RU2624022C1

RU2624022C1 - Modified ras gene of escherichia coli bacterium, coding precursor of enzyme with penicillin g acylase activity, recombinant escherichia coli strain - producer of acylase penicillin g and method for microbiological synthesis of this enzyme

Info

Publication number: RU2624022C1
Application number: RU2015149927A
Authority: RU
Inventors: Михаил Анатольевич Эльдаров; Анна Владимировна Скляренко; Мария Владимировна Думина; Дженни Эрнстовна Сатарова; Александр Александрович Жгун; Наталья Викторовна Медведева; Сергей Викторович Яроцкий
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2017-06-30

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: nucleotide sequence of the gene is represented in SEQ ID NO: 17. This gene codes the precursor of penicillin G acylase enzyme consisting of the amino acid sequence of the signal peptide L-asparaginase Erwinia carotovora and structural elements of acylase penicillin G E.coli. The present invention also relates to a recombinant strain of E.coli BL21 (DE3)/pMD704. This strain is a producer of penicillin G acylase. The strain was obtained by introducing said modified ras gene within pSVH0107 vector into the recipient strain E.coli BL21 (DE3). The invention also relates to the process of microbiological synthesis of penicillin G acylase. The method includes the cultivation of E.coli BL21 (DE3)/pMD704 strain under suitable conditions.

EFFECT: invention allows obtaining Penicillin G acylase enzyme with a high activity.

3 cl, 5 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается получения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента пенициллин G ацилазы путем введения в штамм-реципиент модифицированного гена рас в составе рекомбинантной плазмидной ДНК и разработки способа микробиологического синтеза продуцента пенициллин G ацилазы.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering, and for the production of a recombinant strain of Escherichia coli - producer of penicillin G acylase by introducing a modified race gene into the recipient strain as part of recombinant plasmid DNA and developing a method for microbiological synthesis of the producer of penicillin G acylase.

Фермент пенициллин G ацилазу (PGA) широко используют в промышленности в качестве биокатализаторов для гидролиза пенициллина G до 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК), которая является ключевым предшественником для синтеза β-лактамных антибиотиков [1-4], которые занимают доминирующее место на рынке системных антибиотиков [5, 6]. PGA также широко используют для ферментативного синтеза широко применяемых цефалоспориновых антибиотиков [7-9]. Несомненный практический интерес представляет усовершенствование известных способов получения ферментов, необходимых для синтеза этих антибиотиков, в частности с помощью технологий рекомбинантных ДНК.The enzyme penicillin G acylase (PGA) is widely used in industry as biocatalysts for the hydrolysis of penicillin G to 6-aminopenicillanic acid (6-APA), which is a key precursor for the synthesis of β-lactam antibiotics [1-4], which occupy a dominant position on systemic antibiotic market [5, 6]. PGAs are also widely used for the enzymatic synthesis of widely used cephalosporin antibiotics [7–9]. Of undoubted practical interest is the improvement of the known methods for producing enzymes necessary for the synthesis of these antibiotics, in particular using recombinant DNA technologies.

Пенициллин G ацилазы представляют собой гетеродимеры, состоящие из 2-х альфа и 2-бета- субъединиц [9], которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника.Penicillin G acylases are heterodimers consisting of 2 alpha and 2 beta subunits [9], which are formed from a single chain polypeptide precursor.

Известны первичные структуры генов, кодирующих предшественники ферментов с активностью пенициллин G ацилазы из различных бактерий, в частности ген рас, кодирующий предшественник пенициллин G ацилазы из бактерии E. coli (ECOPGA) [7].The primary structures of genes encoding precursors of enzymes with penicillin G acylase activity from various bacteria are known, in particular, the race gene encoding penicillin G acylase precursor from E. coli bacteria (ECOPGA) [7].

Общими недостатками известных методов гетерологичной экспрессии PGA являются невысокий уровень синтеза рекомбинантного продукта [10-12], сложности процессов масштабирования ферментации штаммов [13], накопление телец включения и непроцессированного предшественника, что в свою очередь приводит к замедлению роста штаммов, их лизису, высвобождению синтезированной PGA в среду культивирования [14-18].Common disadvantages of the known methods for heterologous PGA expression are the low level of synthesis of the recombinant product [10-12], the complexity of the processes for scaling the fermentation of strains [13], the accumulation of inclusion bodies and an unprocessed precursor, which in turn leads to a slowdown in the growth of strains, their lysis, and the release of synthesized PGA in the culture medium [14-18].

Устранение указанных недостатков может быть достигнуто на пути разработки новых систем экспрессии пенициллин G-ацилазы, обеспечивающих повышение выхода функционально-активного фермента [19], в том числе за счет модификации сигнального пептида PGA, играющего важную роль в транслокации функционально-активного фермента из цитоплазмы в периплазму с участием Sec-системы E. coli [15, 20-23].The elimination of these drawbacks can be achieved by developing new systems for the expression of penicillin G-acylase, which increase the yield of the functionally active enzyme [19], including by modifying the signal peptide PGA, which plays an important role in translocation of the functionally active enzyme from the cytoplasm into periplasm with the participation of the Sec-system of E. coli [15, 20-23].

В качестве ближайшего аналога заявляемого штамма рассмотрим штамм-продуцент ECOPGA E. coli JM109(DE3) (pETKn29a, pARDegP), а в качестве ближайшего аналога заявляемого способа - способ получения ECOPGA с помощью указанного продуцента, обеспечивающий синтез целевого фермента с активностью 0,94 ME на мл культуры [10]. Удельная активность ECOPGA составляет 0,45 МЕ/мл на 1 ОД (оптических единиц). Эти штамм и способ его культивирования не позволяют достичь высокой плотности культуры.As the closest analogue of the claimed strain, we consider the producer strain of ECOPGA E. coli JM109 (DE3) (pETKn29a, pARDegP), and as the closest analogue of the claimed method is a method for producing ECOPGA using the specified producer, providing synthesis of the target enzyme with an activity of 0.94 ME per ml of culture [10]. The specific activity of ECOPGA is 0.45 IU / ml per 1 OD (optical units). These strain and its cultivation method do not allow to achieve a high density culture.

Задача заявляемой группы изобретений - расширение арсенала способов микробиологического синтеза ECOPGA.The task of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of methods for microbiological synthesis of ECOPGA.

Задача решена путем:The problem is solved by:

- конструирования модифицированного гена рас бактерии Escherichia coli, кодирующего предшественник фермента с активностью пенициллин G ацилазы [(ans) ECOPGA] и соответствующего последовательности SEQ ID N17, часть которого, кодирующая природную сигнальную последовательность ECOPGA, заменена на фрагмент, кодирующий сигнальную последовательность секреции фермента L-аспарагиназы Erwinia carotovora;- constructing a modified gene of the bacterium Escherichia coli encoding an enzyme precursor with penicillin G acylase activity [(ans) ECOPGA] and the corresponding sequence SEQ ID N17, a part of which encoding the natural ECOPGA signal sequence has been replaced by a fragment encoding the signal sequence for the secretion of the L- enzyme Erwinia carotovora asparaginase;

- конструирования рекомбинантного штамма E. coli BL21(DE3)/pMD704 - продуцента ECOPGA, полученного путем введения заявляемого модифицированного гена рас в составе вектора pSVH0107 в штамм-реципиент Escherichia coli BL21 (DE3;- the construction of a recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pMD704 - producer of ECOPGA, obtained by introducing the inventive modified race gene in the vector pSVH0107 in the recipient strain Escherichia coli BL21 (DE3;

- разработки способа микробиологического синтеза ECOPGA путем культивирования заявляемого штамма-продуцента в подходящих условиях.- development of a method of microbiological synthesis of ECOPGA by culturing the inventive producer strain under suitable conditions.

