RU2627710C2

RU2627710C2 - Производные стеринов и их применение для лечения заболеваний, связанных с трансформированными астроцитными клетками, или для лечения злокачественных заболеваний крови

Info

Publication number: RU2627710C2
Application number: RU2014149705A
Authority: RU
Inventors: Людовик КЛАРИОН; Марсель МЕРСЕЛЬ; Дидье ПЕТИТ
Original assignee: Бета Иннов
Priority date: 2012-05-10
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2017-08-10
Also published as: EP2847204B1; JP6270823B2; PT2847204T; IN2014DN09437A; CY1117723T1; EP2662382A1; JP2015520146A; RU2014149705A; ES2580331T3; BR112014026948B1; CN104302655A; KR20150013254A; LT2847204T; HRP20180345T1; CY1120395T1; EP2847204A1; US20150086615A1; HK1191654A1; HK1207385A1; SMT201800147T1

Abstract

Изобретение относится к соединению формулы (I), имеющему основную структуру 7 бета-гидроксихолестерола

в которой А представляет собой группу -(R₁)_n, в которой R₁ представляет собой аминокислотный остаток глицина или аланина, присоединенный его С-концом, и n=1 или 2, причем R₁ являются одинаковыми или разными и N-конец указанной аминокислоты замещен группой -C(O)-R₂, в которой R₂ представляет собой бензилоксигруппу, или группу -(R₁)_n, в которой R₁ представляет собой остаток аминокислоты глицина или аланина, n=1 или 2 и N-конец указанной аминокислоты замещен бензилоксикарбонилом; или группу -C(O)-R₆, в которой R₆ представляет собой пятичленный гетероцикл, включающий 2 гетероатома кислорода, незамещенный или замещенный по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным C₁-С₆алкилом; В представляет собой группу -C(O)-R₇, в которой R₇ представляет собой C₁-С₆алкил, неразветвленный или разветвленный; или R₇ представляет собой OR₈, где R₈ означает C₁-С₆алкил, неразветвленный или разветвленный. Изобретение также относится к индивидуальным соединениям, способу получения соединения формулы (I) и к фармацевтической композиции, обладающей активностью в отношении трансформированных астроцитных клеток. Технический результат: получены новые соединения формулы (I), которые могут применяться для лечения заболеваний, связанных с трансформированными астроцитами. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 табл., 16 пр.

Description

Изобретение относится к новым производным стеринов, способу их получения, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению для лечения заболеваний, связанных с астроцитными клетками, трансформированными в раковые клетки, в частности, для лечения мультиформной глиобластомы, или для лечения злокачественных заболеваний крови, в частности, связанных с трансформированными миелоидными клетками, или для лечения лимфом.

Клеточная трансформация соответствует переходу от нормальной эукариотической клетки к иммортализованной клетке и/или раковой эукариотической клетке. Термины «трансформированная клетка" или "раковая клетка" будут использоваться в контексте в дальнейшем как синонимы.

Мультиформная глиобластома (GBM), известная также как астроцитома IV степени, является опухолью головного мозга, характеризующейся трансформацией астроцитных клеток в раковые клетки, в частности, проходящей через глиомы степени I, степени II и степени III.

Несмотря на значительные научные и терапевтические достижения в области онкологии, GBM до сих пор является неизлечимым раком. В лучшем случае, исследователи и врачи удовлетворены, когда средняя продолжительность жизни пациентов может быть продлена на несколько месяцев, самое большее на пятнадцать месяцев.

Одной из проблем, возникающих при лечении GBM, является рецидив, вызванный стволовыми клетками. В самом деле, даже когда существующие способы лечения достигают успеха в ликвидации большей части опухоли, стволовые клетки часто вызывают развитие новой опухоли (1, 2).

Современные способы терапии всегда состоят из резекции опухоли, если ее расположение позволяет это сделать, с последующей лучевой терапией и/или химиотерапией в случае необходимости. В химиотерапии, одним из ведущих способов лечения является битерапия, которая состоит из введения авастина (ингибирование связывания VEGF с его рецептерами) и иринотекана (ингибитор топоизомеразы I). Тритерапия типа PCV, которая представляет собой комбинацию прокарбазина (алкилирующий ДНК агент), ломустина (CCNU; неспецифический алкилирующий агент) и винкристина (ингибирование полимеризации микротрубочек), является в настоящее время весьма спорным способом лечения. Темозоломид, алкилирующий гуанин агент, в комбинации с лучевой терапией, показывает увеличение средней выживаемости, особенно для пациентов с гиперметилированой ДНК. В настоящее время проводятся клинические испытания (фаза III), тестирование действий циленгитида (ингибирование некоторых рецепторов интегрина) и талампанела (блокирование глутаматных каналов типа АМРА).

Исследования иммунотерапии и клинические испытания относятся к двум типам:

- Адаптивная иммунотерапия, в которой пациенту инъецируют клетки, активированные in vitro, такие как лимфокин-активированные киллер-клетки (LAK; фаза II клинических испытаний) или цитотоксические Т-лимфоциты (CTL; фаза I клинических испытаний), инъецированные интракраниально. Исследования в настоящее время показывают выживаемость 20 месяцев, которая является очень незначительной.

- Активная иммунотерапия, которая заключается в использовании вакцин (фаза I) и дендритных клеток (фаза II). Такая терапия не показывает значительное улучшение в выживаемости пациентов. Эти испытания были прекращены.

Генные терапии, которые состоят из использования аденовирусов, ретровирусов или вирусов кори в качестве векторов молекул с противораковым потенциалом, показывают повышение выживаемости только от 6 до 11 месяцев. Клеточная терапия, которая предлагает использование нейронных стволовых клеток в качестве переносчиков лекарственных средств в GBM, все еще находится на стадии демонстрации в фундаментальном исследовании.

Подход, которым несколько пренебрегали в последние десятилетия и который снова рассматривается, состоит из действия на уровне гликолиза и окислительного фосфорилирования. Раковые клетки увеличивают свое потребление глюкозы, поскольку они имеют тенденцию изменять свой метаболизм в сторону анаэробного метаболизма, даже если подача кислорода не является ограничивающим фактором. Этот феномен, наблюдаемый Warburg (3), является результатом избыточной экспрессии HIF (фактор, индуцированный гипоксией) и про-онкогена Myc. HIF повышает превращение пирувата в лактат анаэробно инактивацией пируват-дегидрогеназы, которая является ключевым ферментом в аэробном дыхании. Myc стимулирует биосинтез глутамина, который участвует в анаэробном дыхании (4).

В данном контексте выполняются клинические испытания агентов, действующих на энергетический метаболизм. В качестве примеров можно указать (4):

- метформин: ингибитор митохондриального дыхательного комплекса I, который, в свою очередь, индуцирует AMPK, который замедляет пролиферацию клеток;

- форетин: агент для снижения введенной извне глюкозы;

- фенилацетат: агент для снижения уровня глутамина;

- дихлорацетат: ингибитор пируватдегидрогеназы.

Все эти соединения, кроме дихлорацетата, проходят испытания (фаза II клинических испытаний) и в настоящее время экспериментальные данные еще не известны.

В настоящее время обнаружено, что производные стеринов, нацеливаемые на конкретный аспект энергетического метаболизма астроцитов, тип клеток происхождения GBM, можно применять для лечения мультиформной глиобластомы.

Исходный аспект настоящего изобретения заключается в использовании конкретного энергетического метаболизма астроцитной клетки (глиального происхождения), превращение которой, в конечном счете, приводит к образованию GBM.

Действительно, астроцитная клетка одновременно использует подачу энергии в форме АТФ посредством окислительного фосфорилирования (цикл Кребса, связанный с переносом электронов в митохондрию) и посредством гликолиза: в последнем случае пируват не входит в цикл Кребса, но восстанавливается в лактат ферментом лактатдегидрогеназа (LHD) типа 5. Помимо подачи АТФ астроцит использует гликолиз, посредством продуцирования лактата, для снабжения соседней клетки, нейрона, нейротрансмиттером (глутаматом).

В следующей таблице энергетический метаболизм астроцита, нормального или ракового, сравнивается схематически с энергетическим метаболизмом других клеток:

	Астроциты		Другие клетки
	Митохондриальное окислительное фосфорилирование	Гликолиз	Митохондриальное окислительное фосфорилирование	Гликолиз
Нормальные клетки	50%	50%	90%	10%
Раковые клетки	GBM 1%	GBM 99%	1%	99%

Энергетический метаболизм астроцитов является особым: фактически, митохондриальное окислительное фосфорилирование и функция гликолиза находятся в согласии.

Именно это является специфической метаболической двойственностью нормальной астроцитной клетки, а именно митохондриальное окислительное фосфорилирование, с одной стороны, и гликолиз, с другой стороны, что образует основу для стратегии получения производных стеринов согласно изобретению.

Фактически, авторами изобретения выдвинута рабочая гипотеза, согласно которой производные стеринов согласно изобретению могут направлять энергетический метаболизм раковых астроцитных клеток из гликолиза в митохондриальное окислительное фосфорилирование, процесс, который может привести к их гибели.

Молекула 7β-гидроксихолестерина (7β-ОНСН) с высоким противораковым потенциалом (5, 6) проявляет замечательную цитотоксичность на иммортализованных (спонтанно трансформированных) линиях астроцитов крыс (7, 8) и GBM (линия С6 крыс) "in vitro" (9). Исследования показывают, что этерификация 7β-OHCH у С3-OH внутриклеточными жирными кислотами (образование 7β-OHCH-С3-эфира) в значительной степени была причастна к токсическому действию “родительской” молекулы 7β-OHCH (7, 8, 10).

Тем не менее, механизм действия 7β-OHCH, независимо от того, этерифицирован ли он у C3-ОН или нет, на GBM "in vitro" был далек от выяснения. В последнее время исследования, проведенные на линиях С6, показали, что 7β-OHCH модулирует структуру и динамику скоплений, микродоменов в плазматической мембране, сайтах инициации определенных клеточных мессенджеров, включая мессенджер протеинкиназы Akt, ключевого фермента в клеточном энергетическом метаболизме (11). Фактически, нарушением структуры скоплений оксистерина можно последовательно влиять на активность Akt, в частности, во время превращения нормальных клеток в раковые клетки: Akt регулирует захват глюкозы и активность гликолиза в этих клетках.

Неожиданно было обнаружено, что производные стеринов согласно изобретению, имеющие 7бета-гидроксихолестериновую основную структуру, содержащую заместители в положении 3 и защитные группы в положении 7, могут одновременно разрешать ингибирование гликолиза, необходимого для подачи энергии в высокой степени раковых астроцитов и, в то же время, восстановить митохондриальное окислительное фосфорилирование, которое также является "летальным" для этой клетки.

Фактически такое двойное действие приводит к "перегреву" раковой клетки, приводящему к ее гибели.

Более того, было показано, что производные стеринов согласно изобретению обладают также активностью в отношении к стволовым клеткам, тем самым приводя к полному разрушению клеток глиобластомы.

Активность производных стеринов согласно изобретению в отношении к глиобластоме также означает, что их использование может быть предусмотрено при лечении злокачественных заболеваний крови миелоидного типа вследствие сходства клеточного метаболизма миелоидной клетки с клеточным метаболизмом астроцита; при лечении нейробластомы, причем нейроны имеют такое же эмбриональное и клеточное происхождение, как и астроциты; и при лечении меланомы, поскольку меланоциты имеют такое же эмбриональное происхождение, как и астроциты, как будет объясняться позже.

