[go: up one dir, main page]

RU2630669C1 - Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа - Google Patents

Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа Download PDF

Info

Publication number
RU2630669C1
RU2630669C1 RU2016129968A RU2016129968A RU2630669C1 RU 2630669 C1 RU2630669 C1 RU 2630669C1 RU 2016129968 A RU2016129968 A RU 2016129968A RU 2016129968 A RU2016129968 A RU 2016129968A RU 2630669 C1 RU2630669 C1 RU 2630669C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sites
regulatory regions
fam
probe
bhq1
Prior art date
Application number
RU2016129968A
Other languages
English (en)
Inventor
Евгений Викторович Дубинин
Алексей Альбертович Евдокимов
Нина Александровна Нетесова
Наталья Анатольевна Сметанникова
Мурат Абдурашитович Абдурашитов
Александр Григорьевич Акишев
Евгения Сергеевна Давидович
Сергей Харитонович Дегтярев
Виталий Викторович Кузнецов
Валерий Николаевич Михеев
Андрей Борисович Карпов
Борис Сотиволдиевич Малышев
Владимир Владимирович Федотов
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор")
Priority to RU2016129968A priority Critical patent/RU2630669C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2630669C1 publication Critical patent/RU2630669C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метелирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР и способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР. Указанный способ включает формирование панели генов-онкомаркеров колоректального рака: ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM. Изобретение расширяет арсенал олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных праймеров. 2 н.п. ф-лы., 3 ил., 4 табл., 3 пр., 1 прил.

