RU2625012C2 - Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna - Google Patents
Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna Download PDFInfo
- Publication number
- RU2625012C2 RU2625012C2 RU2015154505A RU2015154505A RU2625012C2 RU 2625012 C2 RU2625012 C2 RU 2625012C2 RU 2015154505 A RU2015154505 A RU 2015154505A RU 2015154505 A RU2015154505 A RU 2015154505A RU 2625012 C2 RU2625012 C2 RU 2625012C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fragments
- dna
- adapters
- selection
- complementary
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 95
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims abstract description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 abstract 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к молекулярной биологии, и может быть использовано при проведении генетических исследований, требующих приготовления геномных библиотек ограниченных выборок локусов из деградированной ДНК, независимо от биологической принадлежности изучаемых геномов и независимо от изучаемых классов нуклеотидных последовательностей (например, регуляторных участков генов, повторяющихся элементов генома и т.д.), в том числе ретроспективных генетических исследований в области онкологии.The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to molecular biology, and can be used in genetic studies that require the preparation of genomic libraries of limited samples of loci from degraded DNA, regardless of the biological origin of the studied genomes and regardless of the studied classes of nucleotide sequences (e.g. regulatory areas of genes, repetitive elements of the genome, etc.), including retrospective genetic studies in the field of oncol ohii.
Из существующего уровня техники известен способ, в котором перечислены реактивы и методы, позволяющие приготовить геномную библиотеку с ограниченной выборкой локусов из бисульфитно-конвертированной геномной ДНК путем гибридизации образца с локус-специфическими зондами (WO 2015014759 А1, 05.02.2015).A method is known from the prior art that lists reagents and methods for preparing a genomic library with a limited selection of loci from bisulfite-converted genomic DNA by hybridizing a sample with locus-specific probes (WO 2015014759 A1, 02/05/2015).
Недостатками этого способа являются: длительность протокола; получение большого числа фрагментов, не относящихся к целевым локусам генома, вследствие неспецифической гибридизации фрагментов ДНК со сниженной, вследствие обработки бисульфитом натрия, информативностью нуклеотидных последовательностей.The disadvantages of this method are: the duration of the protocol; obtaining a large number of fragments that are not related to the target loci of the genome due to nonspecific hybridization of DNA fragments with reduced, due to the processing of sodium bisulfite, informativeness of nucleotide sequences.
Целевыми локусами генома (целевыми фрагментами ДНК) являются участки геномной ДНК, свойства которых должны быть изучены в соответствии с целью конкретного исследования.The target genome loci (target DNA fragments) are the sections of genomic DNA, the properties of which should be studied in accordance with the purpose of a specific study.
Другой известный способ заключается в селективной амплификации целевых локусов высокомультиплексной ПЦР с использованием специфических праймеров (WO 2014018080 А1, 30.01.2014).Another known method is the selective amplification of target loci of high multiplex PCR using specific primers (WO 2014018080 A1, 01/30/2014).
Недостатками этого способа являются: увеличение доли фрагментов, не относящихся к целевым локусам, с увеличением числа исследуемых локусов по причине образования неспецифических продуктов ПЦР; невозможность выявления химических модификаций нуклеотидов (например, метилирование ДНК).The disadvantages of this method are: an increase in the proportion of fragments not related to the target loci, with an increase in the number of studied loci due to the formation of non-specific PCR products; the inability to detect chemical modifications of the nucleotides (for example, DNA methylation).
Также известен способ, заключающийся в обработке образца геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции со специфическим сайтом узнавания с последующей адаптер-опосредованной амплификацией полученных фрагментов с праймером со специфическим 3'-удлинителем (RU 2472859 С1, 20.01.2013).Also known is a method consisting in processing a sample of genomic DNA with a restriction endonuclease with a specific recognition site, followed by adapter-mediated amplification of the obtained fragments with a primer with a specific 3'-extension cord (RU 2472859 C1, 01/20/2013).
Недостатками этого способа являются: высокие требования к качеству ДНК исследуемых образцов, что делает невозможным использование этого метода для проведения ретроспективных генетических исследований, так как ДНК из доступных образцов ткани, сохраненных в парафиновых блоках для гистологических исследований, сильно фрагментирована.The disadvantages of this method are: high demands on the quality of the DNA of the studied samples, which makes it impossible to use this method for retrospective genetic studies, since the DNA from available tissue samples stored in paraffin blocks for histological studies is highly fragmented.