Кроме того, тот факт, что миелоидная линия и лимфоидная линия имеют общее происхождение, а именно, плюрипотентные кроветворные стволовые клетки, означает, что также можно предусмотреть использование производных стеринов согласно изобретению для лечения лимфом.

Таким образом, изобретение относится к соединениям формулы (I)

в которой

- А представляет собой

группу -(R₁)_n-, в которой R₁ представляет собой аминокислотный остаток, присоединенный его С-концевой частью и n=1 или 2, причем остатки R₁ являются одинаковыми или разными, и N-концевая часть указанной аминокислоты может быть замещена группой -C-(O)-R₂, в которой R₂ представляет собой моно- или полициклическую C₆-C₁₄арилалкильную группу, или группой R₃-C(O)-O- или R₃C(O)-, в которой R₃ представляет собой C₁-C₆алкил, который является незамещенным или замещенным по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, где R представляет собой водород, неразветвленный C₁-C₁₂алкил или незамещенный C₆-C₁₄арил; или R₃ представляет собой С₆-С₁₄арильную или C₅-C₁₄гетероарильную группу, которая является незамещенной или замещенной по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным C₁-C₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или

моно- или полициклическую C₅-C₁₄гетероарилалкильную группу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть одинаковыми или разыми, которые являются незамещенными или замещенными по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₄ алкилом; моно- или полициклическую С₆-С₁₄арилалкилоксигруппу или моно- или полициклическую С₅-С₁₄гетероарилалкилоксигруппу, которая может содержать один или несколько гетероатомов, которые могут быть одинаковыми или разными, которые являются незамещенными или замещенными по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₄алкилом, или

группу -C(O)-NH-R₄ или -C(S)-NH-R₄, в которой R₄ представляет собой водород; С₁-С₁₂алкильную группу, неразветвленную или разветвленную, незамещенную или замещенную по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; С₆-С₁₄арильную группу, незамещенную или замещенную по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆ алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; ацильную группу; формильную группу; сульфонильную группу; сульфинильную группу; или же R₄ представляет собой аллильную группу или остаток сахара;

группу -C(O)-OR₅, в которой R₅ представляет собой С₁-С₁₂алкил, неразветвленный или разветвленный, незамещенный или замещенный по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше;

группу -C(O)-R₆, в которой R₆ представляет собой насыщенный С₅-С₁₄гетероцикл, содержащий 1 или 2 гетероатома, незамещенный или замещенный по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-C₆ алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или R₆ представляет собой неразветвленную или разветвленную С₁-С₁₂алкильную группу, незамещенную или замещенную по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; С₆-С₁₄арильную группу или С₅-С₁₄гетероарильную группу, которые являются незамещенными или замещенными по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или же остаток сахара;

- B представляет собой группу -C(O)-R₇, в которой R₇ представляет собой водород; С₁-С₁₂-, предпочтительно С₁-С₆алкил, неразветвленный или разветвленный, незамещенный или замещенный по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; С₆-С₁₄арильную группу, незамещенную или замещенную по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-C₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или R₇ представляет собой OR₈, где R₈ представляет собой неразветвленный или разветвленный С₁-С₁₂-, предпочтительно С₁-С₆алкил.

Алкильная группа означает неразветвленную или разветвленную С₁-С₁₂алкильную группу, такую как метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная, втор-бутильная, трет-бутильная, пентильная, изопентильная, втор-пентильная, трет-пентильная, неопентильная, гексильная, изогексильная, втор-гексильная, трет-гексильная, гептильная, октильная, нонильная, децильная, ундецильная или додецильная группа, причем неразветвленные или разветвленные С₁-С₆алкильные группы являются предпочтительными.

Арильная группа означает ненасыщенную моноциклическую или полициклическую, карбоциклическую, С₆-С₁₄арильную группу, такую как фенильная, нафтильная, инденильная, антраценильная группы, и более конкретно фенильная группа.

Гетероарильная группа означает ненасыщенную, моноциклическую или полициклическую, С₅-С₁₄гетероарильную группу, содержащую один или несколько гетероатомов, которые могут быть одинаковыми или различными, и более конкретно, группу пуринового или пиримидинового основания.

"Гетероатом" означает атом кислорода, азота или серы.

"Остаток сахара" означает, например, звено типа глюкозы, рибозы или арабинозы.

Подходящими остатками аминокислот являются, например, остатки метионил, глицинил или аланил.

Предпочтительными соединениями формулы (I) являются соединения, у которых выполняется по меньшей мере одно из следующих условий:

- А представляет собой группу -(R₁)_n-, в которой R₁ представляет собой остаток аминокислоты и n=1 или 2;

- А представляет собой группу -(R₁)_n-, в которой R₁ представляет собой остаток аминокислоты, n=1 или 2 и N-концевая часть указанной аминокислоты замещена арилалкоксикарбонильной группой, в частности, бензилоксикарбонилом; или группой R₃-C(O)-O- или R₃-C(O)-, в которой R₃ представляет собой С₁-С₆ алкил, незамещенный или замещенный по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или R₃ представляет собой С₁-С₆арильную или С₅-С₁₄гетероарильную группу, которая является незамещенной или замещенной по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше;

- А представляет собой радикал аланил, связанный с радикалом глицинил, необязательно замещенный у его N-концевой части арилалкоксикарбонильной группой, в частности, бензилоксикарбонилом;

- А представялет собой радикал метионил, связанный с радикалом глицинил, необязательно замещенный у его N-концевой части арилалкоксикарбонильной группой, в частности, бензилоксикарбонилом;

- А представляет собой группу -C(O)-R₆, в которой R₆ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу или неразветвленную или разветвленную С₁-С₆алкильную группу, незамещенную и замещенную по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; С₆-С₁₄арильную группу или С₅-С₁₄гетероарильную группу, которая не замещена или замещена по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или же остаток сахара.

Преимущественно, В представляет собой ацильную группу, у которой алкильная группа является C₁-С₆алкилом, в частности, ацетильную или алкоксикарбонильную группу, в которой алкильная группа представляет собой C₁-C₆алкил, в частности, трет-бутоксикарбонильную группу.В может также, в частности, представлять собой C₁-C₆алкильную группу, незамещенную или замещенную по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше; или С₆-С₁₄арильную группу, незамещенную или замещенную по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆алкилом или по меньшей мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше.

Предпочтительными соединениями формулы (I) являются следующие соединения:

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропаноат (соединение 1.а);

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)-ацетамидо)пропаноат (соединение 1.b);

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат (соединение 2.а);

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат (соединение 2.b).

Соединения формулы (I) можно получить из холестерина способом, содержащим следующие стадии:

- защиту гидроксильной функциональной группы в положении 3 холестерина защитной группой, такой как, например, ацилоксигруппа R₉-C(O)-, в которой группа R₉ представляет собой замещенную или незамещенную C₁-C₆алкильную или замещенную или незамещенную арильную группу, в частности, арилалкоксикарбонильную группу,

- введение функциональной кетоновой группы в положение 7,

- восстановление функциональной кетоновой группы в гидроксильную функциональную группу,

- введение защитной группы в гидроксильную функциональную группу в положении 7, соответствующей группе B, такой как, например, ацильная, арильная или алкоксикарбонильная группа или ацилоксигруппа R₁₀-С(О), в которой R₁₀ представляет собой замещенный или незамещенный С₁-С₆алкил, арил, незамещенный или замещенный по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆алкилом, или С₅-С₁₄гетероарил, незамещенный или замещенный по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным С₁-С₆ алкилом или по меньней мере одной группой, выбранной из OR, NHR и SR, как указано выше,

- удаление защитной группы у функциональной гидроксильной группы в положении 3.

После удаления защиты у функциональной гидроксильной группы в положении 3 указанную функциональную гидроксильную группу можно заместить нужной группой А.

Введение функциональной кетоновой группы в положение 7 можно проводить обычными методами окисления.

Восстановление функцииональной кетоновой группы в гидроксильную функциональную группу, селективно в положении β, можно проводить, например, методом Luche посредством применения NaBH₄ в присутствии гептагидрата хлорида церия (12).

Изобретение относится также к фармацевтическим композициям или лекарственным средствам, содержащим по меньшей мере одно соединение формулы (I) и фармацевтически приемлемый наполнитель.

Фармацевтическая композиция в соответствии с изобретением может состоять из липосомного препарата, содержащего по меньшей мере одно соединение формулы (I). Липосомы можно получить различными способами, известными специалисту в данной области. Можно применять различные липиды, входящие в состав липосом [Медицинское применение липосом (1986) под редакцией Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger].

Альтернативно, указанная липосома может состоять из так называемой "улучшенной" липосомы, имеющей распределение размеров преимущественно между 40 и 80 нм и имеющей состав, который является стабильным в течение времени, или из так называемой "концентрированной" липосомы, имеющей такое же распределение размеров, но содержащей более высокую концентрацию активных молекул, в частности, 50% выше, чем "улучшенная" липосома.

"Улучшенную" липосому можно получить методом получения, содержащим следующие стадии:

- контактирование активной молекулы, которую нужно включить в липосому, и фосфолипида в органическом растворителе,

- выпаривание растворителя в потоке азота, чтобы получить липидную пленку,

- растворение липидной пленки в органическом растворителе,

- выпаривание указанного растворителя в потоке азота и перенос липидной пленки в водный буфер,

- обработка ультразвуком в ультразвуковой ванне,

- получение везикул экструзией.

Предпочтительно, обработку ультразвуком предпочтительно проводят в течение 10 импульсов на одну мин при температуре приблизительно 20°С. Экструзию можно проводить на мембране типа PVDF, имеющей размер пор 200 нм.

"Концентрированые" липосомы можно получить методом, содержащим следующие стадии:

- контактирования активной молекулы, которая должна быть включена в липосому, и количества фосфолипида, которое выше, чем количество, используемое в обычных методах, в частности в два раза выше обычного количества, в органическом растворителе,

- выпаривания растворителя при пониженном давлении так, чтобы получить липидную пленку,

- растворения липидной пленки в органическом растворителе,

- выпаривания указанного растворителя при пониженном давлении и перенос липидной пленки в водный буфер,

- обработки ультразвуком в ультразвуковой ванне,

- получения везикул экструзией.

Предпочтительно обработку ультразвуком проводят в течение 20 импульсов на одну мин при температуре приблизительно 20°С. Экструзию можно проводить на мембране типа PVDF, имеющей размер пор 200 нм.

Выпаривание предпочтительно проводят при давлении ниже приблизительно 3 кПa (30 мбар) и при температуре бани 25°С. Предпочтительно используют ротационный испаритель.

Количество активной молекулы относительно фосфолипида может быть, например, приблизительно 15%, выраженное в масс. %.

Предпочтительный лекарственный препарат по настоящему изобретению состоит из липосом, загруженных по меньшей мере одним соединением формулы (I).

Соединение(я) формулы (I) предпочтительно является единственным активным ингредиентом(ами), содержащимся в фармацевтической композиции согласно изобретению, в частности, когда указанная фармацевтическая композиция представляет собой липосому. Указанную липосому, содержащую по меньшей мере одно соединение формулы (I), можно вводить, например, пероральным или парентеральным путем.