Description

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины, и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике онкологических заболеваний и для оценки эффективности противораковой терапии, а именно для анализа метилирования генов-онкомаркеров колоректального рака в образцах биологического материала.
Перспективным инструментом молекулярно-генетической диагностики и мониторинга онкологических заболеваний является эпигенетическая диагностика, то есть идентификация болезни путем выявления эпигенетических маркеров. Эпигенетические маркеры представляют собой химические группы, которые присоединяются к геномной ДНК человека (метилирование цитозиновых оснований с образованием 5-метилцитозина, 5mC) либо к ассоциированным с ней гистоновым комплексам и оказывают влияние на функциональную активность генов. Наиболее распространенным эпигенетическим нарушением при канцерогенезе является локальное гиперметилирование отдельных участков ДНК, так называемых CpG-островков, в регуляторных областях генов-онкосупрессоров, которые в норме лишены метальных групп. В настоящее время показано, что подобное аберрантное метилирование характерно для начальных стадий большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, которые в среднем составляют более 90% всех случаев злокачественных новообразований.
Для осуществления эпигенетической диагностики злокачественных новообразований необходимо решить два ключевых вопроса:
а) какой метод детекции следует использовать для определения статуса метилирования генов;
б) метилирование регуляторных участков каких генов ассоциировано с конкретным онкологическим заболеванием?
Для решения первого вопроса, а именно для анализа статуса метилирования генов, применяется ряд методов, которые можно разделить на четыре группы.
Первая группа методов основана на бисульфитной конверсии ДНК, влекущей изменения ее нуклеотидного состава. В дальнейшем нужный участок конвертированного генома может быть амплифицирован в ПЦР и секвенирован для определения всех метилированных цитозиновых остатков. Если исследователя интересует статус метилирования конкретного CG-динуклеотида, то используются более простые способы анализа. Так, возможно проведение метилчувствительной ПЦР (другой употребляемый термин - «метилспецифическая ПЦР»), в которой проводятся две реакции с использованием праймеров, подобранных для случаев прохождения или непрохождения конверсии в исследуемом динуклеотиде. Другим широко используемым способом определения метилирования является обработка конвертированной ДНК эндонуклеазами рестрикции (метод COBRA, основанный на появлении или исчезновении сайтов узнавания ферментов в измененной ДНК). К недостаткам описанных методов относятся существенная деградация и значительные потери нуклеиновых кислот при проведении бисульфитной конверсии, что делает проблематичным анализ малого количества материала, трудоемкость, дороговизна исследования и значительные затраты времени [Umer M, Herceg Z. Deciphering the epigenetic code: an overview of DNA methylation analysis methods // Antioxid Redox Signal. - 2013. - V. 18. - P. 1972-1986].
Вторая группа методов включает в себя процедуры гидролиза ДНК метилчувствительными эндонуклеазами. Анализ статуса метилирования генов основан на том, что данные рестриктазы не способны распознавать и расщеплять последовательности, содержащие метилированные CG-сайты (например, фермент HpaII, узнающий и гидролизующий лишь неметилированный тетрануклеотид CCGG). Результаты реакции гидролиза могут быть проанализированы с помощью ПЦР с фланкирующими праймерами. Существенным ограничением для широкого применения этих методов является относительно небольшое число известных эндонуклеаз рестрикции, распознающих последовательности, содержащие CG-динуклеотиды, и при этом чувствительных к метилированию цитозиновых остатков в них [Shen L, Waterland RA. Methods of DNA methylation analysis // Curr Opin Clin Nutr Metab Care. - 2007. - V. 10. - P. 576-581]. Данный подход также не позволяет выявлять частично метилированную ДНК, тогда как именно такой паттерн метилирования CpG-островков характерен для самых ранних стадий канцерогенеза. Кроме того, использование данных методов предъявляет более высокие требования как к чистоте анализируемой ДНК, так и к качеству проведения исследования на всех стадиях, поскольку вывод о наличии метилирования в этих методах делается при отсутствии гидролиза ДНК метилчувствительными эндонуклеазами рестрикции. Однако недогидролиз ДНК может происходить в случаях наличия загрязнений или нарушений условий анализа. Это приводит к ложным выводам о наличии метилирования и как следствие к ложно-положительному диагнозу.
Третья группа методов базируется на использовании метил-связывающих белков (methyl binding domain containing proteins, MBD-белки) для изоляции метилированной ДНК и ее последующей амплификации. Известна, например, технология MethylMeter, разработанная специалистами американской компании RiboMed (патент Канады №2724343, опубл. 15.05.2008 г.), позволяющая достигать высоких показателей чувствительности и специфичности. Данная технология используется производителями некоторых тест-систем, например, G-CIMP DecisionDX американской компании Castle Biosciences. Для защиты данной тест-системы подана заявка США №2014272986, опубликованная 18.09.2014 г. Тем не менее, подобные методы остаются весьма трудоемкими, а для четкого количественного анализа результатов требуется сложное дорогостоящее оборудование.
Четвертая группа методов базируется на использовании сайт-специфических метилзависимых ДНК эндонуклеаз. После их открытия и начала коммерческого производства их препаратов появилась возможность использования этого нового класса ферментов в эпигенетических исследованиях. В отличие от обычных эндонуклеаз рестрикции, метилзависимые ферменты узнают только метилированные последовательности ДНК, что делает их еще одним удобным инструментом изучения статуса метилирования генов. В число ферментов данного класса входят производимые в России компанией ООО «СибЭнзайм» эндонуклеазы GlaI, BisI, BlsI, MteI и ряд других [http://russia.sibenzyme.com/products/m2_type].
Благодаря совпадению последовательности ДНК, являющейся продуктом метилирования de novo, и субстратной специфичности фермента GlaI исследователями ООО «СибЭнзайм» был разработан метод, названный GLAD-ПЦР (GlaI hydrolysis and Ligation Adapter Dependent PCR), который позволяет определять наличие сайтов R(5mC)GY в исследуемом участке ДНК [Кузнецов В. В. с соавт. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК // Патент РФ №2525710 С1, опубл. 20.08.2014, Бюл. № 23]. Метод включает гидролиз ДНК ферментом GlaI, присоединение специфического адаптера к концам гидролизованной ДНК и последующую реакцию ПЦР в режиме реального времени с праймеров, окружающих целевой участок ДНК. Метод позволяет определить наличие одного или нескольких сайтов Pu(5mC)GPy внутри изучаемого фрагмента ДНК. Таким образом, метод GLAD-ПЦР может быть использован для определения статуса метилирования регуляторных участков генов.
Данный метод обладает рядом преимуществ, заключающихся в простоте выполнения, способности выявлять лишь метилированные сайты в сложных смесях ДНК и возможности количественно оценивать их число. Следует также отметить, что метод обладает значительной универсальностью и может быть применен для анализа любых сложных смесей ДНК, например, ДНК из опухолей, содержащей нуклеиновые кислоты не только из малигнантных, но и из нормальных клеток (клетки сосудов, соединительной ткани и т.д.). Апробация GLAD-ПЦР показала, что метод обладает высокой чувствительностью, позволяя детектировать метилированные сайты в сильноразбавленных растворах.
Указанный метод является универсальным методом детекции метилирования сайтов R(5mC)GY, позволяющим сформировать и описать конкретную панель генов, специфичную, например, для колоректального рака. Но в самом описании метода специфичные для различных видов онкологии панели генов отсутствуют.
