RU2616275C1 - Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия - Google Patents
Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия Download PDFInfo
- Publication number
- RU2616275C1 RU2616275C1 RU2015154418A RU2015154418A RU2616275C1 RU 2616275 C1 RU2616275 C1 RU 2616275C1 RU 2015154418 A RU2015154418 A RU 2015154418A RU 2015154418 A RU2015154418 A RU 2015154418A RU 2616275 C1 RU2616275 C1 RU 2616275C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- canescens
- strain
- penicillopepsin
- complex
- pep3
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000228172 Penicillium canescens Species 0.000 title claims abstract description 11
- 230000000367 exoproteolytic effect Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 108700033921 EC 3.4.23.20 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract description 15
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 29
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 28
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 23
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 6
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 3
- UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N benzyl n-[2-[(2s)-2-[(4-nitrophenyl)carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1NC(=O)[C@H]1N(C(=O)CNC(=O)OCC=2C=CC=CC=2)CCC1 UTXSFKPOIVELPQ-SFHVURJKSA-N 0.000 claims description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- XAGBTTZSBGDKRS-NSHDSACASA-N (2s)-2-amino-4-methyl-n-nitro-n-phenylpentanamide Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N([N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 XAGBTTZSBGDKRS-NSHDSACASA-N 0.000 claims 1
- AXZJHDNQDSVIDR-NSHDSACASA-N 4178-93-2 Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 AXZJHDNQDSVIDR-NSHDSACASA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 abstract description 15
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 abstract description 15
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 abstract description 9
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 abstract description 7
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 244000010916 Prunus canescens Species 0.000 description 23
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 15
- 101000782453 Homo sapiens Vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog Proteins 0.000 description 13
- 102100035870 Vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog Human genes 0.000 description 13
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 11
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 7
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 5
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 4
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 101150093025 pepA gene Proteins 0.000 description 4
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 2
- 241000995051 Brenda Species 0.000 description 2
- 101100317179 Dictyostelium discoideum vps26 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 101100407639 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) prtB gene Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 2
- 241000863422 Myxococcus xanthus Species 0.000 description 2
- 102000056251 Prolyl Oligopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001148118 Xanthomonas sp. Species 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- -1 cyclic amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 108010007119 flavourzyme Proteins 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 101150048732 lap1 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 1
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101100412459 Arabidopsis thaliana RER3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 101710087092 Dipeptidyl-peptidase 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000589566 Elizabethkingia meningoseptica Species 0.000 description 1
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000204946 Halobacterium salinarum Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 description 1
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000046866 Metula Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 1
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 101710168595 Probable dipeptidyl-peptidase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101710136733 Proline-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 101710178372 Prolyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003667 Serine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000083 Serine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000736131 Sphingomonas Species 0.000 description 1
- NCKJIJSEWKIXAT-DQRAZIAOSA-N [(z)-2-diphenylphosphanylethenyl]-diphenylphosphane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)/C=C\P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NCKJIJSEWKIXAT-DQRAZIAOSA-N 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108090000987 aspergillopepsin I Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940014425 exodus Drugs 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 101150072645 pea gene Proteins 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан ген, кодирующий пенициллопепсин из Penicillium canescens. Описан рекомбинантный штамм Penicillium canescens РЕР 3 ВКМ-F-4662D. Также описан способ получения комплексного ферментного препарата, обладающего активностями пенициллопепсина, лейцинаминопептидазы и пролилспецифичной эндопептидазы. Изобретение позволяет получать высокоактивный комплекс ФП пенициллопепсина, лейцинаминопептидазы и пролилспецифичной эндопептидазы для использования при переработке растительного белоксодержащего сырья в различных областях АПК, для получения белковых гидролизатов из растительного сырья без горечи, с повышенными органолептическими свойствами и улучшенной усвояемостью. 3 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой и кормовой промышленности для получения комплексного препарата грибных протеаз эндо- и экзодействия (пенициллопепсина, пролилспецифичной эндопептидазы и лейцинаминопептидазы), с целью дальнейшего применения для получения белковых гидролизатов из растительного сырья.
Благодаря высокой активности кислой аспартатной протеазы - пенициллопепсина, обладающей широкой субстратной специфичностью и способностью к ограниченному гидролизу высокомолекулярных белковых субстратов, способности лейцинаминопептидазы к удалению N-концевых гидрофобных аминокислот, придающих пептидам горький вкус, а также способности пролилспецифичной эндопептидазы эффективно гидролизовать пептидные связи, соединяющие остатки пролина, изобретение может использоваться для получения белковых гидролизатов без горечи, с повышенными органолептическими свойствами и улучшенной усвояемостью.
