RU2619186C1 - Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes - Google Patents
Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2619186C1 RU2619186C1 RU2016112218A RU2016112218A RU2619186C1 RU 2619186 C1 RU2619186 C1 RU 2619186C1 RU 2016112218 A RU2016112218 A RU 2016112218A RU 2016112218 A RU2016112218 A RU 2016112218A RU 2619186 C1 RU2619186 C1 RU 2619186C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- cells
- specific
- tumor
- lymphocytes
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 105
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 105
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 65
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 55
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 10
- AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)[C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 AHOKKYCUWBLDST-QYULHYBRSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 66
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 24
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 13
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 11
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 9
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 12
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 13
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 description 12
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 description 12
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 12
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 9
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 7
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 7
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 7
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 3
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000017214 establishment of T cell polarity Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 102100033108 Transketolase-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 208000017891 HER2 positive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000010410 Nogo Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077641 Nogo Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000009172 cell transfer therapy Methods 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 108040003610 interleukin-12 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.The invention relates to immunology and biotechnology, and in particular to methods for producing in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) specific for tumor-associated antigen epitopes.
В структуре смертности населения России злокачественные новообразования занимают второе место (15,4%) после болезней системы кровообращения. Ведущими локализациями злокачественных опухолей у обоих полов являются кожа (12,3%, с меланомой - 14,0%), молочная железа (11,4%), трахея, бронхи, легкое (10,5%), желудок (7,0%). При этом, ведущей онкологической патологией у женского населения является рак молочной железы (20,9%), уровень смертности от которого занимает первое место (17,0%) [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2015. илл. 250 с. ISBN 978-5-85502-205-6].In the structure of mortality in the Russian population, malignant neoplasms take the second place (15.4%) after diseases of the circulatory system. The leading localizations of malignant tumors in both sexes are skin (12.3%, with melanoma - 14.0%), mammary gland (11.4%), trachea, bronchi, lung (10.5%), stomach (7.0 %). Moreover, the leading oncological pathology in the female population is breast cancer (20.9%), the mortality rate from which is in first place (17.0%) [Ed. HELL. Kaprina, V.V. Starinsky, G.V. Petrova Malignant neoplasms in Russia in 2013 (morbidity and mortality) M .: FGBU "MNIII im. P.A. Herzen »Ministry of Health of Russia. - 2015. ill. 250 s ISBN 978-5-85502-205-6].
Общепринятыми методами лечения рака на сегодняшний день являются хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Использование данных методов позволяет эффективно снижать опухолевую нагрузку за короткий период времени, но не дает возможности элиминировать все опухолевые клетки, диссеминированные в организме пациента. Минимальная опухолевая нагрузка, сохраняющаяся после удаления основной части новообразования, является причиной возникновения рецидивов опухоли и развития метастазов, что в свою очередь приводит к повышению уровня смертности и инвалидизации пациентов с онкологическими заболеваниями.Common methods for treating cancer today are surgery, radiation therapy and chemotherapy. The use of these methods can effectively reduce the tumor load in a short period of time, but does not make it possible to eliminate all tumor cells disseminated in the patient's body. The minimum tumor load that persists after removal of the main part of the neoplasm is the cause of tumor recurrence and the development of metastases, which in turn leads to an increase in mortality and disability of patients with cancer.
Таким образом, традиционные подходы к лечению рака обнаруживают недостатки в вопросе устранения минимальной опухолевой нагрузки, и становится очевидной необходимость появления новых технологий, направленных на улучшение процессов распознавания и уничтожения единичных опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после проведения лучевой терапии, химиотерапии или хирургического удаления основной массы опухоли.Thus, traditional approaches to the treatment of cancer reveal shortcomings in eliminating the minimum tumor burden, and the need for new technologies to improve the recognition and destruction of single tumor cells remaining in the patient’s body after radiation therapy, chemotherapy, or surgical removal of the main tumor mass.
Фундаментальные и клинические исследования последних лет подтверждают, что использование потенциала иммунной системы может быть весьма перспективным для устранения опухолевых клеток [Palucka K., Ueno Н., Banchereau J. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011. - Vol. 186. - №3. - P. 1325-31; Qian X., Wang X., Jin H. Cell transfer therapy for cancer: past, present, and future. // J Immunol Res. - 2014. doi: 10.1155/2014/525913]. Иммунотерапевтические подходы позволяют активировать клеточное звено иммунитета, нацеливая специфический иммунный ответ против опухолевых клеток, несущих на своей поверхности опухолевые антигены. Ввиду вышесказанного целесообразна разработка подходов, позволяющих эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ в организме пациента.Basic and clinical studies of recent years confirm that the use of the potential of the immune system can be very promising for the elimination of tumor cells [Palucka K., Ueno N., Banchereau J. Recent developments in cancer vaccines. // J Immunol. - 2011 .-- Vol. 186. - No. 3. - P. 1325-31; Qian X., Wang X., Jin H. Cell transfer therapy for cancer: past, present, and future. // J Immunol Res. - 2014. doi: 10.1155 / 2014/525913]. Immunotherapeutic approaches enable activation of the cellular immunity, targeting a specific immune response against tumor cells carrying tumor antigens on their surface. In view of the foregoing, it is advisable to develop approaches that effectively generate a specific antitumor immune response in the patient's body.
Основную роль в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа играют цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты. Наличие противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как в отношении их количества, так и нормального функционирования, является необходимым условием для уничтожения опухолевых клеток иммунной системой [Aerts J., Hegmans J. Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73. - P. 2381-2388]. Иммунотерапевтические подходы, направленные на борьбу с конкретными опухоль-ассоциированными антигенами, также используют активированные антигенспецифические цитотоксические CD8+ Т-клетки в качестве главного противоопухолевого агента.The main role in the development of a specific antitumor immune response is played by cytotoxic CD8 + T-lymphocytes. The presence of antitumor cytotoxic T lymphocytes (CTLs), both in terms of their number and normal functioning, is a prerequisite for the destruction of tumor cells by the immune system [Aerts J., Hegmans J. Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. // Cancer Res. - 2013 .-- Vol. 73. - P. 2381-2388]. Immunotherapeutic approaches aimed at combating specific tumor-associated antigens also use activated antigen-specific cytotoxic CD8 + T cells as the main antitumor agent.
Известен способ проведения адоптивной иммунотерапии приматам путем введения обогащенных популяций CD8-позитивных цитотоксических Т-лимфоцитов, включающий стадию in vitro получения активированных антигенспецифических Т-лимфоцитов. На стадии in vitro выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК), производят сортировку популяций CD8+CD62L+ CD8+CD62L- Т-лимфоцитов, культивируют отсортированные фракции CD62L+CD8+ и CD8+CD62L- Т-клеток в среде RPMI 1640, дополненной 25 мМ HEPES, 10% человеческой АВ сыворотки, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола, и 4 мм L-глутамина, совместно с аутологичными моноцитами в присутствии пептидов антигена, который может быть опухолевым или вирусным антигеном, добавляют интерлейкин-2 (ИЛ-2) на 3-й день культивирования, и затем производят обогащение клонов Т-клеток путем культивирования в 96-луночных круглодонных планшетах на слое фидерных клеток, а именно γ-облученных аутологичных МНК ПК и γ-облученных В-лимфобластоидных клеток, в присутствии ИЛ-2. Способ включает добавление моноклональных антител анти-CD3 и анти-CD28 для обогащения популяций CD8+ ЦТЛ в присутствии фидерного слоя клеток (US 2014356398, A61K 35/17, C12N 15/85, опубл. 04.12.2014).A known method of administering immunotherapy to primates by introducing enriched populations of CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes, including the stage of in vitro production of activated antigen-specific T-lymphocytes. At the in vitro stage, peripheral blood mononuclear cells (PC MNCs) are isolated, populations of CD8 + CD62L + CD8 + CD62L-T lymphocytes are sorted, sorted fractions of CD62L + CD8 + and CD8 + CD62L-T cells are cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 25 mM HEPES, 10% human AV serum, 25 μM 2-mercaptoethanol, and 4 mm L-glutamine, together with autologous monocytes in the presence of antigen peptides, which may be a tumor or viral antigen, add interleukin-2 (IL-2) to 3- cultivation day, and then enrichment of T cell clones by cultivation tion in a 96-well round bottom plates in a layer of feeder cells, namely γ-irradiated autologous PBMC and γ-irradiated B-lymphoblastoid cells in the presence of IL-2. The method includes the addition of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to enrich CD8 + CTL populations in the presence of a feeder cell layer (US 2014356398, A61K 35/17, C12N 15/85, published 04.12.2014).