Альтернативно, соединение формулы (I) можно применять в сочетании с другим активным ингредиентом, таким как, например противораковый агент, в частности, авастин, иринотекан, темозоломид или производные таксола.

Фармацевтические композиции согласно изобретению может быть в любой подходящей форме для перорального введения или для парентерального введения, в частности, инъекцией, инфузией или ингаляцией, известной специалисту в данной области.

В частности, указанная фармацевтическая композиция может быть фармацевтически приемлемым раствором, в частности, спиртовым раствором только по меньшей мере одного соединения формулы (I), или комбинацией его с другим активным ингредиентом, который можно вводить пациенту внутривенным вливанием или инфузией.

Указанная фармацевтическая композиция может, в частности, быть пригодной для введения пероральным или сублингвальным путем. Кроме обычных фармацевтических форм, например, таблеток, капсул, порошков, гранул, растворов, эмульсий, пероральных суспензий, капель, сиропов и т.д., пероральные фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать комплексы соединений формулы (I) с солями желчных кислот или, например, комбинации соединений формулы (I) с фосфолипидами, такими как фосфатидилхолин, в липосомальной или не липосомальной форме.

Объектом настоящего изобретения также являются соединения формулы (I) для применения при лечении заболеваний, связанных с трансформированными астроцитными клетками, в частности, при лечении мультиформной глиобластомы или астроцитомы IV стадии (GBM). В частности, соединения формулы (I) можно вводить инъекцией непосредственно в кору головного мозга, в место лечения.

Изобретение также относится к лечению заболеваний, связанных с трансформированными астроцитными клетками, в частности, лечению мультиформной глиобластомы или астроцитомы IV стадии (GBM), введением эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I).

Изобретение также относится к лечению других видов рака, а именно, злокачественных заболеваний крови миелоидного типа и лимфом, нейробластом и меланом.

Объектом настоящего изобретения также являются соединения формулы (I) для применения при лечении злокачественных заболеваний крови миелоидного типа.

Изобретение также относится к лечению злокачественных заболеваний крови миелоидного типа введением эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I).

Злокачественные патологии миелоидного типа развиваются из нормальной миелоидной клетки. Теперь клетка этого типа в нормальном состоянии имеет энергетический метаболизм, довольно сходный с энергетическим метаболизмом астроцитов: она продуцирует свою энергию из митохондриального окислительного фосфорилирования и из гликолиза (лактатный путь; LDH) (13). В случае раковых заболеваний миелоидного происхождения раковые клетки продуцируют свою энергию из гликолиза. Что касается GBM, противораковая активность соединений формулы (I) была бы обусловлена ингибированием LDH (гликолиза) и, следовательно, перегревом клетки, вызванным высоким всплеском митохондриального окислительного фосфорилирования.

Объектом изобретения также являются соединения формулы (I) для применения при лечении лимфом.

Изобретение также относится к лечению лимфом введением эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I).

Фактически, поскольку миелоидная линия и лимфоидная линия имеют общее происхождение, которой является плюрипотентная гемопоэтическая стволовая клетка, активность соединений формулы (I) в отношении злокачественных заболеваний крови миелоидного типа означает, что может быть предусмотрено их применение также для лечения лимфом.

Соединения формулы (I) для применения при лечении нейробластом также являются объектом настоящего изобретения.

Изобретение также относится к лечению нейробластом введением эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I).

Что касается нейробластом, которые поражают главным образом экстракраниальную симпатическую нервную систему, соединения формулы (I) проявляют противоопухолевую активность, поскольку как астроцит, так и нейрон имеют одинаковое эмбриональное происхождение, с одной стороны, а именно, эктодерму, и клеточное происхождение, с другой стороны, а именно, нейроэпителиальные клетки (14). Короче говоря, астроцит и нейрон, оба являются нервными клетки и в равной степени чувствительными к соединениям формулы (I).

Объектом настоящего изобретения также являются соединения формулы (I) для применения при лечении меланомы.

Изобретение относится также к лечению меланомы введением эффективного количества по меньшей мере одного соединения формулы (I).

Фактически, меланоциты, которые имеются в начале меланомы, образуются из нервного гребешка, который сам образован из эктодермы (14). Так как астроциты и нейроны также образуются из эктодермы и соединения формулы (I) обнаруживают анти-GBM и антинейробластомную активность, эти соединения также могут иметь противораковые свойства в отношении к меланомам.

Согласно альтернативе, указанное лечение является последовательным лечением, которое содержит по меньшей мере одну стадию введения первого соединения формулы (I) и по меньшей мере одну стадию введения второго соединения формулы (I), отличного от первого.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.

Раздел I относится к химическому синтезу.

Примеры 1 и 2 относятся к получению промежуточных продуктов синтеза, используемых для получения соединений формулы (I). Примеры 3-6 относятся к получению соединений формулы (I).

Раздел II относится к биологической активности соединений формулы (I).

I/ Химический синтез

Пример 1: Получение 7бета-ацетилхолестерина (соединение 1.4)

Схема реакции показана на фигуре 1.

1) Получение соединения 1.1

Применяли следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
Холестерилбензоат	490,78	100 ммоль	-	50 г
Хлорит натрия	90,44	300 ммоль	3 экв.	28 г
N-Гидроксифталимид	163,13	10 ммоль	0,1 экв.	1,7 г
Диоксан/вода, 3/1				500 мл

Холестерилбензоат, смесь диоксан/вода, хлорит натрия и N-гидроксифталимид помещают в указанном порядке в 1-литровую трехгорлую колбу, снабженную обратным холодильником. Эту смесь нагревают при 50°C в течение 6 час. Ход реакции контролируют ТСХ на пластинке диоксида кремния (силикагель ТСХ 60 F254, Merck) в смеси гексан/Et₂О, 8/2.

Когда скорость образования достигает приемлемого значения, сырую реакционную смесь выливают в 10% раствор сульфита натрия (500 мл) и затем экстрагируют эфиром. Полученную органическую фазу промывают насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, затем водой и, наконец, насыщенным раствором соли. Эту органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем выпаривают при пониженном давлении.

Полученный окрашенный маслянистый остаток затем очищают перекристаллизацией из этанола. Когда полученное белое твердое вещество является недостаточно чистым, его снова очищают хроматографией на силикагеле (диоксид кремния SDS 60А, 35-70 мкм). Твердый осадок получают перенесением этого масла в дихлорметан. Очистку проводят с применением в качестве элюента смеси гексан/этилацетат состава от 98/2 до 90/10. Продукт получают в виде белого твердого вещества.

Выход: 23%.

Анализы: Анализ ¹H HMR в CDCl₃, BRUKER 400 МГц. Колонка ВЭЖХ с нормальной фазой CHIRALCEL O-DH (колонка ODH0CE-CE026), элюент гексан/iProH, 9/1, 20 мин, длина волны 190 нм.

Время удерживания 6,682 мин, чистота по ВЭЖХ 99,2%.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,71 (с, 3H, CH₃), 0,89 (дд, 6H, 2CH₃), 0,94 (д, 3H, СН₃), 1,02-2,78 (м, 26H), 1,27 (с, 3H, CH₃), 4,99 (м, 1H, CH), 5,76 (д, 1H, CH), 7,44-8,05 (м, 5H, CHAr).

2) Получение соединения 1.2

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
Кетохолестерилбензоат	504,76	15,8 ммоль	-	8 г
NaBH₄	37,83	7,9 ммоль	0,5 экв. + 0,5 экв.	0,3 г + 0,3 г
CeCl₃.7H₂O	372,60	14,2 ммоль	0,9 экв.	5,3 г
ТГФ/MeOH, 1:1				200 мл

Кетохолестерилбензоат, смесь растворителей ТГФ/MeOH и гидратированный хлорид церия помещают в колбу объемом 500 мл. Сырую реакционную смесь охлаждают до 0°C на ледяной бане перед медленным добавлением борогидрида натрия. Наблюдается выделение газа, ледяную баню сохраняют в течении 1 час, затем смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 18 час. Развитие реакции контролируют ТСХ (силикагель для ТСХ 60 F254, Merck) в элюенте гексан/EtOAc, 80/20. Если скорость образования является недостаточной, добавляют 0,5 экв борогидрида натрия.

50 мл воды и 200 мл дихлорметана добавляют к сырой реакционной смеси. После переноса смеси в делительную воронку получают органическую фазу. Водную фазу снова экстрагируют DCM. Органические фазы объединяют, промывают 1 н раствором хлористоводородной кислоты и затем насыщенным раствором NaCl.

Органическую фазу затем сушат над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают при пониженном давлении, получая при этом слабоокрашенное масло, которое самопроизвольно кристаллизуется.

Твердый осадок получают переносом остатка в DCM. Этот сырой продукт очищают на колонке с силикагелем (диоксид кремния SDS 60А, 35-70 мкм) в элюенте гексан/EtOAc, 9/1. Продукт получают в виде белого твердого вещества.

Выход: 89%

Время удерживания 7,076 мин, чистота по ВЭЖХ 98,8%.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,63 (с, 3Н, СН₃), 0,79 (дд, 6Н, 2СН₃), 0,85 (д, 3Н, СН₃), 0,89-2,43 (м, 27Н), 1,04 (с, 3Н, СН₃), 3,81 (д, 1Н, СН), 4,81 (м, 1Н, СН), 5,29 (д, 1Н, СН), 7,34-7,99 (м, 5Н, СНАr).

3) Получение соединения 1.3

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-гидроксихолесте рилбензоат	505,76	9,9 ммоль	-	5 г
Уксусный ангидрид				20 мл
Пиридин				20 мл

7β-Гидроксихолестерилбензоат, пиридин и затем уксусный ангидрид помещают в колбу объемом 100 мл. Эту смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 16 час. Развитие реакции контролировали ТСХ (силикагель для ТСХ 60 F254, Merck) в элюенте гексан/EtOAc, 9/1.

Сырую реакционную смесь упаривают при пониженном давлении. Проводят два совместных выпаривания с этилацетатом. Полученный остаток растворяют в этилацетате. Полученную таким образом органическую фазу промывают 1 н хлористоводородной кислотой, сушат над сульфатом натрия и затем упаривают при пониженном давлении.

Полученное белое твердое вещество применяют непосредственно в следующей стадии, без дополнительной очистки.

Выход: 100%.

Время удерживания 4,972 мин, чистота по ВЭЖХ 99,6%.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,63 (с, 3H, CH₃), 0,79 (дд, 6H, 2CH₃), 0,84 (д, 3H, СН₃), 0,91-2,41 (м, 26H), 1,06 (с, 3H, CH₃), 1,95 (с, 3H, CH₃ ацетил), 4,78 (м, 1H, CH), 4,99 (д, 1H, CH), 5,21 (с, 1H, CH), 7,33-7,98 (м, 5H, CHAr).

4) Получение соединения 1.4

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-Гидроксихолестерилбензоат	548,81	9,1 ммоль	-	5 г
1% NaOH в метаноле				50 мл

7β-Гидроксихолестерилбензоат и 1% раствор гидроксида натрия в метаноле помещают в колбу объемом 100 мл. Эту смесь перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Развитие реакции контролируют ТСХ (силикагель для ТСХ 60 F254, Merck) в элюенте гексан/EtOAc, 7/3.

