RU2633504C1 - Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles - Google Patents
Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles Download PDFInfo
- Publication number
- RU2633504C1 RU2633504C1 RU2016151604A RU2016151604A RU2633504C1 RU 2633504 C1 RU2633504 C1 RU 2633504C1 RU 2016151604 A RU2016151604 A RU 2016151604A RU 2016151604 A RU2016151604 A RU 2016151604A RU 2633504 C1 RU2633504 C1 RU 2633504C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- iptg
- particles
- antigen
- virus
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 title abstract description 37
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 24
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 12
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims abstract description 7
- 101710199973 Tail tube protein Proteins 0.000 claims abstract 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 101000585552 Bacillus anthracis Protective antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 60
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 14
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 65
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 33
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 32
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 20
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 20
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 9
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 6
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 3
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001672158 Acinetobacter phage AP205 Species 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 2
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 102100026066 Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229910052581 Si3N4 Inorganic materials 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000022338 anthrax infection Diseases 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108010080271 hecolin Proteins 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 2
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- HQVNEWCFYHHQES-UHFFFAOYSA-N silicon nitride Chemical compound N12[Si]34N5[Si]62N3[Si]51N64 HQVNEWCFYHHQES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YYYARFHFWYKNLF-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,4-dimethylphenyl)diazenyl]-3-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound CC1=CC(C)=CC=C1N=NC1=C(O)C(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C12 YYYARFHFWYKNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101500000959 Bacillus anthracis Protective antigen PA-20 Proteins 0.000 description 1
- 101500000960 Bacillus anthracis Protective antigen PA-63 Proteins 0.000 description 1
- 101000870242 Bacillus phage Nf Tail knob protein gp9 Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001137855 Caudovirales Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 1
- 101150105115 PA gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 229960005447 anthrax vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000000567 anti-anemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000418 atomic force spectrum Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 230000002497 edematous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001159 endocytotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000053594 human TNFRSF10B Human genes 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 108091005446 macrophage receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 229960003774 whole virus inactivated tick borne encephalitis Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/07—Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения вакцины для защиты животных и человека от сибиреязвенной инфекции, и позволяет получать основной защитный антиген возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц (ВПЧ), что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность.The invention relates to the field of biotechnology, specifically to methods for producing a vaccine to protect animals and humans from anthrax infection, and allows to obtain the main protective antigen of the causative agent of anthrax Bacillus anthracis in the form of virus-like particles (HPV), which facilitates its cleaning and potentially increases immunogenicity.
Уровень техникиState of the art
Актуальность изобретения связана с тем, что сибирская язва представляет собой природно-очаговое заболевание, среди резервуарных хозяев которого есть дикие животные. Таким образом, окончательное искоренение этой инфекции не представляется возможным, и контроль за заболеваемостью наиболее чувствительных видов домашних животных – крупного рогатого скота и северного оленя – возможен только за счет ежегодной вакцинации. Вакцинация - исторически первое и на сегодняшний день наиболее эффективное средство специфической профилактики бактериальных и вирусных заболеваний людей и животных. Существует несколько подходов к изготовлению вакцинных субстанций [Борисевич И.В. и соавт., Медицинские иммунобиологические препарата, Справочник, Гела-Принт, Москва, 2011]. Это получение аттенуированных живых возбудителей, использование убитых клеток или инактивированных вирусных частиц вирулентных штаммов, а также различные варианты субъединичных вакцин, в которых используются отдельные компоненты возбудителей, выделенные либо из их активных культур, либо полученные генно-инженерным путем. Особо следует отметить такой тип вакцин, как анатоксины – инактивированные экзотоксины бактерий, которые вызывают выработку токсин-нейтрализующих антител, что эффективно защищает человека или животное от бактериальных инфекций, в патогенезе которых выработка экзотоксина имеет определяющее значение.The relevance of the invention is due to the fact that anthrax is a natural focal disease, among the reservoir hosts of which there are wild animals. Thus, the final eradication of this infection is not possible, and control over the incidence of the most sensitive species of domestic animals - cattle and reindeer - is possible only through annual vaccination. Vaccination is historically the first and by far the most effective means of specific prophylaxis of bacterial and viral diseases of humans and animals. There are several approaches to the manufacture of vaccine substances [Borisevich I.V. et al., Medical Immunobiological Preparations, Handbook, Gela-Print, Moscow, 2011]. This is the preparation of attenuated living pathogens, the use of killed cells or inactivated viral particles of virulent strains, as well as various variants of subunit vaccines that use individual components of pathogens isolated either from their active cultures or obtained by genetic engineering. Of particular note is the type of vaccine toxoid - inactivated exotoxins of bacteria that cause the production of toxin-neutralizing antibodies, which effectively protects a person or animal from bacterial infections, in the pathogenesis of which the production of exotoxin is crucial.
Вакцинация животных от сибирской язвы является первым в истории примером создания и коммерциализации вакцины на основе аттенуированного штамма возбудителя, который был получен в лаборатории Л. Пастера [Berche P. (2012) Clin. Microbiol. Infect. 18 (5), 1-6]. Живые сибиреязвенные вакцины используются по настоящее время. В России для вакцинации людей применяется вакцинный штамм B. anthracis СТИ, а для ветеринарных целей – штамм ВНИВВиМ 0055. Вакцинация от сибирской язвы сельскохозяйственных животных входит в число обязательных ветеринарных мероприятий. Взрослому крупному рогатому скоту делают прививки против сибирской язвы один раз в год, желательно весной, перед выгоном на пастбище; телятам и ягнятам - с 3-месячного возраста. Вакцинации подлежат также лошади, козы, и другие животные в случае их нахождения в неблагоприятном по сибирской язве районе.Vaccination of animals from anthrax is the first ever example of the creation and commercialization of a vaccine based on an attenuated strain of the pathogen, which was obtained in the laboratory of L. Pasteur [Berche P. (2012) Clin. Microbiol. Infect. eighteen (5), 1-6]. Live anthrax vaccines are used to date. In Russia, the vaccine strain B. anthracis STI is used to vaccinate people, and the strain VNIVViM 0055 is used for veterinary purposes. Vaccination against anthrax in farm animals is one of the mandatory veterinary measures. Adult cattle are vaccinated against anthrax once a year, preferably in the spring, before pasture on a pasture; calves and lambs - from 3 months of age. Horses, goats, and other animals are also subject to vaccination if they are found in an area unfavorable for anthrax.
Основными факторами патогенности B. anthracis являются капсульный полисахарид, который обуславливает устойчивость бактерий к фагоцитозу и трехчастный экзотоксин [Liu S., Moayeri M., Leppla S.H. (2014) Trends Microbiol. 22(6), 317-325]. Синтез этих факторов патогенности обуславливается двумя крупными плазмидами pX02 и рX01 соответственно. У наиболее традиционного в РФ вакцинного штамма ВНИВВиМ 0055 в процессе аттенуации произошла потеря плазмиды рХO2 и, соответственно, утрата способности к синтезу капсулы. Поэтому основной эффект в протективный иммунитет, формируемый данной вакциной, вносят токсин-нейтрализующие антитела.The main pathogenicity factors of B. anthracis are the capsular polysaccharide, which determines the resistance of bacteria to phagocytosis and the three-part exotoxin [Liu S., Moayeri M., Leppla S.H. (2014) Trends Microbiol. 22 (6), 317-325]. The synthesis of these pathogenicity factors is determined by two large plasmids pX02 and pX01, respectively. In the most traditional vaccine strain VNIVViM 0055 in the Russian Federation, during the attenuation process, the pXO2 plasmid was lost and, accordingly, the ability to synthesize the capsule was lost. Therefore, the main effect in the protective immunity formed by this vaccine is made by toxin-neutralizing antibodies.
Из трех субъединиц сибиреязвенного токсина (PA – протективный антиген, EF – отечный фактор и LF – летальный фактор) набольшее значение имеет развитие иммунного ответа к РА [Wang H.C., An H.J., Yu Y.Z., Xu Q. (2014) Immunol. Lett., S0165-2478(14)00152-7]. Этот белок массой 83 кДа представляет собой рецептор–узнающую субъединицу, способную специфически связываться с рецепторами клеток, которых в настоящее время известно два – опухолевый эндотелиальный маркер (ТЕМ8) и продукт гена морфогенеза капилляров 2 (CMG2). После связывания с рецептором белок РА подвергается процессингу мембранной протеазой класса фуринов и утрачивает N-концевой 20 кДа домен (Домен I, РА20). Образующийся при этом белок РА63 (63 кДа) формирует гептамерные или октамерные комплексы, с которыми связываются каталитически активные субъединицы EF и/или LF. После фагоцитоза связанного с мембраной токсина РА происходит транспорт каталитических субъединиц из эндоцитозного пузырька в цитоплазму клетки, где они проявляют свою энзиматическую активность аденилат-циклазы и металлопротеазы, опосредуя возникновение цитопатогенных эффектов токсина. В отсутствие РА каталитические субъединицы токсина способны проникать в клетки, поэтому образование антител к РА полностью защищает от заражения сибирской язвой. В этой связи РА является основным антигеном, используемым для создания вакцин и сывороток для заблаговременной и экстренной иммунопрофилактики сибирской язвы, хотя имеются работы, направленные на создание иммунитета против каталитических субъединиц или разработку низкомолекулярных ингибиторов этих белков для целей экстренной профилактики.Of the three subunits of anthrax toxin (PA - protective antigen, EF - edematous factor and LF - lethal factor), the development of the immune response to RA is of the greatest importance [Wang H.C., An H.J., Yu Y.Z., Xu Q. (2014) Immunol. Lett., S0165-2478 (14) 00152-7]. This 83 kDa protein is a receptor-recognizing subunit capable of specifically binding to cell receptors, two of which are currently known - the tumor endothelial marker (TEM8) and the product of capillary morphogenesis gene 2 (CMG2). After binding to the receptor, the RA protein is processed by the membrane protease of the furin class and loses the N-
Нейтрализующие антитела обнаруживаются в крови людей и животных в течение 6 – 12 мес.после вакцинации, однако, как было показано, клетки иммунологической памяти, опосредующие образование антител к РА, сохраняются как минимум несколько лет, что обуславливает определенный уровень защиты от инфекции умеренными дозами возбудителя.Neutralizing antibodies are found in the blood of humans and animals within 6 to 12 months after vaccination, however, as shown, immunological memory cells mediating the formation of antibodies to RA remain for at least several years, which leads to a certain level of protection against infection with moderate doses of the pathogen .
