RU2625010C1 - Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка - Google Patents
Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2625010C1 RU2625010C1 RU2016144163A RU2016144163A RU2625010C1 RU 2625010 C1 RU2625010 C1 RU 2625010C1 RU 2016144163 A RU2016144163 A RU 2016144163A RU 2016144163 A RU2016144163 A RU 2016144163A RU 2625010 C1 RU2625010 C1 RU 2625010C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vector
- tnfr1
- protein
- sequence
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims description 14
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims abstract description 5
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 101000818390 Homo sapiens Ferritin light chain Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 2
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 2
- 102100023360 Forkhead box protein N2 Human genes 0.000 abstract 1
- 101000907593 Homo sapiens Forkhead box protein N2 Proteins 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 28
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108091023818 miR-7 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 7
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 7
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 7
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 7
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 7
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 7
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 3
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 3
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 2
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108091067625 Homo sapiens miR-7-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067630 Homo sapiens miR-7-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091067633 Homo sapiens miR-7-3 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000011861 anti-inflammatory therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- UOCJDOLVGGIYIQ-PBFPGSCMSA-N cefatrizine Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)C=2C=CC(O)=CC=2)CC=1CSC=1C=NNN=1 UOCJDOLVGGIYIQ-PBFPGSCMSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003115 certolizumab pegol Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940090100 cimzia Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960001743 golimumab Drugs 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 1
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940068638 simponi Drugs 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1051—Gene trapping, e.g. exon-, intron-, IRES-, signal sequence-trap cloning, trap vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
- C12N2330/51—Specially adapted vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
- C12N2840/206—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES having multiple IRES
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению белков, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка TNFR1-Fc в клетках HEK293. Конструируют экспрессионный плазмидный вектор pFIG-hTNFr с физической картой, представленной на фиг.5, размером 6674 п.о., содержащий: а) последовательность, кодирующую рекомбинантный белок TNFR1-Fc с аминокислотной последовательностью, представленной на фиг. 6б; б) последовательность E/Р энхансера вируса Т-клеточной лейкемии человека и промотора фактора элонгации 1; в) последовательность SP, кодирующую сигнальный пептид CD33; е) последовательность IRES, кодирующую участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита, и ж) последовательность GS, кодирующую глутаминсинтетазу. Способ получения гибридного белка TNFR1-Fc включает культивирование клеток HEK293, последовательно трансформированных введением указанного вектора pFIG-hTNFr и вектора psiRNA-h7SK-miR7 с физической картой, представленной на фиг. 7, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка TNFR1-Fc. Изобретение позволяет получить рекомбинантный белок TNFR1-Fc с высокой активностью ингибирования фактора некроза опухоли с высоким выходом. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано при производстве препаратов-ингибиторов фактора некроза опухоли.
Уровень техники
Фактор некроза опухоли (ФНО) играет ведущую роль в патогенезе хронических воспалительных заболеваний суставов и других тканей (таких как ревматоидный и псориатический артрит, болезнь Крона, анкилозирующий спондилит и др). Действие ФНО на клетки опосредовано двумя типами рецепторов TNFR1 (p55/60) и TNFR2 (p75/80) и имеет плейотропный характер. Патологические эффекты ФНО связаны, в первую очередь, с активацией TNFR1, которая запускает синтез провоспалительных цитокинов, хемокинов , молекул адгезии и, как следствие, развитие воспалительного процесса и дегенерацию ткани. При этом растворимые формы TNFR1 и TNFR2 выступают в качестве антагонистов трансмембранного рецептора и блокируют взаимодействие ФНО и p55/p60.
Это свойство растворимых рецепторов послужило основанием для внедрения ингибиторов ФНО на основе рекомбинантного TNFR в практику противовоспалительной терапии. За последний период в организации США проходят испытания нескольких рекомбинантных белков – ингибиторов TNF.alpha. К ним относятся Etanercept (Enbrel.RTM.), разработанный фирмой Celltech, Infliximab (Remicade), Adalimumab (Humira RTM), разработанный фирмой Centocor, Certolizumab pegol (Cimzia), и Golimumab (Simponi). Наиболее известные ингибиторы-рецепторы TNFR-Ig – p75TNFRigG Etanercept (Enbrel), к другим белкам ингбиторам относятся: Humicade.TM, разработанный фирмой Abbott, разработанный фирмой Immunex/Amgen белок ABX-CBL [1, 2].
Рекомбинантный TNFR-Fc состоит из экстраклеточного домена TNFR1 и Fc фрагмента IgG1 человека. Присутствие Fc фрагмента повышает время полужизни рекомбинантного белка. Кроме этого, Fc фрагмент выступает как олигомеризационный домен и обеспечивает образование димеров белка, стабилизированных дисульфидной связью. В сравнении с мономерной формой авидность олигомеризованного рецептора выше, что позволяет использовать его в меньшей дозировке для ингибирования активности фактора некроза опухоли.
Известны патенты и заявки на изобретения, которые относятся к разработке конструкций экспрессионных векторов для получения TNFR-Fc [3-5].
В известных изобретениях для наработки конечного продукта предлагаются разные экспрессионные системы. В патентах РФ № 2513686, 2225443, 2307163 для синтеза антител человека против фактора некроза опухоли человека применяют рекомбинантные штаммы бактерий Escherichia coli [6-8].
В последний период для экспрессии, в том числе активных белков TNFR-FC, стали использовать клетки млекопитающих СНО [9-12] и клеточные линии HEK293F [13,14]. Однако стандартное использование трансгенных линий клеток млекопитающих связано с относительно низкой продуктивностью, что делает промышленную процедуру наработки белка весьма дорогостоящей.
Известна работа [15], в которой клетки HEK 293 последовательно трансфецируют двумя экспрессионными векторами, например вектором экспрессирующим водорастворимый Her2 (sHer2) и вектором psiRNA-h7SKneo, который содержит последовательность hsa-miR-7-5p. В другом примере, для трансфекции клеток вместо вектора экспрессирующего водорастворимый Her2 рассматривается применение экспрессионного вектора, который экспрессирует водорастворимый TNF-R1 (sTNFR1)совместно с вектором psiRNA-h7SKneo. В работе сделан вывод о том, что применение второго вектора экспрессирующего miR-7 в клетках HEK 293 способствует продуктивности клеток.