Для завершения реакцию сырую смесь можно было нагревать при 40°C, в таком случае мониторинг проводят ТСХ каждые 20 минут.

Добавляют 200 мл этилацетата и 50 мл воды с последующим переносом смеси в делительную воронку и разделением фаз. Водную фазу снова экстрагируют этилацетатом. Органические фазы объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении, получая при этом маслянистый остаток.

Остаток переносят в этилацетат, получая при этом твердый осадок. Очистку проводят на колонке с силикагелем (диоксид кремния SDS 60A, 35-70 мкм) в элюенте гексан EtOAc состава от 9/1 до 7/3. Целевой продукт получают в виде бесцветного масла, которое самопроизвольно кристаллизуется, образуя белое твердое вещество. Колонку промывают 100% этилацетатом, чтобы выделить образованный 7β-гидроксихолестерин.

Выход: 38%.

Время удерживания 6,186 мин, чистота по ВЭЖХ 91,7%.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,62 (с, 3H, CH₃), 0,78 (дд, 6H, 2CH₃), 0,85 (д, 3H, СН₃), 0,86-2,28 (м, 27H), 1,03 (с, 3H, CH₃), 1,96 (с, 3H, CH₃ ацетил), 3,47 (м, 1H, CH), 4,94 (тд, 1H, CH), 5,13 (т, 1H, CH).

Пример 2: Получение 7бета-трет-бутилоксикарбонилхолестерина (соединение 1.6)

Схема реакции показана на фигуре 2.

Соединение 1.6 получают из соединения 1.2 примера 1.

1) Получение соединения 1.5

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-Гидроксихолестерилбензоат	505,76	1,29 ммоль	-	0,65 г
Boc2O	218,25	2,8 ммоль	2,2 экв.	0,61 г
DMAP	122,17	0,13 ммоль	0,1 экв.	0,016 г
Гексан/ТГФ, 5:2				42 мл

7β-гидроксихолестерилбензоат, растворитель, 2,6-диметиламинопиридин и затем трет-бутилоксикарбонилангидрид помещают в одногорлую 100 мл колбу. Эту смесь перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Развитие реакции контролируют ТСХ в элюенте гексан/EtOAc, 8/2.

Добавляют 50 мл EtOAc и 10 мл воды. Полученную таким образом органическую фазу сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении, получая при этом маслянистый остаток.

Остаток переносят в EtOAc с целью получения твердого осадка. Очистку проводят на колонке с силикагелем в элюенте гексан/EtOAc, 95/5.

Анализ: Анализ ¹H NMR в CDCl₃.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,59 (с, 3H, CH₃), 0,77 (дд, 6H, 2CH₃), 0,84 (д, 3H, СН₃), 0,86-1,98 (м, 24H), 1,09 (с, 3H, CH₃), 1,41 (с, 9H, 3СН₃, t-Boc), 2,42 (м, 2H, CH₂), 4,80 (м, 1H, CH), 4,91 (д, 1H, CH), 5,18 (с, 1H, CH), 7,34-7,97 (м, 5H, CHAr).

2) Получение соединения 1.6

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-трет-бутилоксикарбонилхолестерилбензоат	606,89	1,64 ммоль	-	1 г
1% NaOH в MeOH				50 мл

7β-трет-Бутилоксикарбонилхолестерилбензоат и 1% раствор гидроксида натрия в метаноле помещают в одногорлую 50 мл колбу. Эту смесь перемешивают при температуре окружающей среды до полного растворения. Развитие реакции контролируют ТСХ в элюенте гексан/EtOAc, 7/3. Для завершения реакции сырую смесь можно нагреть до 40°С.

Добавляют 100 мл EtOAc и 20 мл воды. Водную фазу снова экстрагируют EtOAc. Органические фазы объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении, получая при этом маслянистый остаток.

Остаток переносят в EtOAc для получения твердого осадка. Очистку проводят на колонке с силикагелем в элюенте гексан/EtOAc состава от 9/1 до 7/3. Колонку промывают 100% EtOAc для выделения образованного 7β-гидроксихолестерина.

Анализы: Анализ ¹H NMR в CDCl₃.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,60 (с, 3H, CH₃), 0,78 (дд, 6H, 2CH₃), 0,84 (д, 3H, СН₃), 0,91-2,29 (м, 27H), 0,97 (с, 3H, CH₃), 1,41 (с, 9H, 3СН₃, t-Boc), 3,47 (м, 1H, CH_B), 4,77 (тд, 1H, CH_c), 5,17 (т, 1H, CH_A).

Пример 3: Получение 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[a]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропаноата (соединение 1.а)

Упрощенное название: 3-бензилоксикарбонилглицинилаланил-7β-O-трет-бутилоксикарбонилхолестерин

Соединение 1.а получают из промежуточного соединения 1.6

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-трет-Бутилоксикарбонилхолестерин (соединение 1.6)	502	0,16 ммоль	-	80 мг
Z-Gly-Ala-COOH	280,28	0,24 ммоль	1,5 экв.	68 мг
DCC	206,3	0,24 ммоль	1,5 экв.	50 мг
DMAP	122,17	0,24 ммоль	1,5 экв.	30 мг
ТГФ/DCE, 1:1				6 мл

80 мг (0,16 ммоль) 7β-трет-бутилоксикарбонилхолестерина, 68 мг (0,24 ммоль, 1,5 экв.) дипептида, 6 мл смеси растворителей (TГФ/DCE, 1:1), 50 мг (0,24 ммоль, 1,5 экв.) DCC и 30 мг (0,24 ммоль, 1,5 экв.) DMAP помещают в 10 мл колбу Wheaton. Сырую реакционную смесь перемешивают в течение 24 час при температуре окружающей среды. Развитие реакции контролируют ТСХ в элюенте гексан/этилацетат, 7/3.

30 мл этилацетата и 10 мл воды добавляют к сырому продукту реакции. Органическую фазу отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении. Полученный маслянистый остаток переносят в этилацетат, получая при этом твердый осадок.

Очистку проводят на колонке с силикагелем в элюенте гексан/этилацетат состава 7/3, затем 6/4.

Анализы: Анализ ¹H NMR в CDCl₃.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,60 (с, 3H, CH₃), 0,79 (дд, 6H, 2CH₃), 0,83 (д, 3H, СН₃), 0,94-1,88 (м, 24H), 0,98 (с, 3H, CH₃), 1,19 (с, 3H, CH₃ Ala), 1,40 (с, 9H, 3СН₃, t-Boc), 2,27 (м, 2H, CH₂), 3,83 (м, 2H, CH₂), 4,47 (тд, 1H, CH Ala), 4,47 (м, 1H, CH), 4,78 (тд, 1H, CH), 5,07 (с, 2H, CH₂ Gly), 5,22 (т, 1H, CH), 5,23 (м, 1H, NH), 6,41 (с, 1H, NH), 7,29 (м, 5H, CHAr).

Пример 4: Получение 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилпентан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[a]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропаноата (соединение 1.b)

Упрощенное название: 3-бензилоксикарбонилглицинилаланил-7β-O-ацетил-холестерин

Соединение 1.b получают из промежуточного соединения 1.4.

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7β-ацетилхолестерин	444	0,18 ммоль	-	80 мг
Z-Gly-Ala-COOH	280,28	0,27 ммоль	1,5 экв.	76 мг
DCC	206,3	0,27 ммоль	1,5 экв.	56 мг
DMAP	122,17	0,27 ммоль	1,5 экв.	33 мг
ТГФ/DCE, 1:1				6 мл

60 мг (0,13 ммоль) 7β-ацетилхолестерина, 70 мг (0,19 ммоль, 1,5 экв.) дипептида, 6 мл смеси растворителей (ТГФ/DCE, 1:1), 42 мг (0,19 ммоль, 1,5 экв.) DCC и 25 мг (0,19 ммоль, 1,5 экв.) DMAP помещали в 10 мл колбу Wheaton. Сырую реакционную смесь перемешивают в течение 24 час при температуре окружающей среды.

Развитие реакции контролируют ТСХ в элюенте гексан/этилацетат, 7/3.

Анализы: Анализ ¹H NMR в CDCl₃.

¹Н ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,62 (с, 3H, CH₃), 0,78 (дд, 6H, 2CH₃), 0,84 (д, 3H, СН₃), 0,91-1,83 (м, 25H), 1,01 (с, 3H, CH₃), 1,17 (с, 3H, CH₃ Ala), 1,94 (с, 3H, СН₃ ацетил), 2,27 (м, 2H, CH₂), 3,82 (м, 1H, CH), 4,47 (тд, 1H, CH Ala), 4,56 (м, 1H, CH), 4,95 (тд, 1H, CH), 5,06 (с, 2H, CH₂ Gly), 5,17 (с, 1H, CH), 5,37 (т, 1H, CH), 6,49 (д, 1H, NH), 7,24 (м, 5H, CHAr).

Пример 5: Получение 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилпентан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[a]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилата (соединение 2.a)

Упрощенное название: 3-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбокси-7β-O-трет-бутилоксикарбонилхолестерин

1) Получение диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилатной группы

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
(-)-Метил-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилат	160,17	31,2 ммоль	-	5 г
LiOH⋅H₂O	41,96	78 ммоль	2,5 экв.	3,3 г
Метанол				25 мл

Ацеталь, метанол и затем гидроксид лития помещали в 50 мл колбу. Эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 час.

Сырую реакционную смесь упаривают при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в 75 мл воды. Эту фазу затем подкисляют при 0°C до рН 1 1 н хлористоводородной кислотой, затем экстрагируют 2×100 мл этилацетата. Органические фазы объединяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении, получая при этом слабоокрашенный маслянистый остаток.

Остаток применяют непосредственно на стадии сочетания без дополнительной очистки.

Анализы: Анализ ¹H ЯМР в ДМСО, BRUKER 400 MHz.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 1,32 (д, 3H, CH₃), 1,42 (с, 3H, CH₃), 4,14 (AB, 2H, CH₂), 4,55 (дд, 1H, CH), 10,30 (c, 1H, OH), 7,24 (м, 5H, CHAr).

Выход: 94%.

2) Получение соединения 2.а

Соединение 2.а получают из промежуточного соединения 1.4

Были использованы следующие реагенты:

	Мол. масса	Nb, моль	Экв.	Масса или объем
7-β-ацетилхолестерин	444	3,4	-	1,5 г
3-(S)-2,2-Диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновая кислота	146,17	10,1 ммоль	3 экв.	1,35 г
DCC	206,3	10,1 ммоль	3 экв.	2,1 г
DMAP	122,17	10,1 ммоль	3 экв.	1,24 мг
ТГФ/DCE (1:1)				50 мл

50 мг (9,9 ммоль) 7-β-трет-бутилоксикарбонилхолестерина, 6 мл смеси растворителей (ТГФ/DCE, 1:1) и 16 мг (11,9 ммоль, 1,2 экв.) 3-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоновой кислоты помещают в 10 мл колбу Wheaton.

24,5 мг (11,9 ммоль, 1,2 экв.) DCC и 14,5 мг (11,9 ммоль, 1,2 экв.) DMAP добавляют перед перемешиванием сырой реакционной смеси в течение 24 час при температуре окружающей среды. Развитие реакции контролируют ТСХ в элюенте гексан/этилацетат, 8/2. Смесь нагревают при 50°C в течение 2 час для завершения реакции.