Рак толстого кишечника и прямой кишки (колоректальный рак) - один из наиболее часто встречающихся видов злокачественных новообразований. В развитых странах мира ежегодно диагностируется более миллиона случаев этого заболевания, а летальность от рака этой локализации составляет более 33% даже в странах с высоким уровнем онкологической помощи [Walther A. et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2009. - V. 9. - P. 489-499]. Как и в случае большинства других онкологических заболеваний, выявление данного вида рака на ранних стадиях во многом определяет успешность лечения, ввиду чего развитие чувствительных молекулярно-генетических, в том числе эпигенетических, методов диагностики колоректального рака несомненно является актуальной задачей. Однако начальные стадии патологии внутренних органов зачастую не сопровождаются определяемыми при наружном осмотре аномалиями или ощущаемыми пациентами нарушениями функций организма, что делает раннюю диагностику в этих случаях крайне затруднительной. Таким образом, использование биохимических и генетических анализов для диагностики колоректального рака является предпочтительным способом выявления заболевания, тем более, что такая диагностика возможна еще на бессимптомной стадии [Gyparaki MT, Basdra EK, Papavassiliou AG. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer // J Mol Med (Berl). - 2013. - V. 91. - P. 1249-1256].
Для разработки соответствующей диагностической системы необходимо найти ответ на второй вопрос: метилирование регуляторных участков каких именно генов ассоциировано с развитием колоректального рака?
Одна из первых масштабных работ по поиску маркерных генов для эпигенетической диагностики колоректального рака была проведена в 2008 году сотрудниками компании Epigenomics AG (Германия) [Lofton-Day C et al. DNA methylation biomarkers for blood-based colorectal cancer screening // Clin Chem. - 2008. - V. 54. - P. 414-423]. На первом этапе работы были использованы метилчувствительные ферменты рестрикции для анализа более 600 кандидатных фрагментов геномной ДНК, выделенной из опухолей и нормальной ткани. Были выбраны 56 участков ДНК, которые достоверно различались по степени метилирования в здоровых и малигнантных клетках. Далее эти участки дополнительно проверялись на микрочипах и в ПЦР в реальном времени. Это позволило сократить число генов, наиболее пригодных для использования в качестве эпигенетических маркеров колоректального рака, до семи (SEPT9, NGFR, TMEFF2, ALX4, EYA4, FOXL2, SIX6).
В дальнейшем большое число авторов опубликовало результаты своих исследований по поиску генов-онкомаркеров для эпигенетической диагностики колоректального рака, проведенных различными методами, включая такие современные подходы, как применение ДНК-микрочипов (например, серии Infinium HumanMethylation, Illumina, США), ограниченное (RRBS, Reduced Representation Bisulfite Sequencing) и полногеномное бисульфитное секвенирование (WGBS, Whole Genome Bisulphite Sequencing) секвенирующими системами нового поколения (Next Generation Sequencing, NGS) [Reinders J. et al. // Epigenomics. - 2010. - V. 2. - P. 209-220; Kaneda A., Yagi K. // Cancer Sci. - 2011. - V. 102. - P. 18-24; Kibriya M.G. et al. // BMC Med Genomics. - 2011. - 4:50; Kim Y.H. et al. // Ann Surg Oncol. - 2011. - V. 18. - P. 2338-2347; Gu H. et al. // Nat Protoc. - 2011. - V. 6. - P. 468-481; Yi J.M. et al. // Tumour Biol. - 2012. - V. 33. - P. 363-372; Hinoue T. et al. // Genome Res. - 2012. - V. 22. - P. 271-282; Lange C.P. et al. // PLoS One. - 2012. - 7:e50266; Li H. et al. // Oncol Rep. - 2012. - V. 28. - P. 99-104; Roperch J.P. et al. // BMC Cancer. - 2013. - P. 13-566; Naumov V.A. // Epigenetics. - 2013. - V. 8. - P. 921-934; Chen Y.A. et al. // Epigenetics. - 2013. - V. 8. - P. 203-209; Harper K.N. et al. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2013. - V. 22. - P. 1052-1060; Mitchell S.M. et al. // BMC Cancer. - 2014. - P. 14-54; Melson J. et al. // Int J Cancer. - 2014. - V. 134. - P. 2656-2662; Papadia C. et al. // Inflamm Bowel Dis. - 2014. - V. 20. - P. 271-277].
Некоторые из обнаруженных генов-онкомаркеров уже применяются в коммерческих тест-системах для диагностики колоректального рака. В 2008-2012 годах в компании Epigenomics AG (Германия) была разработана и запатентована тест-система «Epi proColon kit 2.0» для диагностики колоректального рака (международная заявка №WO2005001142, опубл. 06.01.2005 г.; заявка США №2014179563, опубл. 26.06.2014 г.) на основе выявления специфического эпигенетического маркера SEPT9 в периферической крови [Heichman KA. Blood-based testing for colorectal cancer screening // Mol Diagn Ther. 2014. - V. 18. - P. 127-135]. Метилирование другого гена (VIM, виментин) в малигнантных клетках послужило основой для создания тест-системы «ColoGuard assay» от компании LabCorp (США) [Lao VV, Grady WM. Epigenetics and colorectal cancer // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. - 2011. - V. 8. - P. 686-700]. Однако подобные моно-тест-системы не предназначены для постановки окончательного диагноза, и их показатели могут служить лишь дополнительными индикаторами развития или отсутствия заболевания.
В совокупности полученные исследователями данные свидетельствуют о ненадежности диагностики, построенной на анализе одного гена и, соответственно, об актуальности разработки и внедрения тест-систем, основанных на определении статуса метилирования ДНК регуляторных областей ряда генов-онкомаркеров, позволяющих проводить диагностику более надежно и точно. Известна работа Lind с соавт., создавших диагностический набор для анализа метилирования шести генов: CNRIP1, FBN1, INA, MAL, SNCA и SPG20 [Lind G.E. et al. Identification of an epigenetic biomarker panel with high sensitivity and specificity for colorectal cancer and adenomas // Mol Cancer 2011. - V 10. - P. 85].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ определения диагноза рака у индивидуума с подозрением на колоректальный рак (Международная заявка №WO2014062218, МПК C12Q1/68, опубл. 24.04.2014 г.), включающий: получение образца от индивидуума с подозрением на рак; гидролиз высокоочищенной геномной ДНК из исследуемого биоматериала с использованием бисульфитной конверсии ДНК; определения наличия или отсутствия высокого уровня экспрессии генов (определение уровня метилирования регуляторных областей генов-онкомаркеров с использованием цифровой ПЦР) по отношению к нормальному базовому стандарту для одной диагностической панели, включающей следующие биомаркеры: TFPI2, THBD, C9ORF50, ADHFEl, FGF12, PTPRT, ZNF568, KIAA1026, SFMBT2, и / или AUTS2; и диагностики рака при наличии высокого уровня экспрессии по отношению к нормальному базовому стандарту по меньшей мере одного биомаркера.
Недостатком известных аналогов и прототипа является использование бисульфитной конверсии ДНК, для которой характерны трудоемкость, дороговизна исследования и значительные затраты времени, а также деградация и значительные потери нуклеиновых кислот, что ведет к снижению точности и делает проблематичным анализ малого количества материала.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение и повышение точности способа определения метилирования сайтов RCGY регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака и расширение его функциональных возможностей.
Указанный технический результат достигается разработанным набором олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР, имеющих структуру, приведенную в приложении (список последовательностей) и таблице 1:
Таблица 1
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ADHFE1 (5'→3'):
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ALX4 (5'→3'):
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера CNRIP1 (5'→3'):
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера EID3 (5'→3'):
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ELMO1 (5'→3'):
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ESR1 (5'→3'):
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(1) (5'→3'):
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(2) (5'→3'):
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(3.1) (5'→3'):
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(3.3) (5'→3'):
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера HLTF (5'→3'):
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера LAMA1 (5'→3'):