Известен способ, в котором при работе с ДНК из парафиновых блоков используют предварительный отбор фрагментов ДНК длиннее 500 п. н. (Н. Gu, С. Bock, et al. Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution // 2010. Nat Methods, 7(2), 133-136).A known method in which when working with DNA from paraffin blocks using preliminary selection of DNA fragments longer than 500 bp (N. Gu, C. Bock, et al. Genome-scale DNA methylation mapping of clinical samples at single-nucleotide resolution // 2010. Nat Methods, 7 (2), 133-136).
Недостатками этого метода являются: наличие в получаемых библиотеках высокой доли фрагментов, не относящихся к исследуемой выборке локусов; низкий количественный выход библиотек. Применимость метода ограничена небольшой частью свежих парафиновых блоков, из которых возможно выделение ДНК фрагментов длиннее 500 п. н.The disadvantages of this method are: the presence in the resulting libraries of a high proportion of fragments that are not related to the studied sample of loci; low quantitative yield of libraries. The applicability of the method is limited to a small part of fresh paraffin blocks, from which it is possible to isolate DNA fragments longer than 500 bp.
Также известен способ, в котором был применен метод секвенирования геномных библиотек ограниченных выборок локусов, конвертированных бисульфитом натрия для определения статуса метилирования отдельных CpG-пар в CpG-богатых районах генома человека. Данный способ включает следующие этапы: обработка геномной ДНК рестриктазой MspI, полное тупление концов фрагментов для предотвращения самолигирования фрагментов с получением липкого 3'-А конца, лигирование с адаптерами с липким 3'-Т концом, селекцию фрагментов по длине, обработку фрагментов бисульфитом натрия, амплификацию фрагментов библиотеки (Н. Gu, Z.D. Smith et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling // 2011. Nat Protocols, 6(4), 468-481).A method is also known in which the method of sequencing a genomic library of limited samples of loci converted with sodium bisulfite was applied to determine the methylation status of individual CpG pairs in CpG-rich regions of the human genome. This method includes the following steps: treatment of genomic DNA with restriction enzyme MspI, complete blunting of the ends of the fragments to prevent self-ligation of the fragments to obtain a sticky 3'-A end, ligation with adapters with a sticky 3'-T end, selection of fragments in length, processing of the fragments with sodium bisulfite, amplification of library fragments (N. Gu, ZD Smith et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling // 2011. Nat Protocols, 6 (4), 468-481).
Недостатком данного способа является примененный для предотвращения самолигирования способ полного тупления концов фрагментов, вследствие чего применение этого метода нецелесообразно для приготовления библиотек из образцов деградированной ДНК. При таком способе тупления короткие фрагменты, исходно присутствующие в образце деградированной ДНК, не могут быть отделены от фрагментов, полученных обработкой эндонуклеазой рестрикции со специфическим сайтом узнавания на этапе селекции фрагментов по длине, и попадают в состав геномной библиотеки, формируя значительную фракцию нецелевых фрагментов (фигура 1).The disadvantage of this method is the method for the complete blunting of the ends of the fragments used to prevent self-ligation, which makes it impractical to prepare libraries from samples of degraded DNA. With this method of blunting, short fragments initially present in a sample of degraded DNA cannot be separated from fragments obtained by treatment with a restriction endonuclease with a specific recognition site at the stage of selection of fragments in length, and fall into the genomic library, forming a significant fraction of non-targeted fragments (figure one).
Задачей изобретения является способ приготовления геномных библиотек ограниченных выборок локусов из деградированной ДНК, позволяющий уменьшить долю фрагментов ДНК, не относящихся к целевым участкам генома, что достигается формированием различия между концами целевых фрагментов и фрагментов, образованных в результате деградации ДНК, с использованием предлагаемых способов модификации концов фрагментов.The objective of the invention is a method for preparing genomic libraries of limited samples of loci from degraded DNA, which allows to reduce the proportion of DNA fragments that are not related to the target parts of the genome, which is achieved by forming a difference between the ends of the target fragments and fragments formed as a result of DNA degradation using the proposed methods for modifying the ends fragments.
Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что проводят гидролиз геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, формирующей фрагменты с 5'-липким концом; частичное тупление концов полимеразной реакцией в присутствии неполного набора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, лигирование фрагментов с адаптерами с липким концом, комплементарным модифицированному липкому концу целевого фрагмента, отбор целевых фрагментов совместно селекцией по длине фрагментов и амплификацией с праймерами, комплементарными адаптерам.The problem is solved by the method consisting in the fact that hydrolysis of genomic DNA is carried out with a restriction endonuclease that forms fragments with a 5'-sticky end; partial blunting of the ends by polymerase reaction in the presence of an incomplete set of deoxyribonucleoside triphosphates, ligation of fragments with adapters with a sticky end, complementary to the modified sticky end of the target fragment, selection of target fragments together by selection along the length of the fragments and amplification with primers, complementary adapters.
Состав ограниченной выборки локусов определяется нуклеотидным составом сайта узнавания используемой для гидролиза ДНК эндонуклеазы рестрикции и отбором фрагментов по длине в соответствии с дизайном конкретного исследования. Максимальная длина фрагментов ДНК ограниченной выборки локусов определяется техническими возможностями технологии ее последующего анализа, например, максимальной допустимой методом секвенирования длиной фрагмента ДНК. Способ может применяться для изучения геномной ДНК любого вида организмов, при условии, что в ее последовательности встречаются сайты узнавания выбранной эндонуклеазы рестрикции, расположенные на расстоянии, не превышающем максимальной длины фрагментов ДНК, для которой доступен последующий анализ.The composition of a limited sample of loci is determined by the nucleotide composition of the recognition site used for the hydrolysis of restriction endonuclease DNA and the selection of fragments along the length in accordance with the design of a particular study. The maximum length of DNA fragments of a limited sample of loci is determined by the technical capabilities of the technology for its subsequent analysis, for example, the maximum allowable DNA fragment length by sequencing. The method can be used to study the genomic DNA of any kind of organisms, provided that in its sequence there are recognition sites of the selected restriction endonuclease located at a distance not exceeding the maximum length of DNA fragments for which subsequent analysis is available.
Гидролиз геномной ДНК может быть проведен чувствительной к химической модификации нуклеотидов эндонуклеазой рестрикции и ее нечувствительным к модификации изошизомером, формирующими различные липкие концы фрагментов.Hydrolysis of genomic DNA can be carried out sensitive to chemical modification of nucleotides by a restriction endonuclease and its insensitive to modification by an isoshizomer, forming various sticky ends of fragments.
При амплификации могут быть использованы праймеры, содержащие участок, комплементарный адаптерам, участок комплементарный остатку сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участок специфического удлинителя длиной 1-4 нуклеотида на 3' конце праймера, для ограничения выборки локусов библиотеки.For amplification, primers can be used that contain a site complementary to the adapters, a site complementary to the rest of the restriction endonuclease recognition site, a specific extension site of 1-4 nucleotides at the 3 'end of the primer, to limit the selection of library loci.
Способ практически осуществляется следующим образом.The method is practically carried out as follows.
Этапы осуществления способа: (1) сайт-специфический гидролиз ДНК; (2) модификация концов фрагментов ДНК частичным туплением; (3) сайт-специфическое лигирование фрагментов ДНК с адаптерами; (4) отбор фрагментов ДНК по длине; (5) амплификация фрагментов ДНК.Stages of the method: (1) site-specific hydrolysis of DNA; (2) modification of the ends of DNA fragments by partial blunting; (3) site-specific ligation of DNA fragments with adapters; (4) selection of DNA fragments along the length; (5) amplification of DNA fragments.
Геномную ДНК обрабатывают эндонуклеазой рестрикции с сайтом узнавания, характерным для интересующего исследователя класса последовательностей генома, формирующей фрагменты с 5'-липким концом. В рестрикционную смесь с общим объемом 11,4 мкл добавляют 0,1-10 мкг нативной ДНК, 1,1 мкл соответствующего 10-кратного буфера и 20 единиц выбранной эндонуклеазы рестрикции. Смесь инкубируют при температуре, оптимальной для выбранного фермента в течение 16 часов.Genomic DNA is treated with a restriction endonuclease with a recognition site characteristic of the researcher of interest in the genome sequence class, which forms fragments with a 5'-sticky end. In a restriction mixture with a total volume of 11.4 μl, 0.1-10 μg of native DNA, 1.1 μl of the corresponding 10-fold buffer and 20 units of the selected restriction endonuclease are added. The mixture is incubated at a temperature optimal for the selected enzyme for 16 hours.