Посттрансляционная модификация растворимого рецептора накладывает дополнительные ограничения на выбор экспрессионной системы для наработки белка. Поэтому получение высокопродуктивных культур клеток с большим выходом биологически активного TNFR является актуальной задачей в настоящее время.
Техническая задача данного изобретения предусматривает совершенствование и расширение арсенала экспрессионных векторов для трансгенных линий клеток млекопитающих с высокой продуктивностью при изготовлении эффективных лекарственных средств направленных против фактора некроза опухоли человека.
Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в том, что за счет выбора новых элементов структуры экспрессионного вектора, достигается высокая эффективность экспрессии целевого, биологически активного белка TNFR1-Fc.
Сущность изобретения
Одним из аспектов изобретения является экспрессионный плазмидный вектор pFIG-hTNFr, для экспрессии активной формы рекомбинантного белка TNFR1-Fc в клетках HEK293, обладающий свойством экспрессионной кассеты в указанных клетках, где указанный плазмидный вектор имеет размер 6674 п.о., молекулярную массу 4,40484 MДа, уникальные сайты рестрикции: Acc65I, AgeI, AhdI, ApaBI, AsiSI, BbeI, BglII, BspEI, BspHI, BssHII, BstAPI, BstZ17I, ClaI, EcoICRI, EcoRI, FalI, FseI, HpaI, KasI, KpnI, NarI, NcoI, NdeI, PflMI, PsiI, PvuI, SacI, SalI, SanDI, SbfI, ScaI, SciI, SfoI, SnaBI, SpeI, SphI, SspI, XbaI, XcmI, XhoI, промоторы: эукариотический промотор фактора элонгации 1α (EF-1α), промотор гена легкой цепи ферритина человека (hFerL), бактериальный промотор EM2KC, энхансеры: R сегмент и часть U5 последовательности длинного концевого повтора типа 1 вируса Т-клеточной лейкемии человека, энхансер раннего гена 1 цитомегаловируса человека. В состав вектора входит экспрессионная кассета с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, которая содержит: а) последовательность, кодирующую рекомбинантный белок TNFR1-Fc с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 б) последовательность E/Р (SEQ ID NO:3) энхансера вируса Т-клеточной лейкемии человека и промотора фактора элонгации 1; в) последовательность SP (SEQ ID NO:5), кодирующую сигнальный пептид CD33; г) последовательность IRES (SEQ ID NO:10) кодирующую участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита; д) последовательность GS (SEQ ID NO:12) кодирующую глутаминсинтетазу.
К другому аспекту изобретения относится линия клеток HEK293 - продуцентов рекомбинантного белка, последовательно трансфицированная экспрессионным вектором pFIG-hTNFr и вектором psiRNA-h7SK-miR7.
К другому аспекту изобретения относится способ получения гибридного белка TNFR1-Fc, включающий культивирование линии клеток HEK293 последовательно трансформированных введением экспрессионного плазмидного вектора pFIG-hTNFr кодирующего синтез активного рекомбинантного белка TNFR1-Fc и дополнительно введенного в клетки вектора psiRNA-h7SK-miR7, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка TNFR1-Fc.
Перечень фигур
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
На фиг.1 изображена схема первой стадии получения вектора pFIG-hTNFr.
На фиг.2 изображена схема второйстадии получения вектора pFIG-hTNFr.
На фиг.3 изображена карта вектора splg-hTNFr.
На фиг.4 изображена схема третьей стадии получения вектора pFIG-hTNFr.
На фиг.5. изображена карта вектора pFIG-hTNFr.
На фиг. 6 изображены аминокислотные последовательности промежуточного и конечного продукта. Где: на фиг.6А представлена аминокислотная последовательность промежуточного продукта, включающая сигнальный пептид (17 аминокислот) и TNFR1-Fc; на фиг 6Б представлена аминокислотная последовательность конечного продукта, TNFR1-Fc (SEQ ID NO:2).
Фиг.7. изображена карта вектора psiRNA-h7SK-miR7.
Фиг.8. представлены результаты анализа ингибирующей активности TNFR-Fc против ФНО in vitro.
Описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на создание культуры-продуцента, которая позволяет наработать в больших количествах рекомбинантный белок TNFR1-Fc - ингибитор фактора некроза опухоли (ФНО) с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1. С этой целью создан новый вектор для получения белка TNFR1-Fc с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2. и получена новая культура-суперпродуцента рекомбинантного TNFR1-Fc.
Поставленная задача решается путем создания ДНК-конструкции, pFIG-hTNFr, которая содержит вставку с экспрессионной кассетой считывания гена, для кодирования рекомбинантного белка TNFR1-Fc следующего состава:
5' – E/P-SP-TNFR1-L-Fc –IRES-GS - 3'
где: E/Р – последовательность E/Р (SEQ ID NO:3) энхансера вируса Т-клеточной лейкемии человека и промотора фактора элонгации 1;
SP - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 5), кодирующая сигнальный пептид CD33;
TNFR1 - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 6) экстраклеточного домена рецептора ФНО 1 типа;
L - синтетическая последовательность (SEQ ID NO:7), кодирующая линкер;
Fc – последовательность (SEQ ID NO: 8), кодирующая Fc фрагмент иммуноглобулина G1 человека;
IRES - нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:10) участка внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита;
GS – нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 12) глутаминсинтетазы.
При конструировании вектора pFIG-hTNFr осуществляют следующие стадии.
- Получают промежуточный вектор pFUSE I, схема получения которого представлена на Фиг 1. Для этого встраивают в коммерческий вектор pFUSE-CHIg-hG1 (Invivogen) элемент IRES, который берут из вектора pIRES (Clontech).
- Формируют промежуточный вектор pFIG, схема получения которого представлена на Фиг 2. Для этого в вектор pFUSE I встраивают элемент GS с последовательностью глутаминсинтетазы.
- Получают промежуточный вектор spIg-hTNFr, физическая карта которого представлена на Фиг 3. Для этого в коммерческий вектор signal plus Ig (Ingenius) встраивают Fc фрагмент и экстраклеточный домен TNFR.