Предпринимались неоднократные попытки создать вакцину на основе продуцентов рекомбинантного РА, однако продуктивность многих предложенных штаммов оказывалась не выше, чем продуктивность вакцинного штамма, кроме того, экспрессия не всегда была стабильной [Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. (2008) патент РФ №2321629. Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis 55Δ тпа-1spo-(pUB110-PA1)-продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба]. Высокие защитные дозы PA (от 50 мкг на голову крупного рогатого скота) в сочетании с дорогостоящей очисткой РА в процессе получения субъединичной вакцины не позволили наладить массовый выпуск препаратов ветеринарного назначения ни в одной стране мира. Таким образом, усилия по повышению иммуногенности РА83 в настоящее время сохраняют практическую актуальность, создавая основу для снижения достаточно высокой стоимости вакцин для ежегодной вакцинации крупного рогатого скота и северного оленя против сибирской язвы. Известен ряд изобретений, описывающих повышение продукции РА83 B. anthracis за счет нарушения механизмов катаболической репрессии, прежде всего, гена AbrB [Yusibov V. патент US 20110142870, опубл. 16.06.2011; Yusibov V. патент WO/2008/048344, опубл. 24.04.2008; Baillie L.W.J. патент WO /1998/008952, опубл. 05.03.1998; Baillie L.W.J. патент EP 0927255, опубл. 07.07.1999], а также генов спорообразования [Leppla S.H., патент US 20130058967 опубл. 03.2013].Repeated attempts have been made to create a vaccine based on producers of recombinant RA, however, the productivity of many of the proposed strains was no higher than the productivity of the vaccine strain, in addition, the expression was not always stable [Mikshis N.I., Popov Yu.A., Shulepov D.V. . (2008) RF patent No. 2321629. Asporogenous recombinant strain of Bacillus anthracis 55Δ TPA-1spo- (pUB110-PA1) - producer of the protective antigen of anthrax microbe]. High protective doses of PA (from 50 μg per head of cattle) in combination with expensive cleaning of RA in the process of obtaining a subunit vaccine did not allow the mass production of veterinary preparations in any country in the world. Thus, efforts to increase the immunogenicity of PA83 are currently of practical relevance, creating the basis for reducing the rather high cost of vaccines for annual vaccination of cattle and reindeer against anthrax. A number of inventions are known that describe the increase in PA83 production of B. anthracis due to disruption of the mechanisms of catabolic repression, primarily of the AbrB gene [Yusibov V. Patent US 20110142870, publ. 06/16/2011; Yusibov V. Patent WO / 2008/048344, publ. 04/24/2008; Baillie L.W.J. Patent WO / 1998/008952, publ. 03/05/1998; Baillie L.W.J. Patent EP 0927255, publ. 07/07/1999], as well as spore formation genes [Leppla S.H., patent US 20130058967 publ. 03.2013].
Вакцины на основе рекомбинантных белков имеют целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными. Для них характерен высокий уровень биологической безопасности, так как ни в процессе изготовления, ни в самой готовой субстанции рекомбинантного белка не используются патогенные бактерии, вирусы или продукты их жизнедеятельности [Chroboczek J. Et al. Virus-like particles as vaccine. Acta Biochim. Pol. – 2014. – V.61(3). – P. 531−539]. Рекомбинантные технологии позволяют пользоваться для конструирования вакцин отдельными антигенами и даже их фрагментами, что обеспечивает высокую специфичность ответа. Однако на практике в настоящее время на рынке практически отсутствуют вакцины на основе рекомбинантных белков. Единственным значимым исключением из этого правила является вакцина против вирусного гепатита В [Борисевич И.В. и соавт., Медицинские иммунобиологические препарата, Справочник, Гела-Принт, Москва, 2011].Recombinant protein vaccines have a number of advantages over traditional vaccines. They are characterized by a high level of biological safety, since neither pathogenic bacteria, viruses, or their vital products are used in the manufacturing process or in the finished substance of the recombinant protein [Chroboczek J. Et al. Virus-like particles as vaccine. Acta Biochim. Pol. - 2014 .-- V.61 (3). - P. 531−539]. Recombinant technologies make it possible to use individual antigens and even their fragments for constructing vaccines, which ensures a highly specific response. However, in practice, there are currently virtually no vaccines based on recombinant proteins on the market. The only significant exception to this rule is a vaccine against viral hepatitis B [I. Borisevich et al., Medical Immunobiological Preparations, Handbook, Gela-Print, Moscow, 2011].
В случае противовирусных вакцин основной причиной такого положения является то, что субъединичные вакцины на основе растворимых антигенов уступают по иммуногенности цельновирионным, что приводит к необходимости использования высоких доз рекомбинантных антигенов по сравнению с природными. Природа повышенной иммуногенности антигена, имеющего наноразмерную корпускулярную структуру, остается неизвестной.In the case of antiviral vaccines, the main reason for this situation is that subunit vaccines based on soluble antigens are inferior in immunogenicity to whole-virion ones, which necessitates the use of high doses of recombinant antigens compared to natural ones. The nature of the increased immunogenicity of an antigen having a nanoscale corpuscular structure remains unknown.
Анализ литературы [Летаров и соавт.(2016) Биотехнология №2, С.43–56] показывает, что наименьшая доза антигена – 1,5-3 мкг на дозу –используется при изготовлении цельновирионных инактивированных вакцин против клещевого энцефалита (ФСМЕ и Энцепур) и ветеринарной вакцины против ящура. При вакцинации против сибирской язвы используется протективный антиген в дозе от 50 до 4800 мкг (от 0,7 до 70 мкг/кг живой массы). При этом необходимо учитывать, что в состав вирусных частиц входит не один какой-либо чистый антиген, а набор белков, среди которых «нейтрализуемые» поверхностные антигены составляют, как правило, 1-5%. С учетом этого можно утверждать, что иммуногенность натуральных вирусных частиц вируса клещевого энцефалита и ящура в 200-400 раз выше, чем у протективного антигена B. anthracis, который многие авторы относят к высокоиммуногенным бактериальным белкам.An analysis of the literature [Letarov et al. (2016) Biotechnology No. 2, pp. 43–56] shows that the smallest dose of antigen — 1.5–3 μg per dose — is used in the manufacture of whole-virus inactivated tick-borne encephalitis vaccines (FSME and Enzepur) and a veterinary vaccine against foot and mouth disease. When vaccinating against anthrax, a protective antigen is used in a dose of 50 to 4800 mcg (0.7 to 70 mcg / kg body weight). It should be borne in mind that the composition of the viral particles includes not one pure antigen, but a set of proteins, among which the “neutralizable” surface antigens are, as a rule, 1-5%. With this in mind, it can be argued that the immunogenicity of natural viral particles of tick-borne encephalitis virus and foot and mouth disease is 200-400 times higher than that of the protective antigen B. anthracis, which many authors attribute to highly immunogenic bacterial proteins.
Увеличение иммуногенности белковых антигенов за счет создания искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих целевой антиген на своей поверхности, описано в работе [Chroboczek J., Szurgot I., Szolajska E. (2014) Acta Biochim. Pol., 61, 531-539]. Сходные результаты описаны и в обширной литературе по использованию в качестве адъюванта основного белка жгутиков Salmonella typhimurium – флагеллина [Bennett K.M., Gorham R.D., Gusti V., Trinh L., Morikis D., Lo D.D. (2015) BMC Biotechnol., 15, 71]. Эти и многие другие авторы считают, что основой гипериммунногенности флагеллина (и искусственных белков на его основе) является сочетание способности этого белка к формированию линейных полимеров и высокой аффинности к нему рецепторов макрофагов и дендритных клеток TLR5.An increase in the immunogenicity of protein antigens due to the creation of artificial virus-like particles (HPVs) exposing the target antigen on their surface is described in [Chroboczek J., Szurgot I., Szolajska E. (2014) Acta Biochim. Pol., 61, 531-539]. Similar results are described in the extensive literature on the use of flagellin flagellin [Bennett K.M., Gorham R.D., Gusti V., Trinh L., Morikis D., Lo D.D. as an adjuvant of the main flagellar protein Salmonella typhimurium (2015) BMC Biotechnol., 15, 71]. These and many other authors believe that the basis of flagellin's hyperimmunogenicity (and artificial proteins based on it) is the combination of the ability of this protein to form linear polymers and its high affinity for macrophage receptors and TLR5 dendritic cells.
Еще один подход к получению рекомбинантных антигенов в наноструктурированной форме с целью увеличения иммуногенности описан в работах [Гинцбург А.Л., Лунин В.Г., Карягина-Жулина А.С.(2007) Инновации, №12, 62-67]. При этом наноструктуризация антигена достигается за счет сорбции слитых бифункциональных белков-антигенов, имеющих в своем составе полисахарид-связывающие домены, с полисахаридными наночастицами. Аналогичное решение с применением наночастиц полифосфазола при создании вакцины против коклюша описано в работе [Garlapati S., Eng N.F., et al. (2011) Vaccine, 29(38), 6540-6548. DOI: 10.1016/j.vaccine.2011.07.009].Another approach to producing recombinant antigens in nanostructured form in order to increase immunogenicity is described in [Gunzburg A.L., Lunin V.G., Karyagina-Zhulina A.S. (2007) Innovations, No. 12, 62-67]. At the same time, antigen nanostructuring is achieved by sorption of fused bifunctional protein antigens containing polysaccharide-binding domains with polysaccharide nanoparticles. A similar solution using polyphosphazole nanoparticles when creating a pertussis vaccine is described in [Garlapati S., Eng N.F., et al. (2011) Vaccine, 29 (38), 6540-6548. DOI: 10.1016 / j.vaccine.2011.07.009].