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера NEUROG1 (5'→3'):
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера NGFR (5'→3'):
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RARB (5'→3'):
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RXRG (5'→3'):
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RYR2 (5'→3'):
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SDC2 (5'→3'):
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SEPT9 (5'→3'):
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SFRP2 (5'→3'):
Figure 00000058
Figure 00000059
Figure 00000060
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SOCS3 (5'→3'):
Figure 00000061
Figure 00000062
Figure 00000063
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SOX17 (5'→3'):
Figure 00000064
Figure 00000065
Figure 00000066
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера THBD (5'→3'):
Figure 00000067
Figure 00000068
Figure 00000069
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера TMEFF2 (5'→3'):
Figure 00000070
Figure 00000071
Figure 00000072
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера UCHL1 (5'→3'):
Figure 00000073
Figure 00000074
Figure 00000075
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера VIM (5'→3'):
Figure 00000076
Figure 00000077
Figure 00000078
где g - геномный праймер (genome); р - флуоресцентно-меченый зонд (zond); h - гибридный праймер (hybrid); FAM - флуоресцеин; BHQ1 - гаситель флуоресценции (Black Hole Quencher 1).
Учет результатов анализа проводится методом гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР-амплификации в режиме реального времени.
Указанный технический результат достигается также созданием способа идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР, включающем формирование панели генов-онкомаркеров колоректального рака: ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM путем отбора генов-онкомаркеров колоректального рака при биоинформационном анализе и рассмотрения нуклеотидных последовательностей предположительных регуляторных участков этих генов, выявление располагающихся в них CpG-островков, анализ первичной структуры CpG-островков и их соответствие определенным критериям выбора. В регуляторной области (промоторе или первом экзоне) этих генов обычно присутствуют несколько сайтов RCGY, метилирование которых может вызывать подавление экспрессии гена при колоректальном раке. Поэтому далее на образцах ДНК из опухолевого материала или клеточных линий осуществляют отбор наиболее метилированных сайтов с помощью GLAD-ПЦР-анализа, которые в могут использоваться для диагностики и/или прогнозирования течения колоректального рака.
Далее осуществляют гидролиз высокоочищенной геномной ДНК из исследуемого биоматериала метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера
Figure 00000079
, где р - фосфат с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномных праймеров и зондов, комплементарных последовательностям регуляторных областей указанных генов в исследуемой ДНК, и гибридных праймеров, 3'-концы которых комплементарны 5'-концам ДНК в заданных местах гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарнаадаптерной последовательности, и делают заключение о наличии последовательности R(5mC)GY, где 5mC - 5-метилцитозин, R-А или G, Y-Т или С в регуляторных областях указанных генов по появлению флуоресцентного сигнала для определения статуса метилирования сайтов в клинических образцах методом GLAD-ПЦР-анализа и на основе информации о статусе метилирования одного или нескольких сайтов делают вывод о наличии или отсутствия колоректального рака.
Структура адаптера подбирается таким образом, чтобы его нуклеотидная последовательность была уникальна для генома человека, оптимальная по GC составу и защищена от образования самокомплементарных структур.
Причем, при реализации способа используют вышеуказанный набор праймеров и зондов, представленных в Приложении (список последовательностей).
Изобретение иллюстрируется следующим графическим материалом, представленным на фигурах 1-3. На фиг. 1 представлен пример поиска наиболее часто метилированного сайта RCGY на выбранном участке регуляторной области гена FBN1(3.3). Как видно из фиг. 1, таким оказался третий сайт в ампликоне, которому соответствует гибридный праймер
Figure 00000080
.
На панели А представлен фрагмент нуклеотидной последовательности; показаны участки связывания геномного праймера, зонда и геном-специфичных 3'-тетрануклеотидов гибридных праймеров. На панели Б приведены кривые накопления флуоресценции в ходе ПЦР с использованием различных гибридных праймеров. Заглавными буквами «GCGG» обозначен выбранный гибридный праймер, соответствующий точке гидролиза ДНК по наиболее часто метилированному третьему сайту RCGY в ампликоне.
На фиг. 2: представлен результат GLAD-ПЦР-анализа отобранного сайта RCGY в регуляторной области гена SEPT9 в клинических образцах. Погоризонтальной оси отображены номера клинических образцов, где T – соответствует опухолевому образцу, а N – здоровому. По вертикальной оси приведено усредненное значение Cq для каждого образца с указанием доверительного интервала.
На фиг. 3 приведена ROC (Receiver Operating Characteristic) кривая, полученная в результате ROC анализа результатов GLAD-ПЦР-анализа статуса метилирования RCGY сайта-маркера колоректального рака гена SEPT9. Параметры ROC-анализа приведены в таблице 4. ROC-анализ является стандартным методом оценки диагностической ценности тестов.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами 1-3, реализующими способ определения метилирования сайтов RCGY регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа, а также состав олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа.
Пример 1. Разработка специфических праймеров и флуоресцентно-меченых зондов на участки CpG-островков регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака.
Изучение опубликованных в литературе данных по метилированию генов при онкопатологиях нижних отделов кишечника, данных RRBS-секвенирования (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, бисульфитное секвенирование ограниченных выборок локусов) в проекте ENCODE/HudsonAlpha и последующий биоинформационный анализ нуклеотидных последовательностей регуляторных участков описанных ранее генов позволил выбрать кандидатную комбинацию участков CpG-островков регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака, удовлетворяющих критериям анализа методом GLAD-ПЦР (табл. 2).
На первом этапе работы был проведен анализ литературных данных последних лет по метилированию генов при онкопатологиях нижних отделов кишечника, данных RRBS-секвенирования (Reduced Representation Bisulfite Sequencing, бисульфитное секвенирование ограниченных выборок локусов) в проекте ENCODE/HudsonAlpha и сформирован список из 57 генов-онкомаркеров, метилирование которых происходит с высокой частотой в ДНК клеток колоректального рака. Этот список включает в себя следующие гены: SEPT9, SYNE1, FGF12, GAD2, HAND1, CACNA1G, CNRIP1, TLX2, LOX, LAMA1, GAS7, SLC6A15, BOLL, TFPI2, SOCS3, TRH, MDFI, C1orf70, RUNX3, TMEFF2, SFRP2, WNT5A, IGFBP7, TFPI2, FOXE1, NPY, WIF1, CIDEB, RIC3, KCNQ5, COL4A1, SPG20, SND1, PENK, CDO1, THBD, EDIL3, DUSP26, UCHL1, STOX2, ELMO1, SLC30A10, IGF2, ESR1, EYA4, NALCN, FLI1, RXRg, RYR2, PRKAR1B, BEND5, ITGA4, ADHFE1, NGFR, GATA4, NEYROG1, FBN1. При выборе генов для данного списка учитывалось также количество проанализированных проб в описанных авторами статей экспериментах, так как достоверные данные могут быть получены лишь при большом числе образцов ДНК в выборке. Большое значение также придавалось такому описанному авторами работ свойству, как возможность выявления метилирования гена на ранних стадиях заболевания, хотя, к сожалению, число публикаций, в которых рассматривалась зависимость метилирования гена от стадии онкопатологии, очень незначительно.
На втором этапе работы были рассмотрены нуклеотидные последовательности предположительных регуляторных участков этих 57 генов и выявлены CpG-островки, располагающиеся в них. Первичные структуры CpG-островков были проанализированы на их соответствие критериям выбора:
1) Наличие данных из опубликованных работ, показывающих высокую частоту метилирования регуляторного участка гена в исследованных выборках образцов ДНК от больных колоректальным раком при низкой частоте метилирования данного участка у здоровых доноров или в прилегающих нормальных тканях толстой и прямой кишки онкопациентов.
2) Присутствие СpG-островка в области начала гена (или в районе точки старта кодирования альтернативной изоформы белка - продукта гена), что в большинстве случаев служит свидетельством регуляции активности данного гена путем метилирования этой области.
3) Присутствие потенциального сайта узнавания эндонуклеазы GlaI (RCGY) в нуклеотидной последовательности на выбранном участке.
4) Достаточное расстояние (50 п.н. и более) между двумя потенциальными сайтами узнавания эндонуклеазы GlaI для одновременного отжига на этом участке флуоресцентно-меченого зонда и геномного праймера и возможность подбора для этого участка праймера и зонда, не подверженных теоретической кросс-гибридизации между собой и с последовательностью адаптера.
5) Значение G+C состава на кандидатном участке, не превышающее 80%, что вызвано ограничениями системы амплификации ДНК in vitro, в которой используется HotStart Taq ДНК-полимераза.
6) Уникальность нуклеотидной последовательности кандидатного участка анализа (невхождение его в число повторяющихся элементов генома) во избежание неспецифического отжига подобранного геномного праймера в других областях генома, что может привести к значительному снижению эффективности амплификации и затруднению детекции результатов при проведении ПЦР в реальном времени.
В результате проведенного биоинформационного анализа регуляторных участков каждого из перечисленных генов для проведения экспериментального исследования были отобраны 26 областей из данных участков (табл.2), которые удовлетворяют всем требуемым критериям проведения анализа с помощью метода GLAD-ПЦР, и подобраны специфические праймеры и зонды на выбранные участки регуляторных областей генов-онкомаркеров (табл.3).
Таблица 2.
Участки регуляторных областей генов-онкомаркеров перспективные для GLAD-ПЦР-анализа.
Ген (регион) Название гена Расположение в хромосоме Координаты участка в хромосоме (версия генома человека GRCh38.p7)
ADHFE1 alcohol dehydrogenase, iron containing 1 8q12.3 chr8:66432540-66432621
ALX4 ALX homeobox 4 11p11.2 chr11:44304627-44304798
CNRIP1 cannabinoid receptor interacting protein 1 2p13 chr2:68319340-68319419
EID3 EP300 interacting inhibitor of differentiation 3 12q23.3 chr12:104303544-104303697
ELMO1 engulfment and cell motility 1 7p14.1 chr7:37448622-37448735
ESR1 estrogen receptor 1 6q24-q27 chr6:151807784-151807876
FBN1(1) fibrillin 1 15q21.1 chr15:48644977-48645057
FBN1(2) chr15:48645128-48645191
FBN1(3.1) chr15:48645489-48645638
FBN1(3.3) chr15:48645378-48645537
HLTF helicase-like transcription factor 3q25.1-q26.1 chr3:149086693-149086780
LAMA1 laminin subunit alpha 1 18p11.3 chr18:7117909-7118044
NEUROG1 neurogenin 1 5q23-q31 chr5:135536157-135536283
NGFR nerve growth factor receptor 17q21-q22 chr17:49495262-49495389
RARB retinoic acid receptor beta 3p24 chr3:25428290-25428491
RXRG retinoid X receptor gamma 1q22-q23 chr1:165445168-165445307
RYR2 ryanodine receptor 2 1q43 chr1:237043053-237043209
SDC2 syndecan 2 8q22-q23 chr8:96494024-96494159
SEPT9 septin 9 17q25.3 chr17:77372872-77372956
SFRP2 secreted frizzled-related protein 2 4q31.3 chr4:153789082-153789314
SOCS3 suppressor of cytokine signaling 3 17q25.3 chr17:78359402-78359490
SOX17 SRY-box 17 8q11.23 chr8:54458606-54458751
THBD thrombomodulin 20p11.21 chr20:23049725-23049846
TMEFF2 transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains 2 2q32.3 chr2:192195162-192195377
UCHL1 ubiquitin C-terminal hydrolase L1 4p13 chr4:41256767-41256854
VIM vimentin 10p13 chr10:17229414-17229552
Используемые в работе последовательности регуляторных участков генов по версии генома человека GRCh37/hg19 были получены из международной базы данных GenBank. Для анализа и расчетов праймеров и зондов, изучения их специфичности использовали семейство компьютерных программ Vector NTI 11.5 (Invitrogen, США) и онлайн интернет-ресурсы базы данных Национального центра биотехнологической информации США (Blast NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Таблица 3.
Cпецифические праймеры и зонды на участки регуляторных областей генов-онкомаркеров.
Ген (регион) Последовательность праймеров и зондов*
ADHFE1 g: GTGGGCACCCTGCGGTCC
p: FAM-CCCGCCGGCCCCGCACTC-BHQ1
r: GGTCGCGTACTTGCTGAGGCA
ALX4 g: CGTCAACAACCTCTCATCC
p: FAM-TCCATTTCTTATTTCAGTTTGCCACCA-BHQ1
r: GGACTCTGGTTTCTAAGATCAG
CNRIP1 g: GCCAGACCCTCGCCCAGACA
p: FAM-CGAGGCCCGGCAGGTCCCCC-BHQ1
r: CGTCATTAGGCTGGATGCGCA
EID3 g: GCTCCGCGGGAAGACAGCC
p: FAM-CCCGGCCCAGCCACAAGC-BHQ1
r: TTTGAAAAAGAATAGCTGTCCCCTGA
ELMO1 g: GGGTCGCCGGAGCTCTGA
p: FAM-AACCCTTGCCGCTGCTGTCCTGC-BHQ1
r: CGCCAGCCCAGGAAACTTTAC
ESR1 g: CGCAGGGCAGAAGGCTCAGAA
p: FAM-TGCTCTTTTTCCAGGTGGCCCGCC-BHQ1
r: CGGGACATGCGCTGCGTC
FBN1(1) g: GCGGGGAGACTTTCAGGGCA
p: FAM-ATGCTGAAGCCTCGCGGTCCCC-BHQ1
r: CACGGGTTGGGCTTGGGA
FBN1(2) g: CAGCAGCCCCGGCCGATC
p: FAM-CCTCCCGGGCCCCGCCAGA-BHQ1
r: GGGTACTTTGCGCCGCGCTC
FBN1(3.1) g: GTAGCGGCCACGACTGGGA
p: FAM-CAGCCGCCGCCGCCTCCTC-BHQ1
r: CCGGCTGCACCCACTGGA
FBN1(3.3) g: GAGCCCGGCACCAAGAGC
p: FAM-CCCTCCCCTGCCTGACAGCTTCC-BHQ1
r: CACCGGGGCTGGAGCTGC
HLTF g: AACAAAACACCGGCACCGCA
p: FAM-CAGTCGCACTCCTGGGGCCTCGT-BHQ1
r: GTTCTTCCCCGCCCCCAA
LAMA1 g: ccaccttctctgcccacctccta
p: FAM-CTGACCGCGGCCGCCTCCC -BHQ1
r: CCGCCACCCAGACCCCTC
NEUROG1 g: GTGCCTCGGCCGCTAATCG
p: FAM-CCGACCCCGCCTCTGTTTCACTGC-BHQ1
r: CCGTAATTACCGCCGGCCAATC
NGFR g: TGGCTTCACCCAGCCTCTC
p: FAM-CAGCCAGAGCGAGCCGAGCC-BHQ1
r: TCCAGCTCGGTCCGCTTTG
RARB g: TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC
p: FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1
r: GGTTCCCAGAAAGATCCCAAGTTC
RXRG g: GCCGCCGTCACCGCTACT
p: FAM-CCACCGCCGTCGCTGCTGC-BHQ1
r: GTGCCACCCGGTAGGGACC
RYR2 g: GGGGACCACGGAGGCGACT
p: FAM-TTTCCCCCAAGTCAAGGTGCTGCGAAA-BHQ1
r: CGGGGGTGATGGTGCAGGA
SDC2 g: GCGATTGCGGCTCAGGCT
p: FAM-CCCCGAGCCCGAGTCCCCG-BHQ1
r: GGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGA
SEPT9 g: GCAGGAGGCTGTATTTGGG
p: FAM-AGCCAAACAAAGTTCTCTGTCACCGCC-BHQ1
r: CGCTGCCGTTTAACCCTTG
SFRP2 g: GCACAGCCAGAGTTTTCTTG
p: FAM-TACCCTTCATTGGCTCCTCCCTTGCT-BHQ1
r: AGGCTTCTCTGTTTGTTGTTTAAAG
SOCS3 g: CAGTCCCGGGGGCCCTTCT
p: FAM-TGCTCCCCACCCGGCCACACTCC-BHQ1
r: CAAGGGCGCAGCGTGGGA
SOX17 g: CGCCCTCCGACCCTCCAA
p: FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1
r: CAGTTCAGGGCCAAGGGTGCT
THBD g: GTTCGGGAAAAGGAAGGAAGTGC
p: FAM-ATTGCTGGGTTCTCTGGCCGCC-BHQ1
r: TTACTCATCCCGGCGAGGTGA
TMEFF2 g: GGTGGGCTACCCGCACACTCATA
p: FAM-CCATTCGCCTCACTCTCCGCTCCA-BHQ1
r: CGCCGACTCGCCCCTCTC
UCHL1 g: GCAGAACCAAGCGAGGGGGAA
p: FAM-CGTACCCATCTGGCCGCGACCGTC-BHQ1
r: GGGGCCCGGCCGTACCAC
VIM g: TCCGCAGCCATGTCCACCA
p: FAM-CCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGCAG-BHQ1
r: GCTGCCCAGGCTGTAGGTGC
*Примечание: g – геномный праймер; p – флуоресцентно-меченый зонд; r – дополнительный геномный праймер (reverse), впоследствии заменяемый в GLAD-ПЦР гибридным праймером (пример 2); FAM – флуоресцеин; BHQ1 – гаситель флуоресценции (Black Hole Quencher 1).
Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 20 мкл в трех повторах на детектирующем амплификаторе CXF-96 («Bio-Rad», США) по универсальной для всех амплифицируемых участков программе: 95°С 3 мин, далее 5 циклов без детекции: 95°С 10 сек, 61°С 15 сек, 72°С 20 сек; затем 50 циклов с детекцией по каналу FAM на стадии отжига: 95°С 10 сек, 61°С 15 сек, 72°С 20 сек. Концентрации реакционных компонентов ПЦР были аналогичны указанным в примере 2. В экспериментах использовали лейкоцитарную ДНК здорового донора, полученную и очищенную, как описано ранее [Абдурашитов М.А. с соавт. Рестрикционный анализ ДНК человека – новые возможности в ДНК-диагностике. Медицинская генетика. 2007. - Т. 6. - С. 29-36]. Pезультаты амплификации соответствовали ожидаемым. Последовательности разработанных праймеров и зондов представлены в таблице 3. Впоследствии, при проведении GLAD-ПЦР, один из праймеров, обозначенный в таблице как «r» (reverse), заменяли на отобранный гибридный праймер (пример 2).