- Формируют конечный вектор pFIG-hTNFr, схема получения которого представлена на Фиг 4. Для этого в вектор pFIG встраивают элементы SPL-TNFR1-L , которые взяли из вектора spIg-hTNFr . Физическая карта вектора pFIG-hTNFr представлена на фиг.5.
Для повышения эффективности получения целевого продукта клетки последовательно трансформируют сначала вектором pFIG-hTNFr затем вектором psiRNA-h7SK-miR7, кодирующим микроРНК miR7, который получают путем интегрирования фрагмента кодирующего miR7 в плазмиду psiRNA-h7SK (Invivogen) сайту эндонуклеазы Bbs I. При исследовании различных типов экспрессирующих векторов для синтеза рекомбинантного белка TNFR1 слитого с фрагментом Fс совместно с вектором экспрессирующим miR-7 в клетках HEK 293 было обнаружено, что повысить эффективность экспрессии возможно не только за счет последовательной трансфекции клеток HEK 293 вектором pFIG-hTNFr и вектором psiRNA-h7SK-miR7, но и за счет выбора элементов, входящих в экспрессионную кассету.
Выбор структуры вектора pFIG-hTNFr и последовательная трансфекция линии клеток HEK 293 и последующая селекция клеток с помощью метионинсульфоксимина позволяет получить синергетический результат и повысить выход биологически активного белка TNFR1-Fc.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения. Описание, приведенное в настоящем изобретении, предназначено исключительно для описания конкретных осуществлений и не подразумевает ограничения сферы охвата настоящего изобретения, если не указано иное. Любые методы и материалы, аналогичные или идентичные приведенным в настоящем описании примеров, могут использоваться в практическом применении настоящего изобретения для получения биологически активного белка TNFR1-Fc.
Примеры конкретного осуществления предлагаемого изобретения.
При конструировании вектора pFIG-hTNFr получают ряд промежуточных векторов.
Пример 1. Конструирование промежуточного плазмидного вектора pFUSE-I
При конструировании вектора pFUSE-I в плазмиду pFUSE-CHIg-hG1 (Invivogen) интегрируют фрагмент ДНК, кодирующий участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита (IRES). Для этого в плазмиду pFUSE-CHIg-hG1 вводят сайт для эндонуклеазы рестрикции PaeI путем ПЦР с использованием олигонуклеотидов:
pF-Sph_f (SEQ ID NO:17)
(5`-GTAAATGAGTCCTAGCATGCCAGACATGATAAGATAC-3`) и
pF-Sph_r (SEQ ID NO:18)
(5`-GTATCTTATCATGTCTGGCATGCTAGGACTCATTTAC-3`).
Реакцию проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1× буфер для KOD Hot Start DNA Polymerase («Novagen»), 1,5 мМ MgSO4, 0,2 мМ раствор дНТФ, 0,3 мкМ олигонуклеотид pF-Sph_f, 0,3 мкМ олигонуклеотид pF-Sph_r, 5 нг векторной ДНК pFUSE-CHIg-hG1, 0,02 ед/мкл KOD Hot Start DNA Polymerase.
Очищенные продукты ПЦР и векторную ДНК pIRES («Clontech») обрабатывают эндонуклеазами рестрикции PaeI и KspAI. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1× буфер «B» («Thermo Fisher Scientific»), продукты ПЦР или 1 мкг векторной ДНК и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции PaeI и KspAI. Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 4 часов. Для выделения фрагмента ДНК, кодирующего элемент IRES, продукты гидролиза pIRES разделяют в 0,8% агарозном геле. Вырезают часть агарозного геля, содержащего фрагмент ДНК длиной приблизительно 820 п.н. и выделяют ДНК из геля.
Обработанные фрагменты ДНК эндонуклеазами рестрикции лигируют с использованием ДНК лигазы фага Т4. Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 1× буфер для ДНК лигазы фага Т4, 1 мМ АТФ, по 200 нг лигируемых фрагментов и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 2 часов. Продуктами лигирования трансформируют клетки E. coli штамма TOP10. Трансформированные клетки высевают на чашки с селективной агаризованной средой, содержащей 25 мкг/мл зеоцина.
Скрининг колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, проводят с использованием полимеразной цепной реакции. В качестве матричной ДНК используют часть колонии E. coli, ресуспендированной в 5 мкл 1% раствора Тритон Х-100. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 5 ед. Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific») и по 10 пмоль олигонуклеотидов:
SV40_pAd (SEQ ID NO:19) (5`-AACTTGTTTATTGCAGCTT-3`) и
hFc_r (SEQ ID NO:20) (5`-TCCTTCTTCCTCTACAGCA-3`)
Из положительных колоний выделяют плазмидную ДНК. Правильность встраивания фрагмента проверяют секвенированием рекомбинантных векторов. Полученный вектор был обозначен как pFUSE-I (см. Фиг. 1).
Пример 2. Конструирование промежуточного вектора pFIG дополнительно кодирующего глутаминсинтазу.
Фрагмент ДНК, кодирующий глутаминсинтазу (GS) получают путем ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией. В качестве матрицы и используют тотальную РНК клеток линии CHO. Реакцию проводят в 20 мкл смеси, содержащей 1× буфер для обратной транскриптазы, 0,5 мМ дНТФ, 100 пмоль олигонуклеотида oligo(dT), 5 мкг образца тотальной РНК, 20 ед. ингибитора РНКаз «RiboLock RNase Inhibitor» («Thermo Fisher Scientific»), 50 ед. обратной транскриптазы «Maxima H Minus Reverse Transcriptase» («Thermo Fisher Scientific»). Реакцию синтеза кДНК проводят при 50 °C в течение 30 мин. Реакцию останавливают прогреванием реакционной смеси при 85 °С в течение 5 минут.
На следующем этапе для получения фрагмента ДНК, кодирующего глутаминсинтазу, проводят ПЦР с использованием ген-специфических олигонуклеотидов:
GS_f1 (SEQ ID NO:21) (5`-TTTGGATCCATGGCCACCTCAGCAAGTTC-3`) и
GS_r (SEQ ID NO:22) (5`-TGGTCGACTTAGTTTTTGTATTGGAAGGGCTG-3`)
В качестве матричной ДНК используют продукты реакции обратной транскрипции. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль олигонуклеотида GS_f1, 10 пмоль олигонуклеотида GS_r, 2 мкл реакционной смеси синтеза кДНК, 2 ед. Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»).