Для этого:For this:

а) из штамма E. coli ВКПМ В-10182 выделен ген рас, кодирующий ECOPGA;a) a race gene encoding ECOPGA was isolated from E. coli strain VKPM B-10182;

б) получен модифицированный ген рас, в котором последовательность, кодирующая природную сигнальную последовательность секреции ECOPGA, заменена на последовательность, кодирующую сигнальную последовательность секреции L-аспарагиназы Erwinia carotovora;b) a modified race gene is obtained in which the sequence encoding the natural signal sequence for ECOPGA secretion is replaced by the sequence encoding the signal sequence for Erwinia carotovora L-asparaginase secretion;

в) сконструирована рекомбинантная плазмида pMD704, полученная путем введения модифицированного гена рас в вектор экспрессии pSVH0107 [24];c) a recombinant plasmid pMD704 was constructed, obtained by introducing a modified race gene into the expression vector pSVH0107 [24];

г) в результате трансформации плазмидой pMD704 клеток реципиентного штамма Е. соli BL21(DE3) получен рекомбинантный штамм E. coli BL21(DE3)/pMD704, который при культивировании заявляемым способом позволяет получать целевой фермент с выходом более чем в 5 раз превышающим продукцию фермента, полученного с использованием способа - ближайшего аналога.g) as a result of transformation of plasmid pMD704 cells of the recipient strain E. coli BL21 (DE3), a recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pMD704 was obtained, which, when cultured by the claimed method, allows to obtain the target enzyme with a yield of more than 5 times the production of the enzyme, obtained using the method is the closest analogue.

Выбор сигнальной последовательности секреции L-аспарагиназы Erwinia carotovora (SIGANS) [25] обусловлен тем, что эта последовательность является типичным secB-зависимым сигнальным пептидом для системы секреции 2 типа, и, в отличие от природной сигнальной последовательности ECOPGA, не содержит аминокислотных остатков с объемными боковыми группами, что облегчает процесс транспорта синтезированного (экспрессированного) белка в периплазму штаммов-продуцентов [7].The choice of the signal sequence for the secretion of L-asparaginase Erwinia carotovora (SIGANS) [25] is due to the fact that this sequence is a typical secB-dependent signal peptide for the type 2 secretion system, and, unlike the natural ECOPGA signal sequence, does not contain amino acid residues with bulk lateral groups, which facilitates the transport of synthesized (expressed) protein into the periplasm of producer strains [7].

Полная природная кодирующая последовательность гена рас (SEQ ID №1) получена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК, выделенной из штамма E. coli ВКПМ В-10182, а в качестве праймеров - синтетических олигонуклеотидов с нуклеотидными последовательностями SEQ ID №3 (праймер PGA_F) и SEQ ID №4 (праймер PGA_R). Полученная последовательность немодифицированного гена рас введена в вектор pSVH0107 [24]. В результате получена рекомбинантная плазмида pMD0107 (Пример 2).The complete natural coding sequence of the races gene (SEQ ID No. 1) was obtained by the polymerase chain reaction (PCR) method using chromosomal DNA isolated from E. coli strain VKPM B-10182 as a template, and synthetic oligonucleotides with nucleotide sequences SEQ as primers ID No. 3 (primer PGA_F) and SEQ ID No. 4 (primer PGA_R). The obtained sequence of the unmodified race gene was introduced into the vector pSVH0107 [24]. The result is a recombinant plasmid pMD0107 (Example 2).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую SIGANS (SEQ ID №5), получили сборкой из двух синтетических олигонуклеотидов ansU (SEQ ID №7) и ansD (SEQ ID №8).The nucleotide sequence encoding SIGANS (SEQ ID No. 5) was obtained by assembly of two synthetic oligonucleotides ansU (SEQ ID No. 7) and ansD (SEQ ID No. 8).

Положение участка, кодирующего SIGANS в составе модифицированного гена рас, определено на основании данных о структуре предшественника и зрелой ECOPGA (номера доступа номера доступа в PDB 1Е3А и 1GM7, соответственно), предшественника и зрелой ECAR-LANS (номера доступа в Genbank №ААР92666.3 и PDB 2GVN соответственно).The position of the site encoding SIGANS as part of the modified race gene is determined based on the structure of the predecessor and mature ECOPGA (access numbers of access numbers in PDB 1E3A and 1GM7, respectively), the predecessor and mature ECAR-LANS (access numbers in Genbank No. AAAR92666.3 and PDB 2GVN, respectively).

Объединение последовательностей, кодирующих SIGANS (SEQ ID №5) и зрелую ECOPGA проведено в составе вектора pMD0107, обеспечивающего экспрессию не модифицированного гена рас.Combining the sequences encoding SIGANS (SEQ ID No. 5) and mature ECOPGA was performed as part of the vector pMD0107, which provides expression of the unmodified race gene.

Для создания вектора экспрессии модифицированного гена рас, направляющего в клетках Е. coli синтез белка (ans)ECOPGA на основе плазмиды pMD0107, сконструирован промежуточный вектор pMD0107-1, полученный путем удаления сайта SphI в положении 123 SEQ ID №1 и введения дополнительного сайта рестрикции SacI в положении 84 SEQ ID №1, который использован для последующего встраивания последовательности S1GANS между сайтами NdeI и SacI гена рас. Полученная при этом экспрессирующая рекомбинантная плазмида обозначена как pMD704 (Фиг. 2).To create an expression vector of a modified race gene that directs the synthesis of protein (ans) ECOPGA based on plasmid pMD0107 in E. coli cells, an intermediate vector pMD0107-1 was constructed by removing the SphI site at position 123 of SEQ ID No. 1 and introducing an additional SacI restriction site at position 84 of SEQ ID No. 1, which is used for subsequent insertion of the S1GANS sequence between the NdeI and SacI sites of the race gene. The resulting expressing recombinant plasmid is designated as pMD704 (Fig. 2).

Путем трансформации клеток реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) [26] сконструированной плазмидой pMD704, отбора и культивирования клонов трансформантов с высоким уровнем синтеза функционально-активной ECOPGA получен рекомбинантный штамм E. coli BL21(DE3)/pMD704 - продуцент ECOPGA.By transforming the cells of the recipient strain of E. coli BL21 (DE3) [26] with the constructed plasmid pMD704, selecting and culturing clones of transformants with a high level of synthesis of functionally active ECOPGA, a recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pMD704, an ECOPGA producer, was obtained.

Для осуществления микробиологического синтеза ECOPGA заявляемый рекомбинантный штамм культивируют на среде с добавлением лактозы, которая служит как источником углерода, так и индуктором синтеза ECOPGA.To carry out microbiological synthesis of ECOPGA, the inventive recombinant strain is cultured on a medium with the addition of lactose, which serves as both a carbon source and an inducer of ECOPGA synthesis.