Использование для гидролиза ДНК эндонуклеаз рестрикции, чувствительных к химическим модификациям нуклеотидов, и их нечувствительных к таким модификациям изошизомеров, позволяет выявить эпигенетические химические модификации нуклеотидов, по наличию либо отсутствию фрагментов геномных локусов в составе получаемых библиотек. В этом случае гидролиз ДНК проводят последовательно, сначала - эндонуклеазой рестрикции, чувствительной к химическим модификациям нуклеотидов, затем - ее нечувствительным к таким модификациям изошизомером.The use of restriction endonucleases for DNA hydrolysis that are sensitive to chemical modifications of nucleotides and their insensitive to such modifications of isoshizomers makes it possible to identify epigenetic chemical modifications of nucleotides by the presence or absence of fragments of genomic loci in the resulting libraries. In this case, DNA hydrolysis is carried out sequentially, first with a restriction endonuclease that is sensitive to chemical modifications of the nucleotides, and then it is insensitive to such modifications with the isoshizomer.
Для модификации концов фрагментов, предотвращающей самолигирование фрагментов и формирующей отличие концов целевых фрагментов, от концов фрагментов, образовавшихся в результате деградации ДНК, продукты гидролиза обрабатывают 2,5 ед.а. мутантного рекомбинанта полимеразы I E. coli, лишенного 3'-5'-экзонуклеазной (корректорной) активности (фрагмент Кленова ехо-) в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего необходимо инактивировать фермент инкубаций в течение 10 мин при 75°С. Частичное тупление в присутствии 0,5 мкл неполного набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (каждого по 1 мМ) позволяет одновременно предотвратить самолигирование фрагментов и сформировать сайт-специфический конец у фрагментов, полученных гидролизом эндонуклеазой рестрикции, отличающийся от конца фрагментов, образовавшихся в результате деградации ДНК. При несовместимости буфера рестриктазы с буфером фрагмента Кленова ехо - необходимо провести очистку фрагментов ДНК, например, с помощью реактива Agencourt AMPure ХР (Beckman Coulter Inc.) по протоколу производителя, либо, в случае возможности, провести коррекцию буфера до необходимого молярного состава.To modify the ends of the fragments, which prevents self-ligation of the fragments and forms the difference between the ends of the target fragments and the ends of the fragments formed as a result of DNA degradation, the hydrolysis products are treated with 2.5 u.a. mutant recombinant of E. coli polymerase I lacking 3'-5'-exonuclease (corrective) activity (Klenov exo fragment) for 30 min at 37 ° C, after which it is necessary to inactivate the incubation enzyme for 10 min at 75 ° C . Partial blunting in the presence of 0.5 μl of an incomplete set of deoxyribonucleotide triphosphates (each 1 mM each) simultaneously prevents fragments self-ligation and forms a site-specific end for fragments obtained by restriction endonuclease hydrolysis, which differs from the end of fragments resulting from DNA degradation. If the restriction enzyme buffer is incompatible with the Klenov exo fragment buffer, it is necessary to purify DNA fragments, for example, using the Agencourt AMPure XP reagent (Beckman Coulter Inc.) according to the manufacturer's protocol, or, if possible, correct the buffer to the required molar composition.
