивации ферментов и испарения IPA и любых органических растворителей. После охлаждения до комнатной температуры добавляют рекомбинантную D-сорбит-дегидрогеназу из Bacillus subtilis (сверхпродуцированную в E. coli BL21 (DE3)) в конечной концентрации 5 U/мл, CaCl2 в конечной концентрации 1 мМ и смесь NAD+ и NADH в конечной концентрации 0.1 мМ. Для регенерации кофактора используют 10 U/мл (конечная концентрация) NADH-оксидазы из Leuconostoc mesenteroides (сверхпродуцированной в E. coli BL21 (DE3)). Ферменты применяют в виде лизатов клеток. Загрузку доливают водой до объема 0.5 мл. Реакцию проводят 24 часа при 40°С в открытой системе с непрерывным перемешиванием (900 об/мин), чтобы обеспечить достаточное поступление кислорода из воздуха для NADH-оксидазы. В этой открытой системе вода испаряется. Поэтому через 6 часов и через 21 час ее доливают водой до объема 0,5 мл. Достигается конверсия D-глюкозы в D-фруктозу около 98%.
Пример 7
Переработка и анализ сахаров
Загрузку инкубируют при 65°С 10 мин для инактивации ферментов и затем центрифугируют. Супернатант фильтруют сквозь фильтр из ПВДФ 0,2 мкм и анализируют лигандообменной высокоточной жидкостной хроматографией (аппаратура фирмы Agilent Technologies Inc.). При этом сахара и полиолы разделяют через свинцовую колонку фирмы Showa Denko К.К. (Shodex® Sugar SP0810) с расходом 0.5 мл/мин воды (VWR International GmbH, HPLC Grade) при 80°C. Используют детектор рефракции света (RID, Agilent 1260 Infinity®, Agilent Technologies Inc.). Также применяют встроенный фильтр фирмы Agilent Technologies Inc. и предварительные колонки - анионообменную (Shodex® Axpak-WAG), с обратной фазой (Shodex® Asahipak® ODP-50 6Е) и предварительную сахарную колонку (SUGAR SP-G) фирмы Showa Denko К.К.
Пример 8
Биоконверсия холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту с помощью 12α-гидроксистероидной дегидрогеназы, 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы с системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и спиртовой дегидрогеназы кофакторов
Загрузка 0,5 мл содержит 25 мг холевой кислоты, 12,5 U рекомбинантной 12α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Eggertella lenta or Lysinibacillus sphaericus, 16 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 6 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 1 мМ NAD+ и 1 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 12.5 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы из Oryctolagus cuniculus (мышечная изоформа) и 200 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 5 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и поначалу 2 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты. Через 18 часов и 24 часа дополнительно дозируют по 2 мас. % IPA. Через 48 часов 61% холевой кислоты прореагировали с образованием 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты.
Пример 9
Биоконверсия холевой кислоты в 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановую кислоту с помощью 12α-гидроксистероидной дегидрогеназы, 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы с системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы, NADH-оксидазы и спиртовой дегидрогеназы кофакторов
Загрузка 0,5 мл содержит 25 мг холевой кислоты, 12,5 U рекомбинантной 12α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Eggertella lenta or Lysinibacillus sphaericus, 16 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 6 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 1 мМ NAD+ и 1 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 5 U рекомбинантной NADH-оксидазы из Leuconostoc mesenteroides и 12.5 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы из Oryctolagus cuniculus (мышечная изоформа) и 200 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 5 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы из Oryctolagus cuniculus (мышечная изоформа) и 200 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 5 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и первоначально 2 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) и при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин).
Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты. Через 18 часов и 24 часа дополнительно дозируют по 2 мас. % IPA. Через 48 часов 70% холевой кислоты прореагировали с образованием 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты.