30 мл этилацетата и 10 мл воды добавляют в сырой продукт реакции. Органическую фазу отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и затем упаривают при пониженном давлении. Полученный маслянистый остаток переносят в этилацетат, получая при этом твердый осадок.

Очистку проводят на колонке с силикагелем в элюенте гексан/этилацетат состава 95/5, затем 9/1.

Анализы: Анализ ¹H ЯМР в CDCl₃.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,60 (с, 3H, CH₃), 0,79 (дд, 6H, 2CH₃), 0,83 (д, 3H, СН₃), 0,74-1,97 (м, 25H), 0,98 (с, 3H, CH₃), 1,33 (с, 3H, CH₃ Ацеталь), 1,40 (с, 9H, 3СН₃, t-Boc), 1,42 (с, 3H, CH₃ Ацеталь), 2,29 (м, 2H, CH₂), 4,08 (AВ, 2H, CH₂ Ацеталь), 4,48 (ддд, 1Н, CH Ацеталь), 4,63 (м, 1Н, CH), 4,78 (тд, 1H, CH), 5,22 (д, 1H, CH).

Пример 6: Получение 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилпентан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклорента[a]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилата (соединение 2.b)

Упрощенное название: 3-(S)-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбокси-7-β-О-ацетил-холестерин

Соединение 2.b получают из промежуточного соединения 1.4.

Были использованы следующие реагенты:

Холестерин, смесь растворителей и кислоту помещают в 100 мл колбу. DCC и DMAP добавляют перед перемешиванием сырого реакционного продукта в течение 24 час при температуре окружающей среды. Развитие реакции контролируют ТСХ (силикагель для ТСХ 60 F254, Merck) в элюенте гексан/этилацетат, 8/2.

100 мл этилацетата и 50 мл воды добавляют к сырой реакционной смеси. Органическую фазу отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтрую и затем упаривают при пониженном давлении.

Полученный маслянистый остаток переносят в этилацетате, получая при этом твердый остаток. Колонка с силикагелем (диоксид кремния SDS 60A, 35-70 мкм) в элюенте гексан/этилацетат состава 95/5, затем 9/1.

Выход: 68%.

Анализы: Анализ ¹H и ¹³С ЯМР в CDCl₃, BRUKER 400 MHz. Колонка ВЭЖХ с нормальной фазой CHIRALCEL O-DH (колонка ODH0CE-CE026), элюент гексан/iProH, 9/1, 20 мин, длина волны 190 нм.

Время удерживания 5,291 мин, чистота по ВЭЖХ 98,7%.

¹H ЯМР (CDCl₃, 400,13 МГц): δ 0,62 (с, 3H, CH₃), 0,79 (дд, 6H, 2CH₃), 0,84 (д, 3H, СН₃), 0,91-2,30 (м, 27H), 1,01 (с, 3H, CH₃), 1,33 (с, 3H, CH₃ Ацеталь), 1,42 (с, 3H, CH₃ Ацеталь), 1,93 (с, 3H, CH3 ацетил), 4,09 (AB, 2H, CH₂ Ацеталь), 4,48 (дд, 1H, CH Ацеталь), 4,62 (м, 1H, CH), 4,96 (тд, 1H, CH), 5,18 (д, 1H, CH).

II/ Биологическая активность

А/ Протоколы

Для всех экспериментов применяли следующие протоколы.

1) Клеточные культуры

Применяют пластиковые плоскодонные 96-луночные культуральные планшеты (NUNC, США), обработанные для клеточных культур (Sigma-Aldrich, Ref. 114754); 1500 клеток высевают на лунку в 200 мкл культуральной среды. Во время обработки 100 мкл чистой культуральной среды, 100 мкл культуральной среды, содержащей этанол или липосомы, или 100 мкл культуральной среды, содержащей активные ингредиенты, добавляют в каждую лунку; конечный объем культуральной среды после обработки, таким образом, составляет 300 мкл для всех лунок.

Культуры инкубируют в инкубаторе Sanyo (Япония, модель MCO-19AIC-UV) при 37°C и в атмосфере с 5% СО₂ и насыщенной влажности. Клетки наблюдают с помощью инвертированного микроскопа (Nikon Eclipse TS100, Japan) и фотографии получают при помощи фотоаппарата (DIGITAL camera with c-mount; LABOVER, France). Бокс для культур является микробиологически безопасным боксом MSC (thermo SCIENTIFIC, Model HERA SAFE KS12, France).

Время удвоения клетки рассчитывается при помощи формулы:

Время удвоения=(tb-ta) log(2)/(log(b)-log(a))

где (a) и (b) представляют собой число клеток во время ta и tb (tb>ta) (15).

Переход проводят диссоциацией трипсином (бычьей поджелудочной железы типа 3, Sigma, France). Клеточную диссоциацию проводят при температуре окружающей среды в течение 30 минут 0,04% (масс./об.) раствором KCl Tyrode, содержащим 0,05% (масс./об.) трипсина.

После диссоциации клетки суспендируют в культуральной среде, подходящей для клеток, и считают с помощью счетной камеры THOMA и разводят в такой же среде для получения 1500 клеток на лунку.

а) Клеточные линии

Были использованы следующие клетки глиобластомы:

- Линии С6.

Клеточная линия типа С6 была получена Benda и др. (16) из опухолей головного мозга крыс, индуцированных N-метилнитрозомочевиной. Этот тип клеток применяют в качестве модели как "in vitro", так и "in vivo", для оценки потенциала действия против GBM. Линии получают из бывшего Strasbourg Neurochemistry Centre (U44 INSERM и UPR 416 CNRS).

Культуральная среда состоит из 70% минимальной эссенциальной среды (MEM; Fisher Scientifique, ref. 61100) и 30%-ого раствора Хэнкса (Sigma, ref. H 9269). Затем к культуральной среде добавляют: фетальную телячью сыворотку (FCS; Fisher Scientifique, ref. 10108165) до конечной концентрации 5% (об./об.), раствор 5 мкг/мл антибиотика ципрофлоксацина гидрохлорида (EUROMEDEX, Ref UC5074) и раствор 2,5 мкг/мл фунгизона (INVITROGEN, ref. 15290-026). Время удвоения этого типа клеток составляет 17 час.

- Человеческие линии GBM

Линии глиобластомы человека (GBM, линия U-87 MG) и их культуральная среда (минимальная эссенциальная среда Игла или EMEM) были получены от АТСС (USA, ref. ATCC-HTB-14). Культивирование клеток начинают и поддерживают согласно рекомендациям АТСС. Эти линии обычно используют "in vitro" и "in vivo" для тестирования потенциала действия против GBM. Время удвоения этих линий 16 час.

Применяют также следующие первичные культуры человеческих клеток:

- астроцитные клетки

Применяемые человеческие астроцитные клети были получены из ScienCell, США (ref. 1800), а также их культуральная среда, составленная из основной среды, содержащей 2% (об./об.) сыворотки FCS (ref. 0010), белки роста астроцитов (AGS, Ref. 1852) и раствор пенициллина/стрептомицина (ref. 0503). Время удвоения этих астроцитов человека 96 час.

- Печеночные клетки

Печеночные клетки человека были получены от ScienCell, США (ref. 50200), как и культуральная среда (ref. 5201), которая содержит 10% (об./об.) FCS. Время удвоения этих клеток 24 часа.

- Почечные клетки

Эти почечные клетки человека были получены из ScienCell, USA (ref. 4120), как и культуральная среда (ref. 4101), которая содержит 10% (об./об.) FCS. Время удвоения 96 час.

- Сердечные клетки

Эти человеческие клетки получали от ScienCell, США (ref. 6300), как и культуральную среду, которая содержит 10% (об./об.) FCS. Время удвоения составляет 72 часа.

- Клетки скелетных мышц

Человеческие клетки получали от ScienCell, США (ref. 3500), как и культуральную среду (ref. 3501), которая содержит 10% (об./об.) FCS. Время удвоения составляет 72 часа.

Использовали также следующие культуры раковых клеток человека:

- Клетки рака печени

Их получали от АТСС (ref. АТСС-НВ-8065). Культуральная среда состоит из MEM (Gibco, USA; ref. 51200) и 10% (об./об.) FCS. Время удвоения составляет 60 час.

- Клетки рака простаты

Их получали от АТСС (ref. АТСС-НTВ-81). Культуральная среда такая же, как культуральная среда, применяемая для линий клеток рака печени. Время удвоения составляет 60 час.

- Клетки рака молочной железы

Их получали от АТСС (ref. АТСС-НTВ-19). Культуральная среда такая же, как культуральная среда, применяемая для линий клеток рака печени. Время удвоения составляет 20 час.

- Клетки карциномы толстой кишки (линия HT29/219)

Их получали из ЕСАСС collection (ref. ЕСАСС-85061109). Условия культивирования основаны на рекомендациях, содержащихся в информационном листке Sigma-Aldrich.

- Клетки нейробластомы (линия SH-SY5Y)

Их получали из коллекции АTСС (ref. ATСС-CRL-2266). Условия культивирования основаны на рекомендациях, содержащихся в информационном листке ATCC.

- Клетки хронического миеломоноцитарного лейкоза (СММL)

Клетки, очищенные от образцов крови пациентов, страдающих хроническим миеломоноцитарным лейкозом (CММL), были получены Clinical Haematology Centre и Biotherapy Centre Saint Eloi Hospital (CHU de Montpellier). Культивирование проводили по методике культивирования на питающем подслое. Клетки высевали на питающий подслой, на который не воздействуют обработки, предназначенные для представляющих интерес клеток и который значительно не изменяет физиологию представляющих интерес клеток. Клетки CММL культивировали на клеточных линиях, полученных из спинного мозга эмбриона человека (17).

Для всех этих культур культивирование начинали и поддерживали в соответствии с рекомендациями поставщиков.

b) Обработка культур

Активные ингредиенты либо растворяют в абсолютном этаноле (AnalaR, NORMAPUR, VWR, France) либо применяют в форме липосомального раствора, такого как 10 мкл исходных растворов, разведенных в 990 мкл, и затем добавляли в лунки для культур (200 мкл культуральной среды), в результате чего получали концентрации 30,0, 15,0, 7,5 и 3,3 мкМ (окончательный объем культуральной среды на лунку BI-GBM: 300 мкл).

Когда активные ингредиенты находятся в этанольном растворе, культуральная среда содержит 3,3% этанола (об./об.).

2) Получение липосом

а) Базовая методология описана Werthle et al. (10).

Вкратце, соединения, которые должны быть испытаны, а именно соединения согласно изобретению (активные ингредиенты) или 7β-OHCH-C3-эфир (производное 7бета-гидроксистерина, этерифицированного в положении 3 олеатной группой, синтез которого описан Rakotoarivelo et al. (18) и который применяли в качестве контроля), соевый фосфатидилхолин (Sigma), а также холестерил-3-сульфат (Sigma), берут из их исходных растворов, полученных из дихлорэтана в случае активных ингредиентов и 7β-OHCH-C3-эфира, из смеси хлороформ:метанол (9:1, об./об.) в случае фосфатидилхолина и из хлороформа в случае холестерил-3-сульфата. Молярные отношения составляют 1 М/0,1 М/0,25 М для фосфатидилхолина, холестерил-3-сульфата и 7β-OHCH-С3-эфира и активных ингредиентов, соответственно.