Недостатком способа является использование аутологичных моноцитов периферической крови в качестве антиген-презентирующих клеток для захвата, обработки и представления антигенного пептида Т-лимфоцитам, без предварительной стимуляции дифференцировки моноцитов в зрелые дендритные клетки (ДК). Моноциты обладают высокой способностью к фагоцитозу, но не способны к эффективному представлению антигенов CD8+ Т-лимфоцитам в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости - major histocompatibility complex (МНС) I класса. Кроме того, недостаточный уровень сигнала от костимуляторных молекул, в норме обеспечиваемый зрелыми ДК в момент презентации антигена Т-лимфоцитам, может привести к нарушению процесса активации Т-лимфоцитов и нарушению их функциональных свойств [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - №6. - Р. 417-30]. Еще одним недостатком способа является тот факт, что сортировка и обогащение CD8+CD62L+ и CD8+CD62L- Т-лимфоцитов с использованием применяемых стимуляторных факторов не обеспечивает получение чистых популяций ЦТЛ, обладающих необходимой антигенной специфичностью. Конечная культура клеток, полученная таким способом, может содержать недостаточное количество эффекторных ЦТЛ, специфичных к антигенам, использовавшимся для активации МНК.The disadvantage of this method is the use of autologous peripheral blood monocytes as antigen-presenting cells for the capture, processing and presentation of the antigenic peptide to T-lymphocytes, without preliminary stimulation of differentiation of monocytes into mature dendritic cells (DC). Monocytes have a high ability to phagocytosis, but are not capable of efficiently presenting antigens of CD8 + T-lymphocytes in combination with molecules of the major histocompatibility complex (MHC) class I. In addition, the insufficient signal level from co-stimulatory molecules, normally provided by mature DCs at the time of presentation of the antigen to T-lymphocytes, can lead to disruption of the activation of T-lymphocytes and their functional properties [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - No. 6. - R. 417-30]. Another disadvantage of this method is the fact that the sorting and enrichment of CD8 + CD62L + and CD8 + CD62L-T lymphocytes using the applied stimulatory factors does not provide pure CTL populations possessing the necessary antigenic specificity. The final cell culture obtained in this way may contain an insufficient amount of CTL effector specific for the antigens used to activate the MNCs.
Известен способ получения активированных МНК с противоопухолевой активностью для клеточной иммунотерапии, включающий в себя выделение МНК ПК, культивирование их в среде AIM-V в присутствии пептидной композиции, интерлейкина-2 и антител анти-CD3 (CN 102643783, A61K 35/14, опубл. 22.08.2012).A known method of producing activated MNCs with antitumor activity for cellular immunotherapy, including the selection of MNCs PC, culturing them in AIM-V medium in the presence of a peptide composition, interleukin-2 and anti-CD3 antibodies (CN 102643783, A61K 35/14, publ. 08/22/2012).
Недостатком способа является отсутствие этапа генерации антиген-презентирующих клеток из используемых МНК для эффективного представления антигена эффекторным Т-клеткам, а также отсутствие этапа выделения популяций CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Эффективность функций ЦТЛ в смешанной культуре может быть снижена в результате супрессивного влияния клеточного окружения, а именно, популяций Т-регуляторных клеток и выделяемых ими факторов [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - №6. - Р. 417-30]. Кроме того, необходимо учитывать низкое содержание клеток-эффекторов, специфичных к выбранному антигенному пептиду, в смешанной культуре МНК, что также может влиять на отсутствие выраженного цитотоксического эффекта.The disadvantage of this method is the lack of a stage for generating antigen-presenting cells from used MNCs for efficient presentation of antigen to effector T cells, as well as the absence of a stage for isolating populations of CD8 + cytotoxic T lymphocytes. The effectiveness of CTL functions in a mixed culture can be reduced as a result of the suppressive effect of the cell environment, namely, populations of T-regulatory cells and the factors secreted by them [Wood K., Bushell A., Hester J. Regulatory immune cells in transplantation. // Nat Rev Immunol. 2012. - Vol. 12. - No. 6. - R. 417-30]. In addition, it is necessary to take into account the low content of effector cells specific for the selected antigenic peptide in a mixed culture of MNCs, which may also affect the absence of a pronounced cytotoxic effect.
Известен также способ получения антигенспецифических Т-лимфоцитов, представляющий собой закрытую систему культивирования клеток в стерильных емкостях, включающий выделение МНК из периферической крови, несколько раундов культивирования их в среде, содержащей антигенный пептид, культивирование антигенспецифических Т-лимфоцитов фракции МНК в присутствии антитела anti-CD3 и несколько раундов культивирования активированных МНК в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-15 (US 2014127805, C12N 5/0783, опубл. 08.05.2014).There is also a method for producing antigen-specific T-lymphocytes, which is a closed system for culturing cells in sterile containers, including the selection of MNCs from peripheral blood, several rounds of culturing them in a medium containing an antigenic peptide, culturing antigen-specific T-lymphocytes of the MNC fraction in the presence of anti-CD3 antibody and several rounds of cultivation of activated MNCs in the presence of IL-2 and IL-15 (US 2014127805, C12N 5/0783, publ. 08.05.2014).
Недостатком описанного способа также является отсутствие предварительного этапа получения профессиональных антиген-презентирующих клеток перед добавлением антигенного пептида к культуре МНК, что существенно снижает эффективность процессов обработки и презентации антигена цитотоксическим Т-лимфоцитам и активации данных клеток.The disadvantage of the described method is the lack of a preliminary stage of obtaining professional antigen-presenting cells before adding the antigenic peptide to the MNC culture, which significantly reduces the efficiency of the processing and presentation of the antigen to cytotoxic T-lymphocytes and activation of these cells.
Известен способ обогащения опухоль-реактивных CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов для иммунотерапии пациентов с онкологическими заболеваниями. Способ включает в себя стадии стимуляции CD4+ Т-хелперов 1 типа (Th1) и/или CD8+ Т-лимфоцитов с помощью добавления антиген-презентирующих клеток, представляющих собой аутологичные лейкоциты, содержащие В-лимфоциты или моноциты, и антигена опухолевого происхождения, при этом в качестве антигена используется денатурированный гомогенат опухоли или аутологичный опухолевый антиген. Способ включает в себя несколько этапов культивирования клеток в присутствии, по меньшей мере, одного вещества, имеющего агонистическую активность по отношению к рецептору ИЛ-2, несколько раундов подавления экспрессии мембранных молекул CD25 на поверхности CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов с повторным добавлением антигена опухолевого происхождения для активации опухоль-реактивных CD25-негативных Т-лимфоцитов, а также стимуляцию, по меньшей мере, одним веществом, способным усиливать экспрессию рецептора к интерлейкину-12 (ИЛ-12R) на Т-лимфоцитах, одним или более веществами, способными нейтрализовать ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, и/или TGF-β, подавляя развитие Т-лимфоцитов типа Th2. Способ включает также добавление одного или более веществ, способствующих развитию Т-лимфоцитов типа Th1 и/или цитотоксических Т-лимфоцитов, выбирая из следующих цитокинов: ИЛ-7, ИЛ-12, ИЛ-15 и ИЛ-21. При этом получаемые Т-лимфоциты являются производными от клеток лимфатических узлов, дренирующих первичную опухоль или метастаз, или от лейкоцитов периферической крови. Особенностью описанного способа является то, что производится обогащение не только эффекторного пула опухоль-реактивных Т-лимфоцитов, но и Т-хелперных клеток 1 типа. В способе отсутствует этап выделения популяций опухоль-реактивных Т-клеток из совместной культуры лейкоцитов. Это существенно снижает относительное содержание эффекторных Т-лимфоцитов, специфичных к опухолевым антигенам, в культуре клеток, предназначенной для адоптивного переноса пациенту (US 2009297489, A61K 35/12, опубл. 03.12.2009).A known method of enrichment of tumor-reactive CD4 + and / or CD8 + T-lymphocytes for immunotherapy of patients with cancer. The method includes the steps of stimulating type 1 CD4 + T helper cells (Th1) and / or CD8 + T lymphocytes by adding antigen-presenting cells, which are autologous white blood cells containing B-lymphocytes or monocytes, and an antigen of tumor origin, denatured tumor homogenate or autologous tumor antigen is used as antigen. The method includes several steps of culturing cells in the presence of at least one substance having agonistic activity towards the IL-2 receptor, several rounds of suppressing the expression of membrane molecules of CD25 on the surface of CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes with repeated addition of antigen tumor origin for activation of tumor-reactive CD25-negative T-lymphocytes, as well as stimulation with at least one substance capable of enhancing the expression of the receptor for interleukin-12 (IL-12R) on T-lymphocytes, one if more substances capable of neutralizing IL-4, IL-5, IL-10 and / or TGF-β, suppressing the development of Th2 type T-lymphocytes. The method also includes the addition of one or more substances that promote the development of Th1 type T lymphocytes and / or cytotoxic T lymphocytes, choosing from the following cytokines: IL-7, IL-12, IL-15 and IL-21. Moreover, the resulting T-lymphocytes are derived from lymph node cells draining the primary tumor or metastasis, or from peripheral blood leukocytes. A feature of the described method is that not only the effector pool of tumor-reactive T-lymphocytes is enriched, but also type 1 T-helper cells. The method lacks the step of isolating tumor-reactive T-cell populations from a co-culture of leukocytes. This significantly reduces the relative content of effector T lymphocytes specific for tumor antigens in a cell culture intended for adaptive transfer to a patient (US 2009297489, A61K 35/12, published 03.12.2009).