Пример 10
Эпимеризация хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и спиртовой дегидрогеназы кофакторов. Преимущества добавления хлорида марганца (MnCl2)
Используют 0.5 мл загрузки, включающей 50 мг хенодеоксихолевой кислоты, 12 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 6 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 0.5 мМ NAD+ и 0.3 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 6 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы и 350 мМ пирувата натрия. Для регенерации NADPH используют 6 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и поначалу 2.4 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) и 5 мМ MnCl2 при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону урсодеоксихолевой кислоты. Через 6 часов дополнительно дозируют 1.6 мас. % IPA, через 16 часов - еще 2.4 мас. % IPA и через 24 часа - 3.9 мас. % IPA. Через 36 часов добавляют 200 мкл 2-пентанола и 3 мас. % IPA, а через 48 часов - 100 мкл 2-пентанола и 4 мас. %» IPA. Через 64 часа доля урсодеоксихолевой кислоты среди всех желчных кислот в реакционной смеси составляет >99%. В частности, на хенодеоксихолевую кислоту приходится около 0.3%. В контрольных опытах без добавления MnCl2 доля хенодеоксихолевой кислоты составляет около 2%, а доля урсодеоксихолевой кислоты - около 97.5% (средняя величина по 5 опытам в каждой группе).
Пример 11
Эпимеризация хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от спиртовой дегидрогеназы кофакторов, а также комбинированной системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и NADH-оксидазы кофакторов
Используют 0.5 мл загрузки, включающей 50 мг хенодеоксихолевой кислоты, 12 U рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 6 U рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 0.5 мМ NAD+ и 0.3 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 6 U рекомбинантной лактат-дегидрогеназы и 350 мМ пирувата натрия. Дополнительно для регенерации NAD+ используют 9 U рекомбинантной NADH-оксидазы из Leuconostoc mesenteroides и 6 U рекомбинантной NADH-оксидазы из Clostridium aminovalericum.. Для регенерации NADPH используют 6 U рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и первоначально 2.4 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) при 25°С и при непрерывном перемешивании (850 об/мин). Система используется все время открытой, чтобы способствовать испарению ацетона и сдвигу реакции в сторону урсодеоксихолевой кислоты. Через 6 часов дополнительно дозируют 1.6 мас. % IPA, через 16 часов - еще 2.4 мас. % IPA и через 24 часа - 3.9 мас. % IPA. Через 36 часов добавляют 200 мкл 2-пентанола и 3 мас. % IPA, а через 48 часов - 100 мкл 2-пентанола и 4 мас. % IPA. Через 64 часа доля урсодеоксихолевой кислоты среди всех желчных кислот в реакционной смеси составляет >99%. В частности, на хенодеоксихолевую кислоту приходится около 0.2%. В контрольных опытах без добавления NADH-оксидазы доля хенодеоксихолевой кислоты составляет около 2%, а доля урсодеоксихолевой кислоты - около 97.5% (средняя величина по 5 опытам в каждой группе).
Пример 12
Эпимеризации хенодеоксихолевой кислоты в урсодеоксихолевую кислоту 7α-гидроксистероидной дегидрогеназой и 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой с системой регенерации зависимых от спиртовой дегидрогеназы кофакторов, а также комбинированной системой регенерации зависимых от лактат-дегидрогеназы и NADH-оксидазы кофакторов. Эффект от добавлении 2-пентанола и 2-пропанола
Используют 50 мл загрузки, включающей 5 г хенодеоксихолевой кислоты, 24 U/мл рекомбинантной 7α-гидроксистероидной дегидрогеназы из Escherichia coli, 12 U/мл рекомбинантной 7β-гидроксистероидной дегидрогеназы из Ruminococcus torques, а также 0.55 мМ NAD+ и 0.3 мМ NADPH. Для регенерации NAD+ используют 12 U/мл рекомбинантной лактат-дегидрогеназы и 350 мМ пирувата натрия. Дополнительно для регенерации NAD+ используют 18 U/мл рекомбинантной NADH-оксидазы из Leuconostoc mesenteroides и 12 U/мл рекомбинантной NADH-оксидазы из Clostridium aminovalericum.. Для регенерации NADPH используют 12 U/мл рекомбинантной спиртовой дегидрогеназы из Lactobacillus kefir и поначалу 1.5 мас. % IPA. Реакцию проводят в водной среде с буфером - фосфатом калия (100 мМ, рН 7.8) и 5 мМ МnСl2 при 25°С. В трехгорлышковой колбе перемешивание осуществляется прецизионной стеклянной мешалкой со скоростью около 100 об/мин. Ацетон, выделяющийся в ходе реакции, отводят потоком воздуха через реакционный сосуд (около 400-600 мл/мин). Поскольку при этом испаряется и 2-пропанол, необходимо его дополнительное дозирование, например, в количестве 0.75 мл (1,5 часа), 0.75 мл (3 часа), 0.5 мл (4 часа), 0.75 мл (6 часов), 0.75 мл (8 часов), 0.5 мл (11 часов), 0.5 мл (14 часов), 0.5 мл (17 часов), 0.5 мл (21 час), 1 мл (23 часа), 2.5 мл (25 часов), 4 мл (29 часов). Через примерно 30 часов добавляют 20 мл 2-пентанола и 2 мл 2-пропанола. Через 46 часов с начала реакции доля 7-кетолитохолевой кислоты составляет около 1% (от суммы хенодеоксихолевой, урсодексихолевой и 7-кетолитохолевой кислот). Далее добавляют 2-пропанол: 3 мл (46 часов), 4 мл (52 часа), 4 мл (54 часа), а также 10 мл 2-пентанола. Через 72 часа реакции содержание 7-кетолитохолевой кислоты может быть сведено до менее 0.2%. Доля урсодеоксихолевой кислоты составляет >99%.