Сайт-специфическое лигирование фрагментов с адаптерами с липким концом, комплементарным липкому концу фрагмента, полученному при частичном туплении концов фрагментов, образованных эндонуклеазой рестрикции. Дизайн 5'-липкого конца адаптера необходимо проводить с учетом сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, используемой для приготовления библиотеки, и используемого способа тупления концов фрагментов. Пример такого дизайна показан на фигуре 2. К образцу добавляют по 0,8 мкл каждого из адаптеров 15 мкМ; 1,8 мкл dATP 10 мМ; 1,6 мкл лигазы 200000 CEU/мл. Так как буфер лигазы совместим с буфером фрагмента Кленова ехо-, то достаточно коррекции реакционного буфера добавлением 0,6 мкл десятикратного буфера лигазы. Адаптеры могут быть приготовлены отжигом из синтетических олигонуклеотидов, для чего эквимолярную смесь олигонуклеотидов нагревают до 95°С и остужают со скоростью 2°/мин. Если для предотвращения образования конкатемеров адаптеров применяли адаптеры, не кинированные на 5'-конце со стороны лигируемого 5'-липкого конца, то необходимо провести ник-трансляцию с использованием 1 ед.а. полимеразы с добавлением 1 мкл смеси всех дезоксирибонуклеотидов (dNTP) по 2,5 мМ каждого. Могут быть использованы адаптеры, совместимые с различными приборами для высокопроизводительного параллельного секвенирования фрагментов, например, Roche/454 Life Sciences, Applied Biosystems/SOLiD, Ion Torrent/Proton, Illumina, подходящей производительности по протоколу производителя. Настоящее изобретение не предъявляет требований к структуре основной части адаптера. Принципиальным является лишь дизайн 5'-липкого конца адаптера, который необходимо проводить с учетом сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, используемой для приготовления библиотеки, и используемого способа частичного тупления концов фрагментов. Пример такого дизайна показан на фигуре 2.Site-specific ligation of fragments with adapters with a sticky end complementary to the sticky end of the fragment obtained by partially blunting the ends of the fragments formed by the restriction endonuclease. The design of the 5'-sticky end of the adapter must be carried out taking into account the recognition site of the restriction endonuclease used to prepare the library and the method used to blunt the ends of the fragments. An example of such a design is shown in Figure 2. 0.8 μl of each of the 15 μM adapters are added to the sample; 1.8 μl dATP 10 mM; 1.6 μl of ligase 200,000 CEU / ml. Since the ligase buffer is compatible with the buffer of the Klenov exo fragment, it is sufficient to correct the reaction buffer by adding 0.6 μl of a ten-fold ligase buffer. Adapters can be prepared by annealing from synthetic oligonucleotides, for which an equimolar mixture of oligonucleotides is heated to 95 ° C and cooled at a rate of 2 ° / min. If, to prevent the formation of adapter concatemers, adapters were used that were not cinned at the 5'-end from the ligated 5'-sticky end, then nick translation should be performed using 1 unit a. polymerase with the addition of 1 μl of a mixture of all deoxyribonucleotides (dNTP) of 2.5 mm each. Adapters compatible with various instruments for high-performance parallel sequencing of fragments can be used, for example, Roche / 454 Life Sciences, Applied Biosystems / SOLiD, Ion Torrent / Proton, Illumina, suitable performance according to the manufacturer's protocol. The present invention does not impose requirements on the structure of the main part of the adapter. Of fundamental importance is the design of the 5'-sticky end of the adapter, which must be carried out taking into account the recognition site of the restriction endonuclease used to prepare the library, and the method used to partially blunt the ends of the fragments. An example of such a design is shown in figure 2.
Отбор фрагментов библиотеки для сокращения выборки локусов можно проводить селекцией фрагментов по длине, например, в приборе PippinPrep (Sage Science, USA) по протоколу производителя, либо электрофорезом фрагментов библиотеки в 2%-агарозном геле, в присутствии в соседних дорожках маркера молекулярной массы фрагментов. Область геля, содержащую фрагменты библиотеки интересующей исследователя длины, вырезают одноразовым скальпелем, после чего проводят выделение фрагментов из геля, например, с помощью набора реагентов для извлечения ДНК из агарозного геля GeneJET Gel Extraction Kit (ThermoFisher scientific). Перед электрофорезом в геле образец очищают от ДНК-связывающих белков и после электрофореза образец очищают от электрофоретического буфера, например, с помощью реактива Agencourt AMPure ХР (Beckman Coulter Inc.) по протоколу производителя.Selection of library fragments to reduce the selection of loci can be performed by selection of fragments along the length, for example, in a PippinPrep instrument (Sage Science, USA) according to the manufacturer's protocol, or by electrophoresis of library fragments in a 2% agarose gel, in the presence of molecular weight fragments in neighboring tracks. The area of the gel containing the library fragments of the length researcher of interest is excised with a disposable scalpel, after which the fragments are isolated from the gel, for example, using the GeneJET Gel Extraction Kit (ThermoFisher scientific) reagent kit for DNA extraction from agarose gel. Before gel electrophoresis, the sample was purified from DNA-binding proteins and after electrophoresis, the sample was purified from electrophoretic buffer, for example, using the Agencourt AMPure XP reagent (Beckman Coulter Inc.) according to the manufacturer's protocol.