Недостатком способа является использование аутологичного опухолевого материала для антигенной активации лейкоцитов, поскольку зачастую невозможно получить необходимое количество опухолевой ткани для приготовления гомогената ввиду ее труднодоступности, недостаточности размеров операционного материала или неоперабельности пациента. Кроме того, в опухолевом материале может присутствовать широкий спектр опухолевых белков, способных оказывать супрессивный эффект на иммунные клетки. Указанный недостаток устраняется при использовании ДНК-конструкции в качестве источника опухолевых антигенов для активации ДК, что позволяет оптимизировать технологию антигенной активации антиген-презентирующих клеток с возможностью использования ее для всех пациентов. Также недостатком способа является использование моноцитов и В-лимфоцитов крови для обработки и представления опухолевого антигена Т-лимфоцитам, без использования этапа получения антиген-активированных ДК из моноцитов периферической крови. Моноциты, как известно, не являются профессиональными антиген-представляющими клетками. Показано также, что В-лимфоциты, будучи антиген-презентирующими клетками, тем не менее, выполняют данную функцию менее эффективно по сравнению с ДК, и, кроме того, представляют антигены преимущественно CD4+ Т-хелперным клеткам в комплексе с МНС II класса [Chappell С., Giltiay N., Dresch С., Clark Е. Controlling immune responses by targeting antigens to dendritic cell subsets and В cells. // Int Immunol. - 2014. - Vol. 26(1). P. 3-11]. Наиболее мощными антиген-презентирующими клетками считаются ДК, благодаря своей способности эффективно представлять вирусные и опухолевые антигены цитотоксическим Т-лимфоцитам. Показано, что зрелые ДК приобретают способность более эффективно, чем другие антиген-презентирующие клетки, стимулировать дифференцировку и пролиферацию Т-клеток [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307].The disadvantage of this method is the use of autologous tumor material for antigenic activation of leukocytes, since it is often impossible to obtain the necessary amount of tumor tissue to prepare a homogenate due to its inaccessibility, insufficient size of the surgical material or inoperability of the patient. In addition, a wide range of tumor proteins capable of suppressing the effect on immune cells may be present in the tumor material. This drawback is eliminated by using the DNA construct as a source of tumor antigens for activation of DCs, which makes it possible to optimize the technology of antigenic activation of antigen-presenting cells with the possibility of using it for all patients. Another disadvantage of this method is the use of blood monocytes and B-lymphocytes for processing and presenting a tumor antigen to T-lymphocytes, without using the step of obtaining antigen-activated DCs from peripheral blood monocytes. Monocytes are not known to be professional antigen-presenting cells. It was also shown that B-lymphocytes, being antigen-presenting cells, nevertheless, perform this function less efficiently than DCs, and, in addition, present antigens mainly to CD4 + T-helper cells in complex with MHC class II [Chappell C ., Giltiay N., Dresch C., Clark E. Controlling immune responses by targeting antigens to dendritic cell subsets and B cells. // Int Immunol. - 2014 .-- Vol. 26 (1). P. 3-11]. DCs are considered the most powerful antigen-presenting cells due to their ability to efficiently present viral and tumor antigens to cytotoxic T-lymphocytes. It has been shown that mature DCs acquire the ability to more efficiently, than other antigen-presenting cells, stimulate the differentiation and proliferation of T cells [Kadowaki N., But S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869 .; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005 .-- Vol. 26. - No. 3. - P. 289-307].
Однако в периферической крови человека ДК составляют лишь около 0,2% от общего количества циркулирующих лейкоцитов, в связи с чем в большинстве современных работ для антигенной активации Т-лимфоцитов, как правило, используются ДК, полученные из моноцитов в условиях in vitro [Gelao L., Criscitiello С., Esposito A. et al. Dendritic cell-based vaccines: clinical applications in breast cancer. // Immunotherapy. - 2014. - Vol. 6. - №3. - P. 349-60].However, in human peripheral blood, DCs make up only about 0.2% of the total number of circulating leukocytes, and therefore, in most modern works, DCs obtained from monocytes in vitro are usually used for antigenic activation of T-lymphocytes [Gelao L ., Criscitiello C., Esposito A. et al. Dendritic cell-based vaccines: clinical applications in breast cancer. // Immunotherapy. - 2014 .-- Vol. 6. - No. 3. - P. 349-60].
Известен способ получения антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, включающий в себя этапы конструирования рекомбинантного вектора, несущего ген опухолевого антигена, выделения и культивирования ДК, трансфекции полученных незрелых ДК с использованием сконструированного на первом шаге рекомбинантного вектора, стимуляции незрелых ДК цитокинами для получения зрелых ДК и сокультивирования зрелых ДК с Т-лимфоцитами, для получения антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CN 104004712, C12N 15/867, C12N 5/0783, опубл. 27.08.2014). В описанном способе для трансдукции предпочтительно используется лентивирусный вектор, кодирующий три опухолевых антигена - СЕА, MAGE-А3 и MUC1, для получения активированных и пролиферирующих противоопухолевых Т-клеток, специфичных к данным антигенам. Особенностью данного способа по сравнению с описанными выше способами является наличие этапа получения зрелых антиген-активированных ДК из моноцитов периферической крови и последующего "обучения" Т-лимфоцитов, что существенно увеличивает эффективность процесса активации антигенспецифических CD8+ ЦТЛ. Причем, для антигенной активации незрелые ДК подвергаются трансдукции лентивирусным вектором, кодирующим опухолевый антиген, после чего ДК подвергаются стимулированному созреванию с использованием молекул ФНО-α и ИФН-γ.A known method for producing antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, which includes the steps of constructing a recombinant vector carrying the tumor antigen gene, isolating and culturing DCs, transfecting the resulting immature DCs using the recombinant vector constructed in the first step, stimulating immature DCs with cytokines to obtain mature DCs and sap mature DK with T-lymphocytes, to obtain antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CN 104004712, C12N 15/867, C12N 5/0783, publ. 08.28.2014). The described method for transduction preferably uses a lentiviral vector encoding three tumor antigens - CEA, MAGE-A3 and MUC1 to obtain activated and proliferating antitumor T cells specific for these antigens. A feature of this method compared to the methods described above is the presence of a stage for the production of mature antigen-activated DCs from peripheral blood monocytes and the subsequent "training" of T-lymphocytes, which significantly increases the efficiency of the process of activation of antigen-specific CD8 + CTLs. Moreover, for antigenic activation, immature DCs are transduced with a lentiviral vector encoding a tumor antigen, after which DCs are stimulated by maturation using TNF-α and IFN-γ molecules.
Недостатком данного способа является использование вирусной трансфекции и отсутствие этапа выделения популяций антигенспецифических ЦТЛ из совместной культуры МНК и ДК, в результате чего итоговая культура активированных антигенспецифических клеток содержит в себе все разнообразие популяций мононуклеарных клеток периферической крови. Эффективность функций ЦТЛ культуре клеток, получаемой таким способом, может быть снижена в результате влияния клеточного окружения и выделяемых им факторов.The disadvantage of this method is the use of viral transfection and the absence of the stage of isolating populations of antigen-specific CTLs from a co-culture of MNCs and DCs, as a result of which the final culture of activated antigen-specific cells contains the whole variety of populations of peripheral blood mononuclear cells. The efficiency of CTL functions in a cell culture obtained in this way can be reduced as a result of the influence of the cell environment and the factors secreted by it.
Основной недостаток всех перечисленных способов получения антигенспецифических ЦТЛ заключается в том, что относительное содержание антигенспецифических CD8 + ЦТЛ в смешанной культуре мононуклеарных клеток невелико, что снижает общий уровень цитотоксического эффекта полученной культуры клеток против клеток, несущих опухолевые антигены.The main disadvantage of all the above methods for producing antigen-specific CTLs is that the relative content of antigen-specific CD8 + CTLs in a mixed culture of mononuclear cells is small, which reduces the overall level of the cytotoxic effect of the obtained cell culture against cells carrying tumor antigens.