В то же время, само по себе формирование ВПЧ не является достаточным условием повышения иммуногенности до уровня, характерного для нативных вирусных частиц. Из таблицы 1 видно, что HBsAg вируса гепатита В, имеющий форму ВПЧ [Czyż M. et al. (2016) Biologicals, pii: S1045-1056(15)00137-2. DOI: 10.1016/j.biologicals.2015.12.001], используется в вакцинах в относительно высоких концентрациях ~20 мкг на дозу, характерных скорее для растворимых антигенов с высокой иммуногенностью. Антигены возбудителя коклюша B. pertussis: коклюшный антиген, филаментозный гемагглютинин и пертактин – также склонны к формированию агрегатов, что не позволяет считать их истинно мономерными белками и относить получаемые на них результаты к категории растворимых белков или ВПЧ [Scheller E.V., Cotter P.A. (2015) Pathog. Dis., 73(8)]. Аналогичная трудность с интерпретацией данных касается и поведения очищенного HA вируса гриппа, несомненно, склонного к агрегации даже в отсутствие других структурных белков вируса гриппа.At the same time, the formation of HPV in itself is not a sufficient condition for increasing immunogenicity to the level characteristic of native viral particles. From table 1 it is seen that the hepatitis B virus HBsAg in the form of HPV [Czyż M. et al. (2016) Biologicals, pii: S1045-1056 (15) 00137-2. DOI: 10.1016 / j.biologicals.2015.12.001], is used in vaccines in relatively high concentrations of ~ 20 μg per dose, which is more likely for soluble antigens with high immunogenicity. Antigens of the pertussis pathogen B. pertussis: pertussis antigen, filamentous hemagglutinin and pertactin are also prone to the formation of aggregates, which does not allow them to be considered truly monomeric proteins and to classify the results obtained on them as soluble proteins or HPV [Scheller E.V., Cotter P.A. (2015) Pathog. Dis. 73 (8)]. A similar difficulty in interpreting the data concerns the behavior of purified HA influenza virus, which is undoubtedly prone to aggregation even in the absence of other structural proteins of the influenza virus.
Неоднозначные результаты получены и при использовании рекомбинантных ВПЧ, сформированных капсидным антигеном вируса гепатита Е [Zhang X., Wei M., et al. (2014) Vaccine, 32(32), 4039-50]. Разработанная китайской компанией «Xiamen Innovax Biotech» вакцина против вируса гепатита Е HEV239 (коммерческое название Hecolin) в 2012 году прошла третью фазу клинических испытаний на двух группах из 50 000 человек каждая. Испытания проводились в провинции Цзянсу в течение 12 месяцев и показали высокую эффективность. Однако в 2014 году производство вакцины было свернуто из-за высокой себестоимости производства, не обеспечивающей рентабельности. Косвенно это свидетельствует о недостаточной иммуногенности ВПЧ на основе капсидного белка ВГЕ.Ambiguous results were also obtained using recombinant HPVs formed by the capsid antigen of hepatitis E virus [Zhang X., Wei M., et al. (2014) Vaccine, 32 (32), 4039-50]. A vaccine against hepatitis E virus HEV239 (commercial name Hecolin) developed by the Chinese company Xiamen Innovax Biotech in 2012 passed the third phase of clinical trials in two groups of 50,000 people each. Tests were conducted in Jiangsu for 12 months and showed high efficiency. However, in 2014, vaccine production was phased out due to the high cost of production, which does not ensure profitability. Indirectly, this indicates the insufficient immunogenicity of HPV based on the capsid protein of HEV.
В настоящее время в США в стадии испытаний находятся 88 вакцин, основанных на применении ВПЧ самого различного происхождения (clinicaltrials.gov). Большинство этих препаратов предназначено для борьбы с вирусными инфекциями людей. По сведениям [Zeltins A. (2013) Mol. Biotechnol., 53(1), 92-107] было сконструировано около 110 различных вариантов ВПЧ, основанных на белках около 35 семейств вирусов. При создании противовирусных вакцин для защиты людей применяются, в основном, платформы на основе белков вирусов человека и животных, экспрессируемых в эукариотических системах.Currently, 88 vaccines based on the use of HPV of various origins (clinicaltrials.gov) are in the testing phase in the United States. Most of these drugs are designed to fight people’s viral infections. According to [Zeltins A. (2013) Mol. Biotechnol., 53 (1), 92-107], about 110 different HPV variants based on the proteins of about 35 virus families were constructed. When creating antiviral vaccines to protect people, mainly platforms based on proteins of human and animal viruses expressed in eukaryotic systems are used.
Аналогами настоящего изобретения являются изобретения, в которых описаны способы получения различных практически важных белков в форме вирусоподобных частиц. К этому числу можно отнести Патент РФ №2409667 «Вирусоподобные частицы, включающие гибридный белок белка оболочки бактериофага ар205 и антигенного полипептида» швейцарских и латвийских авторов Бахманн М. (CH), Тиссо А. (CH), Дженнингс Г. (CH), Ренхофа Р. (LV), Пумпенс П. (LV), Сиеленс И. (LV) (заявлено 21.09.2005, опубликовано 20.01.2011, заявитель Цитос Биотехнологии АГ (CH). Описанная в этом изобретении вирусоподобная частица (ВПЧ) включает гибридный белок, который состоит из белка бактериофага АР205 и какого-либо антигена. Описана также композиция, включающая ВПЧ на основе РНК-содержащего бактериофага АР205. Изобретение включает в себя способ получения описанных выше ВПЧ. Модифицированная ВПЧ настоящего изобретения применяется для получения композиций для индукции иммунного ответа для профилактики и лечения различных заболеваний, в том числе инфекционных, аллергии, рака и наркомании.Analogues of the present invention are inventions that describe methods for producing various practically important proteins in the form of virus-like particles. This includes Patent RF №2409667 “Virus-like particles, including the hybrid protein of the coat protein of the bacteriophage a205 antigenic polypeptide” by Swiss and Latvian authors Bachmann M. (CH), Tissot A. (CH), Jennings G. (CH), Renhof R. (LV), Pumpens P. (LV), Sielens I. (LV) (claimed September 21, 2005, published January 20, 2011, Applicant Cytos Biotechnology AG (CH). The virus-like particle (HPV) described in this invention includes a hybrid protein , which consists of the protein of the bacteriophage AP205 and any antigen. Also described is a composition comprising HPV based on ov RNA-containing bacteriophage AP205 The invention includes a method for producing the HPV described above The modified HPV of the present invention is used to obtain compositions for inducing an immune response for the prevention and treatment of various diseases, including infectious, allergies, cancer and drug addiction.
В патенте РФ №2375076 «Гибридные вирусоподобные частицы» швейцарских авторов Бахманн М. и Шварц К. (заявлено 12.07.2004, опубликовано 10.12.2009, заявитель Цитос Биотехнологии АГ (CH)) описывается метод получения гибридных антигенов, связанных или слитых с ВПЧ, содержащей, по крайней мере, одну неметилированную CpG-последовательность в составе ДНК, и лиганд toll-подобного рецептора (TLR). Описывается метод получения вакцинной композиции и способ ее введения, обеспечивающий усиление иммунного ответа.In the patent of the Russian Federation No. 2375076 "Hybrid virus-like particles" by Swiss authors Bachmann M. and Schwartz K. (filed July 12, 2004, published December 10, 2009, Applicant Cytos Biotechnology AG (CH)) describes a method for producing hybrid antigens bound or fused to HPV, containing at least one unmethylated CpG sequence in the DNA, and a toll-like receptor ligand (TLR). A method for producing a vaccine composition and a method for its administration, which enhances the immune response, is described.
К аналогам можно отнести Патент РФ №2162856 «Изолированный полипептид, изолированный слитой белок (варианты) для получения наноструктуры» автора Голдберг Э.Б. (заявлено 13.10.1995, опубликовано 10.02.2001, заявитель Нанофреймз ЛЛС.(US)), описывающий метод получения наночастиц с применением белков бактериофага Т4. Метод конструирования полипептидов на основе белка gp36 бактериофага Т4 основан на получении слитого белка, состоящего из N-концевой части белка gp37 Т-четного (или родственного) бактериофага и С-концевых аминокислот белка gp36 (с 10 по 60) или N-концевой части белка gp36 и С-концевой части белка gp34 Т-четного (или родственного) бактериофага. Выделенный белок включает 20 смежных остатков белка gp37, белков gp36 или gp34 Т-четного (или родственного) бактериофага. Изобретение позволяет создавать препараты ВПЧ, размер и свойства которых могут быть адаптированы к конкретным задачам.Patents of the Russian Federation No. 2162856 “Isolated polypeptide, isolated fusion protein (variants) for producing a nanostructure” by B. Goldberg can be attributed to analogues. (Declared 10/13/1995, published 02/10/2001, Applicant NanoFrames LLS. (US)), describing a method for producing nanoparticles using proteins of the bacteriophage T4. The method of constructing polypeptides based on the gp36 protein of the bacteriophage T4 is based on obtaining a fusion protein consisting of the N-terminal part of the gp37 protein of the T-even (or related) bacteriophage and C-terminal amino acids of the gp36 protein (10 to 60) or the N-terminal part of the protein gp36 and the C-terminal portion of the gp34 protein of the T-even (or related) bacteriophage. The isolated protein includes 20 contiguous residues of the gp37 protein, gp36 or gp34 proteins of the T-even (or related) bacteriophage. The invention allows the creation of HPV preparations, the size and properties of which can be adapted to specific tasks.
В патенте РФ №2470941 «Связывающие полипептиды и их применения» американских и канадского авторов Сидху С.С.(US), Бирталан С.К. (US), Феллуз Ф.А. (CA) (заявлено 01.12.2006, опубликовано 27.12.2012, заявитель Genentech Inc. (US)) в числе примеров описывается возможность использования белков Soc и Hoc бактериофага T4 для получения полипептидов, специфически связывающих DR5 человека, перспективных при лечении аллергических расстройств.In the patent of the Russian Federation No. 2470941 "Binding polypeptides and their use" by American and Canadian authors Sidhu S.S. (US), Birtalan S.K. (US), Fellows F.A. (CA) (claimed December 1, 2006, published December 27, 2012, Applicant Genentech Inc. (US)) as examples describes the possibility of using Soc and Hoc proteins of the bacteriophage T4 to obtain polypeptides specifically binding to human DR5, promising in the treatment of allergic disorders.