Амплификацию библиотеки с праймерами, комплементарными адаптерам, проводят в условиях, оптимальных для праймеров, комплементарных используемым адаптерам в зависимости от платформы, выбранной для клонального секвенирования фрагментов библиотеки по протоколу производителя. При использовании праймеров, содержащих участок, комплементарный адаптерам, участок комплементарный остатку сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции и участок специфического удлинителя длиной 1-4 нуклеотида на 3' конце праймера возможно сокращение размера получаемой геномной библиотеки. Сочетание сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции и специфического удлинителя праймера позволяет проводить отбор геномных локусов для формирования библиотеки фрагментов, принадлежащих различным классам последовательностей генома, например CpG-островкам, семействам повторов и др.The amplification of the library with primers complementary to the adapters is carried out under conditions optimal for the primers complementary to the adapters used, depending on the platform selected for clonal sequencing of the library fragments according to the manufacturer's protocol. When using primers containing a portion complementary to the adapters, a portion complementary to the rest of the restriction endonuclease recognition site, and a portion of a specific extension of 1-4 nucleotides at the 3 'end of the primer, it is possible to reduce the size of the resulting genomic library. The combination of a restriction endonuclease recognition site and a specific primer extension allows the selection of genomic loci to form a library of fragments belonging to different classes of genome sequences, for example, CpG islands, repeating families, etc.
В процессе амплификации могут участвовать только фрагменты, дотированные с обеих сторон адаптерами, что возможно только в том случае, если фрагмент с обеих сторон имел концы, соответствующие концам, образуемым туплением 5'-липкого конца, полученного обработкой геномной ДНК выбранной эндонуклеазой рестрикции. Таким образом, происходит отбор целевых фрагментов библиотеки, так как фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате деградации ДНК, с очень малой вероятностью могут иметь подходящие для лигирования адаптеров концы.Only fragments subsidized on both sides by adapters can participate in the amplification process, which is possible only if the fragment on both sides had ends corresponding to the ends formed by blunting the 5'-sticky end obtained by treating genomic DNA with a selected restriction endonuclease. Thus, the selection of target fragments of the library occurs, since DNA fragments formed as a result of DNA degradation are very unlikely to have ends suitable for ligation of adapters.
На фигуре 1 показаны различия содержания в приготавливаемой геномной библиотеке нецелевых фрагментов при приготовлении геномных библиотек с использованием: высокомолекулярной ДНК; фрагментированной ДНК по ранее предложенным протоколам; фрагментированной ДНК, в соответствии с настоящим изобретением. Толстыми линиями обозначены целевые локусы генома, тонкими линиями - нецелевые локусы генома, включение которых в состав библиотеки нежелательно. Адаптеры обозначены толстыми серыми линиями. Концы фрагментов, образованные в результате гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции, обозначены уголками. Концы фрагментов, образованные в результате деградации ДНК, свободны. Концы фрагментов, подготовленные к лигированию с адаптерами, обозначены полуокружностями. В случае приготовления геномной библиотеки из фрагментированной ДНК по ранее предложенным протоколам, ПЦР с праймерами, комплементарными адаптерам, приводит к образованию значительного количества нецелевых элементов геномной библиотеки.The figure 1 shows the differences in the content in the prepared genomic library of non-target fragments in the preparation of genomic libraries using: high molecular weight DNA; fragmented DNA according to previously proposed protocols; fragmented DNA in accordance with the present invention. Thick lines indicate the target loci of the genome, thin lines indicate non-target loci of the genome, the inclusion of which in the library is undesirable. Adapters are indicated by thick gray lines. The ends of the fragments formed as a result of DNA hydrolysis by restriction endonuclease are indicated by corners. The ends of the fragments formed as a result of DNA degradation are free. The ends of fragments prepared for ligation with adapters are indicated by semicircles. In the case of preparing a genomic library from fragmented DNA according to previously proposed protocols, PCR with primers complementary to the adapters leads to the formation of a significant number of non-target elements of the genomic library.