Таким образом, сконструированы:Thus constructed:

A) модифицированный ген рас, который кодирует предшественник ECOPGA, состоящий из аминокислотной последовательности сигнального пептида L-аспарагиназы Erwinia carotovora и структурной части ECOPGA штамма E. coli ВКПМ В 10182 и характеризуется нуклеотидной последовательностью SEQ ID №17.A) a modified rac gene that encodes an ECOPGA precursor consisting of the amino acid sequence of the Erwinia carotovora L asparaginase signal peptide and the structural part of the ECOPGA E. coli strain VKPM B 10182 and is characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID No. 17.

B) рекомбинантная плазмида pMD704, обеспечивающая синтез (ans)ECOPGA в клетках E. coli , которая образована вектором pSVH0107, содержащим промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, разделенные участком полилинкера, ген устойчивости к канамицину и ген lас-репрессора, и модифицированным геном рас, встроенным в полилинкерную область указанного вектора.B) a recombinant plasmid pMD704 providing ECOPGA synthesis (ans) in E. coli cells, which is formed by the pSVH0107 vector containing the T7 phage RNA polymerase promoter and terminator separated by a polylinker site, a kanamycin resistance gene and a lac repressor gene, and a modified gene races embedded in the polylinker region of the specified vector.

C) рекомбинантный штамм Е. coli BL21 (DE3)/pMD704 - продуцент ECOPGA.C) Recombinant E. coli strain BL21 (DE3) / pMD704 - producer of ECOPGA.

Заявляемый рекомбинантный штамм Е.соli BL21(DE3)/pMD704 характеризуется следующими признаками.The inventive recombinant E. coli strain BL21 (DE3) / pMD704 is characterized by the following features.

Морфологические признаки: Клетки имеют продолговатую палочковидную форму, при делении не почкуются.Morphological signs: Cells have an elongated rod-shaped shape, do not bud when dividing.

Культуральные признаки:Cultural traits:

Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Время генерации около 30 мин в жидкой LB-среде. На 1,5-2% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность.Cells grow well on commonly used culture media. The generation time is about 30 minutes in a liquid LB medium. On 1,5-2% nutrient agar "Difco" round, smooth, yellowish colonies with smooth edges are formed. When grown on liquid LB and YT media, intense even turbidity forms.

Физиолого-биохимические признаки:Physiological and biochemical signs:

Оптимальная температура культивирования - 20°С, оптимум рН - 7,6. Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта). Уровень активности ECOPGA при культивировании сконструированного штамма заявляемым способом составляет не менее 5 МЕ/мл при выходе влажной биомассы порядка 18 г/л.The optimum cultivation temperature is 20 ° C, and the optimum pH is 7.6. The source of nitrogen is organic compounds (in the form of tryptone, yeast extract). The level of ECOPGA activity during cultivation of the constructed strain by the claimed method is at least 5 IU / ml when the wet biomass yield is about 18 g / l.

Способ микробиологического синтеза в общем видеThe method of microbiological synthesis in General

Посевной материал, представляющий собой клетки заявляемого штамма Е.соli BL21(DE3)/pMD704, подготавливают путем инкубации в течение 20-24 часов при температуре 20-22°С на среде LB, содержащей дополнительно 17 мг/л канамицина. Выросшую культуру переносят в соотношении 1:400 (по объему) в среду ZY5052 [27] содержащую мас. %: энзиматический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, (NH4)₂SO4 -0,33, КН₂РO₄ - 0,68, Na₂HPO₄ - 0,71, глицерин - 0,5, глюкоза - 0,05, лактоза-0,2, MgSO4 - 0,012, вода - остальное. Дополнительно в среду добавляют 50 мг/л канамицина. Процесс культивирования ведут при температуре 20-22°С с аэрацией на качалке (250-300 об/мин). Синтез целевого белка происходит под действием содержащейся в составе среды лактозы по мере исчерпания в процессе роста культуры, входящей в состав среды глюкозы. Биомассу отделяют центрифугированием, промывают фосфатным буфером и повторно осаждают.Inoculum, which is a cell of the inventive strain E. coli BL21 (DE3) / pMD704, is prepared by incubation for 20-24 hours at a temperature of 20-22 ° C in LB medium containing an additional 17 mg / l kanamycin. The grown culture is transferred in a ratio of 1: 400 (by volume) to ZY5052 medium [27] containing wt. %: casein enzymatic hydrolyzate - 1, yeast extract - 0.5, (NH4) ₂ SO4 -0.33, KH ₂ PO ₄ - 0.68, Na ₂ HPO ₄ - 0.71, glycerin - 0.5, glucose - 0.05, lactose-0.2, MgSO4 - 0.012, water - the rest. Additionally, 50 mg / L kanamycin is added to the medium. The cultivation process is carried out at a temperature of 20-22 ° C with aeration on a rocking chair (250-300 rpm). The synthesis of the target protein occurs under the influence of lactose contained in the medium as the culture that is part of the glucose medium is exhausted during the growth process. The biomass is separated by centrifugation, washed with phosphate buffer and reprecipitated.

Уровень синтетазной активности в биомассе клеток составляет не менее чем 1500 МЕ/г влажн., 6000 МЕ/г сух.The level of synthetase activity in the biomass of cells is not less than 1500 IU / g wet., 6000 IU / g dry.

Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами.The claimed group of inventions is illustrated by the following figures.

Фиг. 1 - Сравнение частичных нуклеотидных последовательностей гена PGA штамма ВКПМ В-10182 и ПЦР-фрагмента, выделенного с помощью праймеров PGA_F и PGA_R.FIG. 1 - Comparison of partial nucleotide sequences of the PGA gene strain VKPM B-10182 and PCR fragment isolated using primers PGA_F and PGA_R.

Фиг. 2 - физическая и генетическая карты плазмиды pMD0107. Обозначены положения гена PGA (заполнение черным), сигнального пептида L-аспарагиназы (SIGANS), индикаторных сайтов рестрикции, участков промотора и терминатора РНК-полимеразы фага Т7 (Т7 prom и Т7 term), область начала репликации pBR322 (pBR322 origin), область начала репликации f1 (f1 origin)ген устойчивости к канамицину (обозначен KanR, заполнение черным), гена lас-репрессора.FIG. 2 - physical and genetic maps of plasmid pMD0107. The positions of the PGA gene (black filling), the signal peptide of L-asparaginase (SIGANS), the indicator restriction sites, the promoter and terminator sites of the T7 phage RNA polymerase (T7 prom and T7 term), the region of origin of replication pBR322 (pBR322 origin), the region of origin are indicated replication f1 (f1 origin) gene of resistance to kanamycin (indicated by KanR, black filling), lac repressor gene.

Фиг. 3 - физическая и генетическая карты плазмиды pMD704. Все обозначения - как на Фиг. 2.FIG. 3 - physical and genetic maps of plasmid pMD704. All designations are as in FIG. 2.

Фиг. 4 - Выравнивание N-концевых аминокислотных последовательностей предшественника PGA дикого типа (ECOPGA) и варианта предшественника ECOPGA с сигнальным пептидом L-аспарагиназы (ans)ECOPGA.FIG. 4 - Alignment of the N-terminal amino acid sequences of the wild-type PGA precursor (ECOPGA) and the ECOPGA precursor variant with the ECOPGA L-asparaginase (ans) signal peptide.