Пример 2. Поиск метилированных сайтов RCGY для GLAD-ПЦР-анализа
Изучен статус метилирования сайтов RCGY в пределах выбранных участков ДНК с целью выбора оптимальных сайтов для дальнейшего GLAD-ПЦР-анализа клинических образцов. Для поиска перспективных сайтов R(5mC)GY в пределах выбранных для анализа участков регуляторных областей генов-онкомаркеров использовали препарат ДНК из клеток колоректального рака линии SW837 (линия клеток аденокарциномы ободочной кишки), выделенный известным методом [Sambrook J., Russel D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – 2222 p.]. Поиск проводили методом подбора гибридных праймеров под близлежащие сайты RCGY на протяжении не более 400 п.о. от положения геномного праймера. Использовали методологию, структуры олигонуклеотидного адаптера и гибридных праймеров согласно известному способу [Кузнецов В. В. с соавт. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК // Патент РФ №2525710 С1, опубл. 20.08.2014, Бюл. № 23].
Структура гибридного праймера представляет собой 19-звенную последовательность следующего состава: 5’-CCTGCTCTTTCATCGgYNN-3’, где подчеркиванием выделена 15-звенная часть праймера, комплементарная универсальному олигонуклеотидному адаптеру, а gYNN – 4-звенник, комплементарный геномной последовательности в точке гидролиза ДНК метилзависимой эндонуклеазой GlaI. Данная структура предполагает 32 варианта гибридных праймеров, соответствующих различным точкам гидролиза ДНК по сайту R(5mC)GY.
К 45 нг препарата ДНК добавляли метилзависимую сайт-специфическую ДНК-эндонуклеазу GlaI в количестве 1,5 е.а. и компоненты буфера для достижения следующего состава в объеме 21,7 мкл: 20 мМ Tris-SO4, pH 8.0, 4 мМ MgCl2, 1 мМ ß-меркаптоэтанол, 100 нг/мкл БСА. Гидролиз проводили в течение 30 мин при 30 С с последующей инактивацией GlaI при 65 С в течение 20 мин.
Далее в к GlaI-гидролизату добавляли АТФ до конечной концентрации 0,5 мМ, ß-меркаптоэтанол до 6,8 мМ, универсальный олигонуклеотидный адаптер 5’-CCTGCTCTTTCATCG-3’/3’-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5’, до конечной концентрации 0,5 мкМ и 1000 е.а. высокоактивной T4 ДНК-лигазы. Реакцию лигирования адаптера проводили в 30 мкл реакционной смеси в течение 15 мин при 25 С, затем лигазу термоинактивировали при 65 С в течение 20 мин.
Для проведения ПЦР в режиме реального времени к лигазной смеси добавляли следующие компоненты до достижения итоговых концентраций в конечном объеме, равном 60 мкл: 50 мМ Tris-SO4, pH 9,0, 30 мМ KCl, 10 мМ сульфата аммония, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 0,01 % Tween-20, смесь геномного праймера, гибридного праймера и зонда по 0,4 мкМ каждого и 0,05 е.а./мкл Hot Start ДНК-полимеразы. Для повышения эффективности амплификации GC-богатых участков ДНК использовали стабилизатор. Полученную реакционную смесь (60 мкл) разделяли на три равные части.
Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 20 мкл в трех повторах на детектирующем амплификаторе CXF-96 («Bio-Rad», США) по программе: 95°С 3 мин, далее 5 циклов без детекции: 95°С 10 сек, 61°С 15 сек, 72°С 20 сек; затем 50 циклов с детекцией (канал FAM) на стадии отжига: 95°С 10 сек, 61°С 15 сек, 72°С 20 сек. Результаты анализировали при помощи программного обеспечения амплификатора CXF-96 и интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривых флуоресценции образцов с пороговыми линиями, что соответствовало наличию или отсутствию значения порогового цикла «Cq» в соответствующей графе таблицы результатов программы амплификатора.
На фиг. 1 представлен пример поиска наиболее часто метилированного сайта RCGY на выбранном участке регуляторной области гена FBN1(3.3). Выбор наиболее метилированного сайта RCGY и соответствующего ему гибридного праймера для GLAD-ПЦР анализа в регуляторной области гена FBN1. (a) Фрагмент нуклеотидной последоваательности регуляторного участка гена FBN1. Показаны геномные праймеры, флуоресцентные зонды, GlaI специфичные сайты (RCGY) и четырехнуклеотидная последовательность соответствующего гибридного праймера. Гибридные праймеры, соответствующие наиболее метилированным сайтам RCGY показаны заглавными буквами. Координаты участка в хромосоме даны в соответствии с геномной сборкой GRCh38/hg38. (b) Кривые ПЦР в реальном времени полученные с применением различных гибридных праймеров в GLAD-ПЦР-анализе регуляторного участка гена FBN1 (3.1).
Как видно из фиг. 1, таким оказался третий сайт в ампликоне, которому соответствует гибридный праймер 5’- CCTGCTCTTTCATCGGCCG -3’.
Результаты поиска наиболее метилированных сайтов RCGY из регуляторных областей генов ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM, перспективных для GLAD-ПЦР-анализа клинических образцов и идентификации колоректального рака приведены в Таблице 1.
Пример 3. GLAD-ПЦР-анализ статуса метилирования генов-онкомаркеров колоректального рака
Образцы операционного материала опухолей (n = 21) и нормальной слизистой кишечника (n = 9) от больных колоректальным раком были получены из ФГУП Северский биофизический научный центр ФМБА России (г. Северск, Томская обл., РФ). Для GLAD-ПЦР-анализа статуса метилирования сайтов RCGY в заданных положениях участка ДНК определенного гена использовали препараты геномных ДНК, выделенные из клинических образцов известным методом фенол-хлороформной экстракции [Sambrook J., Russel D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. – 2222 p.], прошедшие обработку РНК-азой А для очистки от примесей РНК и фрагментацию редкощепящей эндонуклеазой рестрикции TaqI для более полного гидролиза ДНК. Концентрации образцов ДНК (нг/мкл) определяли спектрофотометрически. Реакцию GLAD-ПЦР проводили, как описано в примере 2. В реакцию брали 9 нг ДНК, ПЦР проводили в трех повторах для каждого образца (по 3 нг ДНК, т.е. по ~103 копий генома на реакцию). Один из геномных праймеров в ПЦР заменяли на подобранный, как описано в примере 2, т.е. гибридный праймер.
Результаты проведенного анализа для гена SEPT9 представлены на фиг. 2: результаты GLAD-ПЦР-анализа отобранного сайта RCGY в регуляторной области гена SEPT9 в клинических образцах. По горизонтальной оси отображены номера клинических образцов, где T – соответствует опухолевому образцу, а N – здоровому. По вертикальной оси приведено усредненное значение Cq для каждого образца с указанием доверительного интервала. В соответствии с полученными значениями Cq для каждого цикла экспериментов для оценки чувствительности и специфичности каждого маркера были построены ROC кривые и оценена площадь под кривой [E. R. DeLong, D. M. DeLong, and D. L. Clarke-Pearson, “Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach,” Biometrics, vol. 44, no. 3, pp. 837–845, 1988]. Результаты оценки приведены в таблице 4, а соответствующие кривые на рисунке фиг.3 - ROC кривая для GLAD-ПЦР-анализа статуса метилирования RCGY сайта-маркера колоректального рака для гена SEPT9.
В ходе ROC-анализа рассчитывался оптимальный пороговый цикл отсечения «Ctопт», при котором суммарное значение чувствительности и специфичности было максимальным. Анализируемый образец считали положительным, если среднее значение «Ct» для образца было меньше или равно «Ctопт». Анализируемый образец считали отрицательным, если среднее значение «Ct» для образца превышало «Ctопт».
Таблица 4
Оценка диагностической ценности отобранного сайта RCGY в регуляторной области гена-онкомаркера колоректального рака SEPT9 методом GLAD-ПЦР-анализа.
Ген (регион) Количество детектировнных образцов колоректального рака / общее число образцов опухолей Чувствительность,
%		 Количество отрицательных результатов / общее число здоровых образцов Специфичность,
%		 Площадь под кривой
(стандартное отклонение)		 95% доверительный интервал
SEPT9 16/21 76.2 9/9 100 0.862 (0.067) 0.688–0.960
Таким образом, в примере 3 показана возможность успешного применения метода GLAD-ПЦР для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки с использованием разработанного набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для анализа методом GLAD-ПЦР статуса метилирования заданных сайтов RCGY в регуляторных областях генов-онкомаркеров колоректального рака.