Грибные протеазы, благодаря уникальной специфичности действия, обеспечивающей получение продуктов с заданными свойствами, нашли широкое применение в пищевой промышленности.
Основной проблемой при получении белковых продуктов является горечь белковых гидролизатов, обусловленная присутствием остатков гидрофобных аминокислот и пролина в пептидах. Пролин - циклическая аминокислота, играет ключевую физиологическую роль и защищает пептиды от ферментативного гидролиза, что может вызывать такие заболевания, как депрессия, болезнь Паркинсона и целиакия [1].
Для устранения горечи при получении белковых гидролизатов используют протеазы с определенной специфичностью действия. К таким протеазам относятся пепсинподобные аспартатные протеазы, лейцинаминопептидазы (LAP) и пролилспецифичные эндопептидазы.
Пепсинподобные аспартатные протеазы характеризуются широкой субстратной специфичностью и способностью расщеплять пептидные связи между громоздкими гидрофобными остатками [2, 3]. В результате гидролиза белковых субстратов пепсином образуются, преимущественно, мелкие пептиды от 3 до 30 остатков. Несмотря на широкую специфичность, пепсины дают воспроизводимый выход продуктов, т.е. при одинаковых условиях гидролиза белка образуются одинаковые пептиды [4-7]. Наиболее хорошо известными грибными аспартатными протеазами являются аспергиллопепсин и пенициллопепсин [8].
Гомологичный пенициллопепсин (КФ 3.4.23.20), синтезируемый грибами рода Penicillium, обладает широкой субстратной специфичностью, предпочтительно катализирует гидролиз гидрофобных остатков в положении Р1 и Р1', обладает молокосвертывающей способностью [9, 10] применяется в пищевой промышленности для получения пептидов, не образующих горечь [11].
Лейцинаминопептидаза (КФ 3.4.11.1) - экзоаминопептидаза, катализирует расщепление полипептидов, начиная с N-конца с образованием свободных аминокислот, фермент не строго специфичен по отношению к лейцину, но "предпочитает" расположенные на N-конце аминокислоты с разветвленной алифатической цепью [12].
Способность грибных аминопептидаз высвобождать отдельные N-концевые аминокислоты, также как и их термостабильность, делает их перспективными для контроля степени гидролиза и развития вкуса различных белковых субстратов [13, 14]. Так как интенсивность горечи пептида пропорциональна количеству гидрофобных аминокислот на N-конце, LAP используют для удаления единичных или пары гидрофобных аминокислот с N-конца полипептидной цепи при снятии горечи белковых гидролизатов [15-17].
Пепсинподобные аспартатные протеазы и LAP, как правило, являются основными компонентами протеолитического комплекса мицелиальных грибов [18-21].
Пролилспецифичная эндопептидаза (КФ 3.4.21.26) - сериновая эндопептидаза, гидролизующая пролин и, в меньшей степени, аланин в олигопептидах. Фермент гидролизует пептиды с карбоксильной стороны остатков пролина [22].
Пролилспецифичная эндопептидаза - единственный фермент эндодействия, способный эффективно гидролизовать пептидные связи, соединяющие остатки пролина, в богатых пролином белках (глютен, казеин, коллаген и желатин) [1].
В мировой практике основными продуцентами комплексных ферментных препаратов грибных эндо- и экзо-пептидаз являются штаммы рода Aspergillus. Например ФП Flavourzyme 500L (Novozymes, США) получают на основе штамма A. oryzae, ФП Corolase PN-L (АВ enzymes, Финляндия) - на основе штамма A. sojae. Штамм A. oryzae также является продуцентом для получения комплексных препаратов Fungal Protease 500000 и Fungal Protease Concentrate (Genencor International, США), а также Fungal Protease 100 и Protease FNP (Enzeco, США) [23, 24].