В качестве аналога изобретения, описывающего способы получения протективного антигена в В. anthracis в E.coli, можно привести патент РФ №2288272 «Высокие уровни конститутивной продукции протективного антигена сибирской язвы» индийских авторов Бхатнагар Р., Вахид С.М., Чаухан В. (заявлено 12.07.2001, опубликовано 27.11.2006, патентообладатель Бхатангар Р.). В патенте описан опытно-промышленный способ получения протективного антигена В. anthracis, включающий культивирование рекомбинантного штамма E.coli в лабораторных ферментерах с подпиткой. Штамм получен на базе плазмиды pQE30. Денатурированный мочевиной рекомбинантный белок РА, имеющий на N-конце 6His-таг, очищают с помощью металлоаффинной хроматографии. Известна также публикация Willhite с соавт., Protein and Peptide Letters, (1998), 5; 273-278, описывающая высокоэффективную экспрессию РА в цитоплазме E.coli в виде растворимого белка. Авторы это работы присоединили к N-концу продукта аффинную метку (таг) для упрощения процедуры его очистки.As an analogue of the invention describing methods for producing a protective antigen in B. anthracis in E. coli, one can cite RF patent No. 2288272 "High levels of constitutive production of protective antigen of anthrax" by Indian authors Bhatnagar R., Wahid S.M., Chauhan V. (claimed July 12, 2001, published November 27, 2006, patent holder Bhatangar R.). The patent describes a pilot industrial method for producing the protective antigen of B. anthracis, including the cultivation of a recombinant strain of E. coli in laboratory-fed fermenters. The strain obtained on the basis of the plasmid pQE30. Urea-denatured recombinant PA protein having the 6His tag at the N-terminus is purified by metal affinity chromatography. A publication by Willhite et al., Protein and Peptide Letters, (1998), 5; 273-278, which describes the highly efficient expression of RA in the E. coli cytoplasm as a soluble protein. The authors of this work attached an affinity tag (tag) to the N-terminus of the product to simplify the procedure for cleaning it.
Наиболее близким прототипом изобретения является действующий патент РФ №2270865 «Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против Bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной Bacillus anthracis» авторов Уильямсон Э.Д. (GB), Миллер Дж. (GB), Уолкер Н.Дж. (GB), Бэйли Л.В.Д. (GB), Холден П.Т. (GB), Флик-Смит Х.К. (GB), Баллифент Х.Л. (GB), Титболл Р.В. (GB), Топпинг Э.В. (GB) (заявка подана 06.07.2001, опубликовано 27.02.2006, заявитель The secretary of State for defense DSTL (GB)). Описан способ получения иммуногенного полипептида, вызывающего иммунный ответ, обеспечивающий защиту от инфекции B. anthracis. Полипептид содержит один, два или три домена полноразмерного протективного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты. По меньшей мере, один из указанных доменов является доменом 1, или доменом 4, или его вариантом. Варианты иммуногенного полипептида, а также полноразмерный РА, получают в результате экспрессии в E.coli. Описана структура векторов для экспрессии в E.coli, кодирующие перечисленные выше иммуногенные полипептиды. Авторы утверждают, что ими разработан способ предупреждения инфекции В. anthracis за счет введения достаточного количества иммуногенного полипептида. Конкретно ими предлагается также вакцина, обеспечивающая защиту мышей от экспериментальной инфекции В. anthracis, содержащая необходимое количество иммуногенного полипептида и носитель. При создании плазмид для экспрессии укороченных вариантов РА в прототипе используется экспрессионная система на основе промотора фага Т7 (вектор pGEX-6-Р3). Для повышения выхода белка оптимизируется кодоновый состав гена РА, повышая общий его общий GC-состав до уровня ~50%, характерного для E.coli (заменяются преимущественно третьи положения кодонов). Для облегчения очистки продукта в прототипе все варианты укороченного РА получаются в виде химерного белка, имеющего в своем составе глутатион-S-трансферазу E.coli. Авторы установили, что при введении созданной ими конструкции в штамм E.coli BL21 (DE3) и культивировании его при 37°С в присутствии индуктора (ИПТГ) полноразмерный PA распределяется между растворимой и нерастворимой клеточными фракциями в пропорции: 350 мг/л нерастворимого продукта против 650 мг/л продукта в растворимой форме.The closest prototype of the invention is the current patent of the Russian Federation No. 2270865 "Immunogenic polypeptide that elicits a protective immune response against Bacillus anthracis (options), method for its preparation, nucleic acid encoding it, expression vector (options), method and vaccine for preventing infection caused by Bacillus anthracis "authors Williamson ED (GB), Miller J. (GB), Walker N.J. (GB), Bailey L.V. D. (GB), Holden P.T. (GB), Flick-Smith H.K. (GB), Ballyfent H.L. (GB), Titball R.V. (GB), Topping E.V. (GB) (application filed July 6, 2001; published February 2, 2006; applicant by The secretary of State for defense DSTL (GB)). A method for producing an immunogenic polypeptide that elicits an immune response that provides protection against B. anthracis infection is described. The polypeptide contains one, two or three domains of a full-sized protective antigen (RA) from B. anthracis or their variants. At least one of these domains is
Продукты получаются в форме телец включения, денатурируются в мочевине, ренатурируются и очищаются на глутатион-S-сефарозе. Для иммунизации все варианты белка РА вводятся мышам в дозе 10 мкг на животное (~500 мкг/кг живой массы) в адсорбированной на гидроксиде алюминия форме (без использования масляного адъюванта Фрейнда) двукратно с интервалом между иммунизациями в 28 суток. Животные дают ответ в виде образования IgG, специфичных к РА, от 6 до 1500 мкг/мл сыворотки. Два варианта белка из 14 испытанных дают полную защиту животных от заражения 105 КОЕ спор штамма В. anthracis (штамм STI), что косвенно говорит о близости использованных концентраций к минимально необходимым для достижения защитного эффекта.Products are obtained in the form of inclusion bodies, denatured in urea, renatured and purified on glutathione-S-Sepharose. For immunization, all variants of the RA protein are administered to mice at a dose of 10 μg per animal (~ 500 μg / kg body weight) in the form adsorbed on aluminum hydroxide (without the use of Freund's oil adjuvant) twice with an interval between immunizations of 28 days. Animals give an answer in the form of the formation of IgG specific for RA from 6 to 1500 μg / ml serum. Two protein variants out of 14 tested provide complete protection of animals against infection of 10 5 CFU spores of B. anthracis strain (STI strain), which indirectly indicates the proximity of the concentrations used to the minimum necessary to achieve a protective effect.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Целью настоящего изобретения является разработка подхода к изучению механизма повышения иммуногенности антигена при его полимеризации и использование этого явления для создания рекомбинантной вакцины против актуальной ветеринарной инфекции - сибирской язвы с применением вирусоподобных частиц на основе белков бактериофагов, декорированных протективным антигеном B. anthracis.The aim of the present invention is to develop an approach to studying the mechanism of increasing the immunogenicity of an antigen during its polymerization and to use this phenomenon to create a recombinant vaccine against an actual veterinary infection - anthrax using virus-like particles based on bacteriophage proteins decorated with the protective antigen B. anthracis.
Задачей настоящего изобретения является разработка метода получения РА В. anthracis в форме ВПЧ путем наработки в клетках E.coli слитого химерного производного, в составе которого РА трансляционно слит с белком трубки капсида Т5-подобного бактериофага DT57C (белок pb6). Белок pb6 является наиболее массовым компонентом хвоста Т5-подобных бактериофагов, в том числе фага DT57C.The objective of the present invention is to develop a method for producing B. anthracis RA in the form of HPV by producing a fused chimeric derivative in E. coli cells, in which RA is translationally fused to the protein of the T5-like bacteriophage DT57C capsid tube protein (pb6 protein). The pb6 protein is the most abundant tail component of T5-like bacteriophages, including the DT57C phage.
Задача изобретения решается путем последовательного выполнения следующих стадий:The objective of the invention is solved by sequentially performing the following stages:
1. Получение конструкции рGEM-TTPPAG по следующей схеме: наработка фрагмента ДНК, соответствующего гену TTP, с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pTTPХ; наработка фрагмента ДНК, соответствующего гену PА, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК B. anthracis ВНИИВВиМ 0055, полученного из НИИ микробиологии МО РФ, г.Киров; соединение фрагментов ДНК путем рестрикции, лигирования и выполнения ПЦР с фланкирующими праймерами на матрице лигазной смеси; клонирование полученного продукта в вектор pGEM-T (Promega).1. Obtaining the pGEM-TTPPAG construct according to the following scheme: production of a DNA fragment corresponding to the TTP gene using pTTPX plasmid as a DNA template; production of a DNA fragment corresponding to the PA gene using B. anthracis VNIIVViM 0055, obtained from the Scientific Research Institute of Microbiology of the Ministry of Defense of the Russian Federation, Kirov, as a matrix; combining DNA fragments by restriction, ligation and PCR with flanking primers on the matrix of the ligase mixture; cloning the resulting product into the pGEM-T vector (Promega).
2. Получение штамма-продуцента путем введения ДНК плазмиды рGEM-TTPPAG в штамм E.coli BL21 (DE3).2. Obtaining a producer strain by introducing the DNA of plasmid pGEM-TTPPAG into E. coli strain BL21 (DE3).
3. Наработка биомассы в условиях, обеспечивающих наилучший выход целевого продукта.3. The accumulation of biomass in conditions that provide the best yield of the target product.
4. Очистка фракции ВПЧ комбинацией низкоскоростного и высокоскоростного центрифугирования.4. Purification of the HPV fraction by a combination of low speed and high speed centrifugation.
5. Оценка гомогенности и размера ВПЧ, содержащих РА B. anthracis, с применением методов динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии.5. Evaluation of the homogeneity and size of HPVs containing B. anthracis RA using dynamic light scattering and atomic force microscopy.
Техническим результатом изобретения является достижение превосходства над прототипом по следующим характеристикам:The technical result of the invention is to achieve superiority over the prototype in the following characteristics:
- устранение необходимости ренатурировать целевой продукт, снижающую его иммуногенность, при сохранении выхода продукта на уровне ~1 г/л культуры;- eliminating the need to renature the target product, reducing its immunogenicity, while maintaining the product yield at the level of ~ 1 g / l of culture;
- устранение необходимости использовать аффинную хроматографию, недостаточно пригодную для промышленной эксплуатации в виду недолговечности сорбентов на основе лиганд-сефарозы без перекрестных сшивок;- eliminating the need to use affinity chromatography, not suitable enough for industrial use due to the fragility of the sorbents based on ligand-sepharose without cross-linking;
- придание антигену формы вирусоподобных частиц, потенциально обладающих повышенной иммуногенностью.- giving the antigen a form of virus-like particles, potentially with increased immunogenicity.