Известен способ получения HLA-А0201-рестриктированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к вирусу папилломы человека (human papilloma virus, HPV). Данный способ направлен на получение Т-лимфоцитов, специфичных к вирусному, а не опухолевому антигену. Способ включает в себя следующие этапы: сбор мононуклеарных клеток периферической крови с помощью афереза, выделение и обогащение CD8+ Т-лимфоцитов, стимуляция CD8+ Т-лимфоцитов с помощью зрелых ДК, активированных HLA-А0201-рестриктированным полипептидом антигена ВПЧ, и стимулирование роста Т-клеток с помощью использования комбинаций цитокинов ИЛ-2 и ИЛ-7, выделение целевых ЦТЛ с помощью окрашивания тетрамерами и сортировки методом проточной цитометрии, стимуляция роста целевых ЦТЛ с помощью моноклональных антител к человеческому CD3 и ИЛ-2 сорбированных на пластике, добавление аутологичных гамма-облученных МНК ПК в качестве фидерных клеток для усиления пролиферации ЦТЛ и культивирование в присутствии ИЛ-15, а также сбор и идентификация полученных ЦТЛ (CN 102719402, C12N 5/0783, опубл. 10.10.2012).A known method of producing HLA-A0201-restricted cytotoxic T-lymphocytes specific for human papilloma virus (human papilloma virus, HPV). This method is aimed at obtaining T-lymphocytes specific for the viral rather than tumor antigen. The method includes the following steps: collection of peripheral blood mononuclear cells using apheresis, isolation and enrichment of CD8 + T lymphocytes, stimulation of CD8 + T lymphocytes with mature DCs activated by HLA-A0201-restricted HPV antigen polypeptide, and stimulation of T-cell growth using combinations of cytokines IL-2 and IL-7, isolation of target CTLs by staining with tetramers and sorting by flow cytometry, stimulation of the growth of target CTLs using monoclonal antibodies to human CD3 and IL-2 sorbi On plastic, the addition of autologous gamma-irradiated PC MNCs as feeder cells to enhance the proliferation of CTLs and cultivation in the presence of IL-15, as well as the collection and identification of the obtained CTLs (CN 102719402, C12N 5/0783, published 10.10.2012).
К недостаткам способа относится использование антигенного пептида для активации зрелых ДК, поскольку зрелые ДК характеризуются сниженной способностью к захвату, процессингу и представлению антигена [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different tolllike receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immunopathol. - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307]. Кроме того ограничение использования пептида для антигенной активации ДК заключается в том, что пептид способен легко отделяться от молекул МНС [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - №9. - P. 1065-9], вследствие чего нарушается способность ДК представлять антиген Т-лимфоцитам.The disadvantages of the method include the use of an antigenic peptide to activate mature DCs, since mature DCs are characterized by a reduced ability to capture, process and present antigen [Kadowaki N., But S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different tolllike receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869 .; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin Immunopathol. - 2005. - Vol. 26. - No. 3. - P. 289-307]. In addition, the restriction of the use of the peptide for antigenic activation of DCs lies in the fact that the peptide can be easily separated from MHC molecules [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - No. 9. - P. 1065-9], as a result of which the ability of DC to present the antigen to T-lymphocytes is impaired.
Другим недостатком является необратимость окрашивания Т-лимфоцитов тетрамерами, что приводит к нарушениям в функциональной активности и жизнеспособности выделенных клеток, в связи с длительной активацией Т-клеточных рецепторов (ТКР). [Wang X., Pang Н., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013. - Vol. 112. - №6. P. 338-45]. Кроме того, недостатком является использование тетрамеров для выделения популяций антигенспецифических Т-лимфоцитов, так как сконструированные молекулы тетрамеров содержат в своем составе молекулы стрептавидина, которые не допускаются к использованию в клинической практике для введения пациентам. [Wang X., Pang Н., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013. - Vol. 112. - №6. P. 338-45].Another disadvantage is the irreversibility of staining T-lymphocytes with tetramers, which leads to impaired functional activity and viability of the selected cells, due to the prolonged activation of T-cell receptors (TCR). [Wang X., Pang N., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013 .-- Vol. 112. - No. 6. P. 338-45]. In addition, the disadvantage is the use of tetramers to isolate populations of antigen-specific T-lymphocytes, since the designed tetramer molecules contain streptavidin molecules, which are not allowed for use in clinical practice for administration to patients. [Wang X., Pang N., Xu X. et al. Streptamer versus tetramer-based selection of functional cytomegalovirus-specific T cells. // J Formos Med Assoc. 2013 .-- Vol. 112. - No. 6. P. 338-45].
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения in vitro HLA-А0201-рестриктированных цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к раково-эмбриональному антигену (carcinoembryonic antigen, СЕА), включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции МНК, выделенных из периферической крови человека, получение ДК путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных ЦТЛ с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15).Closest to the proposed method is a method for producing in vitro HLA-A0201-restricted cytotoxic T-lymphocytes specific for cancer-embryonic antigen (carcinoembryonic antigen, CEA), comprising obtaining an adherent and non-adherent fraction of MNCs isolated from human peripheral blood, obtaining DC by stimulation of their differentiation from the adherent fraction of MNCs and antigenic activation of the resulting mature DCs with a tumor-associated antigen; co-cultivation of cells from the non-adherent fraction with autologous mature with antigen-activated DCs from the adherent fraction, subsequent isolation of the fraction of antigen-specific T lymphocytes by staining with antigen-specific reagents, stimulation of the growth of isolated CTLs using recombinant human interleukin-2 (rchIL-2), interleukin-7 (rhIL-7) and interleukin- 15 (rchIL-15).
Зрелые ДК получали из клеток прилипающей фракции МНК периферической крови посредством культивирования их в среде RPMI-1640 с добавлением активированной человеческой сыворотки АВ, в присутствии цитокинов ГМ-КСФ и ИФН-α в течение 3 дней. К полученной культуре зрелых ДК добавляли антигенный полипептид CEA691-699 и инкубировали во влажной атмосфере при 37°С и содержании CO2 5% в течение 2 часов, после чего дважды отмывали в среде RPMI-1640. Из клеток неприлипающей фракции МНК ПК выделяли CD8+ Т-лимфоциты, и стимулировали их активацию и пролиферацию путем совместного культивирования CD8+-T лимфоцитов, выделенных из неприлипающей фракции МНК, со зрелыми аутологичными ДК, активированными HLA-A0201-рестриктированным полипептидом антигена СЕА, в соотношении CD8+ T-лимфоцитов к ДК, составляющем 5:1, соответственно, и при одновременном добавлении в совместную культуру цитокинов ИЛ-2 (до конечной концентрации 500-750 МЕ/мл) и ИЛ-7 (до конечной концентрации 50-75 нг/мл), участвующих в стимуляции Т-клеточного роста, для продлевания времени жизни активированных Т-лимфоцитов и генерации Т-клеток памяти. Культуру ДК и CD8+ Т-лимфоцитов стимулировали указанными цитокинами в течение 14 суток. Затем популяции ЦТЛ, специфичные к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена СЕА, выделяли из совместной культуры с использованием метода необратимого окрашивания антиген-специфичных клеток тетрамерами и сортировки окрашенных клеток методом проточной цитометрии. Затем производили стимуляцию выделенных СЕА-специфичных Т-клеток с помощью твердофазных моноклональных антител к человеческому CD3 и ИЛ-2 в конечной концентрации 500 МЕ/мл, а также добавляют аутологичные гамма-облученные МНК ПК в качестве фидерных клеток для усиления активации деления ЦТЛ. Одновременно с культивированием в присутствии фидерных клеток добавляли ИЛ-15 в конечной концентрации 100-250 нг/мл (CN 102719400, C12N 5/0783, опубл. 10.10.2012).Mature DCs were obtained from cells of an adhering fraction of peripheral blood MNCs by culturing them in RPMI-1640 medium supplemented with activated human AB serum in the presence of cytokines GM-CSF and IFN-α for 3 days. CEA 691-699 antigenic polypeptide was added to the resulting culture of mature DCs and incubated in a humid atmosphere at 37 ° C and a CO 2 content of 5% for 2 hours, after which it was washed twice in RPMI-1640 medium. CD8 + T-lymphocytes were isolated from cells of the non-adherent fraction of MNK PK and stimulated their activation and proliferation by co-culturing CD8 + -T lymphocytes isolated from the non-adherent fraction of MNCs with mature autologous DCs activated with HLA-A0201-restricted CEA antigen polypeptide in the ratio CD8 + T-lymphocytes to DC, comprising 5: 1, respectively, and with simultaneous addition of IL-2 cytokines (to a final concentration of 500-750 IU / ml) and IL-7 (to a final concentration of 50-75 ng / ml) in a joint culture involved in T-cell stimulation Nogo growth, to prolong the lifetime of the activated T-lymphocytes, and generation of memory T-cells. A culture of DC and CD8 + T-lymphocytes was stimulated by the indicated cytokines for 14 days. Then, CTL populations specific for the epitopes of the tumor-associated CEA antigen were isolated from the co-culture using irreversible staining of antigen-specific cells with tetramers and sorting of stained cells by flow cytometry. Then, the isolated CEA-specific T cells were stimulated with solid-phase monoclonal antibodies to human CD3 and IL-2 at a final concentration of 500 IU / ml, and autologous gamma-irradiated PC MNCs were added as feeder cells to enhance activation of CTL division. Simultaneously with culturing in the presence of feeder cells, IL-15 was added at a final concentration of 100-250 ng / ml (CN 102719400, C12N 5/0783, publ. 10.10.2012).