Мицелиальные грибы Aspergillus oryzae и Aspergillus sojae являются близкими родственниками. На сегодняшний день в грибах были идентифицированы следующие эндопептидазы: две нейтральные эндопептидазы (NP1 и NP2) [25, 26], щелочная эндопептидаза (ALP) [25, 26] и аспартатная эндопротеаза аспергиллопепсин I (РерО) [27]. Экзопептидазы A. oryzae представлены лейцинаминопептидазами [25, 26], карбоксипептидазами [25], дипептидилпептидазой IV (dppIV) и дипептидилпептидазой V (dppV) [26]. Дипептидилпептидаза IV высвобождает Х-Pro остатки с N-конца и может иметь особое значение для деградации пшеничного глютена, однако коммерческие препараты на основе штаммов A. oryzae, в состав которых входят пролил дипептидилпептидазы, характеризуются высокой стоимостью, что делает их применение нецелесообразным [25,26]. Высокой эффективностью при гидролизе пшеничного глютена характеризуются пролилспецифичные эндопептидазы, не входящие в состав большинства коммерческих комплексных препаратов грибных протеаз [1, 24,26].
Пролилспецифичные эндопептидазы синтезируют Xanthomonas sp., Aeromonas hydrophilic, Pseudomonas sp. KU-22, Sphingomonas capsulate, Lactobacillus helveticus, Halobacterium halobium S9, Myxococcus xanthus, Aspergillus oryzae, A. niger [1, 28, 29].
Однако F. meningosepticum, Xanthomonas sp., A. hydrophila, Pseudomonas sp.KU-22, Myxococcus xanthus относятся к патогенным бактериям, и применение пролилспецифичной эндопептидазы, полученной на их основе, в пищевой промышленности не допускается [1].
В пивоваренной промышленности для стабилизации пива широко применяется ФП Brewers Clarex (DSM, США), содержащий пролилспецифичную эндопептидазу A.niger [30]. Однако ФП Brewers Clarex характеризуется низкой активностью пролилспецифичной протеазы (≥5 PPU/g) при высокой стоимости препарата.
В России единственными продуцентами комплекса грибных эндо- и экзопептидаз являются штаммы A. oryzae 12 и A. oryzae 107, полученные на основе A. oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза [31, 32]. Широкому внедрению производства ФП на основе указанных штаммов препятствует недостаточный уровень протеолитической активности продуцентов. Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутантный штамм A. oryzae 107 (ВКПМ F-929), являющийся продуцентом комплекса кислых и слабокислых протеаз [32].
При глубинном культивировании штамма A. oryzae 107 на средах на основе ячменной муки (3%), пшеничных отрубей (3%) и KH2PO4 (1,5%), в течение 40 ч в зависимости от температуры культивирования 30 и 32°C, активность внеклеточных протеаз, определенная модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина (при рН 4,7), составляет 20,8 -24,8 ед. ПС/мл.
Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении высокоактивного рекомбинантного штамма мицелиального гриба - продуцента комплекса грибных протеаз эндо- и экзодействия для применения в процессах преработки зернового сырья.
Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в использовании нового рекомбинантного штамма и высокоактивного ферментного препарата пенициллопепсина, лейцинаминопептидазы и пролилспецифичной эндопептидазы, полученного на его основе, в процессах переработки растительного белок-содержащего сырья в белковые гидролизаты без горечи, с повышенными органолептическими свойствами и улучшенной усвояемостью для различных отраслей АПК.
Сущность объекта изобретения - новый рекомбинантный штамм гриба Penicillium canescens РЕР3 - продуцент комплекса ферментов: пенициллопепсина, лейцинаминопептидазы и пролилспецифичной пептитидазы, и комплексный ферментный препарат протеаз эндо- и экзодействия на основе P. canescens РЕР3.
Изобретение обеспечивает получение высокоактивного комплексного ФП грибных протеаз эндо- и экзодействия в результате глубинного культивирования нового рекомбинантного штамма P. canescens РЕР3 на ферментационных средах на основе соевой шелухи и кукурузного экстракта.
Рекомбинантный штамм P. canescens РЕР3 создан на основе ауксотрофного штамма P. canescens RN3-11-7 NiaD-, являющегося мутантом штамма P. canescens ВКПМ F-178 [33], путем трансформации экспрессионными плазмидами:
- pPrXyl-PepA, содержащей гомологичный ген pepА, кодирующий пенициллопепсин P. canescens;
- pPrAbf-Lap1, несущей ген lap1, кодтрующий лейцинаминопептидазу А. oryzae;
- pPrXyl-Epo, содержащей ген epo1, кодирующий пролилспецифичную пептидазу A. niger.
Заявляемый штамм Penicillium canescens РЕР3 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под №ВКМ F-4662D.