Фиг. 5 - Динамика накопления активности ECOPGA (столбцы, основная ось Y) и прироста биомассы (график, дополнительная ось Y) штаммами BL21(DE3)/pMD0107 и BL21(DE3)/pMD704.FIG. 5 - Dynamics of accumulation of ECOPGA activity (columns, main Y axis) and biomass growth (graph, additional Y axis) by strains BL21 (DE3) / pMD0107 and BL21 (DE3) / pMD704.

При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, используют хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [28].When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, methods well-known to those skilled in the art described in the manuals of molecular biology and genetic engineering are used [28].

Пример 1. Выделение немодифицированного гена расExample 1. Isolation of the unmodified race gene

Выделение гена рас, кодирующего предшественник ECOPGA размером 846 а.к.о., проводят на основании известных данных о его кодирующей последовательности, идентифицированной в ходе расшифровки и аннотации геномной последовательности штамма E. coli ВКПМ В- 10182 [29].Isolation of the race gene encoding the 846 a.p.a. ECOPGA precursor is carried out on the basis of known data on its coding sequence identified during decoding and annotation of the genomic sequence of E. coli strain VKPM B-10182 [29].

В качестве матрицы используют хромосомную ДНК штамма E. coli ВКПМ В-10182, а в качестве праймеров - олигонуклеотиды PGA_F (SEQ ID №3) и PGA_R (SEQ ID №4) специфичные к N- и С-концевым кодирующим последовательностям гена рас.The chromosomal DNA of the E. coli strain VKPM B-10182 is used as a matrix, and the oligonucleotides PGA_F (SEQ ID No. 3) and PGA_R (SEQ ID No. 4) specific for the N- and C-terminal coding sequences of the race gene are used as primers.

1 мкг геномной ДНК штамма E. coli ВКПМ В-10182 денатуририруют путем нагревания при 100° в течение 5 минут, помещают в ледяную баню, и подвергают 30 циклам ПЦР с использованием набора Expand Long Template PCR system («Roche Diagnostics GmbH”, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя.1 μg of the genomic DNA of E. coli strain VKPM B-10182 was denatured by heating at 100 ° C for 5 minutes, placed in an ice bath, and subjected to 30 PCR cycles using the Expand Long Template PCR system kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.

Смесь для ПЦР (50 мкл):Mix for PCR (50 μl):

5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера («Roche Diagnostics GmbH");5 μl of 10-fold PCR buffer (Roche Diagnostics GmbH);

5 мкл геномной ДНК (200 нг/мкл);5 μl of genomic DNA (200 ng / μl);

5 мкл 3 мкМ праймера PGA_F5 μl of 3 μM PGA_F primer

5 мкл 3 мкМ праймера PGA_R5 μl of 3 μM PGA_R primer

5 мкл 2 мМ dNTP каждого вида;5 μl of 2 mm dNTP of each type;

25 мкл деионизованной воды; 1 мкл ДНК полимеразы («Roche Diagnostics GmbH").25 μl of deionized water; 1 μl of DNA polymerase ("Roche Diagnostics GmbH").

Условия проведения ПЦР: 94°, 5' (денатурация), 94°, 30''; 50°, 30''; 72°,2' (амплификация).Conditions for PCR: 94 °, 5 '(denaturation), 94 °, 30' '; 50 °, 30``; 72 °, 2 '(amplification).

После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле и выявляют гомогенный фрагмент размером около 2,2 тпн. Фрагмент выделяют из геля с помощью набора Wizard PCR Preps Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя и подвергают автоматическому секвенированию на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с использованием праймеров PGA_F (SEQ ID №3) и PGA_R (SEQ ID №4).After amplification, 5 μl of PCR mixture was analyzed by electrophoresis in a 1% agarose gel and a homogeneous fragment of about 2.2 kb was detected. The fragment was isolated from the gel using the Wizard PCR Preps Kit (Promega, USA) in accordance with the manufacturer's instructions and subjected to automatic sequencing on an ABIPrizm 3100 DNA Sequencer using the primers PGA_F (SEQ ID No. 3) and PGA_R (SEQ ID No. 4).

Результат сравнения полученной нуклеотидной последовательности с последовательностью геномной копии гена рас штамма E. coli ВКПМ В-10182 с помощью программы ClustalX демонстрирует их идентичность (Фиг1).The result of comparing the obtained nucleotide sequence with the sequence of the genomic copy of the gene of the E. coli strain VKPM B-10182 using the ClustalX program demonstrates their identity (Fig. 1).

Пример 2. Конструирование плазмиды рМР0107 для экспрессии немодифицированного гена расExample 2. Construction of plasmid pMP0107 for expression of the unmodified gene

Для создания плазмиды, способной направлять синтез ECOPGA в клетках E. coli , проводят встраивание выделенного гена рас под контроль промотора фага Т7 вектора PSVH0107 [30].To create a plasmid capable of directing ECOPGA synthesis in E. coli cells, the isolated race gene is inserted under the control of the T7 phage promoter of vector PSVH0107 [30].

Полученный методом ПЦР фрагмент геномной ДНК штамма E. coli ВКПМ Β-10182 содержит полную кодирующую последовательность ECOPGA и фланкирован для его последующего направленного встраивания под контроль промотора Т7 экспрессионных векторов уникальными сайтами рестрикции NdeI и XhoI, отсутствующими в кодирующей последовательности гена рас.The PCR fragment of the E. coli VKPM 101 10182 genomic DNA fragment contains the complete ECOPGA coding sequence and is flanked for its subsequent directional insertion under the control of the T7 promoter of expression vectors by unique NdeI and XhoI restriction sites that are absent in the coding sequence of the race gene.

Выделенный из агарозного геля фрагмент гидролизуют рестриктазами NdeI/XhoI и клонируют в вектор pSVH0107. Затем отбирают канамицин-устойчивые трансформанты штамма E. coli JM109 путем «ПЦР скрининга» с помощью праймеров PGA3 (SEQ ID №9) и PGA4 (SEQ ID №10), специфичных к центральной части кодирующей последовательности гена PGA по критерию образования фрагментов размером 0,5 тпн в полученных образцах.The fragment isolated from agarose gel is hydrolyzed with restriction enzymes NdeI / XhoI and cloned into vector pSVH0107. Then, kanamycin-resistant transformants of E. coli JM109 strain were selected by PCR screening using primers PGA3 (SEQ ID No. 9) and PGA4 (SEQ ID No. 10) specific to the central part of the coding sequence of the PGA gene according to the criterion for the formation of fragments of size 0, 5 TPN in the obtained samples.

С целью выявления клона, несущего вставку с интактным геном рас без возможных мутаций, привнесенных за счет ПЦР-амплификации, из полученных «положительных» клонов (канамицин-устойчивых трансформантов) выделяют плазмидную ДНК и секвенируют с использованием праймеров PGA_F, PGA_R, PGA3, PGA4 и идентифицируют клон, несущий вставку с интактным геном рас, кодирующая последовательность которого идентична последовательности фрагмента ДНК SEQ ID №1. Плазмиду, выделенную из отобранного клона, обозначают как pMVD0107. Схема плазмиды приведена на Фиг 2.In order to identify a clone carrying an insert with an intact race gene without possible mutations introduced by PCR amplification, plasmid DNA is isolated from the obtained “positive” clones (kanamycin-resistant transformants) and sequenced using primers PGA_F, PGA_R, PGA3, PGA4 and identify a clone carrying an insert with an intact race gene, the coding sequence of which is identical to the sequence of the DNA fragment SEQ ID No. 1. The plasmid isolated from the selected clone is designated as pMVD0107. The scheme of the plasmid is shown in Fig 2.