Пример 13
Исследование и анализ желчных кислот
После завершения реакций, описанных в примерах 8-12, можно анализировать желчные кислоты, присутствующие в опытах, по методике, приведенной в примере 4.
Claims (76)
1. Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, в частности, и NADP+/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в одной реакционной массе (реакций образования продукта), один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, отличающийся тем, что
a) в реакции регенерации, при которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, восстанавливают кислород или соединение общей формулы
где R1 - линейная или разветвленная (С1-С4)-алкильная группа или (С1-С4)-карбоксиалкильная группа, а
b) в реакции регенерации, при которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, окисляют (С4-С8)-циклоалканол или соединение общей формулы
где R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C1-C6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C1-C6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности С6-C12 арил, карбоксил, или (C1-С4) карбоксиалкил, в частности также циклоалкил, например С3-С8 циклоалкил,
где окислительная реакция (реакции) и восстановительная реакция (реакции) протекают на одной и той же основной молекулярной цепи.
2. Способ по п. 1 ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов NAD+/NADH и/или, в частности, и NADP+/NADPH в совместной реакции, в котором в результате по меньшей мере двух катализируемых ферментами окислительно-восстановительных реакций, протекающих в той же реакционной массе (= реакций образования продукта), один из двух окислительно-восстановительных кофакторов накапливается в восстановленной форме, а другой, соответственно, в окисленной форме, отличающийся тем, что
a) при регенерации окисленного кофактора восстанавливают соединение общей формулы
где R1 - замещенная или незамещенная C1-С4 алкильная группа, а
b) при регенерации восстановленного кофактора окисляют соединение общей формулы
где R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей
1) -Н,
2) -(C1-C6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным,
3) -(C1-C6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и выборочно содержит от одной до трех двойных связей,
4) -циклоалкил, в частности С3-C8 циклоалкил,
5) -арил, в частности C6-C12 арил,
6) -(C1-С4) карбоксиалкил, а в случае, если соединение формулы I является пируватом, выборочно, также карбоксил.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что R2 и R3 независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, (C1-C6) алкил, где алкил является линейным или разветвленным, (C1-C6) алкенил, где алкенил является линейным или разветвленным и содержит от одной до трех двойных связей, арил, в частности C6-C12 арил, карбоксил или (C1-С4) карбоксиалкил.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что окислительная реакция (реакции) и восстановительная реакция (реакции) протекают хронологически параллельно.
5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, 2-пропанол окисляют до ацетона с помощью спиртовой дегидрогеназы.
6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой восстановленный кофактор преобразуется в исходную окисленную форму, пируват восстанавливают до лактата с помощью лактат-дегидрогеназы.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что при реакции регенерации, в которой окисленный кофактор преобразуется в исходную восстановленную форму, малат окисляют до пирувата и СО2 с помощью малат-дегидроненазы.