Краткое описание графических изображений:Brief description of graphic images:
Фиг.1. Карта экспрессионной конструкции pGEM-TTPPAG.Figure 1. Map expression construct pGEM-TTPPAG.
Фиг.2. Анализ продуктов экспрессии конструкций pGEM3z и pGEM-TTPPAG методом электрофореза белков в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном Кумасси R-250. Дорожки 1-4: фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z), дорожки 5-8 фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG). Дорожки 1, 5 – цельный гомогенат, 2, 6 – нерастворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 3, 7 – супернатант после ультрацентрифугирования, 4, 8 – осадок после ультрацентрифугирования. Стрелкой отмечено расположение полосы с подвижностью, соответствующей ~121 кДа, присутствующей во фракции осадка после ультрацентрифугирования лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), но отсутствующей в аналогичной фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z).Figure 2. Analysis of expression products of pGEM3z and pGEM-TTPPAG constructs by protein electrophoresis in a 12.5% denaturing polyacrylamide gel stained with Coomassie R-250. Lanes 1-4: E. coli BL21 lysate fractions (DE3, pGEM3z), Lanes 5-8 E. coli BL21 lysate fractions (DE3, pGEM-TTPPAG).
Фиг.3. Анализ продуктов экспрессии конструкций pGEM3z и pGEM-TTPPAG методом электрофореза белков в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном антителами лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика), с последующей визуализацией связанных антител конъюгатом стафилококкового белка А с пероксидазой хрена (ЗАО «Иннотех-21», Москва) и H2O2 в присутствии хромофорного субстрата пероксидазы (N,N’-диаминобензидин). Дорожки 1-5: фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z), дорожки 6-10 фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG). Дорожки 1, 6 – цельный гомогенат, 2, 7 – нерастворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 3, 8 - растворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 4, 9 – супернатант после ультрацентрифугирования, 5, 10 – осадок после ультрацентрифугирования. На дорожках 6-9 хорошо видно расположение иммуноположительной полосы с подвижностью, соответствующей ~121 кДа, присутствующей во фракции осадка после ультра центрифугирования лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), но отсутствующей в аналогичной фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z).Figure 3. Analysis of the expression products of pGEM3z and pGEM-TTPPAG constructs by protein electrophoresis in a 12.5% denaturing polyacrylamide gel stained with horse antibodies, three times hyperimmunized live anti-anemia vaccine (FKP Oryol Biofactory), followed by visualization of coupled antibodies staphylococcus aureus protein conjugate Innotech-21, Moscow) and H 2 O 2 in the presence of a chromophore peroxidase substrate (N, N'-diaminobenzidine). Lanes 1-5: E. coli BL21 lysate fractions (DE3, pGEM3z), Lanes 6-10 E. coli BL21 lysate fractions (DE3, pGEM-TTPPAG).
Фиг.4. Результаты использования метода динамического светорассеяния для оценки распределения размеров и гомогенности наночастиц в очищенных двухступенчатым центрифугированием фракциях лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM3z) (пунктирная кривая) и E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (сплошная кривая). Съемка проведена на приборе Nano-ZS (Malvern instruments, UK) при угле рассеяния 173°.Figure 4. Results of using the dynamic light scattering method to assess the size distribution and homogeneity of nanoparticles in fractions of E.coli BL21 (DE3, pGEM3z) and E.coli BL21 (DE3, pGEM-TTPPAG) fractions purified by two-stage centrifugation (solid curve). The survey was carried out on a Nano-ZS instrument (Malvern instruments, UK) at a scattering angle of 173 °.
Фиг.5. Результаты использования метода атомносиловой микроскопии для оценки распределения размеров и гомогенности наночастиц в очищенных двухступенчатым центрифугированием фракциях лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (А) и E.coli BL21(DE3, pGEM3z) (Б). Съемка проведена на микроскопе Veeco Multimode 8 с контроллером Nanoscope V (Veeco, США) в нерезонансный режим сканирования PeakForce Tapping QNM. В качестве зондов использовали кантилеверы из нитрида кремния SNL-10A (номинальная силовая константа 0,35 Н/м, резонансная частота - 65 кГц) с иглой из кремния.Figure 5. Results of using atomic force microscopy to assess the distribution of size and homogeneity of nanoparticles in fractions of E.coli BL21 (DE3, pGEM-TTPPAG) (A) and E.coli BL21 (DE3, pGEM3z) (B) fractions purified by two-stage centrifugation. The survey was carried out on a
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
1.one. Получение конструкции рGEM-TTPPAGPreparation of pGEM-TTPPAG construct
С целью обеспечения максимально эффективной экспрессии гена полимеризующегося белка бактериофага, слитого с целевым антигеном B. antracis, для создания конструкций был выбран плазмидный вектор, контроль транскрипции целевых генов в котором осуществляется за счет промотора РНК-полимеразы фага Т7. С учетом этого, в целях создания вирусоподобных частиц на всех этапах конструирования были использован векторы семейства pET (Novagen), содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7. Основой для создания конструкций послужила плазмида pESL (Sycheva et al. 2012), которая в свою очередь является производным плазмиды pET28a (Novagen, США). В качестве примера автономно полимеризующегося белка бактериофага порядка Caudovirales был выбран белок pb6, являющийся главным белком хвоста Т5-подобных бактериофагов, в том числе фагов DT57C.In order to ensure the most efficient expression of the gene of the polymerizing bacteriophage protein fused to the target B. antracis antigen, a plasmid vector was chosen to create the constructs, the transcription of the target genes is controlled by the T7 phage RNA polymerase promoter. With this in mind, in order to create virus-like particles at all stages of construction, we used the pET family vectors (Novagen) containing the phage T7 RNA polymerase promoter. The basis for constructs was the pESL plasmid (Sycheva et al. 2012), which in turn is a derivative of the pET28a plasmid (Novagen, USA). As an example of an autonomously polymerizable bacteriophage protein of the Caudovirales order, pb6 protein was selected, which is the main tail protein of T5-like bacteriophages, including DT57C phages.
Ген белка TTP фага DT57C был амплифицирован в реакции ПЦР с праймерами:The TTP protein gene of phage DT57C was amplified by PCR reaction with primers:
57CTTP.F1 – BspHI (TATATTCATGaCTTTACAACTATTACG) и 57CTTP.R2 – EcoRI (TGAATTCTTCACCAGCACTAACTG).57CTTP.F1 - BspHI (TATATTCATGaCTTTACAACTATTACG) and 57CTTP.R2 - EcoRI (TGAATTCTTCACCAGCACTAACTG).
Путем клонирования продукта ПЦР по сайтам NcoI/BspHI и EcoRI/MunI в pESL была получена конструкция pTTPX с геном ТТP (кодирует белок pb6), предназначенная для трансляционного слияния ТТP с целевыми белками через С-конец.By cloning the PCR product at the NcoI / BspHI and EcoRI / MunI sites in pESL, a pTTPX construct with the TTP gene (encodes pb6 protein) was obtained for translational fusion of TTP with target proteins through the C-terminus.
Для создания конструкции, экспрессирующей полноразмерный белок PAG, трансляционно слитый с белком ТТР, ген белка ТТP, содержащийся в плазмиде pTTP, на матрице плазмиды pTTPX была выполнена ПЦР с использованием прямого праймера T723a-for ATCCCGCGAAATTAATACGA и обратного праймера TTPbam-rev TATAGGATCCTTCACCAGCACTAACTGTGAT (BamHI). Ген белка PAG был наработан с помощью ПЦР с использованием прямого праймера PAGbam-for TATAGGATCCGAAGTTAAACAGGAGAACCGGT (BamHI), и обратного праймера PAG-rev TATAGTCGACGGGTACCTATCTCATAGCCT. Оба фрагмента ДНК после очистки на стеклянном сорбенте были обработаны рестриктазой BamHI и соединены между собой путем обработки Т4 ДНК-лигазой. Полученный продукт реакции лигирования был использован в качестве матрицы в ПЦР с использованием праймеров T723afor и PAGrev. Продукт ПЦР (экспрессионная единица), характеризующийся последовательностью SEQ ID NO 1, был клонирован в плазмиду pGEM-T (коммерческий продукт компании Promega, предназначенный для клонирования продуктов ПЦР без предварительной обработки рестриктазами). Полученная конструкция, характеризующаяся последовательностью SEQ ID NO 2, получила обозначение pGEM-TTPPAG (Фиг.1).To create a construct expressing the full-length PAG protein translationally fused to the TTP protein, the TTP protein gene contained in the pTTP plasmid, PCR was performed on the pTTPX plasmid matrix using the T723a-for ATCCCGCGAAATTAATACGA direct primer and the TTPbamCCTGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG reverse transcript primer. The PAG protein gene was generated by PCR using the PAGbam-for direct primer TATAGGATCCGAAGTTAAACAGGAGAACCGGT (BamHI) and the PAG-rev reverse primer TATAGTCGACGGGTACCTATCTCATAGCCT. Both DNA fragments after purification on a glass sorbent were treated with BamHI restriction enzyme and linked together by treatment with T4 DNA ligase. The resulting ligation reaction product was used as a template in PCR using T723afor and PAGrev primers. The PCR product (expression unit), characterized by the sequence of
2. Получение штамма-продуцента2. Obtaining a producer strain
Для введения конструкции pGEM-TTPPAG в клетки штаммов E.coli, использовали 0,1 мкг очищенной ДНК плазмидной ДНК. Препарат плазмидной ДНК добавляли к аликвоте объемом 50 мкл компетентных клеток E.coli BL21(DE3), приготовленных по методике, предложенной в работе (Cohen et al, 1972). Обработанную суспензию клеток высевали на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Рекомбинантные клоны с введенной конструкцией pGEM-TTPPAG отбирали с помощью однократного пассирования на селективной среде, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), после чего переносили на полноценную питательную среду LB объемом 3 мл, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), культивировали на микробиологической качалке при ротации со скоростью 220 об/мин при 37°С в течение 16 часов.To introduce the pGEM-TTPPAG construct into cells of E. coli strains, 0.1 μg of purified plasmid DNA DNA was used. A plasmid DNA preparation was added to an aliquot of 50 μl of competent E. coli BL21 (DE3) cells prepared according to the method proposed in (Cohen et al, 1972). The treated cell suspension was plated on LB agar medium containing ampicillin (100 μg / ml). Recombinant clones with the introduced pGEM-TTPPAG construct were selected by single passaging on a selective medium containing ampicillin (100 μg / ml), after which they were transferred to a complete 3 L nutrient medium containing ampicillin (100 μg / ml), cultured on a microbiological basis rocking chair during rotation at a speed of 220 rpm at 37 ° C for 16 hours.