Пример 3. Конструирование плазмиды рМD0107-1Example 3. Construction of plasmid pMD0107-1

А) Конструирование промежуточной плазмиды pMD007-a.A) Construction of an intermediate plasmid pMD007-a.

Плазмида pMD0107 содержит два сайта рестриктазы SphI в положениях 4929 и 5351 на физической карте плазмиды (Фиг. 2). Присутствие сайта SphI в положении 5351 в кодирующей последовательности гена рас затрудняет получение различных вариантов ECOPGA методами сайт-направленного мутагенеза.Plasmid pMD0107 contains two SphI restriction enzyme sites at positions 4929 and 5351 on the physical map of the plasmid (Fig. 2). The presence of the SphI site at position 5351 in the coding sequence of the gene makes it difficult to obtain various ECOPGA variants by site-directed mutagenesis methods.

Для удаления этого сайта проводят конструирование промежуточной плазмиды pMD007-a, содержащей в положении 123 последовательности SEQ ID №1 гена рас замену С>Т, не приводящую к изменению аминокислотной последовательности ECOPGA.To remove this site, the construction of the intermediate plasmid pMD007-a containing the sequence C> T substitution at position 123 of the sequence SEQ ID NO: 1 does not lead to a change in the amino acid sequence of ECOPGA.

Удаление сайта SphI проводят с использованием метода «рекомбинантной» ПЦР [31]. Для этого на матрице плазмиды pMD007 получают сначала ПЦР фрагменты №1 и №2.SphI site removal is carried out using the method of “recombinant” PCR [31]. For this, first, PCR fragments No. 1 and No. 2 are obtained on the matrix of plasmid pMD007.

Фрагмент №1, размером 440 пн, получают с использованием прайм еров PromF (SEQ ID №11)/SphD (SEQ ID №12). Праймер PromF расположен в положении 4940 плазмиды pMD007 рядом с сайтом SphI (4929). Праймер SphD расположен в положении 5343-5383 последовательности SEQ ID №1 (по комплементарной цепи) и содержит замену C>Т в положении 5362, приводящую к удалению сайта SphI, без изменения аминокислотной последовательности ECOPGA.Fragment No. 1, 440 bp in size, was prepared using PromF primers (SEQ ID No. 11) / SphD (SEQ ID No. 12). The PromF primer is located at position 4940 of plasmid pMD007 near the SphI site (4929). The SphD primer is located at position 5343-5383 of the sequence SEQ ID No. 1 (complementary chain) and contains the C> T substitution at position 5362, resulting in the removal of the SphI site, without changing the amino acid sequence of ECOPGA.

Фрагмент №2, размером 445 пн, получают с использованием праймеров NcoR (SEQ ID №13) и SphU (SEQ ID №14). Праймер NcoR расположен в положении 5717-5747 плазмиды pMD007 (по комплементарной цепи) и перекрывает сайт NcoI 5738. Праймер SphU комплементарен праймеру SphD.Fragment No. 2, 445 bp in size, was prepared using NcoR primers (SEQ ID No. 13) and SphU (SEQ ID No. 14). The NcoR primer is located at position 5717-5747 of the plasmid pMD007 (complementary chain) and overlaps the NcoI 5738 site. The SphU primer is complementary to the SphD primer.

Фрагменты №1 и №2 выделяют из агарозного геля как описано в примере 1 и используют в качестве матрицы в ПЦР реакции, которую проводят, как описано ниже:Fragments No. 1 and No. 2 isolated from agarose gel as described in example 1 and used as a matrix in the PCR reaction, which is carried out as described below:

Смесь для ПЦР (50 мкл):Mix for PCR (50 μl):

5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера («RocheDiagnosticsGmbH");5 μl of 10-fold PCR buffer (Roche Diagnostics GmbH);

1 мкл Фрагмента 1 (20 нг/мкл);1 μl of Fragment 1 (20 ng / μl);

1 мкл Фрагмента 2 (20 нг/мкл)1 μl of Fragment 2 (20 ng / μl)

4 мкл 5 мкМ праймера PromF4 μl of 5 μM PromF primer

4 мкл 5 мкМ праймера NcoR;4 μl of 5 μM NcoR primer;

5 мкл 2 мМ dNTP каждого вида;5 μl of 2 mm dNTP of each type;

30 мкл деионизованной воды;30 μl of deionized water;

1 мкл ДНК полимеразы («RocheDiagnosticsGmbH”).1 μl of DNA polymerase ("Roche Diagnostics GmbH").

Условия проведения ПЦР (30 циклов): 94°, 5' (денатурация), 94°, 30''; 55°, 30''; 72°,1' (амплификация).Conditions for PCR (30 cycles): 94 °, 5 '(denaturation), 94 °, 30' '; 55 °, 30 ''; 72 °, 1 '(amplification).

После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле и выявляют гомогенный фрагмент размером около 0,9 тпн. Фрагмент выделяют из геля, гидролизуют рестриктазами SphI/NcoI и клонируют в SphI/NcoI вектор pMD007. Из полученных канамицин-устойчивых трансформантов выделяют плазмидную ДНК и анализируют путем совместного гидролиза рестриктазами SphI/NcoI. Отбирают клоны, образующие SphI/NcoI фрагменты размером 7000 и 800 пн в отличие от фрагментов размером 7000 пн, 420 пн и 370 пн, характерных для плазмиды pMD007. Полученные положительные клоны секвенируют и отбирают плазмиду с нужной мутацией, не содержащую других неспецифических мутаций, обусловленных ошибками ПЦР. Один из отобранных клонов обозначают pMD007-a и используют в дальнейшей работе.After amplification, 5 μl of PCR mixture was analyzed by electrophoresis in a 1% agarose gel and a homogeneous fragment of about 0.9 kb was detected. The fragment was isolated from the gel, digested with restriction enzymes SphI / NcoI and cloned into SphI / NcoI vector pMD007. Plasmid DNA is isolated from the obtained kanamycin-resistant transformants and analyzed by co-hydrolysis with SphI / NcoI restriction enzymes. Clones were selected that form SphI / NcoI fragments of 7000 and 800 bp in size, in contrast to fragments of 7000 bp, 420 bp and 370 bp, which are characteristic of plasmid pMD007. The obtained positive clones are sequenced and a plasmid with the desired mutation is selected that does not contain other non-specific mutations due to PCR errors. One of the selected clones is designated pMD007-a and is used in further work.

Б) Конструирование плазмиды pMD007-l.B) Construction of the plasmid pMD007-l.

Для удобства получения вариантов ECOPGA с заменами и делециями в области сигнальной последовательности секреции в положение 83-88 кодирующей последовательности гена рас (SEQ ID №1) вводят уникальный сайт рестриктазы SacI без изменения аминокислотной последовательности ECOPGA.For the convenience of obtaining ECOPGA variants with substitutions and deletions in the region of the secretion signal sequence, a unique SacI restriction enzyme site is introduced at position 83-88 of the racial gene coding sequence (SEQ ID No. 1) without changing the amino acid sequence of ECOPGA.

Введение сайта проводят с использованием метода «рекомбинантной» ПЦР. Для этого на матрице плазмиды pMD007-1 получают сначала ПЦР фрагменты №3 и №4.The site is introduced using the method of "recombinant" PCR. For this, first, PCR fragments No. 3 and No. 4 are obtained on the plasmid matrix pMD007-1.