Очищенные продукты ПЦР и векторную ДНК pFI обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SalI и BamHI. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержит 2× буфер «Tango» («Thermo Fisher Scientific»), продукты ПЦР или 500 нг векторной ДНК pFUSE-I и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции SalI и BamHI. Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 4 часов. Продукты гидролиза очищают и лигируют с использованием ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержит 1× буфер для ДНК лигазы фага Т4, 1 мМ АТФ, лигируемые фрагменты ДНК в молярном соотношении 1:3 (вектор:вставка) и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 2 часов. Продуктами лигирования трансформируют клетки E. coli штамма TOP10. Трансформированные клетки высевают на чашки с селективной агаризованной средой, содержащей 25 мкг/мл зеоцина.
Скрининг колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, проводят с использованием полимеразной цепной реакции. В качестве матричной ДНК используют часть колонии E. coli, ресуспендированной в 5 мкл 1% раствора Тритон Х-100. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 5 ед. Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific») и по 10 пмоль олигонуклеотидов:
SV40 pAd (SEQ ID NO:19) (5`-AACTTGTTTATTGCAGCTT-3`) и
IRES-F (SEQ ID NO:23) (5`-TGGCTCTCCTCAAGCGTATT-3`)
ПЦР проводили в амплификаторе Master Cyclergradient («Eppendorf»). Из положительных колоний выделяют плазмидную ДНК Правильность встраивания фрагмента проверяют секвенированием рекомбинантных векторов. Полученный вектор был обозначен как pFIG (см. Фиг. 2).
Пример 3. Клонирование последовательности экстраклеточного домена TNFR1 в векторе spIg
Получают промежуточный вектор spIg-hTNFr. Для этого в коммерческий вектор signal plus Ig (Ingenius) встраивают элементы: TNFR1 и Fc фрагмент IgG1.
Фрагмент ДНК, кодирующий экстраклеточный домен рецептора фактора некроза опухоли, получают с помощью ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией в присутствии праймеров:
hTNFr_f (SEQ ID NO:13) 5`-CGGAAGCTTATGGGCCTCTCCACCGTGC-3`и
hTNFr_r (SEQ ID NO:14) 5`-ATCCTCGAG AACATTCTCAATCTGGGGTAGGCAC-3`.
В качестве матрицы используют тотальную РНК лейкоцитов человека.
Реакцию обратной транскрипции проводят в 20 мкл смеси, содержащей 1× буфер для обратной транскриптазы («Thermo Fisher Scientific»), 0,5 мМ дНТФ, 100 пмоль олигонуклеотида oligo(dT)18, 5 мкг образца тотальной РНК, 20 ед. ингибитора РНКаз «RiboLock RNase Inhibitor» («Thermo Fisher Scientific»), 50 ед. обратной транскриптазы «Maxima H Minus Reverse Transcriptase» («Thermo Fisher Scientific»). Реакцию синтеза кДНК проводят при 50 °C в течение 30 мин. Реакцию останавливали прогреванием реакционной смеси при 85 °С в течение 5 минут.
ПЦР проводили в смеси объемом 25 мкл содержащую 1× буфер для Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль олигонуклеотида hTNFr_f, 10 пмоль олигонуклеотида hTNFr_r, 2 мкл реакционной смеси синтеза кДНК, 2 ед. Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»).
Очищенные продукты ПЦР и векторную ДНК spIg (Ingenius) обрабатывают эндонуклеазами рестрикции HindIII и XhoI. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержит 1× буфер «R» («Thermo Fisher Scientific»), продукты ПЦР или 500 нг векторной ДНК spIg и по 10 ед. эндонуклеаз рестрикции HindIII и XhoI. Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 4 часов. Продукты гидролиза очищают с помощью набора «GeneJET PCR Purification Kit» («Thermo Fisher Scientific»).
Обработанные фрагменты ДНК эндонуклеазами рестрикции лигируют с использованием ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержит 1× буфер для ДНК лигазы фага Т4, 1 мМ АТФ, лигируемые фрагменты ДНК в молярном соотношении 1:3 (вектор: вставка) и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 2 часов. Продуктами лигирования трансформируют клетки E. coli штамма TOP10. Трансформированные клетки высевают на чашки с селективной агаризованной средой, содержащей 100 мкг/мл ампициллина.
Скрининг колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, проводят с использованием полимеразной цепной реакции. В качестве матричной ДНК используют часть колонии E. coli, ресуспендированной в 5 мкл 1% раствора Тритон Х-100. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 5 ед. Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific») и по 10 пмоль олигонуклеотидов:
T7pr (SEQ ID NO:15) 5`-ATTAATACGACTCACTATAGGGA-3` и
hFc_f (SEQ ID NO:16) 5`-GGGAGATCATGAGGGTGT-3`.
Из положительных колоний выделяют плазмидную ДНК. Правильность встраивания фрагмента проверяют секвенированием рекомбинантных векторов. Полученный промежуточный вектор был обозначен как spIg-hTNFr. Структурная схема вектора spIg-hTNFr приведена на фиг. 3
Пример 4. Конструирование плазмидного вектора pFIG-hTNFr, кодирующего химерный белок
В промежуточый вектор pFIG был введен фрагмент ДНК, кодирующий последовательность лидерной последовательности CD33 и TNFR1.
Для этого фрагмент проводили ПЦР с использованием олигонуклеотидов:
pFI_f (SEQ ID NO:24) 5`-GACAAAACTCACACATGCCCACC-3` и
pFI_r (SEQ ID NO:25) 5`-TGCTAGAGCTCCAGATATCGAATTCAC-3`
и плазмиды pFIG в качестве матричной ДНК. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для KOD Hot Start DNA Polymerase («Novagen»), 1,5 мМ MgSO4, 0,2 мМ раствор дНТФ, 0,3 мкМ олигонуклеотид pFI_f, 0,3 мкМ олигонуклеотид pFI_r, 5 нг векторной ДНК pFIG, 0,02 ед/мкл KOD Hot Start DNA Polymerase.