8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что его используют для проведения по меньшей мере одной окислительной реакции и по меньшей мере одной восстановительной реакции соответственно в той же реакционной массе на соединениях общей формулы
где
R4 - водород, метальная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R5 - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метальная группа,
R6 - водород или гидроксигруппа,
R7 - водород, -COR13, где R13 - С1-С4 алкильная группа, незамещенная или замещенная гидроксигруппой, или C1-С4 карбоксиалкильная группа, замещенная, в частности, гидроксигруппой или незамещенная,
или R6 и R7 вместе представляют собой оксогруппу,
R8 - водород, метальная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R9 - водород, метальная группа, гидроксигруппа или оксогруппа,
R10 - водород, метальная группа или галоген,
R11 - водород, метальная группа, гидроксигруппа, оксогруппа или галоген, а
R12 - водород, гидроксигруппа, оксогруппа или метальная группа,
где структурный элемент
означает бензольное кольцо или кольцо, содержащее 6 атомов углерода и 0, 1 или 2 С-С-двойные связи; причем субстрат (субстраты) предпочтительно присутствуют в концентрации <5 мас. % в реакционной массе для восстановительной реакции (реакций), связанных с образованием целевого продукта.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что его используют для конверсии дегидроэпиандростерона (DHEA) формулы
в тестостерон формулы
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что его используют для ферментной эпимеризации 3α,7α-дигидрокси-5β-холановой кислоты (хенодеоксихолевой кислоты) формулы
в кетолитохолевую кислоту формулы
путем окисления
и в стереоизомерное гидроксисоединение 3α,7β-дигидрокси-5β-холановую кислоту (урсодеоксихолевую кислоту) формулы
путем последующего восстановления,
с использованием двух противоположно стереоспецифичных гидроксистероидных дегидрогеназ, в частности, где окислительную реакцию катализируют 7α-гидроксистероидной дегидронегазой из Е. coli; и/или восстановительную реакцию катализируют 7β-гидроксистероидной дегидрогеназой из Ruminococcus torques.
11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что его используют для ферментной эпимеризации 3α,7α,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты (холевой кислоты) формулы
либо
А) путем окисления с получением 3α,7α-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-CDC) формулы
которая далее реагирует с получением 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы
и последующего восстановления до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы
либо
B) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы
с последующим ферментным окислением до 3α-гидрокси-7,12-диоксо-5β-холановой кислоты (12-оксо-KLC) формулы XI и последующим восстановлением до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII,
либо
C) путем окисления с получением 3α,12α-дигидрокси-7-оксо-5β-холановой кислоты формулы XIII с последующим ферментным восстановлением до 3α,7β,12α-тригидрокси-5β-холановой кислоты формулы
и последующего окисления до стереоизомерного гидроксисоединения 3α,7β-дигидрокси-12-оксо-5β-холановой кислоты (12-кето-урсодеоксихолевой кислоты) формулы XII;
с использованием 3 стереоспецифичных гидроксистероидных дегидрогеназ, из которых 2 обладают противоположной стереоспецифичностью.
12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что его используют для изомеризации C5-или С6-сахаров, в частности для изомеризации глюкозы путем восстановления сорбитом и последующего окисления до фруктозы.
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что субстрат (субстраты) для окислительной реакции (реакций), связанных с получением продукта, вводят в реакционную массу в концентрации по меньшей мере 5 мас. % и более, предпочтительно 7 мас. % и более, особенно предпочтительно 9 мас. % и более.
14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в реакциях получения продукта в целом достигается конверсия ≥70%, в частности ≥90%.