На основе указанных в патенте данных, полученных в результате анализа СЕА-специфичных Т-лимфоцитов, сделан вывод о высоких показателях чистоты получаемой популяции (более 95% CD8+ СЕА-специфичных Т-лимфоцитов). Анализ цитотоксичности полученных СЕА-специфичных ЦТЛ против клеток-мишеней, проведенный с помощью МТТ-теста, показал уровень цитотоксического эффекта, достигающий значения 20,5% при соотношении полученных ЦТЛ к клеткам-мишеням 10:1.Based on the data indicated in the patent, obtained as a result of the analysis of CEA-specific T-lymphocytes, a conclusion was made about high purity of the resulting population (more than 95% of CD8 + CEA-specific T-lymphocytes). The cytotoxicity analysis of the obtained CEA-specific CTLs against target cells, performed using the MTT test, showed a cytotoxic effect level reaching 20.5% at a ratio of the obtained CTLs to target cells of 10: 1.
Описанный способ характеризуется использованием антигенного пептида СЕА для антигенной активации ДК. В научной литературе существует несколько аргументов против использования пептида в качестве способа активации ДК, в числе которых тот факт, что ДК, активированные пептидом, представляют антиген на своей поверхности лишь на короткий период времени [Schuurhuis D., Verdijk P., Schreibelt G. et. al. In situ expression of tumor antigens by messenger RNA-electroporated dendritic cells in lymph nodes of melanoma patients. // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69. - №7. - P. 2927-34], поскольку пептид способен легко отделяться от молекул МНС [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - №9. - P. 1065-9].The described method is characterized by the use of CEA antigenic peptide for antigenic activation of DC. There are several arguments in the scientific literature against the use of a peptide as a method of activating DCs, including the fact that DCs activated by a peptide present an antigen on their surface only for a short period of time [Schuurhuis D., Verdijk P., Schreibelt G. et . al. In situ expression of tumor antigens by messenger RNA-electroporated dendritic cells in lymph nodes of melanoma patients. // Cancer Res. - 2009. - Vol. 69. - No. 7. - P. 2927-34], since the peptide is able to easily separate from MHC molecules [Mitchell D., Nair S. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. // J Clin Invest. - 2000. - Vol. 106. - No. 9. - P. 1065-9].
В описанном способе пептид добавляется к культуре зрелых ДК. Известно, что функциональные изменения зрелых ДК по сравнению с незрелыми ДК заключаются в снижении способности к фагоцитозу, обработке и представлению антигенов [Kadowaki N., Но S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869.; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005. - Vol. 26. - №3. - P. 289-307]. Таким образом, способ имеет недостаток, заключающийся в том, что антигенная активация посредством добавления пептида на стадии зрелых ДК приводит к ухудшению эффективности захвата, процессинга и представления антигена дендритными клетками, что может стать причиной нарушения процесса активации цитотоксических Т-лимфоцитов.In the described method, the peptide is added to a mature DC culture. It is known that the functional changes in mature DCs compared with immature DCs are reduced ability to phagocytosis, processing and presentation of antigens [Kadowaki N., But S., Antonenko S. et al. Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. // J Exp Med. - 2001. - Vol. 194. - P. 863-869 .; Jong, de E., Smits H., Kapsenberg M. Dendritic cell-mediated T cell polarization. // Springer Semin ImmunopathoL - 2005 .-- Vol. 26. - No. 3. - P. 289-307]. Thus, the method has the disadvantage that antigenic activation by adding a peptide at the stage of mature DC leads to a decrease in the efficiency of capture, processing and presentation of the antigen by dendritic cells, which may cause a violation of the activation process of cytotoxic T lymphocytes.
Еще одной особенностью данного способа является наличие двух этапов стимуляции целевых клеток, включающих использование комбинаций ИЛ-2 и ИЛ-7 на первом этапе и ИЛ-2 совместно с ИЛ-15, а также антител anti-CD3 и культивирование на фидерном слое гамма-облученных МНК ПК на втором этапе обогащения СЕА-специфичных ЦТЛ. Таким образом, в данном способе существенно усложнена стадия наработки антигенспецифических Т-лифмоцитов, что приводит к значительному удорожанию и большим затратам времени.Another feature of this method is the presence of two stages of stimulation of target cells, including the use of combinations of IL-2 and IL-7 in the first stage and IL-2 in conjunction with IL-15, as well as anti-CD3 antibodies and cultivation on the feeder layer of gamma-irradiated PS MNCs at the second stage of enrichment of CEA-specific CTLs. Thus, in this method, the stage of producing antigen-specific T-lymphocytes is substantially complicated, which leads to a significant increase in cost and time.
Недостатком способа является также использование тетрамеров для окрашивания и выделения популяций СЕА-специфичных Т-лимфоцитов. Тетрамеры, как и другие мультимеры, представляют собой естественный лиганд, связывающийся с ТКР, что приводит к функциональным изменениям очищенных популяций клеток, таких как интернализация, активация и сверхстимуляция ТКР, а также клеточная гибель. Кроме того, препараты, содержащие стрептавидин, входящий в состав молекул тетрамеров, или его производные, являются недопустимыми для введения пациентам в клинической практике. Эта неизбежная проблема технологии окрашивания МНС мультимерами существенно ограничивает применение технологии, как для фундаментальных исследований Т-лимфоцитов, так и для клинических.The disadvantage of this method is the use of tetramers for staining and isolation of populations of CEA-specific T-lymphocytes. Tetramers, like other multimers, are a natural ligand that binds to TKR, which leads to functional changes in purified cell populations, such as internalization, activation and overstimulation of TKR, as well as cell death. In addition, preparations containing streptavidin, which is part of the tetramer molecules, or its derivatives, are unacceptable for administration to patients in clinical practice. This inevitable problem of the technology of staining MHCs with multimers significantly limits the application of the technology, both for basic research of T-lymphocytes and for clinical ones.
Все вышеназванные недостатки снижают эффективность генерации in vitro популяций антигенспецифических цитотоксических Т-клеток с активностью против опухолевых клеток.All of the above disadvantages reduce the efficiency of in vitro generation of populations of antigen-specific cytotoxic T cells with activity against tumor cells.
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.The objective of the present invention is to increase the efficiency of obtaining in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes specific for tumor associated antigen epitopes.
Поставленная задача решается предложенным способом получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающем получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15), в котором антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл.The problem is solved by the proposed method for producing in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes specific for tumor-associated antigen epitopes, including the adhering and non-adherent fractions of mononuclear cells (MNCs) isolated from human peripheral blood, obtaining dendritic cells (DC) by stimulation of their differentiation from the adherent fraction of MNCs and antigenic activation of the resulting mature DCs with a tumor-associated antigen, joint cultivation of cells from a non-adherent fraction with autologous mature antigen-activated DCs from the adherent fraction, subsequent isolation of the antigen-specific T-lymphocyte fraction by staining with antigen-specific reagents, stimulation of the growth of isolated cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) using recombinant human interleukin-2 ( 2), interleukin-7 (rchIL-7) and interleukin-15 (rchIL-15), in which the antigenic activation of the resulting mature DCs is carried out using a DNA construct encoding of the KIFGSLAFL and RLLQETELV epitopes of the tumor-associated HER2 protein, all cells of the non-adherent fraction of MNCs are co-cultured with autologous mature antigen-activated DCs from the adherent fraction, then cytotoxic T-lymphocytes specific for KLGV epitopes of CLVFELVET and KLG are isolated from the DC and MNC culture HER2 by magnetic separation using antigen-specific reagents, providing reversible staining of secreted cells, and after isolation of HER2-specific CTLs, their proliferation is stimulated cations by culturing in the presence of the cytokines rchIL-2, rchIL-7, rchIL-15 simultaneously introduced for 14-20 days, the final concentration of each of the cytokines rchIL-2, rchIL-7 and rchIL-15 being 50 ng / ml.
В качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры.Streptamers are used as a staining antigen-specific reagent.
В отличие от использования пептида, антигенная активация полученных зрелых ДК с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного антигена HER2, обеспечивает более прочное и длительное взаимодействие молекул МНС с эксперессируемыми антигенными эпитопами, что позволяет улучшать процесс представления антигена Т-лимфоцитам дендритными клетками, что, в свою очередь, повышает эффективность генерации антигенспецифических Т-лимфоцитов in vitro.In contrast to the use of the peptide, the antigenic activation of the obtained mature DCs using the DNA construct encoding the KIFGSLAFL and RLLQETELV epitopes of the tumor-associated HER2 antigen provides a stronger and longer-lasting interaction of MHC molecules with the expressed antigenic epitopes, which improves the process of antigen presentation to T lymphocytes dendritic cells, which, in turn, increases the efficiency of generation of antigen-specific T-lymphocytes in vitro.
Следует подчеркнуть, что опухоль-ассоциированный антиген HER2 (human epidermal growth factor receptor-2, Her-2/neu, HER2), кодируемый геном ErbB2, относится к семейству эпидермальных факторов роста и его эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV описаны в научной литературе как наиболее иммуногенные эпитопы. Гиперэкспрессией HER2 характеризуются разновидности злокачественных карцином молочной железы, яичника, желудка, поджелудочной железы, колоректального рака и рака эндометрия. Гиперэкспрессия рецептора или амплификация онкогена HER2 ассоциированы с наиболее агрессивным фенотипом опухоли, более коротким периодом до рецидива после первичного лечения [Subbiah, I.M., Gonzalez-Angulo, A.M. Advances and Future Directions in the Targeting of HER2-positive Breast Cancer: Implications for the Future. // Curr Treat Options Oncol. - 2013. - Vol. 2]. Показано, что HER-2 является патологическим биомаркером, отличающим раковые клетки молочной железы от неопухолевых, так как экспрессия белка HER2 на поверхности клеток HER2-гиперэкспрессирующего рака молочной железы может в 50-100 раз превышать экспрессию этого белка в нормальных клетках [Dev K., Ak М., Husain Е. Immunohistochemical expression of Her-2/neu and its correlation with histological grades and age in IDC of breast. // 2013. - Vol. 3. - №3. - P. 230-247]. Данный факт сделал рецептор Her-2/neu идеальной мишенью для терапии против HER2-гиперэкспрессирующих опухолей молочной железы. Показана также перспективность использования данного антигена в качестве мишени для терапии других злокачественных карцином с гиперэкспрессией HER2 [Eroglu Z., Tagawa Т., Somlo G. Human epidermal growth factor receptor family-targeted therapies in the treatment of HER2-overexpressingbreast cancer. // Oncologist. - 2014. - Vol. 19. - №2. - P. 135-50].It should be emphasized that the tumor-associated antigen HER2 (human epidermal growth factor receptor-2, Her-2 / neu, HER2) encoded by the ErbB2 gene belongs to the family of epidermal growth factors and its epitopes KIFGSLAFL and RLLQETELV are described in the scientific literature as the most immunogenic epitopes. Overexpression of HER2 is characterized by varieties of malignant carcinomas of the breast, ovary, stomach, pancreas, colorectal cancer and endometrial cancer. Overexpression of the receptor or amplification of the HER2 oncogen is associated with the most aggressive tumor phenotype, a shorter period before relapse after the initial treatment [Subbiah, I.M., Gonzalez-Angulo, A.M. Advances and Future Directions in the Targeting of HER2-positive Breast Cancer: Implications for the Future. // Curr Treat Options Oncol. - 2013 .-- Vol. 2]. It has been shown that HER-2 is a pathological biomarker that distinguishes breast cancer cells from non-tumor ones, since the expression of the HER2 protein on the surface of HER2-hyperexpressing breast cancer cells can be 50-100 times higher than the expression of this protein in normal cells [Dev K., Ak M., Husain E. Immunohistochemical expression of Her-2 / neu and its correlation with histological grades and age in IDC of breast. // 2013. - Vol. 3. - No. 3. - P. 230-247]. This fact made the Her-2 / neu receptor an ideal target for therapy against HER2-overexpressing breast tumors. The prospects of using this antigen as a target for the treatment of other malignant carcinomas with HER2 overexpression was also shown [Eroglu Z., Tagawa T., Somlo G. Human epidermal growth factor receptor family-targeted therapies in the treatment of HER2-overexpressingbreast cancer. // Oncologist. - 2014 .-- Vol. 19. - No. 2. - P. 135-50].
Совместное культивирование всех клеток неприлипающей фракции МНК с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции по сравнению с использованием чистой популяции CD8+ Т-лимфоцитов, повышает эффективность предложенного способа за счет того, что в момент представления антигена дендритными клетками для полноценной активации цитотоксических Т-лимфоцитов дополнительный костимуляторный сигнал от клеточного окружения, включающего в себя Т-хелперные клетки и другие иммунокомпетентные клетки, выделяющие ряд стимуляторных цитокинов, усиливает активацию ЦТЛ.The joint cultivation of all cells of the non-adherent fraction of MNCs with autologous mature antigen-activated DCs from the adherent fraction compared with the use of a pure population of CD8 + T-lymphocytes, increases the efficiency of the proposed method due to the fact that at the time of presentation of the antigen by dendritic cells to fully activate cytotoxic T-lymphocytes additional co-stimulatory signal from the cellular environment, which includes T-helper cells and other immunocompetent cells that secrete a number of stimuli ornyh cytokines, enhances activation of CTLs.
Выделение из совместной культуры ДК и МНК цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV антигена HER2 осуществляют методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, в частности стрептамеров. При использовании стрептамеров - реагенты окрашивания удаляются с мембран клеток, в связи с чем отсутствует негативное влияние на функциональное состояние клеток, заключающееся в чрезмерном, длительном связывании лиганда с поверхностными рецепторами Т-клеток. В результате длительного взаимодействия ТКР с тетрамерами происходит интернализация Т-клеточных рецепторов, в связи с чем меченные тетрамерами Т-лимфоциты существенно снижают свою способность распознавать клетки-мишени и реализовывать свои эффекторные функции. Кроме того, стрептамеры, в отличие от тетрамеров, не имеют в своем составе стрептавидин, который недопустим для использования в клинической практике. Использование обратимого окрашивания для выделения HER2-специфических ЦТЛ резко повышает эффективность способа в целом.Isolation of the cytotoxic T-lymphocytes specific for the KIFGSLAFL and RLLQETELV epitopes of the HER2 antigen from the co-culture of DC and MNCs is carried out by magnetic separation using antigen-specific reagents that provide reversible staining of the secreted cells, in particular streptamers. When using streptamers, staining reagents are removed from cell membranes, and therefore there is no negative effect on the functional state of cells, which consists in excessive, prolonged binding of the ligand to surface T-cell receptors. As a result of long-term interaction of TCR with tetramers, T-cell receptors are internalized, and therefore tetramer-labeled T-lymphocytes significantly reduce their ability to recognize target cells and realize their effector functions. In addition, streptamers, unlike tetramers, do not include streptavidin, which is unacceptable for use in clinical practice. The use of reversible staining to isolate HER2-specific CTLs dramatically increases the overall efficiency of the method.
Проведение стимуляции пролиферации выделенных HER2-специфических ЦТЛ производят в один этап, заключающийся в их культивировании в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл. Одновременность использования цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 позволяет добиться синергидного стимуляторного действия на Т-клеточный рост. Тем самым, повышается эффективность стимуляции пролиферации ЦТЛ, обеспечивается увеличение времени сохранения жизнеспособности данных клеток.Stimulating the proliferation of the isolated HER2-specific CTLs is carried out in one step, which consists in culturing them in the presence of the cytokines rchIL-2, rchIL-7, rchIL-15 simultaneously for 14-20 days, with the final concentration of each of the cytokines rchIL-2, rchIL-7 and rchIL-15 is 50 ng / ml. The simultaneous use of the cytokines rchIL-2, rchIL-7 and rchIL-15 allows us to achieve a synergistic stimulatory effect on T-cell growth. Thus, the efficiency of stimulation of CTL proliferation is increased, and an increase in the time for maintaining the viability of these cells is provided.
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.