Штамм Penicillium canescens РЕР3 (ВКМ F-4662D) характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма
Температурный оптимум роста - 28-30°C, рН 4,5-6,0. Аэроб.
Среда Чапека с дрожжевым автолизатом (CYA), 26°C. Диаметр колонии 40-45 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез обильный. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона палевая, буроватая до темно-коричневой.
Среда Мальц-агар (МА), 26°C. Диаметр колонии 30-35 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, пушистый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез средний. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона палевая, в центре слегка оранжевая.
Среда Чапека с глицерином (GN25), 26°C. Диаметр колонии 16-20 мм, отчетливо радиально складчатая, средней плотности, ростовая зона плотная, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, прижатый, конидиальная зона голубовато-серая, конидиогенез слабый. Экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Обратная сторона светлая.
Конидиеносцы двухъярусные, терминальные, фуркатные, шероховатые, длиной более 150 мкм, шириной 3-4 мкм. Метулы шероховатые, 10-18×2,5-3,5 мкм, фиалиды ампуллиформные, 7-8×2,2-2,5 мкм, конидии округлые, иногда овальные, гладкие, 2,2-3,0×2,0-3,0 мкм.
Данный вид мицелиального гриба относится к IV группе патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» (СП 1.3.2322-08), утвержденными Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ №4 от 28 января 2008 г.
Полученный рекомбинантный штамм P. canescens РЕР3 отличается от исходного штамма P. canescens RN3-11-7 NiaD- по морфологическим признакам - более интенсивному спороношению при росте на среде РМ и повышенной способностью при глубинном культивировании на жидких средах к биосинтезу пенициллопесина, пролилспецифичной пептидазы и лейцинаминопептидазы.
Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на скошенном агаре со средой SM при +4°C при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 5-6 мес.
Среда SM (% масс): глюкоза - 1, KH2PO4 - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, агар-агар - 2.
Заявляемый штамм способен синтезировать пенициллопепсин с активностью 50-60 ед/мл, лейцинаминопептидазу с активностью 10-15 ед/мл и пролилспецифичную пептидазу с активностью 0,5-0,6 ед/мл при выращивании в качалочных колбах объемом 750 мл со 100 мл ферментационной среды на качалке (240 об/мин) при 30°C в течение 144 ч. Состав ферментационной среды (% масс): соевая шелуха - 4,5, кукурузный экстракт - 5,0, KН2РО4 - 2,5, рН естественный.
Штамм P.canescens РЕР3 и ферментный препарат, полученный на его основе, будут содержать комплекс протеолитических ферментов эндо- и экзодействия, активный в широком диапазоне рН 3,5-7,0. Преимуществом ферментного препарата РЕР3 будет являться возможность применения в пищевой промышленности в процессах, происходящих при кислых значениях рН в меньших дозировках, чем препараты с нейтральным оптимумом действия. Например, в хлебопечении для повышения качества продукции за счет быстрого расщепления белка на крупные фрагменты при рН 3,5-5,5. В производстве спирта на стадии брожения сусла для улучшения и ускорения процесса сбраживания. В пивоварении для гидролиза белковых веществ при затирании при рН 4,5-5,0 для увеличения выхода экстрактивных веществ в сусло, интенсификации процесса дрожжегенерации и для предотвращения коллоидного помутнения пива, за счет гидролиза белковой составляющей коллоидных частиц, что сокращает расходы за счет исключения этапа холодной стабилизации. Благодаря специфичности действия протеаз препарат также будет гидролизовать глиадины глютена, обладающие антипитательными свойствами.
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.
Пример 1. Получение целевой плазмиды рРеР заключалось в клонировании гена пенициллопепсина из P.canescens (pepA) в универсальный вектор, обеспечивающий экспрессию целевого гена под контролем промотора xylA из P.canescens
Ген рерА получают методом инверсного ПЦР. На первом этапе находят две консервативные области в выравнивании генов, отличающихся наибольшей степенью гомологии с pepА из P.canescens. Затем проводят рестрикцию геномной ДНК P.canescens с использованием эндонуклеазы HindIII, полученный набор фрагментов лигируют. Далее амплифицируют пробу ДНК с использованием инверсных праймеров, комплементарных к консервативным областям:
где I - инозин (универсальный нуклеотид)
Пробу ДНК, размером 1500 п.о. секвенируют по обеим цепям, получая последовательность 5' и 3' концевых участков гена pepА из P.canescens.