Claims (55)

1. Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР, имеющих следующую структуру:
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ADHFE1 (5'→3'):
ADHFE1_g: 5'-GTGGGCACCCTGCGGTCC-3' (18 н.) ADHFE1_p: 5'-FAM-CCCGCCGGCCCCGCACTC-BHQ1-3' (18 н.) ADHFE1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTAC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ALX4 (5'→3'):
ALX4_g: 5'-CGTCAACAACCTCTCATCC-3' (18 н.) ALX4_р: 5'-FAM-TCCATTTCTTATTTCAGTTTGCCACCA-BHQ1-3' (18 н.) ALX4_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера CNRIP1 (5'→3'):
CNRIP1_g: 5'-GCCAGACCCTCGCCCAGACA-3' (20 н.) CNRIP1_p: 5'-FAM-CGAGGCCCGGCAGGTCCCCC-BHQ1 (20 н.) CNRIP1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGA-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера EID3 (5'→3'):
EID3_g: 5'-GCTCCGCGGGAAGACAGCC-3' (19 н.) EID3_p: 5'-FAM-CCCGGCCCAGCCACAAGC-BHQ1-3' (18 н.) EID3_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTGT-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ELMO1 (5'):
ELMO1_g: 5'-GGGTCGCCGGAGCTCTGA-3' (18 н.) ELMO1_p: 5'-FAM-AACCCTTGCCGCTGCTGTCCTGC-BHQ1-3' (23 н.) ELMO1 _h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCCG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера ESR1 (5'→3'):
ESR1_g: 5'-CGCAGGGCAGAAGGCTCAGAA-3' (21 н.) ESR1_p: 5'-FAM-TGCTCTTTTTCCAGGTGGCCCGCC-BHQ1-3' (24 н.) ESR1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTGT-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(1) (5'→3'):
FBN1(1)_g: 5'-GCGGGGAGACTTTCAGGGCA-3' (20 н.) FBN1(1)_p: 5'-FAM-ATGCTGAAGCCTCGCGGTCCCC-BHQ1-3' (22 н.) FBN1(1)_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(2) (5'→3'):
FBN1(2)_g: 5'-CAGCAGCCCCGGCCGATC-3' (18 н.) FBN1(2)_p: 5'-FAM-CCTCCCGGGCCCCGCCAGA-BHQ1-3' (19 н.) FBN1(2)_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCTC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(3.1) (5'→3'):
FBN1(3.1)_g: 5'-GTAGCGGCCACGACTGGGA-3' (19 н.) FBN1(3.1)_p: 5'-FAM-CAGCCGCCGCCGCCTCCTC-BHQ1-3' (19 н.) FBN1(3.1)_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера FBN1(3.3) (5'→3'):
FBN1(3.3)_g: 5'-GAGCCCGGCACCAAGAGC-3' (18 н.) FBN1(3.3)_p: 5'-FAM-CCCTCCCCTGCCTGACAGCTTCC-BHQ1-3' (23 н.) FBN1(3.3)_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCCG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера HLTF(5'→3'):
HLTF_g: 5'-AACAAAACACCGGCACCGCA-3' (20 н.) HLTF_p: 5'-FAM-CAGTCGCACTCCTGGGGCCTCGT-BHQ1-3' (23 н.) HLTF_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера LAMA1 (5'→3'):
LAMA1_g: 5'-CCACCTTCTCTGCCCACCTCCTA-3' (23 н.) LAMA1_p: 5'-FAM-CTGACCGCGGCCGCCTCCC-BHQ1-3' (19 н.) LAMA1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера NEUROG1 (5'→3'):
NEUROG1_g: 5'-GTGCCTCGGCCGCTAATCG-3' (19 н.) NEUROG1_p: 5'-FAM-CCGACCCCGCCTCTGTTTCACTGC-BHQ1-3' (24 н.) NEUROG1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера NGFR (5'→3'):
NGFR_g: 5'-TGGCTTCACCCAGCCTCTC-3' (19 н.) NGFR_р: 5'-FAM-CAGCCAGAGCGAGCCGAGCC-BHQ1-3' (20 н.) NGFR_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCTC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RARB (5'→3'):
RARB_g: 5'-TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC-3' (23 н.) RARB_p: 5'-FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1-3' (26 н.) RARB_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTTC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RXRG (5'→3'):
RXRG_g: 5'-GCCGCCGTCACCGCTACT-3' (18 н.) RXRG_p: 5'-FAM-CCACCGCCGTCGCTGCTGC-BHQ1-3' (19 н.) RXRG_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера RYR2 (5'→3'):
RYR2_g: 5'-GGGGACCACGGAGGCGACT-3' (19 н.) RYR2_p: 5'-FAM-TTTCCCCCAAGTCAAGGTGCTGCGAAA-BHQ1-3' (27 н.) RYR2_h:. 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGT-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SDC2 (5'→3'):
SDC2_g: 5'-GCGATTGCGGCTCAGGCT-3' (18 н.) SDC2_p: 5'-FAM-CCCCGAGCCCGAGTCCCCG-BHQ1-3' (19 н.) SDC2_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGTTC-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SEPT9 (5'→3'):
SEPT9_g: 5'-GCAGGAGGCTGTATTTGGG-3' (19 н.) SEPT9_p: 5'-FAM-AGCCAAACAAAGTTCTCTGTCACCGCC-BHQ1-3' (27 н.) SEPT9_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCAG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SFRP2 (5'→3'):
SFRP2_g: 5'-GCACAGCCAGAGTTTTCTTG-3' (20 н.) SFRP2_p: 5'-FAM-TACCCTTCATTGGCTCCTCCCTTGCT-BHQ1-3' (26 н.) SFRP2_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGT-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SOCS3 (5'→3'):
SOCS3_g: 5'-CAGTCCCGGGGGCCCTTCT-3' (19 н.) SOCS3_p: 5'-FAM-TGCTCCCCACCCGGCCACACTCC-BHQ1-3' (23 н.) SOCS3_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера SOX17 (5'→3'):
SOX17_g: 5'-CGCCCTCCGACCCTCCAA-3' (18 н.) SOX17_p: 5'-FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1-3' (21 н.) SOX17_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCCG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера THBD (5'→3'):
THBD_g: 5'-GTTCGGGAAAAGGAAGGAAGTGC-3' (23 н.) THBD_p: 5'-FAM-ATTGCTGGGTTCTCTGGCCGCC-BHQ1-3' (22 н.) THBD_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGA-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера TMEFF2 (5'→3'):
TMEFF2_g: 5'-GGTGGGCTACCCGCACACTCATA-3' (23 н.) TMEFF2_p: 5'-FAM-CCATTCGCCTCACTCTCCGCTCCA-BHQ1-3' (24 н.) TMEFF2_h. 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера UCHL1 (5'→3'):
UCHL1_g: 5'-GCAGAACCAAGCGAGGGGGAA-3' (21 н.) UCHL1_p: 5'-FAM-CGTACCCATCTGGCCGCGACCGTC-BHQ1-3' (24 н.) UCHL1_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCTG-3' (19 н.)
- для специфических праймеров и зонда на участки CpG-островков регуляторных областей гена-онкомаркера VIM (5'→3'):
VIM_g: 5'-TCCGCAGCCATGTCCACCA-3' (19 н.) VIM_p: 5'-FAM-CCGTGTCCTCGTCCTCCTACCGCAG-BHQ1-3' (25 н.) VIM_h: 5'-CCTGCTCTTTCATCGGCGC-3' (19 н.)
где g - геномный праймер (genome); р - флуоресцентно-меченый зонд (zond); h - гибридный праймер (hybrid); FAM - флуоресцеин; BHQ1 - гаситель флуоресценции (Black Hole Quencher 1).
2. Способ идентификации злокачественного поражения толстого кишечника и прямой кишки посредством анализа в образцах ДНК метилирования сайтов RCGY в заданных положениях регуляторных областей генов-онкомаркеров методом GLAD-ПЦР, включающий формирование панели генов-онкомаркеров колоректального рака: ADHFE1, ALX4, CNRIP1, EID3, ELMO1, ESR1, FBN1, HLTF, LAMA1, NEUROG1, NGFR, RARB, RXRG, RYR2, SDC2, SEPT9, SFRP2, SOCS3, SOX17, THBD, TMEFF2, UCHL1 и VIM; гидролиз высокоочищенной геномной ДНК из исследуемого биоматериала метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазой GlaI, лигирование универсального олигонуклеотидного адаптера 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', где р - фосфат с последующей амплификацией в реальном времени с использованием геномных праймеров и зондов, комплементарных последовательностям регуляторных областей указанных генов в исследуемой ДНК, и гибридных праймеров, 3'-концы которых комплементарны 5'-концам ДНК в заданных местах гидролиза GlaI, а оставшаяся часть комплементарна адаптерной последовательности, и делают заключение о наличии последовательности R(5mC)GY, где 5mC - 5-метилцитозин, R-А или G, Y-Т или С в регуляторных областях указанных генов по появлению флуоресцентного сигнала для определения статуса метилирования сайтов в клинических образцах методом GLAD-ПЦР-анализа и на основе информации о статусе метилирования одного или нескольких сайтов делают вывод о наличии или отсутствии колоректального рака, причем при реализации способа используют набор праймеров и зондов по п. 1.
RU2016129968A 2016-07-21 2016-07-21 Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа RU2630669C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016129968A RU2630669C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016129968A RU2630669C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2630669C1 true RU2630669C1 (ru) 2017-09-11