3. Наработка биомассы в условиях, обеспечивающих наилучший выход целевого продукта3. The production of biomass in conditions that provide the best yield of the target product
При проведении ферментации несколько десятков клонов инокулировали в жидкую среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 0,4% глюкозы. Перед посевом ночную культуру хранили в течении дня при температуре +4°С. Для индукции синтеза белка культуру разводили в 100 раз в одной из сред с добавлением 100 мкг/мл ампициллина состава, указанного в Таблице 3, и инкубировали при интенсивной аэрации при температуре 30°С в течение ночи.During fermentation, several tens of clones were inoculated into LB liquid medium with the addition of 100 μg / ml ampicillin and 0.4% glucose. Before sowing, the night culture was stored during the day at a temperature of + 4 ° C. To induce protein synthesis, the culture was diluted 100 times in one of the media with the addition of 100 μg / ml ampicillin of the composition shown in Table 3, and incubated with intensive aeration at a temperature of 30 ° C overnight.
Клетки из объема среды 3 мл осаждали центрифугированием (10 тыс.g на настольной центрифуге) и ресуспендировали в охлажденном до 0°С буфере А (20 мМ Tрис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 0,03 мг/мл и инкубировали 30 мин в ледяной бане. После инкубации с лизоцимом добавляли равное количество буфера А, содержащего 2% TX-100, и инкубировали еще 20 мин. Гомогенизацию проводили на ультразвуковом дезинтеграторе MSE Soniprep 150 Plus Ultrasonic Disintegrator 3 раза по 30 сек при выходной мощности 100 Вт, между обработками делали паузы по 1 мин для охлаждения, вся процедура осуществлялась при охлаждении пробирки с образцом в ледяной бане.Cells from a volume of medium of 3 ml were besieged by centrifugation (10 thousand g in a benchtop centrifuge) and resuspended in buffer A cooled to 0 ° С (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 ). Lysozyme was added to the suspension to a final concentration of 0.03 mg / ml and incubated for 30 minutes in an ice bath. After incubation with lysozyme, an equal amount of buffer A containing 2% TX-100 was added and incubated for another 20 minutes. Homogenization was carried out on an MSE Soniprep 150
В качестве способа определения выхода белка-антигена использовали электрофорез растворимой фракций клеточного лизата в денатруирующих условиях по Лэммли с иммунологическим окрашиванием продукта антителами лошади, иммунизированной жидкой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофбарика». Расчетная масса продукта 121 кДа.Electrophoresis of the soluble fractions of the cell lysate under denaturing Laemmli conditions with immunological staining of the product with horse antibodies immunized with the liquid anthrax vaccine manufactured by the FCS Orlovskaya Biofarika was used as a method for determining the protein antigen yield. The estimated mass of the product is 121 kDa.
Все операции по подготовке проб для электрофореза до стадии осаждения ацетоном выполняли на холоду (ледяная баня). В полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл вносили аликвоты растворимых фракций клеточного лизата биомассы штамма-трансформанта, производного от E.coli BL21(DE3), несущего конструкции pGEM-TTPPAG, содержащие по 2 мкг общего белка, доводили объем до 100 мкл забуференным физиологическим раствором (NaCl 100 мМ, фосфат натрия 10 мМ, рН 7,2), тщательно перемешивали и добавляли 100 мкл ацетона. Выдерживали при +4°С 30 минут и осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 12 тыс.g. Супернатант тщательно удаляли с помощью водоструйного насоса, а осадок подсушивали в открытых пробирках в воздушном термостате при +37°С в течение 10 минут.В каждую пробирку вносили 20 мкл свежеприготовленного буфера Лэммли (не допускали хранение этого буфера с добавленным восстановителем более 24 часов) для денатурации образцов и прогревали в сухом термостате при 96°С в течение 5 мин. Прогретые образцы тщательно гомогенизировали и осветляли центрифугированием в течение 10 минут при 12 тыс.g. С целью приготовления серии разведений с шагом падения концентрации в 10 раз готовили 3 пробирки, содержащие по 20 мл буфера Лоури для денатурации образцов. Из денатурированной пробы отбирали аликвоту 2 мкл и переносили в первую пробирку с буфером, тщательно перемешивают. Операцию аналогичным образом повторяли со следующими двумя пробирками, перенося аликвоты образца объемом по 2 мкл в буфер объемом 20 мкл.All operations for the preparation of samples for electrophoresis to the stage of precipitation with acetone were performed in the cold (ice bath). Aliquots of soluble fractions of the cell lysate of the biomass of the transformant strain derived from E. coli BL21 (DE3) carrying the pGEM-TTPPAG constructs containing 2 μg of total protein were added to 1.5 μl of volume and brought up to 100 μl of buffered saline solution into 1.5 ml polypropylene tubes (
В лунки денатурирующего ПААГ вносили по 10 мкл каждого разведения образца (соответствует 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции). Полиакриламидный гель для выполнения электрофореза готовили согласно прописи, приведенной в таблице 1.10 μl of each dilution of the sample (corresponding to 1, 0.1, 0.01, and 0.001 μg of the total protein in the soluble cell fraction) was added to the wells of denaturing PAAG. Polyacrylamide gel for electrophoresis was prepared according to the recipe shown in table 1.
Таблица 1 - Состав денатурирующего полиакриламидного геля. Table 1 - Composition of denaturing polyacrylamide gel.
(10 мл)Separating gel
(10 ml)
Для электрофореза использовали следующие стандартные растворы: электродный буфер - 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,6; верхний (концентрирующий) буфер (4×) - 50 мМ трис-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8; нижний (разделяющий) буфер (4×) - 150 мМ трис-HCl, pH 8,8 0,4% SDS; буфер Лэммли с мочевиной- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 7 М мочевина, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий; буфер Лэммли без мочевины- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 60% сахароза, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий.The following standard solutions were used for electrophoresis: electrode buffer - 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.6; upper (concentrating) buffer (4 ×) - 50 mM Tris-HCl, 0.4% SDS, pH 6.8; lower (dividing) buffer (4 ×) - 150 mM Tris-HCl, pH 8.8 0.4% SDS; Laemmli buffer with urea - 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.6, 1% SDS, 7 M urea, 50 mM DTT, 0.001% bromophenol blue; Laemmli buffer without urea - 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.6, 1% SDS, 60% sucrose, 50 mM DTT, 0.001% bromphenol blue.
Концентрирование белков в концентрирующем геле проводили при напряжении 80 В, разделение белков по молекулярным массам в разрешающем геле проводят при напряжении 250 В и длине пробега около 5 см.The concentration of proteins in a concentration gel was carried out at a voltage of 80 V, the separation of proteins by molecular weight in a resolving gel was carried out at a voltage of 250 V and a path length of about 5 cm.
После проведения электрофореза в ПААГ белки растворимой клеточной фракции штамма-трансформанта переносили на нитроцеллюлозный фильтр в приборе «Mini-Protean 3 Cell» (фирмы Bio-Rad) в течение 1,5 ч и токе 0,8 мА/см при 20°С.После переноса фильтр окрашивали в растворе 1% Понсо красного, растворенного в 10% уксусной кислоте и фиксировали расположение полос молекулярно-весового стандарта и наиболее ярких полос образцов. После этого обесцвечивали фильтр 10 кратным промыванием в деионизованной воде и помещали в 25 мл раствора 0,1%-ного сывороточного альбумина быка (BSA) в буфере PBS для блокирования неспецифического связывания. Блокирование проводили в течение 4-20 часов при 20°С, затем отмывали в буфере PTBS (5 раз по 25 мл), после чего инкубировали в растворе PBS, содержащем 1 мкг/мл аффинно очищенных антител лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика) в течение 2 часов при 20°С и слабом качании. Разведение исходного раствора антител составляло 1:20 000. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST объемом 20 мл. После отмывки фильтр инкубировали в растворе PBS, содержащем конъюгат стафилококкового белка А с пероксидазой хрена (ЗАО «Иннотех-21», Москва) в разведении 1: 10 000 в течение 2 часов при 20°С и слабом качании. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST объемом 20 мл и прокрашивали в растворе 0,065% H2O2 в присутствии хромофорного субстрата пероксидазы (N,N’-диаминобензидин), в течение 5-10 минут до появления окрашенных полос.Затем реакцию останавливали инкубацией фильтра в 10% серной кислоте и ополаскивали водой.After electrophoresis in PAGE, the proteins of the soluble cell fraction of the transforming strain were transferred to a nitrocellulose filter in a Mini-Protean 3 Cell device (Bio-Rad) for 1.5 h and a current of 0.8 mA / cm at 20 ° C. After transfer, the filter was stained in a solution of 1% Ponceau red dissolved in 10% acetic acid and the location of the molecular weight standard bands and the brightest bands of the samples was recorded. After that, the filter was decolorized by 10 times washing in deionized water and placed in 25 ml of a solution of 0.1% bovine serum albumin (BSA) in PBS buffer to block non-specific binding. Blocking was carried out for 4-20 hours at 20 ° C, then washed in PTBS buffer (5
Фиксация результатов определения проводилась в форме титра путем выявления последнего разведения, реагирующего с антителами в блоттинге. Поскольку нанесенные на дорожки геля количества материала соответствуют 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции, а чувствительность использованных аффинно очищенных антител лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика) согласно спецификации производителя составляет 50 пг в точке, содержание рекомбинантного белка – слитого протективного антигена B. anthracis в биомассе E.coli оценивалось с помощью таблицы 2.The determination results were recorded in the form of a titer by detecting the last dilution that reacts with antibodies in blotting. Since the amounts of material deposited on the gel tracks correspond to 1, 0.1, 0.01, and 0.001 μg of the total protein in the soluble cell fraction, and the sensitivity of the used affinity purified horse antibodies, the three-time hyperimmunized live anti-siren vaccine (PCF Orel Biofactory) is 50 according to the manufacturer's specification pg at the point, the content of the recombinant protein - fused protective antigen of B. anthracis in the biomass of E. coli was estimated using table 2.