Полинуклеотидная последовательность гена рерА и транслируемый полипептид представлены на фиг. 1.
Пример 2. Получение штамма P.canescens РЕР3 ВКМ F-4662D.
Для создания экспрессионных плазмид ПЦР-методом амплифицируют гены целевых ферментов.
Используя в качестве матрицы геномную ДНК P.canescens, амплифицируют полинуклеотидную последовательность размером 1326 п.о., соответствующую целевому гену пенициллопепсина (фиг. 1). Для этого синтезируют следующие праймеры:
Используя в качестве матрицы геномную ДНК A.niger, амплифицируют полинуклеотидную последовательность размером 1578 п.о., соответствующую целевому гену пролилспецифичной пептидазы (AN: АМ270168).
Для этого синтезируют следующие праймеры:
Используя в качестве матрицы геномную ДНК A. oryzae, ПЦР-методом амплифицируют полинуклеотидную последовательность размером 1134 п.о., соответствующую целевому гену лейцинаминопептидазы (AN: ХМ_001825693). Для этого синтезируют следующие праймеры:
Фрагменты ДНК, соответствующие гену пенициллопесина (рерА) и гену пролилспецифичной пептидазы (еро), клонируют в векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной и терминаторной областям гена ксиланазы А P.canescens. Для этого используют метод независимого лигирования, описанный в [34]. Таким образом получают экспрессионные плазмиды PrXyl-PepA и pPrXyl_Epo (фиг. 2 и фиг. 3).
Фрагмент ДНК, соответствующий гену лейцинаминопептидазы (lap1), клонируют в вектор, содержащий полинуклеотидные последовательности, соответствующие промоторной и терминаторной областям гена арабинофуранозидазы P.canescens, с использованием метода независимого лигирования. Таким образом получают экспрессионную плазмиду pPrAbf_Lap1 (фиг. 4).
Трансформацию реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 проводят полученными экспрессионными плазмидами pPrXyl-PepA (5 мкг ДНК), pPrXyl-Epo (5 мкг ДНК), pPrAbf-Lap1 (5 мкг ДНК) совместно с трансформационной плазмидой pSTA10 (1 мкг ДНК), несущей селективный niaD признак.
Трансформанты отбирают на средах с 10 мМ нитрата натрия. Из 20 полученных трансформантов методом PCR отобран 1 клон, содержащий все три целевых гена.
Проверка протеолитических активностей: пенициллопепсина (рН 4,7, 30°C, субстрат гемоглобин), пролилспецифичной пептидазы (рН 4,0, 45°C, субстрат - Z-Gly-Pro-4-нитроанилид) и лейцинаминопептидазы (рН 5,0, 30°C, субстрат - L-Leucine-p-нитроанилид) при глубинном культивировании отобранного трансформанта и реципиентного штамма в колбах (табл. 1) показывает увеличение всех трех активностей у полученного трансформанта.
Результаты ДДС-электрофоретического анализа КЖ штаммов Р. canescens подтверждают наличие в рекомбинантном штамме белков с молекулярными массами 66 кДА, что соответствует ожидаемой массе пролилспецифичной пептидазы, 43 кДА, что соответствует массе пенициллопепсина и 37 кДА, что соответствует ожидаемой массе лейцинаминопептидазы (фиг. 5). Таким образом получают штамм Р. canescens РЕР3.
Пример 2. Культивирование штамма P. canescens РЕР3 ВКМ F-4662D в лабораторном ферментере объемом 3 л, оснащенном системой автоматического регулирования рН, pO2 и температуры, а также барботерами для подачи воздуха в аппарат и двухъярусной мешалкой. Получение инокулята и культивирование проводят на ферментационной среде следующего состава, %: соевая шелуха - 4,5, кукурузный экстракт - 5, KН2РО4 - 2,5. В качестве пеногасителя перед стерилизацией вносят 0,1% Лапрола. Ферментеры засевают 10% вегетативного посевного материала, выращенного в колбах при 28-30°C в течение 24 ч. Температура культивирования - 28±0,2°C; рН естественный (4,0-4,2 в начале ферментации, 6,0-6,1 в конце ферментации). Через каждые 24 ч отбирают пробы КЖ и после удаления биомассы определяют активности целевых ферментов и концентрацию растворимого белка.