Выделенные из периферической крови мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO2 при 37°C с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через трое суток культивирования для созревания незрелых ДК вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл, а еще через сутки полученные зрелые ДК трансфицируют методом магнитной трансфекции ДНК-конструкцией, кодирующей 2 эпитопа опухоль-ассоциированного антигена Her-2/neu, описанные в научной литературе как наиболее иммуногенные эпитопы данного белка (эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV). На следующие сутки для активации HER2-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов полученные трансфицированные ДК подвергают совместному культивированию с неприлипшей фракцией МНК в соотношении 1:10. Через 4 суток совместного культивирования из совместной культуры мононуклеарных и дендритных клеток выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2, с помощью магнитной сепарации по технологии стрептамеров Выделенные HER2-специфичные Т-лимфоциты культивируют в присутствии цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15, в конечной концентрации каждого цитокина, составляющей 50 нг/мл, в течение 14-20 суток, для стимуляции пролиферации ЦТЛ и наработки достаточного количества эффекторных клеток. Смена среды с указанными цитокинами производится через каждые 3-4 дня культивирования. По окончании этапа обогащения популяции HER2-специфичных клеток производится анализ цитотоксической эффективности полученной культуры против клеток, экспрессирующих целевые антигены.Mononuclear cells of adherent fraction isolated from peripheral blood are cultured at a concentration of 1 million / ml in RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 5 × 10 -5 mM 2-mercaptoethanol, 80 μg / ml gentamicin, 100 μg / ml ampicillin in an atmosphere of 5% CO 2 at 37 ° C with the addition of rhGM-CSF (50 ng / ml) and rhIL-4 (100 ng / ml). After three days of cultivation, rcfNO-α is introduced at a dose of 25 ng / ml to mature immature DCs, and another day later, the obtained mature DCs are transfected by magnetic transfection with a DNA construct encoding 2 epitopes of the tumor-associated antigen Her-2 / neu described in scientific literature as the most immunogenic epitopes of a given protein (KIFGSLAFL and RLLQETELV epitopes). The next day, in order to activate HER2-specific cytotoxic T-lymphocytes, the obtained transfected DCs were subjected to co-cultivation with a non-adherent fraction of MNCs in a ratio of 1:10. After 4 days of co-cultivation, cytotoxic T-lymphocytes specific for the KIFGSLAFL and RLLQETELV HER2 protein epitopes are isolated from the co-culture of mononuclear and dendritic cells using magnetic separation using streptamer technology. Isolated HER2-specific T-lymphocytes are cultured in the presence of rhIL-2 cytokines -7 and rhIL-15, in a final concentration of each cytokine of 50 ng / ml, for 14-20 days, to stimulate the proliferation of CTLs and the production of a sufficient number of effector cells. A change of medium with the indicated cytokines is performed every 3-4 days of cultivation. At the end of the enrichment phase of the population of HER2-specific cells, the cytotoxic efficiency of the obtained culture is analyzed against cells expressing target antigens.
После культивирования выделенной фракции антигенспецифических Т-клеток в присутствии цитокинов обогащенные популяции ЦТЛ оценивали методом проточной цитофлуориметрии на содержание CD8-положительных клеток. Анализ показал, что фракция HER2-специфических Т-лимфоцитов содержит не менее 90% клеток, экспрессирующих маркер CD8+, и не менее 75% клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор, распознающий эпитопы белка HER2, что свидетельствует о высоком уровне чистоты культуры HER2-специфичных Т-лимфоцитов (рис. 1).After culturing the isolated fraction of antigen-specific T cells in the presence of cytokines, enriched CTL populations were evaluated by flow cytometry for the content of CD8-positive cells. The analysis showed that the fraction of HER2-specific T-lymphocytes contains at least 90% of cells expressing the CD8 + marker and at least 75% of cells expressing a T-cell receptor that recognizes HER2 protein epitopes, which indicates a high level of purity of the HER2-specific culture T lymphocytes (Fig. 1).
Для стимуляции пролиферации выделенных HER2-специфичных ЦТЛ были подобраны условия культивирования, определяющие оптимальное соотношение иммуномодулирующих цитокинов, которые, согласно сведениям из научной литературы, являются необходимыми молекулами для активации роста и поддержания жизнеспособности цитотоксических Т-лимфоцитов. В результате было показано, что наибольшей эффективностью в стимуляции пролиферативной активности культуры CD8+ лимфоцитов обладает коктейль из трех иммуностимулирующих цитокинов ИЛ-2, ИЛ-7 и ИЛ-15 в дозах по 50 нг/мл каждого.To stimulate the proliferation of the isolated HER2-specific CTLs, culturing conditions were selected that determined the optimal ratio of immunomodulating cytokines, which, according to the scientific literature, are necessary molecules for activating growth and maintaining the viability of cytotoxic T lymphocytes. As a result, it was shown that a cocktail of three immunostimulatory cytokines IL-2, IL-7, and IL-15 in doses of 50 ng / ml each has the greatest efficiency in stimulating the proliferative activity of a CD8 + lymphocyte culture.
Анализ цитотоксического потенциала HER2-специфичных Т-клеток проводился следующим образом. Полученные HER2-специфичные Т-лимфоциты подвергали совместному культивированию с клетками опухолевой линии MCF-7, экспрессирующими рецептор HER2, прижизненно помеченными флуорохромом CFSE до процедуры совместного культивирования. Для совместного культивирования использовали соотношение HER2-специфичных ЦТЛ к клеткам линии MCF-7, равное 10:1, соответственно. Спустя 2 суток совместного культивирования клеток-мишеней и клеток-эффекторов проводился анализ цитотоксического эффекта с помощью оценки относительного количества поврежденных опухолевых клеток в совместной культуре методом проточной цитометрии. В качестве контроля цитотоксичности использовалась совместная культура МНК и ДК, трансфицированных плазмидой, кодирующей эпитопы белка HER2 (рис. 2). Кроме того, был поставлен контроль на спонтанную гибель клеток-мишеней (рис. 2).Analysis of the cytotoxic potential of HER2-specific T cells was carried out as follows. The obtained HER2-specific T lymphocytes were co-cultured with MCF-7 tumor line cells expressing the HER2 receptor intravitally labeled with CFSE fluorochrome prior to the co-culture procedure. For co-cultivation, a ratio of HER2-specific CTLs to MCF-7 cells of 10: 1, respectively, was used. After 2 days of co-culturing the target cells and effector cells, the cytotoxic effect was analyzed by assessing the relative number of damaged tumor cells in the joint culture by flow cytometry. A co-culture of MNCs and DCs transfected with a plasmid encoding the HER2 protein epitopes was used as a control of cytotoxicity (Fig. 2). In addition, spontaneous death of target cells was put in control (Fig. 2).
Анализ данных, полученных в результате экспериментов по оценке цитотоксичности HER2-специфических Т-лимфоцитов от 6 доноров, показал, что относительное количество поврежденных опухолевых клеток в опытных пробах, состоящих из HER2-специфичных Т-лимфоцитов и клеток линии MCF-7, составило в среднем 65,5% от общего числа опухолевых клеток в пробе.An analysis of the data obtained as a result of experiments to assess the cytotoxicity of HER2-specific T-lymphocytes from 6 donors showed that the relative number of damaged tumor cells in experimental samples consisting of HER2-specific T-lymphocytes and MCF-7 cells averaged 65.5% of the total number of tumor cells in the sample.
Результаты эксперимента показали также, что популяция антигенспецифических клеток оказывает более выраженный цитотоксический эффект на опухолевые клетки, по сравнению со смешанной культурой мононуклеарных клеток, активированных ДК, трансфицированными ДНК-конструкцией, кодирующей эпитопы белка HER2.The experimental results also showed that the population of antigen-specific cells exerts a more pronounced cytotoxic effect on tumor cells compared to a mixed culture of mononuclear cells activated by DC transfected with a DNA construct encoding the epitopes of the HER2 protein.
Полученные данные о цитотоксическом потенциале антигенспецифических противоопухолевых ЦТЛ значительно превышают значения уровня цитотоксичности, приводимые в прототипе (20,5% против 65,5%).The obtained data on the cytotoxic potential of antigen-specific antitumor CTLs significantly exceed the values of the level of cytotoxicity given in the prototype (20.5% versus 65.5%).