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12450007.5 | 2012-02-07 | ||
| EP12450007 | 2012-02-07 | ||
| PCT/EP2012/067781 WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2012-09-12 | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
| EPPCT/EP2012/067781 | 2012-09-12 | ||
| AT12842012A AT513721B1 (de) | 2012-12-10 | 2012-12-10 | Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren |
| ATA1284/2012 | 2012-12-10 | ||
| PCT/EP2013/052313 WO2013117584A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-02-06 | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014136162A RU2014136162A (ru) | 2016-03-27 |
| RU2635087C2 true RU2635087C2 (ru) | 2017-11-09 |
Family
ID=48946925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014136162A RU2635087C2 (ru) | 2012-02-07 | 2013-02-06 | Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9644227B2 (ru) |
| EP (1) | EP2812439B1 (ru) |
| JP (1) | JP6329086B2 (ru) |
| KR (1) | KR102022137B1 (ru) |
| CN (2) | CN104136620A (ru) |
| AR (1) | AR089841A1 (ru) |
| AU (1) | AU2013218042B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014019287B1 (ru) |
| CA (1) | CA2862384C (ru) |
| ES (1) | ES2742381T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20191514T1 (ru) |
| HU (1) | HUE044690T2 (ru) |
| IN (1) | IN2014DN07015A (ru) |
| LT (1) | LT2812439T (ru) |
| MX (1) | MX358771B (ru) |
| MY (1) | MY172493A (ru) |
| NZ (1) | NZ627477A (ru) |
| PH (1) | PH12014501770B1 (ru) |
| PL (1) | PL2812439T3 (ru) |
| PT (1) | PT2812439T (ru) |
| RS (1) | RS59114B1 (ru) |
| RU (1) | RU2635087C2 (ru) |
| SA (1) | SA113340270B1 (ru) |
| SG (1) | SG11201404614XA (ru) |
| SI (1) | SI2812439T1 (ru) |
| TW (1) | TW201343623A (ru) |
| UA (1) | UA117453C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013117584A1 (ru) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
| AT513928B1 (de) | 2013-02-06 | 2015-06-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Fructose |
| CA2907576C (en) * | 2013-03-27 | 2021-05-04 | Annikki Gmbh | Method for isomerisation of glucose |
| EP3105313B1 (en) * | 2014-04-02 | 2020-01-29 | The Regents of The University of California | A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains co-factor balance |
| US9890397B1 (en) | 2015-07-15 | 2018-02-13 | Gaurab Chakrabarti | Hydrogen peroxide production method, system, and apparatus |
| WO2017016949A1 (de) * | 2015-07-24 | 2017-02-02 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen produktion von oxidations- und reduktionsprodukten von gemischten zuckern |
| CN105861613B (zh) * | 2016-03-30 | 2019-12-13 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种熊去氧胆酸制备方法 |
| WO2017202686A1 (de) | 2016-05-23 | 2017-11-30 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen umwandlung von d-glucose in d-fructose via d-sorbitol |
| WO2018036982A1 (de) * | 2016-08-22 | 2018-03-01 | Pharmazell Gmbh | Chemisch-biokatalytisches verfahren zur herstellung von ursodesoxycholsäure |
| US11203769B1 (en) | 2017-02-13 | 2021-12-21 | Solugen, Inc. | Hydrogen peroxide and gluconic acid production |
| CN106957886A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-07-18 | 南京远淑医药科技有限公司 | 一种熊去氧胆酸的制备方法 |
| CN107315038B (zh) * | 2017-07-06 | 2019-06-18 | 江南大学 | 一种批量化对酒类样品中氨基甲酸乙酯快速测定的方法 |
| JP6559745B2 (ja) | 2017-08-23 | 2019-08-14 | 株式会社東芝 | 半導体デバイス検査装置、半導体デバイス検査方法、そのプログラム、半導体装置およびその製造方法 |
| CN108251491A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-07-06 | 中山百灵生物技术有限公司 | 一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法 |
| WO2019195842A1 (en) * | 2018-04-06 | 2019-10-10 | Braskem S.A. | Novel nadh-dependent enzyme mutants to convert acetone into isopropanol |
| CN109055473A (zh) * | 2018-08-21 | 2018-12-21 | 湖南宝利士生物技术有限公司 | 一种基于酶法偶联技术合成熊去氧胆酸和高手性纯度d-氨基酸的方法 |
| CN111217744A (zh) * | 2018-11-26 | 2020-06-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种d-氨基酸基nad+类似物及其合成和应用 |
| CN109486895A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-19 | 南京工业大学 | 一种催化拆分制备异甘草酸的方法 |