Фрагмент №3 размером 400 пн получают с использованием праймеров PromF (SEQ ID №11)/SacD (SEQ ID №15). Праймер SacD расположен в положении 63-108 последовательности SEQ ID №1 и содержит замену TCG>AGC в положении 85-87 приводящую к введению сайта SacI без изменения аминокислотной последовательности ECOPGA.Fragment No. 3 of 400 bp in size was prepared using PromF primers (SEQ ID No. 11) / SacD (SEQ ID No. 15). The SacD primer is located at position 63-108 of the sequence SEQ ID No. 1 and contains a TCG> AGC substitution at position 85-87 leading to the introduction of the SacI site without changing the amino acid sequence of ECOPGA.

Фрагмент №4 размером 500 пн получают с использованием праймеров NcoR (SEQ ID №13) и SacU (SEQ ID №16). Праймер SacU комплементарен праймеру SacD.Fragment No. 4 of 500 bp size was prepared using NcoR primers (SEQ ID No. 13) and SacU (SEQ ID No. 16). The SacU primer is complementary to the SacD primer.

Фрагменты №3 и №4 выделяют из агарозного геля как описано в примере 1 и используют в качестве матрицы в ПЦР реакции с праймерами PromF и NcoR. Полученный ПЦР фрагмент размером 900 пн выделяют из геля, гидролизуют рестриктазами SphI/NcoI и клонируют в SphI/NcoI вектор pMD007-a. Из полученных канамицин-устойчивых трансформантов выделяют плазмидную ДНК и анализируют путем совместного гидролиза рестриктазами SacI/NcoI. Отбирают клоны, образующие Sac/NcoI фрагменты размером 7374 и 412 пн в отличие от фрагмента размером 7777 пн, характерного для плазмиды pMD007a. Полученные положительные клоны секвенируют и отбирают плазмиду с нужной мутацией, несодержащую других неспецифических мутаций, обусловленных ошибками ПЦР. Один из отобранных клонов обозначают pMD007-1 и используют в дальнейшей работе.Fragments No. 3 and No. 4 were isolated from agarose gel as described in Example 1 and used as templates for PCR reactions with PromF and NcoR primers. The obtained 900 bp PCR fragment was isolated from the gel, digested with SphI / NcoI restriction enzymes, and vector pMD007-a was cloned into SphI / NcoI. Plasmid DNA was isolated from the obtained kanamycin-resistant transformants and analyzed by co-hydrolysis with restriction enzymes SacI / NcoI. Clones were selected to form Sac / NcoI fragments of 7374 and 412 bp, in contrast to the 7777 bp fragment characteristic of plasmid pMD007a. The obtained positive clones are sequenced and a plasmid with the desired mutation is selected that does not contain other non-specific mutations due to PCR errors. One of the selected clones is designated pMD007-1 and is used in further work.

Пример 3. Конструирование плазмиды рМР704 для экспрессии модифицированного гена расExample 3. Construction of plasmid pMP704 for the expression of the modified rac gene

Для получения вектора, содержащего ген, кодирующий (ans)ECOPGA под контролем промотора и терминатора гена 10 фага Т7, проводят замену собственной сигнальной последовательности ECOPGA в составе гена рас плазмиды pMD007-1 на SIGANS.To obtain a vector containing a gene encoding (ans) ECOPGA under the control of the promoter and terminator of the T7 phage 10 gene, the native ECOPGA signal sequence of the plasmid pMD007-1 gene is replaced by SIGANS.

В качестве источника SIGANS используют два синтетических олигонуклеотида ansU (SEQ ID №7) и ansD (SEQ ID №8). По 10 мкл 10 мкМ раствора каждого олигонуклеотида в буфере TEN (0,1 MNaCl, 10mMTris, 1 mMEDTA, pH 8.0) смешивают, денатурируют 5 мин при 95°С, плавно охлаждают до комнатной температуры и клонируют в NdeI/SacI вектор pMD007-1.As a source of SIGANS, two synthetic oligonucleotides ansU (SEQ ID No. 7) and ansD (SEQ ID No. 8) are used. 10 μl of a 10 μM solution of each oligonucleotide in TEN buffer (0.1 MNaCl, 10mMTris, 1 mMEDTA, pH 8.0) was mixed, denatured for 5 min at 95 ° C, gradually cooled to room temperature, and cloned into NdeI / SacI vector pMD007-1 .

Из полученных канамицин-устойчивых трансформантов выделяют плазмидную ДНК, анализируют путем секвенирования и отбирают плазмиду со вставкой SIGANS, содержащую последовательность модифицированного гена рас, кодирующего (ans)ECOPGA. Плазмиду обозначают pMD704 и используют для конструирования заявляемого штамма (Фиг. 3).Plasmid DNA was isolated from the obtained kanamycin-resistant transformants, analyzed by sequencing, and a plasmid with a SIGANS insert containing the sequence of the modified race gene encoding (ans) ECOPGA was selected. The plasmid is designated pMD704 and is used to construct the inventive strain (Fig. 3).

Пример 4. Получение заявляемого штамма - продуцента ECOPGAExample 4. Obtaining the inventive strain producer ECOPGA

Полученными рекомбинантными плазмидными ДНК pMD0107 (контроль) и pMD704 с использованием стандартных методов проводят трансформацию реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) [F-, ompT, hsdS_B (r_B-, m_B-), dcm, gal, λ (DE3) [26]. Выбор этого штамма в качестве реципиента для продукции ECOPGA обусловлен тем, что он синтезирует РНК-полимеразу фага Т7, а также обладает сниженной протеазной активностью, что способствует повышению выхода целевых белков.Using recombinant plasmid DNA pMD0107 (control) and pMD704 using standard methods, the recipient strain of E. coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdS _B (r _B- , m _B- ), dcm, gal, λ (DE3 ) [26]. The choice of this strain as a recipient for ECOPGA production is due to the fact that it synthesizes T7 phage RNA polymerase and also has a reduced protease activity, which contributes to an increase in the yield of target proteins.

Для индукции синтеза ECOPGA штаммы BL21(DE3)/pMD0107 и BL21(DE3)/pMD704 выращивают на среде ZY5052 [27] содержащую мас. %: энзиматический гидролизат казеина - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, (NH4)₂SO4 -0,33, КН₂РО₄ - 0,68, Na₂HPO₄ - 0,71, глицерин - 0,5, глюкоза - 0,05, лактоза- 0,2, MgSO4 - 0,012, вода - остальное. Дополнительно в среду добавляют 50 мг/л канамицина и 30 мг/л хлорамфеникола. Культивирование проводят в объеме 25 мл среды ZY5052 в колбах объемом 250 мл на качалке при 210 об/мин в течение 40 часов при температуре 21°С. В процессе культиврования параметры роста культуры и активности фермента в бактериальных клетках.To induce the synthesis of ECOPGA, strains BL21 (DE3) / pMD0107 and BL21 (DE3) / pMD704 were grown on ZY5052 medium [27] containing wt. %: casein enzymatic hydrolyzate - 1, yeast extract - 0.5, (NH4) ₂ SO4 -0.33, KH ₂ PO ₄ - 0.68, Na ₂ HPO ₄ - 0.71, glycerin - 0.5, glucose - 0.05, lactose - 0.2, MgSO4 - 0.012, water - the rest. Additionally, 50 mg / l kanamycin and 30 mg / l chloramphenicol are added to the medium. Cultivation is carried out in a volume of 25 ml of ZY5052 medium in 250 ml flasks on a shaker at 210 rpm for 40 hours at a temperature of 21 ° C. In the process of cultivation, the parameters of culture growth and enzyme activity in bacterial cells.