В культуральной жидкости на 144 ч роста максимальная активность пенициллопепсина составляет 60 ед/мл, активность пролилспецифичной пептидазы - 0,55 ед/мл, активность лейцинаминопептидазы - 15 ед/мл, содержание растворимого белка в культуральной жидкости - 16 мг/мл.
Пример 3. Из культуральной жидкости штамма, наработанной в соответствии с примером 2, получают концентрированный комплексный ферментный препарат методом лиофильного-высушивания ультраконцентрата (табл. 2).
Эффективность полученного ФП оценивают при гидролизе богатых пролином растительных белков (пшеничной муки и пшеничного глютена) в сравнении с ФП Flavourzyme 500L (Novozymes, США). Гидролиз субстратов проводят в пластиковых микропробирках объемом 2 мл при 40°C при постоянном перемешивании. Концентрация субстрата составляет 250 мг/мл, ФП вносят в дозировке 0,5% к массе субстрата (сырья). Концентрацию субстрата выбирают с учетом параметров реальных технологических процессов в пищевой промышленности (пивоварение, хлебопечение и пр.). Через 3 ч гидролиза полученные ферментолизаты инкубируют при 85°C в течение 5 мин для инактивации протеаз и центрифугируют при 10750 g в течение 5 мин. В супернатантах определяют степень гидролиза белка как отношение концентрации низкомолекулярных белковых продуктов к содержанию общего растворимого белка (табл. 3), используя метод Хартри-Лоури [35]. Концентрацию низкомолекулярных белковых продуктов определяют, предварительно осадив высокомолекулярные белковые соединения 20% трихлоруксусной кислотой.
Осадок, полученный при действии ФП на глютен, используют для качественной оценки гидролиза методом ДДС-электрофореза (Фиг. 6).
Применение ФП РЕР3, полученного из КЖ нового рекомбинантного штамма P.canescens РЕР3, при обработке растительного сырья в течение 3 ч обеспечивает степень гидролиза белков пшеницы - 83%, а глютена - 53%, позволяя увеличить степень гидролиза на 4-3% по сравнению с применением коммерческого ФП Flavourzyme 500L.
Результаты ДДС-электрофореза также свидетельствуют о высокой эффективности нового ФП при устранении наиболее трудно гидролизуемых фракций глютена - глиадинов, обладающих антипитательными свойствами при высокой концентрации субстрата.
Используемые источники литературы
1. Kang С., Yu X., Xu Y. Gene cloning and enzymatic characterization of an endoprotease Endo- Pro-Aspergillus niger. J Ind Microbiol Biotechnol. 2013. Vol. 40. P. 855-864.
2. Fruton J.S. The specificity and mechanism of pepsin action. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol., 1970, V. 33, P. 401-443.
3. Ryle A. The porcine pepsinand pepsinogens. Methods Enzymol, 1970, V. 19, P. 316-336.
4. Zhang Z. and Smith D.L. Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation. Protein Sci., 1993, V. 2, P. 522-531.
5. Voynick I.M. and Fruton J.S. The comparative specificity of acid proteinases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1971, V. 68, №2, P. 257-259.
6. Palashoff M.H. Determining the specificity of pepsin for proteolyticdigestion. Chemistry Master's Theses, 2008, P. 1
7. Davies D.R. The structure and function of the aspartic proteinases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chern, 1990, V. 19, P. 189-215.
8. Monoda M., Capocciaa S., Le chennea В., Zaugga C., Holdomb M., Jousson O. Secreted proteases from pathogenic fungi. Int. J. Med. Microbiol., 2002, V. 292, P. 405-419.
9. Enzyme Database - BRENDA
URL: http://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.23.20
10. Davidson R., Gertler A. and Hofmann T. Aspergillus oryzae acid proteinase. Purification and properties, and formation of 7r-chymotrypsin. Biochem. J., 1975, V. 147, P. 45-53
11. Source Book of Enzymes. John S. White, Dorothy C. White. Published by Taylor Francis Inc, United States, 1997, 1328 P.
12. Enzyme Database - BRENDA
URL: http://brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.11.1
13. Nampoothiri K.M., Nagy V., Kovacs K., Szakacs G. and Pandey A. L-leucine aminopeptidase production by filamentous Aspergillus fungi. Letters in Applied Microbiology, 2005, V. 41, P. 498-504.
14. Toldra F., Aristoy A.C., Flores M. Contribution of muscle amino peptidase to flavor development in dry cured ham. Food Res., 2000, Int. 33, P. 181-185.