Фрагмент ДНК, кодирующий лидерную последовательность CD33 и TNFR синтезировали с помощью ПЦР. Для этого использовали олигонуклеотиды:
sp_f (SEQ ID NO:26) 5`-ACTATAGGGAGCTCCAAGCTGCTTC-3`,
фосфорилированного по 5`-концу и
sp_r (SEQ ID NO:27) Р5`-ACCACCACCACCACCACGAC-3`
и вектор spIg-hTNFr в качестве матричной ДНК. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1× буфер для Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль олигонуклеотида sp_f, 10 пмоль олигонуклеотида sp_r, 1 нг векторной ДНК spIg-hTNFr, 2 ед. Pfu ДНК полимеразы («Thermo Fisher Scientific»).
Очищенные продукты ПЦР обрабатывают эндонуклеазой рестрикции SacI. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержит 1× буфер «Buffer SacI» («Thermo Fisher Scientific»), продукты ПЦР и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SacI. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение 4 часов.
Обработанные фрагменты ДНК эндонуклеазами рестрикции лигируют с использованием ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 1× буфер для ДНК лигазы фага Т4, 1 мМ АТФ, лигируемые фрагменты ДНК в молярном соотношении 1:3 (вектор:вставка) и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4 («Thermo Fisher Scientific»). Реакционную смесь инкубируют при 37 °С в течение 2 часов. Продуктами лигирования трансформируют клетки E. coli штамма TOP10. Трансформированные клетки высевают на чашки с селективной агаризованной средой, содержащей 25 мкг/мл зеоцина.
Скрининг колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды, проводят с использованием полимеразной цепной реакции. В качестве матричной ДНК используют часть колонии E. coli, ресуспендированной в 5 мкл 1% раствора Тритон Х-100. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1× буфер для Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific»), 0,2 мМ дНТФ, по 10 пмоль олигонуклеотидов
HTLV5`UTR (SEQ ID NO:28) (5`-TGCTTGCTCAACTCTACGTC-3`) и
hFc_f (SEQ ID NO:16) (5`-GGGAGATCATGAGGGTGT-3`)
и 5 ед. Taq DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific»). ПЦР проводят в амплификаторе Master Cyclergradient («Eppendorf»). Из положительных колоний выделяют плазмидную ДНК. Правильность встраивания фрагмента проверяют секвенированием рекомбинантных векторов. Полученный вектор был обозначен как pFIG-hTNFr.
Пример 5. Конструирование вектора, кодирующего микроРНК
Вектор, кодирующий микроРНК miR7 получают путем интегрирования фрагмента кодирующего miR7 в плазмиду psiRNA-h7SK (Invivogen) по сайту эндонуклеазы Bbs I.
Для этого синтезируют одноцепочечные фрагменты ДНК, кодирующие miR7. Дизайн фрагментов был выполнен в соответствии с рекомендациями производителя вектора (Invivogen).
7-1 (SEQ ID NO:29) 5' ACCTCTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTTCAAGAG ACAACAAAATCACTAGTCTTCCATT 3'
7-2 (SEQ ID NO:30) 5' CAAAAATGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTCTCTTGAAC AACAAAATCACTAGTCTTCCAG 3'
Реакцию отжига олигонуклеотидов проводят в смеси следующего состава: олигонуклеотид 1 (25 мкМ) - 2 мкл; олигонуклеотид 2 (25 мкМ) - 2 мкл; 0.5 M NaCl - 6 мкл; H2O - 20 мкл. Смесь инкубируют в микропробирке Эппендорф на водяной бане в течение 2 мин при 80 °C , затем прекращают нагревание и инкубируют смесь в бане до тех пор, пока температура не достигла 35 °C.
Вектор линеаризируют с помощью эндонуклеазы рестрикции Bbs I (Производитель NEB), в соотношении 2 ед/мкг плазмидной ДНК в течение 2 ч при 37 °C. Разделяют смесь с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. Окрашивают гель 0,005% раствором бромистого этидия. Выделяют большой фрагмент (2945 п.н.) из геля с помощью набора «GeneJET Gel Extraction Kit» («Thermo Fisher Scientific»). Определяют концентрацию и разводят деионизованной водой до конечной концентрации 0.1 мкг/мкл. Для лигирования плазмиды и полученных фрагментов ДНК готовят смесь следующего состава: линеаризованная psiRNA - 1 мкл (100 нг), фрагмент siRNA - 1 мкл, T4 ДНК лигаза - 1 мкл (1 ед), десятикратный буфер для лигирования - 2 мкл, H2O - 15 мкл. Инкубируют смесь при 22 °C в течение 2 часов. Затем продуктами лигирования трансформируют клетки E. coli штамм GT116 sbcCD. Инокулируют единичной колонией 2 мл среды LB и инкубируют 16 ч при 37°C с помощью термостатируемого шейкера. Вносят 20 мкл ночной культуры в 2 мл среды LB. Инкубируют клетки при 37°С при интенсивном перемешивании до концентрации 5·107 кл/мл (0,5 ОЕ). Клетки охлаждают во льду в течение 5-10 мин и центрифугировали (6000 g, 1 мин). Ресуспендируют в 600 мкл 0,1 М раствора СаС12 и охлаждают на льду 20 мин. Осаждают клетки центрифугированием (6000 g,, 1 мин) и ресуспендируют клеточный осадок в 180 мкл 0,1 М раствора СаСl2. Добавляли 1мкг лигазной смеси. Инкубируют на льду 30 мин. После этого термостатируют 30 с при 42°С и охлаждают 15 мин. После добавления 800 мкл LB инкубируют 90 мин при 37°С. Центрифугируют при 6000 g в течение 1 мин. Удаляют 800 мкл супернатанта, осадок ресуспендировали в оставшейся среде и переносят на поверхность чашки с агаризованной LB средой с канамицином (25 мкг/мл), ИПТГ, XGal. Инкубируют при 37°С в течение 16 ч. Переносят клетки из трех белых колоний в 5 мл LB с канамицином и инкубируют при 37°С в течение 16 ч при постоянном перемешивании. Выделяют плазмидную ДНК с помощью коммерческого набора «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Fisher Scientific») согласно рекомендациям производителя.