После выпаривания физиологический раствор PBS без Са²⁺ и Mg²⁺, pH 7,2 (BioRad), добавляют к сухому соединению. Объем буфера и массу продуктов корректировали так, чтобы 20 или 10 мкл липосом, добавленных к 90 мкл культуральной среды, давали желаемые конечные концентрации. Липосомы образовывали методом экструзии посредством Liposofast (Sodexim, SA Muizon, France). Раствор пропускают через поликарбонатные фильтрационные мембраны (100 нм) 41 раз. Липосомы стерилизовали фильтрацией на 22 мкм мембранах Millipore.

Для испытаний активности молекул на других типах клеток человека "in vitro" получение липосом оптимизировали двумя различными способами, как описано выше, а именно относительно однородного распределения по размерам, с одной стороны, и относительно концентрации активных молекул, с другой стороны.

b) Получение липосом с идентичным распределением по размерам и с составом, который является стабильным в течение долгого времени («улучшенные липосомы»).

После выпаривания растворителей, липидную пленку снова растворяют в смеси дихлорэтан:этанол (3,3:1,5; об.:об.) и раствор снова упаривают в потоке азота. Один мл PBS добавляют при энергичном перемешивании, липидный остаток соскабливали так, что он снова растворяется, с последующим интенсивным перемешиванием раствора в течение 5 мин, а затем подвергают действию ультразвука 10 импульсами в 1 мин при температуре, не превышающей 20°C (Elma, S 60H, Elmasonic). Полученные пузырьки экструдировали и стерилизовали, как описано выше, за исключением того, что раствор только дважды пропускали через фильтрационные мембраны.

Эти липосомы имеют распределение по размерам от 40 до 80 нм и содержат 0,086 мг/мл соединения 2.b.

с) Получение липосом с более высокой концентрацией соединения 2.b ("концентрированных липосом")

Для получения липидной пленки концентрацию фосфатидилхолина удваивают; концентрация других соединений остается идентичной концентрации, описанной выше для улучшенных липосом.

Процедура получения этих липосом идентичена процедуре, описанной для улучшенных липосом, за исключением того, что (1) обработку ультразвуком проводят 20 импульсами в 1 мин и (2) растворители выпаривают при пониженном давлении (приблизительно 3 кПа; 30 мбар) с использованием роторного испарителя (Buchi, models V 850 и R 215).

Эти липосомы имеют распределение по размерам от 40 до 80 нм и содержат 0,133 мг/мл соединения 2.b.

Получение характеристик молекул, образующих липосомы, исследование стабильности и состава липосом проводят после экстракции липидных соединений согласно методу Folch et al. (19), за исключением того, что перед экстракцией, 500 мкл раствора липосом инкубируют с 10 мкл 2% (об.:об.) тритона Х-100 (Sigma) при 40°C в течение 18 час.

Анализ жирных кислот, образующих фосфатидилхолин, после метилирования согласно общепринятым методам, проводят газовой хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ/МС).

Получение характеристики холиновой группы фосфатидилхолина выполняют согласно способу Reineckate (20).

Соединение 2.b количественно определяют ВЭЖХ, как описано выше (получение соединений), или тонкослойной хроматографией на диоксиде кремния, как описано ниже в пункте 5).

Распределение липосом по размерам измеряют на флуоресцентных липосомах и морфометрический анализ проводят с помощью программы Sert после получения изображений эпифлуоресцентным микроскопом (Axivert, Zeiss).

Флуоресцентные липосомы получают с таким же количеством фосфатидилхолина, как и количество, описанное для улучшенных или концентрированных липосом, за исключением того, что применяемый фосфатидилхолин содержит 5,0% флуоресцентного фосфатидилхолина (NBD-PC-олеил; Avanti; возбуждение/испускание=460 нм/534 нм) в случае улучшенных липосом и 2,5% в случае концентрированных липосом.

Липосомы осаждают на предметные стекла для культуры, покрытые сначала поли-D-лизином (Sigma, 1% в воде, масс.:об.), и затем ламинином (Sigma, 0,6% в воде). Липосомы фиксируют глутаральдегидом (Merck) (липосомы:глутаральдегид:PBS; 15:37,5:97,5, об.:об.:об.) перед получением изображений.

3) Измерение активности и токсичности

Одинаковые методы применяют для обоих случаев. Для измерения активности используют потенциал испытуемых соединений против GMB, и токсичность измеряют на нормальных клетках человека "in vitro".

Применяют следующие методы измерения:

а) Подсчет клеток

Применяют метод подсчета клеток на фотографиях.

Например, в случае культур в 96-луночных планшетах и с учетом функции увеличения применяемого микроскопа (объективы × 10 или × 20, окуляры × 10), взятые фотографии представляют собой область обзора с диаметром, равным 1/5 диаметра лунки. Поэтому общее число клеток в лунке равно пятикратному числу клеток на фотографии. Эту методику сравнивали со стандартной методикой (трипсинизация клеточного слоя, центрифугирование клеток, суспендирование клеток в физиологическом солевом растворе и подсчет клеток THOMA) в случае клеток линии С6. Полученные результаты идентичны для обеих методик.

b) Анализ белка

Культуральную среду извлекают из каждой лунки и 50 мкл буфера Laemmli (0,1 мл Tris, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10% SDS, 8 мл сверхчистой воды q.s.f) добавляляют в каждую лунку.

В контрольные лунки добавляют 10 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (кристаллизованного BSA, Sigma); диапазон количества от 0 до 20 мкг на лунку. Затем лунки дополняют 40 мкл буфера Laemmli. И, наконец, добавляют 200 мкл раствора реагента BCA (Pierce, USA; BCA Protein Assay Kit; ThemoScientific, France).

Культуральные планшеты инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Оптическую плотность для каждой лунки считывали и количественно определяли планшет-ридером (BioRad, USA, iMark Microplate reader 12222) при 570 нм.

с) Жизнеспособность клеток (тест МТТ)

Этот тест делает возможным обнаружение клеточного дыхания, особенно окислительного фосфорилирования в митохондриях. Исходный раствор соли тетразолия МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия, Sigma-Aldrich, USA, ref. M5655) получают с 10 мг МТТ/мл буфера PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, SIGMA, ref. D 1408). Этот раствор добавляют непосредственно к культуральной среде в каждую лунку; конечная концентрация МТТ составляет 25 мкг/мл. Планшет затем инкубируют при 37°С в течение по меньшей мере 1 часа.

После появления синих гранул формазана, продуцированных в основном митохондриальным переносом электронов, были взяты фотографии для подсчета клеток с гранулами формазана высокой плотности; этот метод применяют в случае линий U87-MG. Затем для этой линии и других культур среды удаляют и добавляют 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО, SDS CARLO ERBA, Italy) для растворения осадков формазана.

Оптическую плотность считывают и количественно определяют при помощи планшет-ридера (BioRad, iMark Microplate reader) при 490 нм.

Жизнеспособность иногда определяют также методом исключения трипанового синего.

4) Мечение клеток иммунной меткой и получение изображений

Первичные антитела против CD133 (poly, Abnova), против GFAP (poly, Sigma), против NFL (mono, Santa Cruz) и против фибробластов (RETR7, Santa Cruz) разводят 1/100 в случае первых трех антител и 1/50 в последнем случае.

Для детектирования IDH-R132H (маркер глиом низкой степени выраженности злокачественности (21)) и CD31 (маркер эндотелиальных клеток (22)) используемые первичные антитела получали из Clinisciences (мыши, разведение 1/20) и из Spring Bioscience (кролика, разведение 1/250), соответственно.

Вторичные антитела, соответствующие распознаванию первичных антител, являются антикроличьими антителами, связанными с пероксидазой (козьей, Sigma), антимышиными антителами, связанными с Dylight 488 (овечьей, Sigma), антимышиными антителами, связанными с Dylight 488 (овечьей, Sigma) и антикрысиными антителами, связанными с FITC (кроличьим, Sigma). Разведения составляют 1/4000, 1/1000, 1/4000 и 1/400, соответственно.

IDH1-R132H и CD31 детектируют при помощи связанных с пероксидазой вторичных антител. Их получают от Fisher Scientific (антимышиные антитела, разведение 1/1000) и от Sigma (антикроличьи антитела, разведение 1/5000), соответственно.

Клеткам придают проницаемость в течение 5 мин 0,1% тритоном X-100 (Sigma) в PBS (Fisher Scientific). Неспецифические сайты блокируют 2% BSA (Sigma) в PBS. Инкубацию проводят в течение 1 час при комнатной температуре, 48 час при 4°C, 24 час при 4°C и 1 час при температуре окружающей среды для антител против CD133, против GFAP, против NFL и против фибробластов, соответственно. Инкубацию с вторичными антителами проводят в течение 1 час при температуре окружающей среды. CD133-положительные клетки детектируют системой DAB/H₂O₂ (Sigma) и наблюдают при помощи оптического микроскопа.

Колориметрическое детектирование маркеров IDH1-R132H и CD31 проводят субстратом NOVARED Vector (Eurobio). Окрашенные клетки детектируют также оптической микроскопией. Флуоресценцию детектируют и изображения получают с помощью эпифлуоресцентного микроскопа (Axiovert, Zeiss, Germany).

5) Экстракция липидов и идентификация оксистеринов

Клетки промывают 0,9% NaCl, собирают механически, суспендируют в буфере трис-HCl (10 мМ, рН 7,4) и гомогенизируют с помощью Potter (1000 об./мин и 13 повторов). Гомогенизацию проводят на льду. Экстракцию проводят при 4°С после добавления 19 объемов смеси хлороформ:метанол (2:1, об./об.) для 1 объема клеточной суспензии согласно Folch et al. (19). Органическую фазу и водную фазу разделяют добавлением 0,2 объема 0,74% KCl (масс./об.).

После выпаривания органической фазы в ротационном испарителе (Buchi, R-215, Switzerland), липидный остаток переносят в хлороформ. Слои для ТСХ предварительно промывают смесью хлороформ:метанол, 1:1, об./об.) и активируют при 100°C в течение 1 час. Липиды элюируют следующей системой: петролейный эфир (точка кипения 60-70°С):простой эфир:уксусная кислота (80:20:1,3, об./об./об.). Наносимыми стандартами являются холестерин, 7-кетохолестерин, 7бета-ОНСН, 7бета-ОНСН-С3-эфир и соединение 2.b. Липиды и стандарты детектируют реагентом Maccala. Величинами Rf являются 0,21, 0,09, 0,08, 0,27 и 0,23 для холестерина, 7-кетохолестерина, 7бета-ОНСН, 7бета-ОНСН-С3-эфира и соединения 2.b, соответственно. Калибровку в пределах от 0,5 до 2 мкг для каждого стандарта проводят по отдельности. Интенсивность представляющих интерес пятен вычисляют относительно стандартов после сканирования проявленных тонких слоев диоксида кремния.

Применяемые растворители имеют чистоту оценки AnalAR или ВЭЖХ.

6) Анализ активности и ингибирования LDH (лактатдегидрогеназы; EC 1.1.1.27)

Измерения активности LDH и ее ингибирование стандартным ингибитором, оксаматом (23), подтверждали спектрометрическим методом (24) с использованием очищенного LDH Lactobacillus leichmannii (LL) (Sigma) в качестве стандарта.