15. Ney K.H., Retzlaff G. The shelf life of foods and beverage. In: Charalambous G (ed.) Proceedings of the 4th International Flavor Conference. Amsterdam: Elsevier, 1985, P. 54.
16. Rao M.B., Tanksale A.M., Ghatge M.S., Deshpande V.V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol, and Mol. Biol. Rev, 1998, V. 62(3), P. 597-63573-550.
17. Clemente A. Enzymatic protein hydrolysates in human nutrition. Trends Food Sci Technol., 2000, V. 11, P. 254-262.
18. Sumantha A., Larroche C., Pandey A. Microbiology and Industrial Biotechnology of Food-Grade Proteases: A Perspective. Food Technol. Biotechnol. 2006. V. 44. №2. P. 211-220.
19. Nampoothiri K.M., Nagy V., Kovacs K., Szakacs G. and Pandey A. L-leucine aminopeptidase production by filamentous Aspergillus fungi. Letters in Applied Microbiology. 2005. V. 41. P. 498-504.
20. Ward O.P., Rao M.B., Kulkarni A. Proteases, production. Applied Microbiology: Industrial. 2009. P. 495-511.
21. Shie-Jea Lin, Li-Lin Chen, Chiou-Yen Wen and Wen-Shen Chu. Extracellular leucine aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae LL1 and LL2. African Journal of Microbiology Research. 2010. V. 4 (3). P. 158-168.
22. Enzyme Database - BRENDA
URL: http://brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.4.21.26
23. Patent US 20080299607 A1. Enzymatic Process To Produce Highly Functional Soy Protein from Crude Soy Material. 2008.
24. Enzyme Development Corporation
URL: http://www.enzymedevelopment.com/enzymes/proteases/
25. Doumas A., Van Den Broek P., Affolter M., Monod M. Characterization of the Prolyl Dipeptidyl Peptidase Gene (dppIV) from the Koji Mold Aspergillus oryzae. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64 (12). P. 4809-4815.
26. Merz M., Eisele Т., Berends P., Appel D., Rabe S., Blank I., Stressler Т., Fischer L. Flavourzyme, an Enzyme Preparation with Industrial Relevance: Automated Nine-Step Purification and Partial Characterization of Eight Enzymes. J Agric Food Chem. 2015. V.63(23). P. 5682-93.
doi: 10.1021/acs.jafc.5b01665.
27. Tsujita, Y., and A. Endo. Purification and characterization of the two molecular forms of Aspergillus oryzae acid protease. Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 445 (1). P. 194-204
28. Patent EP 0522428 A1. Prolyl endopeptidase and production thereof. 1993.
29. Patent US 7323327 B2. Genes encoding novel proteolytic enzymes. 2008.
30. Patent EP 2402425 A1. Improved brewing process. 2012.
31. Патент РФ. 2008. №2315097.
32. Патент РФ. 2008. №2315098.
33. Чулкин A.M., Вавилова Е.А., Беневоленский С.В.
Транскрипционный регулятор углеродной катаболитной репрессии CreA мицелиального гриба Penicillium canescens. Молекулярная биология, 2010, Т. 44(4), с. 1-11.
34. Aslanidis С., de Jong P.J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acid Res. 1990. V. 18. №20. P. 6069-6074.
35. Hartree E.F. Determination of protein: A modification of the lowry method that gives a linear photometric response. Analytical Biochemistry J. 1972. V. 48 (2). P. 422-427 doi: 10.1016/0003-2697(72)90094-2.
Claims (4)
1. Ген, кодирующий пенициллопепсин из Penicillium canescens с аминокислотной последовательностью:
MVVFSQITVVLAGLATVTSAVPTGSSRKSTFTVNQKARPVAQPKSLNLPGVYAAALSKYGAAVPASVKAAAESGTAVTTPEDNDVEYLTPVNVGGTTLNLDFDTGSADLWVFSSELSSTESSGHSLYKPSSNATKLAGYTWSIQYGDQSSASGDVYKDSVIVGGVKASAQAVEAASQISQQFVNDKNNDGLLGLAFSSINTVKPKSQTTFFDTVXGQLDSPLFAVTLKHNAPGTYDFGFVDKSKYTGSLTYTQVDSSQGFWSFTADSYKAGSKSGSSITGIADTGTTLLLLPDNVVSDYYGEVSGAQRDSSAGGYTFPCSAQLPDFTVTIGGYDAVVPGSLINYAPLQAGSSTCFGGIQSNSGLGFSIFGDIFLKSQYVVFDANGPRLGFAPQA
2. Рекомбинантный штамм мицеллиального гриба Penicillium canescens PEP 3 ВКМ-F-4662D, несущий ген пенициллопепсина Penicillium canescens по п. 1, - продуцент комплекса протеолитических ферментов экзо- и эндо- действия: пенициллопепсина из P.canescens, лейцинаминопептидазы из Aspergillus oryzae и пролил-специфичной пептитидазы из Aspergillus niger, обладающий повышенной активностью по гемоглобину, Z-Gly-Pro-4-нитроанилиду и L-лейцин-р-нитроанилиду.