Пример 6. Получение культуры-суперпродуцента
Культуру-продуцента рекомбинантного TNFR-Fc получают путем последовательной трансфекции векторами pFIG-hTNFR и psiRNA-h7SK-miR7.
Для трансфекции используют культуру клеток HEK293F (Invivogen). После размораживания клетки культивируют в среде FreeStyle™ 293 в течение 3 суток при 37°C и 5% CO2 при постоянном перемешивании со скоростью 125 об/мин. Затем клетки адаптируют к среде Гибрис (ПанЭко) в течение 7 сут.
Плазмиды (из расчета1 мкг на 106 клеток) переосаждают с помощью хлорида лития и этилового спирта в течение 16 ч при минус 20°C. Трансфекцию проводят с помощью липагента FreeStyle™ MAX Reagent. Затем клетки культивируют в течение 24 ч при 37°C и 5% CO2. Подсчитывают количество клеток в камере Горяева и оценивают жизнеспособность по окрашиванию красителем трипановым синим.
Готовят суспензию клеток (60 тыс. клеток/мл) в среде Гибрис, содержащей зеоцин в концентрации 400 мкг/мл. Вносят по 100 мкл суспензии клеток в лунки трех 96-луночных планшетов. Помещают в CO2 инкубатор и культивируют в течение 2-3 недель в условиях 37°C и 5% CO2. В процессе культивирования каждые 3-4 дня производят замену среды. После завершения селекции оценивают продуктивность клеток. Для этого в планшетах заменяют среду на Гибрис без зеоцина. Культивируют клетки в течение 24 часов. Затем центрифугируют планшеты при 400 g в течение 10 мин при 37°C.
В лунки трех 96-луночных планшетов для иммуноферментного анализа вносят рекомбинантный человеческий TNF в количестве 100 нг/лунку. После блокирования свободной поверхности лунок 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ФСБ добавляют по 100 мкл культуральной среды каждого клона и инкубируют 1 ч при 37°C. После тщательной промывки ФСБ с 0.05% Твин-20 в лунки вносят антитела, специфичные к Fc фрагмента иммуноглобулина G человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (BioRad) в разведении 1:5000. Инкубируют планшеты при 37 °С в течение 1 ч. Затем планшеты промывают ФБР-Т и проявляют реакцию с помощью субстратного раствора (0,7 мг/мл ортофенилендиамин (ОФД), 0,02% Н2О2, 0,1 М цитрат-фосфатный буфер, рН 5,0). Реакцию останавливают 1 М серной кислотой и определяют оптическую плотность в каждой лунке при 490 нм (бланк или нулевое считывание по воздуху), используя фотометр для микропланшетов.
По результатам исследования были выбраны две лунки с наибольшим сигналом. Клетки из каждой лунки суспендируют в среде Гибрис содержащей зеоцин в концентрации 200 мкг/мл (5 кл/мл). По 100 мкл суспензии клеток переносят в лунки 96-луночного планшета. Помещают в CO2 инкубатор и культивируют в течение 2-3 недель в условиях 37°C и 5% CO2. Отмечают лунки с единичными клонами и оценивают продуктивность клеток, как описано выше. Выбирают клон с наибольшей продуктивностью.
Затем клетки ресуспендируют в среде Гибрис без глутамина. Вносят по 500 мкл суспензии (1/2 кл/лун) в лунки четырех 96-луночных планшетов. Добавляют в лунки концентрированный раствор метионинсульфоксимина до конечной концентрации 1 мМ. Инкубируют в течение 2 недель, каждые три дня заменяли среду на новую. Тестируют клетки с помощью ИФА, как описано выше. По результатам анализа выбрают клон с наибольшей продуктивностью.
Для дополнительного увеличения продуктивности клетки выбранного клона были трансфицированы вектором psiRNA-h7SK-miR7, как описано выше для плазмиды pFIG-hTNFR. Для получения стабильных трансфектантов проводят селекцию клеток, трансфицированных psiRNA-h7SK-miR7 в среде Гибрис, содержащей генетицин (Производитель Gibco) в концентрации 600 мкг/мл. Процедура селекции аналогична приведенной ранее для зеоцина. Продуктивность клонов была проанализирована с помощью иммуноферментного анализа. Был выбран клон с наибольшими значениями специфического ИФА-сигнала.
Пример 7. Наработка белка
Клетки в начальной плотности 4×106 кл/мл инкубируют в среде Гибрис-1-293 (ПанЭко) в течение 10 сут при 37°C и 5% CO2 при постоянном перемешивании со скоростью 125 об/мин, каждые трое суток производят замену ¼ части среды. Среду культивирования объединяют и выделяют рекомбинантный TNFR1-Fc с помощью аффинной хроматографии на белок G сефарозе (Amersham). Колонки объемом 5 мл уравновешивали рабочим буфером, содержащим 25 мМ трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl. Супернатанты пропускают через колонку со скоростью 1 мл/мин. После промывки колонки рабочим буфером (10 V колонки) белок элюировали 0,1М раствором глицина pH 2,5 в пробирки, содержащие 100 мМ раствор трис-HCl, pH 9,0.
Концентрацию белка определяют спектрометрическим методом по поглощению света при длине волны 280 нм.
Очищенный рекомбинантный TNFR1-Fc анализируют с помощью ДСН-ПААГ электрофореза по Laemmli в 12% геле. В белковые препараты добавляют 2× буфер для образцов (1:1), содержащий 2% ДСН и 0,7М меркаптоэтанол и денатурировали образцы 7 мин при 99оС в твердотельном термостате. Пять мкл. образцов вносили в лунки геля ДСН-ПААГ с последующей постановкой электрофореза при силе тока 20 мА до достижения фронта красителя окончания геля. После разделения гель окрашивают с использованием раствора Кумасси G-250.
Для определения олигомерного статуса TNFR1-Fc анализируют с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Рекомбинантный белок растворяют в 10 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,4, содержащим 150 мМ NaCl до конечной концентрации 0,3 мг/мл. На колонку Superdex™ 200 Tricorn 10/300 (GE Healthcare) наносят 100 мкл образца, содержащего 30 мкг рекомбинантного белка. Скорость элюции поддерживают равной 1 мл/мин. Регистрацию оптической плотности элюента осуществляют при длине волны 280нм.
