RU2614960C1 - Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins - Google Patents
Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614960C1 RU2614960C1 RU2016114997A RU2016114997A RU2614960C1 RU 2614960 C1 RU2614960 C1 RU 2614960C1 RU 2016114997 A RU2016114997 A RU 2016114997A RU 2016114997 A RU2016114997 A RU 2016114997A RU 2614960 C1 RU2614960 C1 RU 2614960C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulins
- fluorescent
- sorbent
- unbound
- purification
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 21
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 8
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 6
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 3
- 241000589928 Leptospira biflexa Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000005061 Vibrio cholerae O22 Species 0.000 description 2
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000164109 Brucella abortus 544 Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical class O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000000395 magnesium oxide Substances 0.000 description 1
- CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N magnesium oxide Inorganic materials [Mg]=O CPLXHLVBOLITMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N magnesium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[Mg+2] AXZKOIWUVFPNLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910021647 smectite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000002522 swelling effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве иммуноглобулинов флуоресцирующих для индикации возбудителей инфекционных болезней в реакции иммунофлуоресценции (РИФ).The invention relates to biotechnology and can be used in the production of fluorescent immunoglobulins to indicate infectious pathogens in the immunofluorescence reaction (RIF).
Для получения высокоактивных, специфичных иммуноглобулинов флуоресцирующих, применяемых в РИФ, необходимо провести качественную очистку препаратов от несвязавшегося красителя - флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) и сорбцию гетерологичных антител.To obtain highly active, specific fluorescent immunoglobulins used in the RIF, it is necessary to conduct a high-quality purification of preparations from an unbound dye - fluorescein isothiocyanate (FITC) and sorption of heterologous antibodies.
Известен способ получения иммуноглобулинов флуоресцирующих, включающий получение сыворотки, иммуноглобулинов, конъюгацию с ФИТЦ, очистку от несвязавшегося флуорохрома [1].A known method for producing fluorescent immunoglobulins, including the production of serum, immunoglobulins, conjugation with FITC, purification from unbound fluorochrome [1].
Недостатком способа является отсутствие 100% специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих диагностических в связи с применением хроматографической очистки препарата только от несвязавшегося ФИТЦ без освобождения от гетерологичных антител.The disadvantage of this method is the lack of 100% specificity of fluorescent diagnostic immunoglobulins due to the use of chromatographic purification of the drug only from unbound FITC without release from heterologous antibodies.
Известен способ получения иммуноглобулинов флуоресцирующих, включающий получение антител, конъюгацию с ФИТЦ, очистку от несвязавшегося флуорохрома диализом. При использовании данной методики, при получении флуоресцирующих препаратов на основе поликлональных антител, отмечена неспецифическая реакция при взаимодействии с клетками V. cholerae O22. В процессе адсорбции сыворотки клетками V. cholerae O22 не удалось полностью избавиться от гетерологичных антител [2].A known method of producing immunoglobulins fluorescent, including the production of antibodies, conjugation with FITC, purification from unbound fluorochrome by dialysis. When using this technique, when receiving fluorescent preparations based on polyclonal antibodies, a nonspecific reaction was noted when interacting with V. cholerae O22 cells. In the process of adsorption of serum by V. cholerae O22 cells, it was not possible to completely get rid of heterologous antibodies [2].
Недостатком способа является отсутствие 100% специфичности диагностических иммуноглобулинов флуоресцирующих в связи с применением диализа для очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ без качественного освобождения от гетерологичных антител.The disadvantage of this method is the lack of 100% specificity of diagnostic immunoglobulins fluorescent in connection with the use of dialysis to clean the drug from unbound FITC without qualitative release from heterologous antibodies.
Известен способ получения флуоресцирующего сальмонеллезного препарата, включающий инактивацию сальмонелл формалином, очистку хлороформом, центрифугирование и конъюгирование с ФИТЦ, отмывку от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования [3].A known method of obtaining a fluorescent salmonella preparation, including inactivation of salmonella with formalin, purification with chloroform, centrifugation and conjugation with FITC, washing from unreacted dye by repeated centrifugation [3].
Недостатком способа является длительность очистки препарата от несвязавшегося ФИТЦ путем многократного центрифугирования.The disadvantage of this method is the duration of the purification of the drug from unbound FITC by repeated centrifugation.