Таблица 2 - Расчет доли продукта конструкции pGEM-TTPPAG от общего растворимого белка в клеточном лизате (%) методом предельных разведений в иммуноблоттинге. Table 2 - Calculation of the fraction of the product of the pGEM-TTPPAG construct from the total soluble protein in the cell lysate (%) by the method of limiting dilutions in immunoblotting.
Результаты работ по подбору условий культивирования представлены в таблице 3.The results of the selection of cultivation conditions are presented in table 3.
Таблица 3 - Выход продукта конструкции pGEM-TTPPAG при культивировании рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3) в различных условиях. Table 3 - The product yield of the pGEM-TTPPAG construct during cultivation of the recombinant E. coli strain BL21 (DE3) under various conditions.
Температура ферментации 30°СFermentation temperature 30 ° C
Температура ферментации 37°СFermentation temperature 37 ° C
Представленные результаты оптимизации условий культивирования штамма-трансформанта BL21(DE3), несущего конструкцию pGEM-TTPPAG, с целью повышения выхода целевого белка-антигена в форме наночастиц (а не телец включения) позволили предложить условия, обеспечивающие максимальный выход: культивирование при 30°С в течение 16 часов на среде LB состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 10, дрожжевой экстракт (Difco) – 5, NaCl – 10, без добавления индуктора. Причина снижения выхода растворимого антигена при добавлении индуктора, по-видимому, заключается в его ускоренном накоплении в виде аморфных агрегатов вместо растворимой нативной формы.The presented results of optimizing the cultivation conditions of the transforming strain BL21 (DE3) carrying the pGEM-TTPPAG construct in order to increase the yield of the target antigen protein in the form of nanoparticles (rather than inclusion bodies) made it possible to propose conditions ensuring the maximum yield: cultivation at 30 ° C for 16 hours on LB medium (g / l): proteose peptone (Difco) - 10, yeast extract (Difco) - 5, NaCl - 10, without the addition of an inducer. The reason for the decrease in the yield of soluble antigen upon addition of the inducer, apparently, is its accelerated accumulation in the form of amorphous aggregates instead of the soluble native form.
4. Очистка фракции ВПЧ комбинацией низкоскоростного и высокоскоростного центрифугирования4. Purification of the HPV fraction by a combination of low speed and high speed centrifugation
Клетки штаммов-трансформантов BL21(DE3), несущих конструкции pGEM-TTPPAG и pGEM3z, осаждали центрифугированием (10 тыс.g на центрифуге Allegra X-22R) из объема среды 200 мл и ресуспендировали в 15 мл холодного буфера А (20 мМ Tрис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 0,03 мг/мл и инкубировали 30 мин в ледяной бане. После инкубации с лизоцимом добавляли равное количество буфера А, содержащего 2% TX-100 и инкубировали еще 20 мин. Гомогенизацию проводили на ультразвуковом дезинтеграторе MSE Soniprep 150 Plus Ultrasonic Disintegrator 3 раза по 30 сек при выходной мощности 100 Вт, между обработками делали паузы по 1 мин для охлаждения, вся процедура осуществлялась при охлаждении пробирки с образцом в ледяной бане.Cells of transforming strains BL21 (DE3) bearing the constructs pGEM-TTPPAG and pGEM3z were pelleted by centrifugation (10 thousand g in an Allegra X-22R centrifuge) from a volume of 200 ml of medium and resuspended in 15 ml of cold buffer A (20 mM Tris-HCl , pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 ). Lysozyme was added to the suspension to a final concentration of 0.03 mg / ml and incubated for 30 minutes in an ice bath. After incubation with lysozyme, an equal amount of buffer A containing 2% TX-100 was added and incubated for another 20 minutes. Homogenization was carried out on an MSE Soniprep 150
Полученный гомогенат фракционировали с помощью двухступенчатого центрифугирования по следующей схеме:The resulting homogenate was fractionated using two-stage centrifugation according to the following scheme:
• Низкоскоростное центрифугирование: лизат разделяли на настольной центрифуге путем центрифугирования при 10 тыс.g в течение 15 мин на центрифуге Allegra X-22R;• Low-speed centrifugation: the lysate was separated on a benchtop centrifuge by centrifugation at 10 Kg for 15 min in an Allegra X-22R centrifuge;
• Ультрацентрифугирование: супернатант, полученный после низкоскоростного центрифугирования, фракционировали при 100 тыс.g в течение 1 часа на ультрацентрифуге Avanti J-301 в роторе JS2438.• Ultracentrifugation: the supernatant obtained after low speed centrifugation was fractionated at 100,000 g for 1 hour on an Avanti J-301 ultracentrifuge in a JS2438 rotor.
Осадки после низкоскоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования ресуспендировали в 30 мкл буфера А с 1% TX-100. Для анализа белкового состава фракций, каждая из которых имела объем 30 мл, после тщательной гомогенизации на ручном вортексе отбирали аликвоты по 100 мкл и осаждали добавлением 100 мкл ацетона. Осаждение, денатурацию и разделение в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле проводили, как описано в разделе 3 главы «Осуществление изобретения». Гель окрашивали в 1% растворе Кумасси R-250 в 10% водной уксусной кислоте с последующим обесцвечиванием в горячей уксусной кислоте. Результаты представлены на Фиг.2.Precipitation after low speed centrifugation and ultracentrifugation was resuspended in 30 μl of buffer A with 1% TX-100. To analyze the protein composition of the fractions, each of which had a volume of 30 ml, after thorough homogenization on a manual vortex, 100 μl aliquots were taken and precipitated by adding 100 μl of acetone. Precipitation, denaturation and separation in a 12.5% denaturing polyacrylamide gel was carried out as described in
Полусухой перенос разделенных в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле белков фракций на нитроцеллюлозную мембрану с окрашиванием аффинно очищенными антителами лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика), проводили, как описано в разделе как описано в разделе 3 главы «Осуществление изобретения». Результаты представлены на Фиг.3.Semi-dry transfer of fractions proteins separated in a 12.5% denaturing polyacrylamide gel onto a nitrocellulose membrane stained with affinity purified horse antibodies, three times hyperimmunized live anti-anemic vaccine (PCF Oryol Biofactory) was carried out as described in the section as described in
5. Оценка гомогенности и размера ВПЧ, содержащих РА B. anthracis, с применением методов динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии5. Evaluation of the homogeneity and size of HPVs containing B. anthracis RA using dynamic light scattering and atomic force microscopy
Основной характеристикой препаратов наночастиц является морфологическая гомогенность, которая может быть оценена с помощью методов динамического светорассеяния (ДСР) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).The main characteristic of nanoparticle preparations is morphological homogeneity, which can be estimated using dynamic light scattering (DLS) and atomic force microscopy (AFM) methods.
К преимуществам метода ДСР можно отнести высокую чувствительность и количественность оценки размеров частиц. К недостаткам относится невозможность наблюдать за формой частиц, что особенно важно при работе частицами, склонными к формированию вторичных агломератов. Кроме того, особенностью ДСР является резкое повышение чувствительности детекции с ростом размера частиц. Из-за этого метод не способен выявлять мелкие частицы в присутствии крупных.The advantages of the DSL method include high sensitivity and quantitative estimation of particle sizes. The disadvantages include the inability to observe the shape of the particles, which is especially important when working with particles prone to the formation of secondary agglomerates. In addition, a feature of DSL is a sharp increase in the sensitivity of detection with increasing particle size. Because of this, the method is not able to detect small particles in the presence of large ones.
Метод АСМ позволяет наблюдать за морфологией частиц и одинаково чувствительный к частицам любого размера. Однако, АСМ дает преимущественно качественную характеристику содержанию частиц в препарате.The AFM method allows one to observe the particle morphology and is equally sensitive to particles of any size. However, AFM gives a predominantly qualitative characteristic to the content of particles in the preparation.
При подготовке препаратов наночастиц лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) для ДСР и АСМ, представляющих собой фракцию осадка после ультрацентрифугирования, суспендированную в буфере А, проводили нормировку нагрузки клеточного материала по общему белку: для изготовления одного препарата использовали 0,1 мкг общего белка фракции лизата.In the preparation of preparations of E. coli lysates nanoparticles BL21 (DE3, pGEM3z) and BL21 (DE3, pGEM-TTPPAG) for DDS and AFM, which are the fraction of the precipitate after ultracentrifugation suspended in buffer A, the load of the cell material was normalized by the common protein: the manufacture of one drug used 0.1 μg of the total protein fraction of the lysate.
5.1. Динамическое светорассеяние5.1. Dynamic light scattering
Измерение размера наночастиц в анализируемых образцах осуществлялось методом динамического светорассеяния на приборе Nano-ZS (Malvern instruments, UK). Для изучения размеров частиц в анализируемых образцах был выбран угол рассеяния 173°. В качестве отрицательного контроля использовался образец, полученный при трансформации Е. coli BL21 вектором pGEM3z. Результаты анализа представлены на Фиг.4. Они свидетельствуют о том, что в образце фракции наночастиц лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) наблюдается фракция монодисперсных частиц с модальным размером 225,4 нм (Z-Averege=290 нм). Эти данные согласуются с ожидаемым размером вирусоподобных частиц, описанных в литературе.The size of the nanoparticles in the analyzed samples was measured by dynamic light scattering on a Nano-ZS instrument (Malvern instruments, UK). To study the particle sizes in the analyzed samples, a scattering angle of 173 ° was chosen. As a negative control, we used a sample obtained by transformation of E. coli BL21 with pGEM3z vector. The results of the analysis are presented in figure 4. They indicate that a fraction of monodisperse particles with a modal size of 225.4 nm (Z-Averege = 290 nm) is observed in the sample of the BL21 lysate nanoparticle fraction (DE3, pGEM-TTPPAG). These data are consistent with the expected size of virus-like particles described in the literature.
Во фракции наночастиц отрицательного контроля - лизата BL21(DE3, pGEM3z) также наблюдалось наличие наночастиц. Однако интенсивность ДСР этими частицами составляла только 4,8% от сигнала ДСР (несмотря на выровненное количество общего белка в препарате), а размер частиц отличался неоднородностью (большая величина дисперсии). 98% частиц отрицательного образца попадала в диапазон от 50 до 150 нм.In the fraction of negative control nanoparticles - BL21 lysate (DE3, pGEM3z), the presence of nanoparticles was also observed. However, the DSB intensity of these particles was only 4.8% of the DSB signal (despite the equalized amount of total protein in the preparation), and the particle size was not uniform (a large dispersion value). 98% of the particles of the negative sample fell in the range from 50 to 150 nm.