Далее, активности LDH и их ингибирование детектировали методом "анализа в геле" (25). Источником анализируемой активности были LDH LL и LDH, частично очищенные от линий GBM человека U87-MG (LDH GBM). Детектирование "анализом в геле" проводили после изоэлектрической фокусировки (IEF) на гелях электрофореза образцов LDH LL и LDH GBM.

а) Частичная очистка LDH GBM

Клетки, собранные в фосфатном буфере (50 мM, Ph 7,2.Pi), подвергают нескольким циклам замораживание (-20°С)/оттаивание и клеточный материал гомогенизируют. После центрифугирования при 10,000 g в течение 45 мин при 4°С супернатант собирают и аликвоты, содержащие 10% глицерина (об.:об.), замораживают при -80°С. В нужное время аликвоты после оттаивания хроматографируют на фильтрационной колонке (Biogel P-60, BioRad), полученной в Pi. Объем геля составляет 9 мл и внутренний диаметр колонки составляет 0,4 см. Элюирование проводят при атмосферном давлении. Первую фракцию 1,4 мл удаляют и собирают следующие 2 мл с активностью LDH. Белковые компоненты этой фракции (LDH GBM) характеризовали методом SDS-PAGE с последующим окрашиванием нитратом серебра или вестерн-блоттингом. Находят молекулярные массы, характерные для LDH (31 кДа для субъединицы, или 62 кДа для ее ассоциации в димере).

б) IEF

Мини-гели 7,5 (Т%) и 2,6 (С%) выливают в Pi с амфолинами (BioRad), что делает возможным получение градиента рН в диапазоне от 7 до 5 после предварительной фокусировки в холодной камере. Применяемые контейнеры являются контейнерами мини-продукта начальной стадии расщепления белковой молекулы типа 3 (BioRad). Буфер анода имеет рН 2,0 и буфер катода имеет рН 10,0. Образцы LDH LL и LDH GBM наносят без денатурации и фокусировку проводят в течение 210 мин, повышая напряжение от 100 В до 300 В в холодной камере.

в) Активность LDH

Активность LDH детектируют системой лактат/NAD/МТТ/метосульфат феназина (образование осадка типа формазана в геле IEF); эта система описывается в ссылке (25).

Добавление оксамата (18 мм) или соединения 2.b в этанольной форме (36 мМ) позволяет измерить степень ингибирования активности LDH LL и LDH GBM.

В/ Активность против GBM “in vitro”

В.1. Животная модель

Культуры клеток С6 (крысы) применяли в рабочих условиях, указанных выше (раздел II, А).

Пример 7: Активность против GBM “in vitro” на культурах клеток С6 (крысы)

Полученные результаты суммированы ниже в таблице 1, а также на фигуре 3.

Таблица 1
Испытанные соединения (3% этанола)	1.а (Пр. 3) 15 мкМ	2.а (Пр. 5) 15 мкМ	1.а, затем 2.а 15 мкМ+7,5 мкМ
Живые остаточные клетки	3%	100%	0%

На фигуре 3 (увеличение 20×10) показан внешний вид культур клеток С6 в указанных выше рабочих условиях (раздел II, А) в присутствии соединения 1а (пр. 3) или после последовательной обработки соединением 1.а и затем соединением 2.а (пр. 5) на 19 день и на 35 день.

Результаты (таблица 1) показывают, что соединение 1.а в этанольной форме является цитотоксическим после 19 дней обработки. При 15 мкМ соединения 1.а и после 14 дней обработки число клеток, уровень белков и результат анализа МТТ снижается на 30% и достигает 97% снижения по меньшей мере на 19 день. На 19 день обработки наблюдали также зависимость от дозы для 7,5 и 3,3 мкМ соединения 1.а и при 15 мкМ наблюдали увеличение отношения МТТ/клетка на 20% по сравнению с контрольными культурами.

Для удаления остаточных клеток применяли последовательную обработку. Клетки сначала обрабатывают 15 мкМ соединения 1.а и на 19-й день обработки добавляют соединение 2.а при концентрации 7,5 мкМ.

Не наблюдается присутствия жизнеспособных клеток; только "трупы" клеток прилипают к твердому субстрату культуры клеток (на дне лунки), как показано на фигуре 3.

В заключение, последовательная обработка соединением 1.а и затем соединением 2.а показывает полную эффективность против этого типа клеток. Наблюдения указывают на уменьшение общего дыхания клеток перед их деструкцией.

В.2. Человеческая модель: активности против GBM “in vitro” на культурах клеток человека (линия U-87 GM)

В.2.1. Описание модели “in vitro” и предоставление результатов

а) Характеристика различных типов клеток

Клетки U-87GM культивировали в рабочих условиях, описанных выше (раздел II, А).

Культуры состоят из двух клеточных компонентов: слоя клеток, состоящего из клеток, ведущих себя как нормальные (нераковые) клетки, и клеточных агрегатов, состоящих из клеток типа GBM.

На фигуре 4 показано оптическое изображение (10×10), которое является характеристикой культуры. Можно увидеть слой клеток (CL), на котором фиксируются клеточные агрегаты (СА) полусферической формы. На фигуре 5 (20×10) показано мечением иммунной меткой, что CD133+ клетки (стволовые клетки), описанные в GBM человека, расположены в клеточных агрегатах, а не в CL. Иммунофлуоресцентное мечение показывает присутствие GFAP, маркера нормальных астроцитов (фигуры 6 и 7; 20×10) (26) в CL и СА (фигуры 6 и 7; 20×10) и нейрофиламентов в CL и CA. Тем не менее, специфическое мечение фибробластов, клеток с высоким потенциалом размножения, обнаруживают только в случае CA. Очень мало IDH1-R132H-положительных клеток наблюдают в CL и CA. И наоборот, CD31-положительные клетки присутствуют в CL и CA.

Наблюдения оптической микроскопией явно показывают, что клетки СA делятся очень быстро (время удвоения самое большее 16 час), тогда как клетки, составляющие CL, имеют время удвоения 96 час.

Эти наблюдения подтверждают метод подсчета клеток (меченые клетки или клетки без гранул формазана), который был разработан; фактически, подсчет после трипсинизации не может различать клетки CL и CA. Изображения показывают также, что только клетки CA имеют характер GBM (короткое время удвоения, присутствие стволовых клеток и фибробластов). Полученные результаты, таким образом, являются результатом воздействия соединений, тестированных на CA.

b) Представление результатов

Результаты предоставлены в соответствии со следующими параметрами:

(i) Эффективность соединений согласно изобретению

- Количественное определение остаточных клеток, в частности, стволовых клеток.

- Эффективность соединений согласно изобретению на протяжении времени.

Культуральную среду, содержащую соединения согласно изобретению, заменяют свежей средой, и исследуют размножение клеток "de novo": отсутствие размножения клеток "de novo" означает полное разрушение клеток GBM, в том числе стволовых клеток.

(ii) Воздействие соединений на общее дыхание клеток GBM.

(iii) Сравнение результатов, полученных с соединениями согласно изобретению, с результатами, полученными с 7β-OHCH-C3-эфиром (контроль).

В.2.2. Результаты

Культуры клеток U87-MG (человека) применяли в рабочих условиях, указанных выше (раздел II, А).

7бета-OHCH-С3-эфир применяли в качестве контроля.

Пример 8: изучение активности против GBM "in vitro" соединения 2.а (пр. 5) в липосомальной форме.

Полученные результаты представлены ниже в таблице 2.

Таблица 2
	Соединение 2.а (15 мкМ) в липосомальной форме		7β-OHCH-C3-эфир (80 мкМ) в липосомальной форме
Дни обработки	Белки	МТТ/клетка	Белки	МТТ/клетка
6	70	100	70	100
8	25	140	20	100
13	15	120	15	100
15	0	0	15	100

Эти результаты представляют собой среднюю величину трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях. Результаты выражены как процент относительно контролей.

Наблюдения показывают, что 15 мкМ соединения 2.а в липосомальной форме уменьшает присутствие клеток GBM (CA) до нуля после 15 дней обработки.

Остаются только клетки с медленным делением (CL). Действие является дозазависимым. 7β-OHCH-C3-эфир в этанольной форме не действует на GMB (CA) (см. также пример 9), а действует только в липосомальной форме, а именно, при 80 мкМ. Его эффективность не становится лучше или даже уменьшается при увеличении дозы 7β-OHCH-С3-эфира в липосомальной форме.

Тем не менее, если на 13-й день обработки культуральную среду, содержащую 7β-OHCH-C3-эфир, удаляют и заменяют свежей культуральной средой, не содержащей это лекарственное средство, наблюдают размножение клеток, и, параллельно, увеличение данных теста на МТТ через два дня; это увеличение составляет 40%. Это не относится к случаю соединения 2.а: в отсутствие этого соединения не наблюдают размножения клеток.

Таблица 2 показывает также значительное увеличение в отношении МТТ/клетка (140% по сравнению с контролями) в то время, когда большинство клеток исчезает (8 дней обработки). Это не относится к случаю липосомального 7β-OHCH-С3-эфира: даже при 80 мкМ отношение МТТ/клетка не изменяется.

Это наблюдение показывает различные действия двух соединений: общее клеточное дыхание повышается перед массовой гибелью клеток. Это не относится к случаю 7β-OHCH-С3-эфира.

Пример 9: Исследование активности против GBM “in vitro” соединения 2.b (пр. 6) в этанольной форме

Полученные результаты представлены ниже в таблице 3.

Таблица 3
	Соединение 2.b (30 мкМ) в этанольной форме		7β-OHCH-C3-эфир (30 мкМ) в этанольной форме
Дни обработки	Белки	МТТ/клетка	Белки	МТТ/клетка
4	100	100	100	100
6	100	100	100	100
9	90	160	100	100
15	50	130	100	100
22	0	0	100	100

Эти результаты представляют собой среднюю величину трех независимых экспериментов, каждый из которых проведен в трех повторностях. Результаты выражены как процент относительно контролей. 7β-OHCH-С3-эфир в количестве более 30 мкМ не является больше растворимым в этаноле.

Наблюдения показывают, что соединение 2.b полностью эффективно при 30 мкМ в этанольной форме: клети GBM не остаются даже после удаления активного ингредиента. Так же как для соединения 2.а в липосомальной форме, клеточное дыхание увеличивается перед гибелью клеток. Это не относится к случаю этанольного 7β-OHCH-С3-эфира, противоопухолевую активность не наблюдают.

Более того, замена культуральной среды свежей средой, не содержащей соединение 2.b, на 22 день не приводит ни к какому клеточному размножению.

Пример 10: мечение иммуной меткой CD133+ стволовых клеток системой пероксидазы A/B

Мечение иммунной меткой осуществляют, как описано выше (раздел II, А).

Полученные результаты представлены ниже в таблице 4.

Таблица 4
	CD133+ клетки
Дни обработки	Необработанные клетки (контроли)	Соединение 2.b (30 мкМ) в этанольной форме	7β-OHCH-С3-эфир (80 мкМ) в липосомальной форме
4	100	100	100
22	100	0	50

Эти результаты представляют собой среднюю величину трех независимых экспериментов, каждый из которых проводят в трех повторностях. Результаты выражают как процент CD133-положительных клеток относительно контролей. Эти эксперименты являются независимыми от экспериментов, описанных в примерах 8 и 9.