3. Способ получения комплексного ферментного препарата, обладающего активностями пенициллопепсина P.canescens, лейцинаминопептидазы из Aspergillus oryzae и пролилспецифичной пептитидазы из Aspergillus niger, обладающий повышенной активностью по гемоглобину, Z-Gly-Pro-4-нитроанилиду и L-лейцин-р-нитроанилиду, включающий культивирование штамма по п. 2 в подходящей среде с последующим концентрированием и сушкой.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154418A RU2616275C1 (ru) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015154418A RU2616275C1 (ru) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2616275C1 true RU2616275C1 (ru) | 2017-04-13 |
Family
ID=58642810
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015154418A RU2616275C1 (ru) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2616275C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2315098C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз |
| RU2315097C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы |
| EP2402425A1 (en) * | 2006-07-13 | 2012-01-04 | DSM IP Assets B.V. | Improved brewing process |
-
2015
- 2015-12-18 RU RU2015154418A patent/RU2616275C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2315098C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых и слабокислых протеаз |
| RU2315097C1 (ru) * | 2006-07-04 | 2008-01-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук | Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы |
| EP2402425A1 (en) * | 2006-07-13 | 2012-01-04 | DSM IP Assets B.V. | Improved brewing process |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ward | Proteases | |
| US6372282B1 (en) | Method for producing a protein hydrolysate | |
| JP4202748B2 (ja) | タンパク加水分解物 | |
| KR101239624B1 (ko) | 식물성 단백질 가수분해물의 제조방법 | |
| MXPA03005128A (es) | Hidrolizados proteicos enriquecidos en peptidos que tienen un residuo carboxiterminal de prolina. | |
| Yasuda et al. | Biochemical aspects of red koji and tofuyo prepared using Monascus fungi | |
| KR20110031324A (ko) | 고함량 글루타민산을 포함하는 이스트 추출물 및 그것의 제조방법 | |
| KR100738648B1 (ko) | 단백질 분해 효소를 첨가한 된장의 제조방법 및 된장 | |
| US5914259A (en) | Production of aminopeptidases form aspergillus niger | |
| Tremacoldi et al. | Production of extracellular acid proteases by Aspergillus clavatus | |
| CN110846351B (zh) | 利用菌体蛋白作为原料制备的苏氨酸发酵培养基 | |
| RU2616275C1 (ru) | Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens pep3 и получение на его основе комплексного ферментного препарата протеаз эндо- и экзодействия | |
| EP2139996B1 (en) | Peptidases from basidiomycetes | |
| EP3830258A1 (en) | Proline specific endopeptidases | |
| RU2423526C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного белка | |
| CN100497616C (zh) | 富含具有羧基末端脯氨酸残基的肽的蛋白质水解产物 | |
| CN110846369B (zh) | 一种联合水解菌体蛋白和大豆蛋白的工艺 | |
| Fiechter | Enzyme Studies | |
| Lin et al. | Extracellular leucine aminopeptidase produced by Aspergillus oryzae LL1 and LL2 | |
| Smirnova et al. | A new enzyme preparation with high penicillopepsin activity based on the producer strain Penicillium canescens | |
| Poza et al. | Industrial applications of microbial proteases and genetic engineering | |
| KR20160063650A (ko) | 우피 분해용 효소 농축액 제조 방법 | |
| JP4071876B2 (ja) | 新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法 | |
| CN101283103A (zh) | 生产重组蛋白的方法 | |
| Kumar | VALUE-ADDED PRODUCTS FROM ALKALINE-FERMENTED FOODS OR FROM MICROORGANISMS PREDOMINATING THEREIN |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171219 |