Удельную пенициллинамидазную активность выражают в единицах фермента (мкмолей субстрата в мин при 37°С) на мл культуры штамма-продуцента при помощи метода, описанного в работе [32].The specific penicillin amidase activity is expressed in units of the enzyme (micromoles of substrate per min at 37 ° C) per ml of culture of the producer strain using the method described in [32].

Как видно из представленных данных (Фиг. 5), общая активность фермента достигала максимума через 36 часов инкубации; при этом в штамме E. coli BL21(DE3)/ pMVD704 она выше, чем в контрольном штамме E. coli BL21(DE3)/ pMVD0107.As can be seen from the data presented (Fig. 5), the total enzyme activity reached a maximum after 36 hours of incubation; while in the E. coli strain BL21 (DE3) / pMVD704 it is higher than in the control strain of E. coli BL21 (DE3) / pMVD0107.

Таким образом, получен модифицированный ген рас бактерии Escherichia coli, кодирующий предшественник фермента с активностью пенициллин G ацилазы, с использованием которого сконструирован штамм-продуцент ECOPGA и на его основе разработан способ микробиологического синтеза ECOPGA, позволяющий получить этот фермент с активностью до 15 ME на мл культуры, превосходящий способ - ближайший-аналог - в 15 раз.Thus, a modified Escherichia coli bacterium gene was obtained that encodes a precursor of an enzyme with penicillin G acylase activity, using which the ECOPGA producer strain was constructed and based on it, a microbiological synthesis method ECOPGA was developed that allows one to obtain this enzyme with activity up to 15 ME per ml of culture , superior method - the closest analogue - 15 times.

Список использованной информации:List of information used:

1. Курочкина В.Б., Скляренко А.В. Ферментативный синтез бета-лактамных антибиотиков: аналитический обзор. // Антибиот Химиотер. 2005. Vol. 50, №№5-6. Р. 39-58.1. Kurochkina VB, Sklyarenko A.V. Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics: an analytical review. // Antibiotic Chemioter. 2005. Vol. 50, No. 5-6. R. 39-58.

2. Sklyarenko A.V., Kurochkina V.B. Е.А.М. Enzymatic transformation and synthesis of beta-lactam antibiotics. // Egorov A.M. Zaikov G. New Res. Biotechnol. Biol. Med. - Nov. Sci. Publ. 2006. № Chapter 8. P. 73-86.2. Sklyarenko A.V., Kurochkina V.B. E.A.M. Enzymatic transformation and synthesis of beta-lactam antibiotics. // Egorov A.M. Zaikov G. New Res. Biotechnol. Biol. Med. - Nov. Sci. Publ. 2006. No. Chapter 8. P. 73-86.

3. Kurochkina V.B. S.A.V. Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics. Analytical review. // Zaikov G.E. Biotechnol. state art Prospect. Dev. Nov. Sci. Publ. 2008. Vol. chapter 20. P. 175-204.3. Kurochkina V.B. S.A.V. Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics. Analytical review. // Zaikov G.E. Biotechnol. state art Prospect. Dev. Nov. Sci. Publ. 2008. Vol. chapter 20. P. 175-204.

4. Volpato G., Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Use of enzymes in the production of semi-synthetic penicillins and cephalosporins: drawbacks and perspectives. // Curr. Med. Chem. 2010. Vol.17, №32. P. 3855-3873.4. Volpato G., Rodrigues R.C., Fernandez-Lafuente R. Use of enzymes in the production of semi-synthetic penicillins and cephalosporins: drawbacks and perspectives. // Curr. Med. Chem. 2010. Vol.17, No. 32. P. 3855-3873.

5. К.B. The evolution of β-lactamases. Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. // John Wiley Sons, Ltd. 2007. P. 152-166.5. K. B. The evolution of β-lactamases. Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. // John Wiley Sons, Ltd. 2007.P. 152-166.

6. Parmar A. et al. Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) // Biotechnol. Adv. 2000. Vol.18, №4. P. 289-301.6. Parmar A. et al. Advances in enzymatic transformation of penicillins to 6-aminopenicillanic acid (6-APA) // Biotechnol. Adv. 2000. Vol. 18, No. 4. P. 289-301.

7. Srirangan K. et al. Biotechnological advances on penicillin G acylase: pharmaceutical implications, unique expression mechanism and production strategies. // Biotechnol. Adv. 2013. Vol.31, №8. P. 1319-1332.7. Srirangan K. et al. Biotechnological advances on penicillin G acylase: pharmaceutical implications, unique expression mechanism and production strategies. // Biotechnol. Adv. 2013. Vol.31, No. 8. P. 1319-1332.

8. Schmidt F.-R. The beta-lactam antibiotics: current situation and future prospects in manufacture and therapy. // Hofrichter M. Ind. Appl. Mycota X. 2nd Edn Springer-Verlag Berlin Heidelb. 2010. Vol.chapter 5. P. 101-121.8. Schmidt F.-R. The beta-lactam antibiotics: current situation and future prospects in manufacture and therapy. // Hofrichter M. Ind. Appl. Mycota X. 2nd Edn Springer-Verlag Berlin Heidelb. 2010. Vol.chapter 5. P. 101-121.

9. Sudhakaran V.K. et al. Molecular aspects of penicillin and cephalosporin acylases // Process Biochem. 1992. Vol.27, №3. P. 131-143.9. Sudhakaran V.K. et al. Molecular aspects of penicillin and cephalosporin acylases // Process Biochem. 1992. Vol. 27, No. 3. P. 131-143.

10. Xu Y. et al. Characterization of the T7 promoter system for expressing penicillin acylase in Escherichia coli. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol.72, №3. P. 529-536.10. Xu Y. et al. Characterization of the T7 promoter system for expressing penicillin acylase in Escherichia coli. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol. 72, No. 3. P. 529-536.

11. Narayanan N. et al. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 2006. Vol.22, №3. P. 617-625.11. Narayanan N. et al. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 2006. Vol.22, No. 3. P. 617-625.

12. Narayanan N., Xu Y., Chou CP. High-level gene expression for recombinant penicillin acylase production using the araB promoter system in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 2006. Vol.22, №6. P. 1518-1523.12. Narayanan N., Xu Y., Chou CP. High-level gene expression for recombinant penicillin acylase production using the araB promoter system in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 2006. Vol.22, No. 6. P. 1518-1523.

13. Vélez A.M. et al. High-throughput strategies for penicillin G acylase production in E. coli fed-batch cultivations // BMC Biotechnol. 2014. Vol.14, №1. P. 6.13. Vélez A.M. et al. High-throughput strategies for penicillin G acylase production in E. coli fed-batch cultivations // BMC Biotechnol. 2014. Vol.14, No. 1. P. 6.

14. Ignatova Z. et al. The relative importance of intracellular proteolysis and transport on the yield of the periplasmic enzyme penicillin amidase in Escherichia coli* // Enzyme Microb. Technol. 2000. Vol. 26, №2-4. P. 165-170.14. Ignatova Z. et al. The relative importance of intracellular proteolysis and transport on the yield of the periplasmic enzyme penicillin amidase in Escherichia coli * // Enzyme Microb. Technol. 2000. Vol. 26, No. 2-4. P. 165-170.