На фигуре 2 показан пример сайт-специфического лигирования адаптеров с 5'-липким концов фрагментов, частично тупленным в присутствии неполного набора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов: в результате гидролиза геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции (в примере рассмотрен сайт узнавания рестриктазы Ah1I) образуются фрагменты с 5'-липким палиндромным концом; в результате частичного тупления концов фрагментов для предотвращения самолигирования фрагментов библиотеки и адаптеров (полимеразной реакцией с неполным набором дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, в примере, dCTP и dTTP) образуются фрагменты с 5'-липким непалиндромным концом, соответствующим части сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции; проводится лигирование с адаптером, имеющим 5'-липкий конец, комплементарный полученному 5'-липкому концу фрагмента.Figure 2 shows an example of site-specific ligation of adapters with 5'-sticky ends of fragments, partially stupid in the presence of an incomplete set of deoxyribonucleotide triphosphates: as a result of hydrolysis of genomic DNA with a restriction endonuclease (the Ah1I restriction enzyme recognition site is considered in the example) fragments with a 5'-sticky palindromic end; as a result of partial blunting of the ends of the fragments to prevent self-ligation of the library fragments and adapters (polymerase reaction with an incomplete set of deoxyribonucleotide triphosphates, in the example dCTP and dTTP), fragments with a 5'-sticky non-palindromic end corresponding to a part of the restriction endonuclease recognition site are formed; ligation is carried out with an adapter having a 5'-sticky end complementary to the resulting 5'-sticky end of the fragment.
Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с аналогами, являются одновременно: высокая селективность в отношении целевых фрагментов, небольшое время приготовления геномных библиотек, возможность работы с образцами деградированной ДНК, например, из парафиновых блоков.The defining distinguishing features of the proposed method, in comparison with analogues, are simultaneously: high selectivity for target fragments, short preparation of genomic libraries, the ability to work with samples of degraded DNA, for example, from paraffin blocks.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154505A RU2625012C2 (en) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154505A RU2625012C2 (en) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015154505A RU2015154505A (en) | 2017-06-22 |
| RU2625012C2 true RU2625012C2 (en) | 2017-07-11 |
Family
ID=59240483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015154505A RU2625012C2 (en) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2625012C2 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003106679A1 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Aston University | Methods of producing dna and protein libraries |
| US20060068394A1 (en) * | 2000-05-20 | 2006-03-30 | Langmore John P | Method of producing a DNA library using positional amplification |
| RU2472859C1 (en) * | 2011-05-18 | 2013-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России) | Method for formation of dna methylation marker systems |
-
2015
- 2015-12-18 RU RU2015154505A patent/RU2625012C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060068394A1 (en) * | 2000-05-20 | 2006-03-30 | Langmore John P | Method of producing a DNA library using positional amplification |
| WO2003106679A1 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Aston University | Methods of producing dna and protein libraries |
| RU2472859C1 (en) * | 2011-05-18 | 2013-01-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России) | Method for formation of dna methylation marker systems |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BROWN TA, Genomes, 2nd edition, Oxford:Wiley-Liss, 2002, Chapter 4, Studying DNA. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015154505A (en) | 2017-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022202625B2 (en) | Methods and compositions for rapid nucleic acid library preparation | |
| KR102425438B1 (en) | Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq) | |
| EP4090766B1 (en) | Methods of targeted sequencing | |
| WO2012089148A1 (en) | Method for single cell genome analysis and kit therefor | |
| EP2163646A1 (en) | CpG island sequencing | |
| JP2023153732A (en) | Method for target specific rna transcription of dna sequences | |
| HK1220223A1 (en) | A method for dna amplification | |
| US11339427B2 (en) | Method for target specific RNA transcription of DNA sequences | |
| JP2024035109A (en) | Methods for accurate parallel detection and quantification of nucleic acids | |
| RU2625012C2 (en) | Method for preparation of genomic libraries of limited selections of locuses from degraded dna | |
| WO2024123127A1 (en) | Multibody full-length sequencing analysis method for single cell using multi-combination assembly reaction of dna fragments | |
| US20230122979A1 (en) | Methods of sample normalization | |
| CN117915922A (en) | Compositions and methods relating to the modification and detection of pseudouridine and 5-hydroxymethylcytosine | |
| KR20230124636A (en) | Compositions and methods for highly sensitive detection of target sequences in multiplex reactions | |
| US20250163407A1 (en) | Methods selectively depleting nucleic acid using rnase h | |
| KR102892827B1 (en) | Single-cell omics full-length sequencing analysis method using multi-DNA fragment binding assembly reaction | |
| JP2024035110A (en) | Sensitive method for accurate parallel quantification of mutant nucleic acids | |
| HK40052623A (en) | Nuclease-based rna depletion | |
| Blattner | Single cell transcriptome analysis using next generation sequencing. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181219 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20211203 |