В результате тестирования было показано, что в указанных условиях культивирования выход белка составляет 100±10 мг/л. В препарате очищенного белка TNFR1-Fc присутствует в виде олигомера.
Пример 8. Определение активности рекомбинантного TNFR1-Fc
Активность рекомбинантного TNFR1-Fc оценивают по способности ингибировать цитотоксическое действие ФНО на клетки линии L929.
В лунки 96-луночного планшета вносят по 200 мкл суспензии клеток L929 в среде DMEM c 10% эмбриональной телячьей сывороткой (50 тыс. кл/лун) и культивировали при 37°C и 5% CO2 до достижения 80% конфлюэнтности. В лунки планшета добавляли раствор ФНО до конечной концентрации 100 нг/мл (контроль) или смесь ФНО (100 нг/мл) и TNFR-Fc (100, 200, 300 нг) или смесь ФНО и Fc и инкубировали в течение 24 ч. Затем лунки промывают забуференным физиологическим раствором и вносят по 50 мкл 0,1% раствора нейтрального красного. Инкубируют в течение 20 мин при 37°C. Краситель удаляют и промывают лунки трижды забуференным физиологическим раствором. Вносят в лунки по 100 мкл 0,1% раствора додецилсульфата натрия. После растворения красителя определяют оптическую плотность в каждой лунке при 490 нм (бланк или нулевое считывание по воздуху), используя фотометр для микропланшетов.
В результате тестирования было установлено, что рекомбинантный TNFR1-Fc обладает ингибирующей активностью в отношении фактора некроза опухоли in vitro.
Промышленная применимость
В настоящем изобретении предлагается новый экспрессионный вектор для наработки биологически активного белка TNFR1-Fc. Экспрессируемый белок является водорастворимым, что позволяет существенно упростить процедуру его выделения.
Высокая эффективность вектора, позволяет использовать его при производстве препаратов-ингибиторов фактора некроза опухоли.
Перечень источников информации
1. SHAALTIEL Y. et al. TNF alpha INHIBITOR POLYPEPTIDES, POLYNUCLEOTIDES ENCODING SAME, CELLS EXPRESSING SAME AND METHODS OF PRODUCING SAME. Заявка на патент США № US20160017021 (2016-01.21).
2. Lazar G. A. et al. OPTIMIZED Fc VARIANTS. Заявка на патент США № US20150315284 (2015-05-11).
3. JACOBS C.A. et al. Methods of lowering active TNF- alpha levels in mammals using tumor necrosis factor receptor. Патент США № US5605690 (1997-02-25).
4. PATELL V. M. AN EXPRESSION VECTOR AND A METHOD THEREOF. Заявка на патент Мексики № MX2011001644 (2011-10-06).
5. XIONG S.X. et al. Gene for coding recombinant human TNFR-Fc fusion protein and application of gene. Патент Китая № CN102911958 (2014-08-06).
6. Франк Л.А. и др. РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pG1-Rm7, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА G1-Rm7, И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СВЯЗЫВАЮЩИЙ ФАКТОРНЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ И ОБЛАДАЮЩИЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ. Патент РФ № 2513686 (27.02.2014).
7. Шмелев В.А., Чумбуридзе Г.Г. РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОРНЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-ТИМОЗИН-α1 . Патент РФ № 2225443 (10.03.2004).
8. Батанова Т.А. и др. РЕКОМБИНАНТНАЯ ФАГМИДНАЯ ДНК pHEN-TAB, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНОГО СВЯЗЫВАТЬ ФАКТОРНЕКРОЗА ОПУХОЛИАЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРАНЕКРОЗА ОПУХОЛИАЛЬФА ЧЕЛОВЕКА; РЕКОМБИНАНТНОЕ РАСТВОРИМОЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ФАКТОРАНЕКРОЗА ОПУХОЛИАЛЬФА ЧЕЛОВЕКА. Патент РФ № 2307163 (27.03.2007).
9. BROCKHAUS M. G. et al. Human TNF receptor fusion protein . Патент США № US8063182 (2011-11-22).
10. FINCK B.K. SOLUBLE TUMOR NECROSIS FACTOR RECEPTOR TREATMENT OF MEDICAL DISORDERS. Патент США № US8722631 (2014-05-13).
11. BROWNING J. et al. METHOD FOR THE HIGH LEVEL EXPRESSION OF ACTIVE LYMPHOTOXIN-BETA RECEPTOR IMMUNOGLOBULIN CHIMERIC PROTEINS AND THEIR PURIFICATION. Патент США № US8283138 (2012-10-09).
12. WON H. S. et al. METHOD FOR PREPARING ACTIVE FORM OF TNFR-FC FUSION PROTEIN . Патент США № US9279014 (2016-03-08).
13. HILDINGER M. USE OF VALPROIC ACID FOR ENHANCING PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS IN MAMMALIAN CELLS . Заявка на патент США № US2009023186 (2009-01-22).
14. ХСИЕХ Чунг-Минг УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ВЕКТОРЫ ЭКСПРЕССИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ. Патент РФ№2502800 (27.02.2012).
15. Trizina J.A. et al. Overexpression of Mir-7 has an impact on HEK 293 growth and recombinant protein productivity. 8th International Scientific Conference Science and Society London 24-29 November 2015 p51-60.
Claims (9)
1. Экспрессионный плазмидный вектор pFIG-hTNFr, для экспрессии активной формы рекомбинантного белка TNFR1-Fc в клетках HEK293, обладающий свойством экспрессионной кассеты в указанных клетках, где указанный плазмидный вектор с физической картой, представленной на фиг.5, имеет размер 6674 п.о., молекулярную массу 4,40484 MДа, уникальные сайты рестрикции: Acc65I, AgeI, AhdI, ApaBI, AsiSI, BbeI, BglII, BspEI, BspHI, BssHII, BstAPI, BstZ17I, ClaI, EcoICRI, EcoRI, FalI, FseI, HpaI, KasI, KpnI, NarI, NcoI, NdeI, PflMI, PsiI, PvuI, SacI, SalI, SanDI, SbfI, ScaI, SciI, SfoI, SnaBI, SpeI, SphI, SspI, XbaI, XcmI, XhoI, промоторы: эукариотический промотор фактора элонгации 1α (EF-1α), промотор гена легкой цепи ферритина человека (hFerL), бактериальный промотор EM2KC, энхансеры: R сегмент и часть U5 последовательности длинного концевого повтора типа 1 вируса Т-клеточной лейкемии человека, энхансер раннего гена 1 цитомегаловируса человека, где в состав экспрессионной кассеты входит нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 1, которая содержит:
а) последовательность, кодирующую рекомбинантный белок TNFR1-Fc с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, представленной на фиг. 6б.