| CN109486896A (zh) * | 2018-12-04 | 2019-03-19 | 南京工业大学 | 一种催化拆分制备异甘草酸的方法 |
| CN110387360B (zh) * | 2019-06-18 | 2021-12-28 | 华东理工大学 | 羟基类固醇脱氢酶及其在合成熊去氧胆酸前体中的应用 |
| CN111593085A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-28 | 四川澄华生物科技有限公司 | 一种12-酮基胆酸的制备方法 |
| CN112813128A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-18 | 中山百灵生物技术股份有限公司 | 一种别熊去氧胆酸的合成方法 |
| KR102504343B1 (ko) | 2021-02-22 | 2023-02-28 | 전남대학교산학협력단 | 단량체 이소시트레이트 디하이드로게나아제에 기반한 nadph 재생 시스템 및 이의 용도 |
| CN116536279B (zh) * | 2022-01-25 | 2023-11-14 | 杭州馨海酶源生物科技有限公司 | 一种基因工程菌及在制备去氢表雄酮上的应用 |
| EP4464786A1 (de) | 2023-05-15 | 2024-11-20 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von wässerigen lösungen enthaltend d-psicose oder l-psicose |
| EP4446422A3 (de) * | 2023-03-15 | 2025-12-10 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend l-psicose |
| WO2024189215A2 (de) * | 2023-03-15 | 2024-09-19 | Annikki Gmbh | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend d-psicose |
| EP4446421A1 (de) | 2023-04-11 | 2024-10-16 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von allitol |
| EP4574983A1 (de) | 2023-12-22 | 2025-06-25 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von allitol |
| WO2024213621A2 (de) | 2023-04-11 | 2024-10-17 | Annikki Gmbh | Verfahren zur herstellung von allitol |
| EP4464785A1 (de) | 2023-05-15 | 2024-11-20 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung von d-talitol, d-tagatose und d-psicose |
| AR132695A1 (es) | 2023-05-15 | 2025-07-23 | Annikki Gmbh | Procedimiento para la preparación de d-talitol, d-tagatosa y d-psicosa |
| EP4488368A1 (en) | 2023-07-07 | 2025-01-08 | Annikki GmbH | Nad(p)h oxidase |
| EP4488374A1 (de) | 2023-07-07 | 2025-01-08 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend ethylenglycol |
| EP4488376A1 (de) | 2023-07-07 | 2025-01-08 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend l-sorbose |
| EP4545645A1 (de) | 2023-10-27 | 2025-04-30 | Annikki GmbH | Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend glycolsäure |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2426791C2 (ru) * | 2006-04-11 | 2011-08-20 | Иеп Гмбх | Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3502141A1 (de) * | 1985-01-23 | 1986-10-16 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V., 8000 München | Verfahren zur intrasequentiellen cofaktor-regeneration bei enzymatischen synthesen, insbesondere bei der herstellung von vitamin c |
| SI20642A (sl) | 1999-12-03 | 2002-02-28 | Kaneka Corporation | Nova karbonil-reduktaza, gen le-te in postopek za uporabo le-teh |
| DE10140088A1 (de) | 2001-08-16 | 2003-03-13 | Degussa | NADH-Oxidase aus Lactobacillus |
| AU2003257986A1 (en) | 2002-07-31 | 2004-02-16 | Georgia Tech Research Corporation | Methods and compositions for nad(p)(h) oxidases |
| DE10240603A1 (de) | 2002-09-03 | 2004-03-11 | Degussa Ag | Verwendung von Malat-Dehydrogenase zur NADH-Regenerierung |
| EP1731618A1 (en) | 2005-06-07 | 2006-12-13 | Prodotti Chimici E Alimentari Spa | Process for the selective oxydation of colic acid |
| EP1925674A1 (en) | 2006-11-27 | 2008-05-28 | Universiteit van Amsterdam | Regeneration of NADPH and/or NADH cofactors |
| AT506639A1 (de) | 2008-04-01 | 2009-10-15 | Kroutil Wolfgang Dipl Ing Dr T | Verfahren zur deracemisierung von enantiomerengemischen unter verwendung von enzymsystemen |
| IT1398729B1 (it) | 2009-07-01 | 2013-03-18 | F S I Fabbrica Italiana Sint | Processo per la preparazione di testosterone |
| NZ600189A (en) * | 2009-11-30 | 2014-04-30 | Pharmazell Gmbh | Novel 7beta-hydroxysteroid dehydrogenases and their use |
| US8530213B2 (en) | 2009-12-02 | 2013-09-10 | Georgia Tech Research Corporation | Compositions and methods for using NADH oxidases |
| TW201343623A (zh) | 2012-02-07 | 2013-11-01 | Annikki Gmbh | 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法 |
| WO2013117251A1 (de) | 2012-02-07 | 2013-08-15 | Annikki Gmbh | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren |
-
2013