5.2. Атомно-силовая микроскопия5.2. Atomic force microscopy
Для проведения исследования использовали 10 мкл выровненных по содержанию общего белка препаратов фракций лизатов BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), суспендированных в буфере. Для изготовления одного препарата использовали 0,1 мкг общего белка. Образец наносили на свежий скол слюды (SPI supplies grade V-1, свежий скол осуществлялся путем приклеивания и отрыва полосы скотча с поверхности слюды), помещали в спинкоатер (Chemat KW-4A) и проводили центрифугирование в течение 5 секунд при скорости вращения 1000 об/мин, затем еще 60 секунд при 3000 об/мин с целью обеспечения гомогенности покрытия на подложке. Подложку высушивали в течение ночи на воздухе, при комнатной температуре. Сканирование проводили через 12-20 часов после приготовления образцов.For the study, we used 10 μl of preparations aligned with total protein content of the fractions of the lysates BL21 (DE3, pGEM3z) and BL21 (DE3, pGEM-TTPPAG) suspended in the buffer. For the manufacture of one drug used 0.1 μg of total protein. The sample was applied to a fresh mica cleavage (SPI supplies grade V-1, fresh cleavage was carried out by gluing and tearing off the tape strip from the mica surface), placed in a spincoater (Chemat KW-4A) and centrifuged for 5 seconds at a speed of 1000 rpm min, then another 60 seconds at 3000 rpm in order to ensure the homogeneity of the coating on the substrate. The substrate was dried overnight in air at room temperature. Scanning was performed 12-20 hours after sample preparation.
Измерения проводились на микроскопе Veeco Multimode 8 с контроллером Nanoscope V (Veeco, США) в режиме PeakForce Tapping QNM. В качестве зондов использовали кантилеверы из нитрида кремния SNL-10A (номинальная силовая константа 0,35 Н/м, резонансная частота – 65 кГц) с кремниевой иглой. Сканирование проводили на воздухе при комнатной температуре.The measurements were carried out on a
PeakForce Tapping QNM представляет собой нерезонансный режим сканирования. При сканировании в каждой точке снимали силовую кривую с частотой 2 кГц, что позволяет получить информацию не только о рельефе образца, но и о его локальных механических свойствах: модуле упругости (DMT модуль), силе адгезии между зондом и образцом, уровне деформации образца при сканировании.PeakForce Tapping QNM is a non-resonant scanning mode. During scanning, a force curve with a frequency of 2 kHz was taken at each point, which allows one to obtain information not only about the topography of the sample, but also about its local mechanical properties: the elastic modulus (DMT module), the adhesion force between the probe and the sample, and the level of deformation of the sample during scanning .
При сравнении фракций наночастиц лизатов BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) методом АСМ в основном подтвердились данные ДСР. Наиболее крупные частицы во фракции лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (Фиг.5А) имеют размер ~250 нм, а лизата BL21(DE3, pGEM3z) –<75 нм (Фиг.5Б). На картах модуля упругости видно, что крупные частицы лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) имеют жесткое ядро (иногда два ядра на частицу), окруженное менее упругой периферией. В частицах образца pGEM внутренней негомогенности не выявляется. Однако, этот вывод нельзя считать достоверным, так как эти частицы имеют малый размер, не позволяющий визуально наблюдать в их составе дискреты. Частицы лизата BL21(DE3, pGEM3z) склонны образовывать агломераты, что может приводить к существенному завышению их размера методом ДСР.When comparing the fractions of nanoparticles of lysates BL21 (DE3, pGEM3z) and BL21 (DE3, pGEM-TTPPAG) by AFM, the DLS data were mainly confirmed. The largest particles in the BL21 lysate fraction (DE3, pGEM-TTPPAG) (Fig. 5A) have a size of ~ 250 nm, and the BL21 lysate (DE3, pGEM3z) is <75 nm (Fig. 5B). The elastic modulus maps show that large BL21 lysate particles (DE3, pGEM-TTPPAG) have a rigid core (sometimes two nuclei per particle) surrounded by less elastic periphery. In the particles of the pGEM sample, internal inhomogeneity is not detected. However, this conclusion cannot be considered reliable, since these particles are small in size, which does not make it possible to visually observe discretes in their composition. BL21 lysate particles (DE3, pGEM3z) tend to form agglomerates, which can lead to a significant overestimation of their size by the DLS method.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016151604A RU2633504C1 (en) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016151604A RU2633504C1 (en) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2633504C1 true RU2633504C1 (en) | 2017-10-12 |
Family
ID=60129330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016151604A RU2633504C1 (en) | 2016-12-27 | 2016-12-27 | Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2633504C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761637C1 (en) * | 2020-12-30 | 2021-12-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | ESCHERICHIA coli BL21(DE3)/ pET32 v 11-Cre CELL STRAIN PRODUCING SITE-SPECIFIC Cre RECOMBINASE |
| RU2789418C1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-02-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"(МГУ) | Stable recombinant protective antigen for anthrax vaccine |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2162856C2 (en) * | 1994-10-13 | 2001-02-10 | Нанофреймз Ллс. | Isolated polypeptide, isolated fused protein (versions), and isolated protein (versions) for preparation of nanostructure |
| WO2003040179A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Rakesh Bhatnagar | High level constitutive production of anthrax protective antigen |
| RU2270865C2 (en) * | 2000-07-08 | 2006-02-27 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс Дстл | Immunogenic polypeptide inducing protective immune response against bacillus anthracis (variants), method for its preparing, nucleic acid encoding thereof, expression vector (variants), method and vaccine for prophylaxis of infection caused by bacillus anthracis |
-
2016
- 2016-12-27 RU RU2016151604A patent/RU2633504C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2162856C2 (en) * | 1994-10-13 | 2001-02-10 | Нанофреймз Ллс. | Isolated polypeptide, isolated fused protein (versions), and isolated protein (versions) for preparation of nanostructure |
| RU2270865C2 (en) * | 2000-07-08 | 2006-02-27 | Дзе Секретэри Оф Стейт Фор Дефенс Дстл | Immunogenic polypeptide inducing protective immune response against bacillus anthracis (variants), method for its preparing, nucleic acid encoding thereof, expression vector (variants), method and vaccine for prophylaxis of infection caused by bacillus anthracis |
| WO2003040179A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Rakesh Bhatnagar | High level constitutive production of anthrax protective antigen |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANITA VERMA et al, Mechanistic Analysis of the Effect of Deamidation on the Immunogenicity of Anthrax Protective Antigen, Clinical and Vaccine Immunology, 2016, Vol. 23, No. 5, p. 396-402. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761637C1 (en) * | 2020-12-30 | 2021-12-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН) | ESCHERICHIA coli BL21(DE3)/ pET32 v 11-Cre CELL STRAIN PRODUCING SITE-SPECIFIC Cre RECOMBINASE |
| RU2789418C1 (en) * | 2022-04-29 | 2023-02-02 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"(МГУ) | Stable recombinant protective antigen for anthrax vaccine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111991556B (en) | SARS-CoV-2 RBD conjugated nano particle vaccine | |
| JP5327873B2 (en) | Recombinant Helicobacter pylori oral vaccine and preparation method thereof | |
| WO2012163289A1 (en) | Fusion protein comprising diphtheria toxin non-toxic mutant crm197 or fragment thereof | |
| US9884107B2 (en) | Immunogenic respiratory syncytial virus glycoprotein-containing VLPs and related compositions, constructs, and therapeutic methods | |
| Hao et al. | Display of GCRV vp7 protein on the surface of Escherichia coli and its immunoprotective effects in grass carp (Ctenopharyngodon idella) | |
| Allen et al. | A single peptide from the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis elicits T cell help for the production of antibodies to protective determinants. | |
| CN112679584B (en) | Swine fever epitope peptide and application thereof | |
| Hajam et al. | Co-administration of flagellin augments immune responses to inactivated foot-and-mouth disease virus (FMDV) antigen | |
| US20180141978A1 (en) | Truncated Rotavirus VP4 Protein And Application Thereof | |
| Zykova et al. | Nanoparticles based on artificial self-assembling peptide and displaying M2e peptide and stalk HA epitopes of influenza A virus induce potent humoral and T-cell responses and protect against the viral infection | |
| CN108823218A (en) | Chicken infectivity bursa of Fabricius virus VP 2 gene, its expression product, its subunit vaccine and application | |
| CN113173977A (en) | Bifunctional antigen, preparation method and application thereof | |
| Li et al. | Lactobacillus plantarum surface-displayed influenza antigens (NP-M2) with FliC flagellin stimulate generally protective immune responses against H9N2 influenza subtypes in chickens | |
| JP2019502404A (en) | Mutation of human papillomavirus type 11 L1 protein | |
| CN106146626B (en) | A kind of Erysipelothrix rhusiopathiae subunit vaccine and its preparation method and application | |
| CN105682680A (en) | Enhancing immunity to tuberculosis | |
| KR101846478B1 (en) | Vaccine composition comprising recombinant protein for preventing swine mycoplasma infection | |
| JP2022513734A (en) | Foot-and-mouth disease virus-like particle antigen and its vaccine composition, preparation method and application | |
| CN110845584B (en) | Swine fever virus envelope protein oligomeric protein body and preparation method and application thereof | |
| US10125175B2 (en) | Method for enhancing immunogenicity of epitope peptide of HPV antigen, virus-like particle, and method for preparing HPV vaccine | |
| RU2633504C1 (en) | Ecoli strain - producer of full-dimensional protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles | |
| CN115340609B (en) | A kind of foot-and-mouth disease virus multi-antigen epitope fusion protein, protein cage nanoparticle and preparation method thereof | |
| CN116462743B (en) | Acinetobacter baumannii translation elongation factor recombinant protein, preparation method and application | |
| RU2633508C1 (en) | E. coli strain - producer of isolated domain 1 of protective bacillus anthracis antigen in form of virus-like particles | |
| CN107129527B (en) | A kind of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus protective antigen HP0623 and preparation method thereof |