15. Ignatova Z. et al. Improvement of posttranslational bottlenecks in the production of penicillin amidase in recombinant Escherichia coli strains. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol.69, №2. P. 1237-1245.15. Ignatova Z. et al. Improvement of posttranslational bottlenecks in the production of penicillin amidase in recombinant Escherichia coli strains. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol.69, No. 2. P. 1237-1245.

16. Scherrer S. et al. Periplasmic aggregation limits the proteolytic maturation of the Escherichia coli penicillin G amidase precursor polypeptide. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. Vol.42, №1. P. 85-91.16. Scherrer S. et al. Periplasmic aggregation limits the proteolytic maturation of the Escherichia coli penicillin G amidase precursor polypeptide. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. Vol. 42, No. 1. P. 85-91.

17. Sriubolmas N. et al. Localization and characterization of inclusion bodies in recombinant Escherichia coli cells overproducing penicillin G acylase. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. Vol.47, №4. P. 373-378.17. Sriubolmas N. et al. Localization and characterization of inclusion bodies in recombinant Escherichia coli cells overproducing penicillin G acylase. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. Vol. 47, No. 4. P. 373-378.

18. Pan K.-L. et al. Roles of DegP in prevention of protein misfolding in the periplasm upon overexpression of penicillin acylase in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 2003. Vol.185, №10. P. 3020-3030.18. Pan K.-L. et al. Roles of DegP in prevention of protein misfolding in the periplasm upon overexpression of penicillin acylase in Escherichia coli. // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185, No. 10. P. 3020-3030.

19. Jana S., Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol.67, №3. P. 289-298.19. Jana S., Deb J.K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 67, No. 3. P. 289-298.

20. Berks B.C., Sargent F., Palmer T. The Tat protein export pathway. // Mol. Microbiol. 2000. Vol.35, №2. P. 260-274.20. Berks B.C., Sargent F., Palmer T. The Tat protein export pathway. // Mol. Microbiol. 2000. Vol. 35, No. 2. P. 260-274.

21. Akkaya

. et al. Mutations in the translation initiation region of the pac gene resulting in increased levels of activity of penicillin G acylase. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2012. Vol.28, №5. P. 2159-2164.21. Akkaya

. et al. Mutations in the translation initiation region of the pac gene resulting in increased levels of activity of penicillin G acylase. // World J. Microbiol. Biotechnol. 2012. Vol. 28, No. 5. P. 2159-2164.

22. Topping T.B. et al. Direct demonstration that homotetrameric chaperone SecB undergoes a dynamic dimer-tetramer equilibrium. // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, №10. P. 7437-7441.22. Topping T.B. et al. Direct demonstration that homotetrameric chaperone SecB undergoes a dynamic dimer-tetramer equilibrium. // J. Biol. Chem. 2001. Vol.276, No. 10. P. 7437-7441.

23. Chou CP. et al. Effect of SecB chaperone on production of periplasmic penicillin acylase in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 1999. Vol.15, №3. P. 439-445.23. Chou CP. et al. Effect of SecB chaperone on production of periplasmic penicillin acylase in Escherichia coli. // Biotechnol. Prog. 1999. Vol.15, No. 3. P. 439-445.

24. Патент RU 2388826. C12N 15/62, C12N 15/55, C12N 15/70, C12N 1/22. Рекомбинантная ДНК, кодирующая функционально активный гибридный белок g17аса-ацилазы с хитин-связывающим доменом (brdgl7aca-cbd), рекомбин. плазмида psvh0108, обеспечивающая его синтез в клетках. 2010.24. Patent RU 2388826. C12N 15/62, C12N 15/55, C12N 15/70, C12N 1/22. Recombinant DNA encoding a functionally active g17ac-acylase fusion protein with a chitin-binding domain (brdgl7aca-cbd), recombin. plasmid psvh0108, providing its synthesis in cells. 2010.

25. RU 2221868. C12N 015/55, C12N 009/82, C12N 001/21, C12N 001/21, C12R 001/19. Ген L-аспарагиназы Erwinia carotovora и штамм Escherichia coli ВКПМ №В - 8174 - продуцент L-аспарагиназы Erwinia carotovora. 2004.25. RU 2221868. C12N 015/55, C12N 009/82, C12N 001/21, C12N 001/21, C12R 001/19. Gene L-asparaginase Erwinia carotovora and strain Escherichia coli VKPM No. B - 8174 - producer of L-asparaginase Erwinia carotovora. 2004.

26. рЕТ System Manual, 11th edition. Novagen Inc. 2006.26. pET System Manual, 11th edition. Novagen Inc. 2006.

27. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. Vol.41, №1. P. 207-234.27. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. Vol.41, No. 1. P. 207-234.

28. J. Vennison. Laboratory Manual for Genetic Engineering. PHI Learning (January 30, 2010), 2010. P. 124.28. J. Vennison. Laboratory Manual for Genetic Engineering. PHI Learning (January 30, 2010), 2010. P. 124.

29. Mardanov Α. V et al. Draft Genome Sequence of Escherichia coli Strain VKPM B-10182, Producing the Enzyme for Synthesis of Cephalosporin Acids. // Genome Announc. 2014. Vol.2, №6.29. Mardanov Α. V et al. Draft Genome Sequence of Escherichia coli Strain VKPM B-10182, Producing the Enzyme for Synthesis of Cephalosporin Acids. // Genome Announc. 2014. Vol. 2, No. 6.

30. Eldarov M. et al. Probing the Substrate Specificity and Intersubunit Interactions of Brevundimonas Diminuta Glutaryl Acylase with Site-Directed Mutagenesis // Am. J. Biochem. Biotechnol. Science Publications, 2014. Vol.10, №3. P. 169-179.30. Eldarov M. et al. Probing the Substrate Specificity and Intersubunit Interactions of Brevundimonas Diminuta Glutaryl Acylase with Site-Directed Mutagenesis // Am. J. Biochem. Biotechnol. Science Publications, 2014. Vol.10, No. 3. P. 169-179.

31. Higuchi R., Krummel В., Saiki R.K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. // Nucleic Acids Res. 1988. Vol.16, №15. P. 7351-7367.31. Higuchi R., Krummel B., Saiki R.K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. // Nucleic Acids Res. 1988. Vol.16, No. 15. P. 7351-7367.

32. Ныс П.С., Савицкая E.M. K.T.C. Метод определения активности пенициллинамидазы. //Антибиотики. 1973. Vol.17. P. 270-276.32. Nys P.S., Savitskaya E.M. K.T.C. Method for determining penicillin amidase activity. // Antibiotics. 1973. Vol.17. P. 270-276.

Claims

1. A modified gene of the bacterium Escherichia coli encoding an enzyme precursor with penicillin G acylase activity and the corresponding sequence of SEQ ID NO: 17.

2. The recombinant strain Escherichia coli BL21 (DE3) / pMD704 is the producer of penicillin G acylase obtained by introducing the modified Escherichia coli bacterium gene according to claim 1 in the vector pSVH0107 into the recipient strain Escherichia coli BL21 (DE3).

3. The method of microbiological synthesis of penicillin G acylase by culturing a producer strain according to claim 2 under suitable conditions.