б) последовательность E/Р (SEQ ID NO:3) энхансера вируса Т-клеточной лейкемии человека и промотора фактора элонгации 1;
в) последовательность SP (SEQ ID NO:5), кодирующую сигнальный пептид CD33;
е) последовательность IRES (SEQ ID NO:10), кодирующую участок внутренней посадки рибосомы вируса энцефаломиокардита;
ж) последовательность GS (SEQ ID NO:12), кодирующую глутаминсинтетазу.
2. Линия клеток HEK293 - продуцентов рекомбинантного белка, последовательно трансфицированная экспрессионным вектором по п. 1 и вектором psiRNA-h7SK-miR7 с физической картой, представленной на фиг. 7.
3. Линия клеток по п. 2, отличающаяся тем, что после последовательной трансфекции линии клеток HEK 293 осуществляют последующую селекцию клеток с помощью метионинсульфоксимина.
4. Способ получения гибридного белка TNFR1-Fc, включающий культивирование линии клеток HEK293 по п. 2, последовательно трансформированных введением экспрессионного плазмидного вектора pFIG-hTNFr, кодирующего синтез активного рекомбинантного белка TNFR1-Fc и дополнительно введенного в клетки вектора psiRNA-h7SK-miR7, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка TNFR1-Fc.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016144163A RU2625010C1 (ru) | 2016-11-10 | 2016-11-10 | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016144163A RU2625010C1 (ru) | 2016-11-10 | 2016-11-10 | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2625010C1 true RU2625010C1 (ru) | 2017-07-11 |
Family
ID=59495062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016144163A RU2625010C1 (ru) | 2016-11-10 | 2016-11-10 | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2625010C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689522C1 (ru) * | 2018-09-11 | 2019-05-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA018723B1 (ru) * | 2007-06-06 | 2013-10-30 | Домантис Лимитед | Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты |
-
2016
- 2016-11-10 RU RU2016144163A patent/RU2625010C1/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA018723B1 (ru) * | 2007-06-06 | 2013-10-30 | Домантис Лимитед | Полипептиды, вариабельные домены антител и антагонисты |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| TRIZNA J.A. et al., OVEREXPRESSION OF MIR-7 HAS AN IMPACT ON HEK 293 GROWTH AND RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTIVITY, 8TH INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE SCIENCE AND SOCIETY24-29 NOVEMBER 2015 LONDON, SCIEURO, 2015, n.3, p.51-60. * |
| TRIZNA J.A. et al., OVEREXPRESSION OF MIR-7 HAS AN IMPACT ON HEK 293 GROWTH AND RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTIVITY, 8TH INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE SCIENCE AND SOCIETY24-29 NOVEMBER 2015 LONDON, SCIEURO, 2015, n.3, p.51-60. БД "GenBank", последовательность под номером AGF25094.1, размещена 12.02.2013. * |
| БД "GenBank", последовательность под номером AGF25094.1, размещена 12.02.2013. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689522C1 (ru) * | 2018-09-11 | 2019-05-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2023527927A (ja) | 新型コロナウイルス（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）スパイクタンパク質結合分子及びその使用 | |
| JP2013509867A5 (ru) | ||
| US20050158829A1 (en) | Fusion polypeptides capable of activating receptors | |
| EP2646606B1 (en) | Surface-anchored fc-bait antibody display system | |
| JP6748061B2 (ja) | 二重シストロン細菌発現システム | |
| PT2606064E (pt) | Processos para a geração de anticorpos poliespecíficos e polivalentes | |
| US10125373B2 (en) | Geminiviral vector for expression of rituximab | |
| KR20160003705A (ko) | 발현 방법 | |
| TW201726706A (zh) | 胜肽標記及含有其之附加標記的蛋白質 | |
| CN104829729B (zh) | 一种携带抗Her2/CD3双特异性功能蛋白的人T细胞制备 | |
| CN111349159A (zh) | 一种抗人血清白蛋白的纳米抗体及其应用 | |
| RU2625010C1 (ru) | Экспрессионный плазмидный вектор для экспрессии активной формы TNFR1-Fc и способ получения рекомбинантного белка | |
| EP1678308B1 (en) | Expression vector for secreting antibody fragment using e. coli signal sequence and method for mass-producing antibody fragment | |
| CN119241730B (zh) | 一种分泌il10靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞和应用 | |
| CN109266674B (zh) | 一种人源四次跨膜超家族蛋白12的大胞外片段tspan12-lel制备方法 | |
| JP2022537333A (ja) | 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって多価の多重特異性抗体発現細胞を作製するための方法 | |
| Magistrelli et al. | Chemokines derived from soluble fusion proteins expressed in Escherichia coli are biologically active | |
| WO1993008300A1 (en) | Expression-secretion vectors for the production of biologically active fv fragments | |
| JP7727711B2 (ja) | 抗体－多量体融合物の発現のための方法 | |
| CN117402885A (zh) | 编码泽贝妥单抗的核酸分子及其应用 | |
| CN106661117B (zh) | IgG杂合型抗TNFα和IL-17A双特异性抗体 | |
| US11104721B2 (en) | Surface, anchored FC-bait antibody display system | |
| EP3702495A1 (en) | Antibody like protein | |
| JP4287151B2 (ja) | 組換えタンパク質の翻訳及び発現を増強するための方法 | |
| RU2562857C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCL2h-1I1G, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCH2g-1I1G, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18, И РЕКОМБИНАНТНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА fh1I1G, ОБЛАДАЮЩЕЕ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ИНТЕРЛЕЙКИН-18 |