В ходе эксперимента показано, что разработанный способ получения популяций HER2-специфических Т-лимфоцитов с использованием дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкцией, кодирующей эпитопы белка HER2 и наличием этапа выделения и обогащения популяций ЦТЛ, специфичных к данным эпитопам, позволяет получать антигенспецифические клетки, оказывающие на опухолевые клетки значительно более выраженный цитотоксический эффект по сравнению со смешанной культурой активированных МНК, а также по сравнению с показателями цитотоксичности клеток, генерируемых в прототипе. Таким образом, предложенный способ является эффективным и перспективным для создания Т-клеточных вакцин против HER2-экспрессирующих опухолевых клеток.During the experiment, it was shown that the developed method for producing populations of HER2-specific T lymphocytes using dendritic cells transfected with a DNA construct encoding HER2 protein epitopes and the presence of a stage of isolation and enrichment of CTL populations specific to these epitopes allows one to obtain antigen-specific cells with on tumor cells, a significantly more pronounced cytotoxic effect compared with a mixed culture of activated MNCs, as well as in comparison with glue cytotoxicity current generated in the prototype. Thus, the proposed method is effective and promising for the creation of T-cell vaccines against HER2-expressing tumor cells.
Предложенное изобретение повышает эффективность получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена.The proposed invention increases the efficiency of obtaining in vitro populations of activated antigen-specific antitumor cytotoxic T-lymphocytes specific for tumor-associated antigen epitopes.
Техническим результатом изобретения является индукция эффективного антигенспецифического противоопухолевого цитотоксического иммунного ответа против опухолевых клеток с гиперэкспрессией антигена HER2, характеризующегося увеличением процента гибели HER2-экспрессирующих опухолевых клеток. Изобретение также позволяет получать чистые популяции цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к выбранному опухоль-ассоциированному антигену. Это открывает возможность реализовать адоптивный перенос активированных эффекторных популяций антигенспецифических Т-лимфоцитов пациентам для обнаружения и устранения опухолевых клеток с целью предотвращения рецидивов или развития метастазов, без введения дополнительного клеточного окружения пациенту, т.к. это способно негативно влиять на эффективность цитотоксического эффекта за счет присутствия клеток с толерогенными свойствами.The technical result of the invention is the induction of an effective antigen-specific anti-tumor cytotoxic immune response against tumor cells with overexpression of the HER2 antigen, characterized by an increase in the percentage of death of HER2-expressing tumor cells. The invention also allows the production of pure populations of cytotoxic T lymphocytes specific for the selected tumor-associated antigen. This opens up the possibility of realizing the adaptive transfer of activated effector populations of antigen-specific T-lymphocytes to patients for the detection and elimination of tumor cells in order to prevent relapse or the development of metastases, without introducing an additional cellular environment to the patient, because this can negatively affect the effectiveness of the cytotoxic effect due to the presence of cells with tolerogenic properties.
Дополнительным эффектом является также удешевление и упрощение способа за счет отсутствия этапа выделения CD8+ Т-лимфоцитов и сокращения этапов наработки антигенспецифических ЦТЛ.An additional effect is the reduction and simplification of the method due to the absence of the stage of isolation of CD8 + T-lymphocytes and the reduction of the stages of production of antigen-specific CTLs.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016112218A RU2619186C1 (en) | 2016-03-31 | 2016-03-31 | Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016112218A RU2619186C1 (en) | 2016-03-31 | 2016-03-31 | Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2619186C1 true RU2619186C1 (en) | 2017-05-12 |
Family
ID=58715973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016112218A RU2619186C1 (en) | 2016-03-31 | 2016-03-31 | Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2619186C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717011C1 (en) * | 2018-11-06 | 2020-03-17 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" | Method for inducing immunological tolerance on transplantation antigens in mammals |
| RU2840503C1 (en) * | 2024-05-21 | 2025-05-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии | Method for producing human t-cell receptor specific to epitope 112-120 (kvaelvhfl) of mage-a3 receptor |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719400A (en) * | 2012-07-05 | 2012-10-10 | 时宏珍 | Preparation method of HLA-A0201 restrictive anti-carcinoembryonic antigen (CEA) antigenic specificity cytotoxic T lymphocyte (CTL) |
| US20130108657A1 (en) * | 2010-05-04 | 2013-05-02 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Conditional superagonist ctl ligands for the promotion of tumor-specific ctl responses |
| RU2012116602A (en) * | 2009-10-27 | 2013-12-10 | Иммуникум Аб | METHOD FOR PROLIFERATION OF ANTIGEN SPECIFIC T-CELLS |
-
2016
- 2016-03-31 RU RU2016112218A patent/RU2619186C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2012116602A (en) * | 2009-10-27 | 2013-12-10 | Иммуникум Аб | METHOD FOR PROLIFERATION OF ANTIGEN SPECIFIC T-CELLS |
| US20130108657A1 (en) * | 2010-05-04 | 2013-05-02 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Conditional superagonist ctl ligands for the promotion of tumor-specific ctl responses |
| CN102719400A (en) * | 2012-07-05 | 2012-10-10 | 时宏珍 | Preparation method of HLA-A0201 restrictive anti-carcinoembryonic antigen (CEA) antigenic specificity cytotoxic T lymphocyte (CTL) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2717011C1 (en) * | 2018-11-06 | 2020-03-17 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии" | Method for inducing immunological tolerance on transplantation antigens in mammals |
| RU2840503C1 (en) * | 2024-05-21 | 2025-05-26 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии | Method for producing human t-cell receptor specific to epitope 112-120 (kvaelvhfl) of mage-a3 receptor |
| RU2840503C9 (en) * | 2024-05-21 | 2025-09-29 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии | Method for producing human t-cell receptor specific to epitope 112-120 (kvaelvhfl) of mage-a3 receptor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Perez et al. | Engineering dendritic cell vaccines to improve cancer immunotherapy | |
| US11027001B2 (en) | Therapeutic cancer vaccines derived from a novel dendritic cell line | |
| Reeves et al. | Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene | |
| Sutmuller et al. | Synergism of cytotoxic T lymphocyte–associated antigen 4 blockade and depletion of CD25+ regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses | |
| CA2704232C (en) | Stimulation of anti-tumor immunity using dendritic cell/tumor cell fusions and anti-cd3/cd28 | |
| KR101503341B1 (en) | Methods for isolation and proliferation of autologous cancer antigen-specific CD8+ T cells | |
| Maraskovsky et al. | Dramatic numerical increase of functionally mature dendritic cells in FLT3 ligand-treated mice | |
| CN113677352A (en) | T cell modification | |
| Jacobs et al. | The interaction of NK cells and dendritic cells in the tumor environment: how to enforce NK cell & DC action under immunosuppressive conditions? | |
| JP2018511320A (en) | In vitro artificial lymph node method for sensitization and proliferation of T cells for therapy and epitope mapping | |
| Straetemans et al. | TCR Gene Transfer: MAGE‐C2/HLA‐A2 and MAGE‐A3/HLA‐DP4 Epitopes as Melanoma‐Specific Immune Targets | |
| Kayser et al. | Rapid generation of NY-ESO-1-specific CD4+ THELPER1 cells for adoptive T-cell therapy | |
| zum Buschenfelde et al. | The generation of both T killer and Th cell clones specific for the tumor-associated antigen HER2 using retrovirally transduced dendritic cells | |
| CA2476143A1 (en) | Method for inducing cytotoxic t lymphocyte | |
| Soruri et al. | Ex vivo generation of human anti-melanoma autologous cytolytic T cells by dendritic cell/melanoma cell hybridomas | |
| RU2619186C1 (en) | Method for production of in vitro populations of activated antigenspecific antitumor-tumor cytotoxic t-lymphocytes specific to tumor-associated antigen epitopes | |
| Bixby et al. | CD80 expression in an HLA‐A2‐positive human non‐small cell lung cancer cell line enhances tumor‐specific cytotoxicity of HLA‐A2‐positive T cells derived from a normal donor and a patient with non‐small cell lung cancer | |
| Yoshikawa et al. | Large-scale expansion of γδ T cells and peptide-specific cytotoxic T cells using zoledronate for adoptive immunotherapy | |
| WO2024097864A1 (en) | Expansion of lymphocytes | |
| Kerkmann‐Tucek et al. | Antigen loss variants of a murine renal cell carcinoma: implications for tumor vaccination | |
| Al Qudaihi et al. | Identification of a novel peptide derived from the M-phase phosphoprotein 11 (MPP11) leukemic antigen recognized by human CD8+ cytotoxic T lymphocytes | |
| RU2790867C1 (en) | Method for activating cytotoxic t-lymphocytes in a population of blood mononuclear cells using membrane vesicles obtained from genetically modified tumor cells of m14 melanoma with overexpression of interleukin 2 | |
| Meyer zum Büschenfelde et al. | The generation of both T killer and Th cell clones specific for the tumor-associated antigen HER2 using retrovirally transduced dendritic cells | |
| Akiyama et al. | Characterization of a MAGE-1-derived HLA-A24 epitope-specific CTL line from a Japanese metastatic melanoma patient | |
| Issabekova et al. | The crosstalk between dendritic cells, cytokine-induced killer cells and cancer cells from the perspective of combination therapy |