- 2013-01-28 TW TW102103119A patent/TW201343623A/zh unknown
- 2013-01-29 AR ARP130100266A patent/AR089841A1/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 SA SA113340270A patent/SA113340270B1/ar unknown
- 2013-02-06 KR KR1020147023136A patent/KR102022137B1/ko active Active
- 2013-02-06 HU HUE13703568 patent/HUE044690T2/hu unknown
- 2013-02-06 HR HRP20191514 patent/HRP20191514T1/hr unknown
- 2013-02-06 RU RU2014136162A patent/RU2635087C2/ru active
- 2013-02-06 JP JP2014556034A patent/JP6329086B2/ja active Active
- 2013-02-06 CN CN201380008572.8A patent/CN104136620A/zh active Pending
- 2013-02-06 RS RS20191065A patent/RS59114B1/sr unknown
- 2013-02-06 IN IN7015DEN2014 patent/IN2014DN07015A/en unknown
- 2013-02-06 EP EP13703568.9A patent/EP2812439B1/de active Active
- 2013-02-06 CN CN202110638003.8A patent/CN113337568A/zh active Pending
- 2013-02-06 SI SI201331563T patent/SI2812439T1/sl unknown
- 2013-02-06 MX MX2014009455A patent/MX358771B/es active IP Right Grant
- 2013-02-06 ES ES13703568T patent/ES2742381T3/es active Active
- 2013-02-06 BR BR112014019287-1A patent/BR112014019287B1/pt active IP Right Grant
- 2013-02-06 MY MYPI2014702060A patent/MY172493A/en unknown
- 2013-02-06 PL PL13703568T patent/PL2812439T3/pl unknown
- 2013-02-06 PT PT13703568T patent/PT2812439T/pt unknown
- 2013-02-06 CA CA2862384A patent/CA2862384C/en active Active
- 2013-02-06 SG SG11201404614XA patent/SG11201404614XA/en unknown
- 2013-02-06 US US14/376,512 patent/US9644227B2/en active Active
- 2013-02-06 AU AU2013218042A patent/AU2013218042B2/en active Active
- 2013-02-06 UA UAA201409679A patent/UA117453C2/uk unknown
- 2013-02-06 NZ NZ627477A patent/NZ627477A/en unknown
- 2013-02-06 LT LTEP13703568.9T patent/LT2812439T/lt unknown
- 2013-02-06 WO PCT/EP2013/052313 patent/WO2013117584A1/de not_active Ceased
-
2014
- 2014-08-06 PH PH12014501770A patent/PH12014501770B1/en unknown
-
2017
- 2017-04-18 US US15/490,416 patent/US10370691B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-25 US US16/451,838 patent/US11339415B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2426791C2 (ru) * | 2006-04-11 | 2011-08-20 | Иеп Гмбх | Способ получения стероидных производных восстановлением оксостероидных соединений или окислением гидроксистероидных соединений с использованием гидроксистероидной дегидрогеназы |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2635087C2 (ru) | Способ ферментной регенерации окислительно-восстановительных кофакторов | |
| Hummel et al. | Strategies for regeneration of nicotinamide coenzymes emphasizing self-sufficient closed-loop recycling systems | |
| da Silva et al. | The industrial versatility of Gluconobacter oxydans: current applications and future perspectives | |
| PT2004838E (pt) | Processo para a preparação de derivados esteróides mediante a redução de compostos oxosteróides ou mediante a oxidação de compostos hidroxisteróides com recurso a uma hidroxisteróide desidrogenase | |
| Chadha et al. | Microbial alcohol dehydrogenases: recent developments and applications in asymmetric synthesis | |
| KR101948948B1 (ko) | 담즙산, 이들의 염 또는 유도체의 선택적 산화를 위한 신규한 공정 | |
| WO2013117251A1 (de) | Verfahren zur enzymatischen regenerierung von redoxkofaktoren | |
| CN104350157B (zh) | 在双相系统中选择性还原胆汁酸，它们的盐或衍生物的方法 | |
| US10113192B2 (en) | Method for producing fructose | |
| Ouedraogo et al. | Flavoprotein Oxidases | |
| Cabadaj et al. | Investigation of process stability of a whole-cell biocatalyst with Baeyer–Villiger monooxygenase activity in continuous bioreactors | |
| Ferrandi et al. | New trends in the in situ enzymatic recycling of NAD (P)(H) cofactors | |
| HK1204010B (en) | Method for enzymatic regeneration of redox cofactors | |
| AT513721B1 (de) | Verfahren zur enzymatischen Regenerierung von Redoxkofaktoren | |
| US7795004B2 (en) | Process for the racemization of optically active secondary alcohols with the use of two alcohol dehydrogenases | |
| JP2000224984A (ja) | 新規な２級アルコール脱水素酵素、この酵素の製造方法、およびアルコール、アルデヒド、ケトンの製造方法 |