Как и в наблюдениях, описанных в таблицах 2 и 3, 7β-OHCH-С3-эфир в липосомальной форме и соединение 2.b в этанольной форме снижают уровень белков на 85% и на 100% по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Результаты показывают, что стволовые клетки полностью разрушаются соединением 2.b. Это не относится к случаю 7β-OHCH-С3-эфира, даже при введении в липосомальной форме.

Фигура 9 (мечение CD133⁺ клеток иммунной меткой) ясно показывает их исчезновение после 22 дней обработки. Это не относится к случаюя 7β-OHCH-С3-эфира в липосомальной форме (фигура 10, мечение CD133⁺ клеток иммунной меткой); в этом случае, 50% CD133-положительных клеток все еще присутствуют среди остаточных клеток. Замена культуральной среды свежей средой, не содержащей соединение 2.b, на 22 день не приводит к появлению CD133⁺ стволовых клеток.

Пример 11: Исследование “судьбы” соединения 2.b (пр. 6) в этанольной форме “in vitro” в GBM человека

Экстракция и анализ липидов из GBM, обработанных 30 мкМ соединения 2.b в этанольной форме, не показывают присутствия 7бета-OHCH-С3-эфира после 24 час или 10 дней обработки, причем последнее время является временем, когда инициируется гибель клеток. Однако, 0,12% и 0,18% соединения 2.b, превращенного в 7бета-OHCH, наблюдают после обработки в течение 1 дня и 10 дней, соответственно. Контрольные эксперименты показывают, что эти очень низкие уровни 7бета-OHCH не вызывают никакую гибель GBM.

Пример 12: Исследование токсичности

Токсичность проверяли "in vitro" на различных нормальных типах клеток человека.

а) На астроцитах

Применяемыми клетками являются клетки человека (ScienCell, USA, ref. 1800), указанные выше (раздел II, А).

Астроцитный тип подтверждают присутствием GFAP, стандартного маркера нормальных астроцитов (фигура 11: увеличение × 200).

Соединения 2.а (липосомальная форма) и 2.b (этанольная форма) не токсичны для первичных культур нормальных (нераковых) астроцитов человека при 30 мкМ после 30 дней обработки.

b) На других клетках

Применяемые клетки являются клетками печени (ScienCell, USA, ref. 50200), клетками почек (ScienCell, USA, ref. 4120), клетками скелетных мышц (ScienCell, USA, ref. 3500) и клетками сердца (ScienCell, USA, ref. 6300) человека, указанными выше (раздел II, А).

Соединения 2.а (липосомальная форма) и 2.b (этанольная форма) не токсичны при 30 мкМ после по меньшей мере 30 дней обработки для первичных культур клеток печени, клеток почек, клеток скелетных мышц и клеток сердца человека.

Пример 13: Исследование активности соединения 2.b (пр. 6) “in vitro” для других видов рака

Применяемые раковые клетки являются раковыми клетками печени (ref. ATCC-HB-8060), предстательной железы (ref. ATCC-HTB-81), молочной железы (ref. ATCC-HTB-19) и раковыми клетками толстой кишки (ЕСАСС-HT29/219) человека, указанными выше.

Соединение 2.b при 30 мкМ и в этанольной форме не влияет на клеточное деление и дыхание раковых клеток печени, простаты или молочной железы человека.

Соединение 2.b при 15 мкМ в улучшенной липосомальной форме не токсично для раковых клеток толстой кишки.

Пример 14: Исследование активности соединения 2.b в улучшенной липосомальной форме “in vitro” при хроническом миеломоноцитарном лейкозе (CMML)

Лейкоциты крови выделяют из образца крови, собранного у пациента, страдающего CMML. Клетки обрабатывают один раз 10 мкМ соединения 2.b в улучшенной липосомальной форме спустя 24 часа после культивирования посева на питающем подслое (17).

Результаты показаны на фотографиях фигуры 12 (увеличение 20×10).

Контролями являются клетки, обработанные пустыми липосомами: слева вверху фотография, обозначенная буквой А, получена после 48 час обработки и слева внизу фотография с буквой В получена после 72 час обработки.

Для клеток, обработанных соединением 2.b, фотография вверху справа, отмеченная буквой C, получена после 48 час обработки и фотография справа внизу с буквой D получена после 72 час обработки.

Результаты показывают заметное действие соединения 2.b после 72 час обработки. Размножения клеток значительно замедляется по сравнению с контролем, и наблюдается много клеток с некротическим внешним видом.

Пример 15: Исследование активности соединений 1.b и 2.b “in vitro” для нейробластом человека (АТСС-CRL-2266)

Нейробластомы обрабатывали пустыми липосомами (контроли) или липосомами, содержащими соединение 1.b или 2.b спустя 24 час после начала культивирования. Клетки обрабатывали один раз 22 мкМ соединения 1.b или 22 мкМ соединения 2.b. Липосомальную форму концентрировали.

Результаты показаны на фотографиях фигуры 13 (увеличение 10×10).

Для контрольных клеток фотографию вверху слева, обозначенную буквой А, получали после 7 дней обработки; фотографию нижнюю слева, обозначенную буквой B, получали после 28 дней обработки.

Для клеток, обработанных концентрированным липосомальным соединением 1.b, фотографию, отмеченную буквой С (в середине, вверху) получали после 7 дней обработки и фотографию, отмеченную буквой В (в середине, внизу), получали после 28 дней обработки. Для клеток, обработанных концентрированным липосомальным соединением 2.b, фотографию cверху cправа, обозначенную буквой E, получали после 7 дней обработки.

Результаты показывают замечательную активность соединения 2.b относительно соединения 1.b. После 28 дней обработки соединение 1.b токсично почти для всех клеток по сравнению с контрольными клетками. Для соединения 2.b радикальное токсичное действие наблюдают уже после 7 дней обработки; жизнеспособные клетки не наблюдают.

Пример 16: Исследование ингибирования активности LDH, экстрагированной из GBH человека, “in vitro” (линии U87-MG) соединением 2.b

Целью этих экспериментов была демонстрация потенциала для ингибирования ферментативной активности LDH двух типов соединений. Исследование проводили с соединением 2.b и его ингибирующий потенциал определяли на LDH из Lactobacillus leichmannii (LL) и частично очищенной LDH из линий GBM (U87-MG) человека, как описано выше в разделе "A/ ПРОТОКОЛЫ 6)".

Активность LDH определяли методом "анализ в геле" на гелях электрофореза IEF, которые были описаны в разделе "A/ ПРОТОКОЛЫ 6)" (25); точность этого метода составляет 0,2 единицы рН. Активность LDH определяют по темно-синему осадку типа формазана, места, где локализована активность LDH.

На фигуре 14 (А) показана активность LDH для LDH LL при pHi 6,2 и для LDH GBM при pHi 6,4.

Результаты показывают, что добавление оксамата в водной форме (18 мМ) или соединения 2.b в этанольной форме (36 мМ) ингибирует ферментативную активность LDH LL почти полностью и ферментативную активность LDH GBM (B) частично.

Потенциал для ингибирования ферментативной активности LDH GBM соединением 2.b в сочетании с увеличением окрашивания МТТ перед гибелью клеток GBM (таблицы 2 и 3; фигуры 8 и 9) подтверждает гипотезу механизма действия соединений формулы (I): соединения по изобретению могут ингибировать активность LDH и, следовательно, могут вызвать всплекс окислительного фосфорилирования в митохондриях.

Claims

1. Соединение формулы (I), имеющее основную структуру 7бета-гидроксихолестерола

в которой

- А представляет собой

группу -(R₁)_n, в которой R₁ представляет собой аминокислотный остаток глицина или аланина, присоединенный его С-концом, и n=1 или 2, причем R₁ являются одинаковыми или разными и N-конец указанной аминокислоты замещен группой -C(O)-R₂, в которой R₂ представляет собой бензилоксигруппу, или

группу -(R₁)_n, в которой R₁ представляет собой остаток аминокислоты глицина или аланина, n=1 или 2 и N-конец указанной аминокислоты замещен бензилоксикарбонилом; или

группу -C(O)-R₆, в которой R₆ представляет собой пятичленный гетероцикл, включающий 2 гетероатома кислорода, незамещенный или замещенный по меньшей мере одним неразветвленным или разветвленным C₁-С₆алкилом;

- В представляет собой группу -C(O)-R₇, в которой R₇ представляет собой C₁-С₆алкил, неразветвленный или разветвленный; или R₇ представляет собой OR₈, где R₈ означает C₁-С₆алкил, неразветвленный или разветвленный.

2. Соединение формулы (I) по п. 1, в которой выполняется следующее условие:

- А представляет собой аланил, связанный с глицинилом, замещенным на N-конце бензилоксикарбонилом.

3. Соединение формулы (I) по п. 1, в которой А представляет собой группу -C(O)-R₆, в которой R₆ представляет собой 2,2-диметил-1,3-диоксолановую группу.

4. Соединение формулы (I) по одному из пп. 1-3, в которой В представляет собой ацильную группу, в частности ацетильную или трет-бутоксикарбонильную группу.

5. Соединение формулы (I), отличающееся тем, что его выбирают из следующих соединений:

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропаноата (соединение 1.а);

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2-(2-(((бензилокси)карбонил)амино)ацетамидо)пропаноата (соединение 1.b);

- 7-((трет-бутоксикарбонил)окси)-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилата (соединение 2.а);

- 7-ацетокси-10,13-диметил-17-(6-метилгептан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1Н-циклопента[а]фенантрен-3-ил-2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-карбоксилата (соединение 2.b).

6. Способ получения соединения формулы (I) по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что он содержит следующие стадии:

- защиту гидроксильной функциональной группы в положении 3 холестерина защитной группой,

- введение кетоновой функциональной группы в положение 7,

- восстановление кетоновой функциональной группы в гидроксильную функциональную группу,

- введение защитной группы в гидроксильную функциональную группу в положении 7, соответствующем группе В,

- удаление защитной группы функциональной гидроксильной группы в положении 3, и

- последующее после удаления защитной группы замещение гидроксильной функциональной группы в положении 3 желаемой группой А.

7. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью в отношении трансформированных астроцитных клеток, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного соединения формулы (I) по любому из пп. 1-5 и фармацевтически приемлемый наполнитель.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что она состоит из липосом, содержащих по меньшей мере одно соединение формулы (I).

9. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что она состоит из спиртового раствора, содержащего по меньшей мере одно соединение формулы (I).

10. Соединение формулы (I) по любому из пп. 1-5, предназначенное для лечения заболеваний, связанных с трансформированными астроцитами.

11. Соединение формулы (I) по любому из пп. 1-5, предназначенное для применения при лечении мультиформной глиобластомы.

12. Соединение формулы (I) по любому из пп. 1-5 для применения при лечении заболеваний, связанных с трансформированными астроцитами, заключающемся в последовательном лечении, содержащем по меньшей мере одну стадию введения первого соединения формулы (I) и по меньшей мере одну стадию введения второго соединения формулы (I), отличного от первого.

13. Соединение формулы (I) по любому из пп. 1-5, предназначенное для лечения злокачественных заболеваний крови.

14. Соединение формулы (I) по п. 13, предназначенное для лечения злокачественных заболеваний крови миелоидного типа.

15. Соединение формулы (I) по любому из пп. 1-5, предназначенное для лечения нейробластом.