Family

ID=59893842

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016129968A RU2630669C1 (ru) 2016-07-21 2016-07-21 Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2630669C1 (ru)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019144277A1 (zh) * 2018-01-23 2019-08-01 北京艾克伦医疗科技有限公司 鉴定结直肠癌状态的方法和试剂盒
EP3744860A4 (en) * 2018-06-06 2021-05-19 Suzhou Versabio Technologies, Inc. PRIMER AND PROBE SET FOR DIAGNOSIS, DETECTION OR SCREENING OF COLORECTAL CARCINOMA
CN114507740A (zh) * 2022-04-19 2022-05-17 广州滴纳生物科技有限公司 用于胃肠癌诊断的生物标志物、核酸产品和试剂盒
CN114667355A (zh) * 2019-11-07 2022-06-24 基因特力株式会社 检测结直肠癌的方法
CN114807362A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 武汉艾米森生命科技有限公司 结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
CN116121387A (zh) * 2023-01-19 2023-05-16 深圳市人民医院 一种用于结直肠癌检测的组合标志物及其应用
RU2804112C1 (ru) * 2022-12-28 2023-09-26 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CXCR4 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070026393A1 (en) * 2000-04-06 2007-02-01 Kurt Berlin Detection of variations in the dna methylation profile
US20080064029A1 (en) * 2003-06-23 2008-03-13 Epigenomics Ag Methods and Nucleic Acids for Analyses of Colorectal Cell Proliferative Disorders
US20080221056A1 (en) * 2007-02-12 2008-09-11 Johns Hopkins University Early Detection and Prognosis of Colon Cancers
EA013634B1 (ru) * 2005-04-15 2010-06-30 Эпиджиномикс Аг Способы и нуклеиновые кислоты для анализов клеточных пролиферативных нарушений
WO2014062218A1 (en) * 2012-10-16 2014-04-24 University Of Southern California Colorectal cancer dna methylation markers
RU2013132761A (ru) * 2010-12-16 2015-01-27 Дженетик Энэлисиз Ас Набор олигонуклеотидных зондов и способы профилирования микробиоты
EP2886659A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-24 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Gene methylation based colorectal cancer diagnosis

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070026393A1 (en) * 2000-04-06 2007-02-01 Kurt Berlin Detection of variations in the dna methylation profile
US20080064029A1 (en) * 2003-06-23 2008-03-13 Epigenomics Ag Methods and Nucleic Acids for Analyses of Colorectal Cell Proliferative Disorders
EA013634B1 (ru) * 2005-04-15 2010-06-30 Эпиджиномикс Аг Способы и нуклеиновые кислоты для анализов клеточных пролиферативных нарушений
US20080221056A1 (en) * 2007-02-12 2008-09-11 Johns Hopkins University Early Detection and Prognosis of Colon Cancers
RU2013132761A (ru) * 2010-12-16 2015-01-27 Дженетик Энэлисиз Ас Набор олигонуклеотидных зондов и способы профилирования микробиоты
WO2014062218A1 (en) * 2012-10-16 2014-04-24 University Of Southern California Colorectal cancer dna methylation markers
EP2886659A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-24 AIT Austrian Institute of Technology GmbH Gene methylation based colorectal cancer diagnosis

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3792362A4 (en) * 2018-01-23 2021-11-17 Excellen Medical Technology Co., Ltd. METHOD AND KIT FOR IDENTIFYING THE STATE OF COLORECTAL CANCER
WO2019144277A1 (zh) * 2018-01-23 2019-08-01 北京艾克伦医疗科技有限公司 鉴定结直肠癌状态的方法和试剂盒
EP3744860A4 (en) * 2018-06-06 2021-05-19 Suzhou Versabio Technologies, Inc. PRIMER AND PROBE SET FOR DIAGNOSIS, DETECTION OR SCREENING OF COLORECTAL CARCINOMA
CN114667355A (zh) * 2019-11-07 2022-06-24 基因特力株式会社 检测结直肠癌的方法
EP4056715A4 (en) * 2019-11-07 2023-12-27 Genomictree, Inc. METHOD FOR DETECTING COLON CANCER
CN114807362B (zh) * 2021-01-27 2023-11-10 武汉艾米森生命科技有限公司 结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
CN114807362A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 武汉艾米森生命科技有限公司 结直肠癌或腺瘤的诊断试剂盒
RU2842502C1 (ru) * 2021-03-05 2025-06-30 Эсентавитс Фармасьютикалз, Лтд. Композиция праймера-зонда, набор и способ выявления
CN114507740A (zh) * 2022-04-19 2022-05-17 广州滴纳生物科技有限公司 用于胃肠癌诊断的生物标志物、核酸产品和试剂盒
CN114507740B (zh) * 2022-04-19 2022-07-29 广州滴纳生物科技有限公司 用于胃肠癌诊断的生物标志物、核酸产品和试剂盒
RU2804111C1 (ru) * 2022-12-28 2023-09-26 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования
RU2804112C1 (ru) * 2022-12-28 2023-09-26 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CXCR4 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования
CN116121387A (zh) * 2023-01-19 2023-05-16 深圳市人民医院 一种用于结直肠癌检测的组合标志物及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2630669C1 (ru) Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа
US11840739B2 (en) Gene composition for detecting cell proliferative abnormality or grading disease degree and use thereof
CN110872631B (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
US20210102264A1 (en) Detecting cholangiocarcinoma
RU2700088C2 (ru) Способы скрининга рака
EP2899275B1 (en) Method for obtaining information about endometrial cancer, and marker and kit for obtaining information about endometrial cancer
US20210222256A1 (en) Pancreatic cancer
JP2015006163A (ja) 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
WO2012098215A1 (en) Epigenetic portraits of human breast cancers
JP6269492B2 (ja) 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
Gršković et al. DNA methylation: the future of crime scene investigation?
EP2977467A2 (en) Method, use of marker, and determination device for obtaining information on plural types of cancers
CN108220428B (zh) 用于检测胃癌的组合物及其试剂盒和用途
WO2020254405A1 (en) Predicting age using dna methylation signatures
KR20230003560A (ko) 대장암의 조기 발견, 치료 반응의 예측 및 예후 방법
CN110484621B (zh) 一种肝癌早期预警的方法
EP2899272B1 (en) Method and use for obtaining information about colorectal cancer
CN116555423B (zh) 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用
CN116555422B (zh) 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用
JP6583817B2 (ja) 子宮平滑筋における腫瘍の診断マーカー
WO2021003629A1 (en) Methods and Compositions for Lung Cancer Detection
WO2021091239A1 (ko) 대장암 검출 방법
RU2596404C1 (ru) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛИРОВАНИЯ САЙТОВ PuCGPy РЕГУЛЯТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОВ-ОНКОМАРКЕРОВ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА МЕТОДОМ GLAD-ПЦР-АНАЛИЗА И ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ УКАЗАННОГО СПОСОБА
Evdokimov et al. GLAD-PCR assay of DNA methylation markers associated with colorectal cancer
RU2825782C1 (ru) Способ прогноза метастазирования рака яичников на основе набора генов длинных некодирующих РНК

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20181227

Effective date: 20181227