Известен способ сорбции иммунной сыворотки крови, включающий иммуносорбцию неспецифических антител водорастворимыми гетерологичными антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, в качестве которого используют модифицированный алюмосиликат с магнитными свойствами [4].A known method of sorption of immune blood serum, comprising the immunosorption of non-specific antibodies with water-soluble heterologous antigens immobilized on a solid-phase carrier, which is used as a modified aluminosilicate with magnetic properties [4].
Недостатком способа является применение сорбента, выполняющего одну функцию - сорбцию гетерологичных антител без очистки от несвязавшегося ФИТЦ.The disadvantage of this method is the use of a sorbent that performs one function - the sorption of heterologous antibodies without purification from unbound FITC.
Цель изобретения - создание бифункционального аффинного сорбента для хроматографической очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося ФИТЦ и гетерологичных антител.The purpose of the invention is the creation of a bifunctional affinity sorbent for chromatographic purification of immunoglobulins fluorescent from unbound FITC and heterologous antibodies.
Известны различные методы очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося флуорохрома (чаще всего используют метод гельфильтрации с сефадексом G-50 [5] и от гетерологичных антител (применяют корпускулярные антигены или сорбенты с иммобилизованными водорастворимыми гетерологичными антигенами)). Но их применение имеет ряд недостатков. Сефадкс G-50 - дорогостоящий реактив импортного производства. Сорбция корпускулярными антигенами существенно понижает специфические титры антител. Используемые полиакриламидные сорбенты с иммобилизованными водорастворимыми антигенами из гетерологичных штаммов включают в своем составе высокотоксичные дорогостоящие импортные реактивы.Various methods are known for purifying fluorescent immunoglobulins from unbound fluorochrome (most often gel filtration using Sephadex G-50 [5] and heterologous antibodies is used (corpuscular antigens or sorbents with immobilized water-soluble heterologous antigens are used)). But their use has several disadvantages. Sephadx G-50 is an expensive imported reagent. Sorption by corpuscular antigens significantly lowers specific antibody titers. Used polyacrylamide sorbents with immobilized water-soluble antigens from heterologous strains include highly toxic expensive imported reagents.
Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих используется модифицированный неосмектин (смектит диоктаэдрический) с иммобилизованными гетерологичными антигенами. Аффинный сорбент обладает бифункциональными свойствами, позволяя провести качественную очистку препаратов от несвязавшегося низкомолекулярного вещества - ФИТЦ и сорбцию гетерологичных антител с сохранением активности иммуноглобулинов флуоресцирующих.The technical result of the invention is achieved in that a modified neosmectin (dioctahedral smectite) with immobilized heterologous antigens is used as a bifunctional affinity sorbent for purification of fluorescent immunoglobulins. The affinity sorbent has bifunctional properties, allowing high-quality purification of preparations from unbound low molecular weight substances - FITC and the sorption of heterologous antibodies while maintaining the activity of fluorescent immunoglobulins.
Неосмектин - тонкий, мелкодисперсный порошок для приготовления суспензии (Производитель: ЗАО «Фармпроект», г. Санкт-Петербург). Мощный адсорбент нового поколения, обладающий улучшенными сорбционными свойствами. Эффективно адсорбирует бактерии, вирусы. Состав его представлен соединениями, основными из которых является окись алюминия, окись магния и двуокись кремния, имеет дискоидно-кристаллическую структуру, поэтому обладает выраженным селективным адсорбирующим действием, характеризуется незначительным эффектом набухания.Neosmectin is a fine, finely divided powder for suspension preparation (Manufacturer: Farmproekt CJSC, St. Petersburg). A powerful new generation adsorbent with improved sorption properties. Effectively adsorbs bacteria, viruses. Its composition is represented by compounds, the main of which are aluminum oxide, magnesium oxide and silicon dioxide, has a discoid-crystalline structure, and therefore has a pronounced selective adsorbing effect, characterized by a slight swelling effect.
Первоначально апробацию сорбента проводили на растворе ФИТЦ без иммуноглобулинов, используя неосмектин, а для сравнения - сефадекс G-50 (традиционно применяемый при хроматографической очистке). Сефадекс имеет ряд достоинств, но низкая степень пористости не позволяет использовать его при аффинной хроматографии. Сефадекс можно использовать для очистки от низкомолекулярного красителя, но нельзя применять для иммобилизации белковых лигандов, т.е. получения аффинных сорбентов.Initially, the sorbent was tested on an FITC solution without immunoglobulins using neosmectin, and for comparison, Sephadex G-50 (traditionally used in chromatographic purification). Sephadex has several advantages, but the low degree of porosity does not allow its use in affinity chromatography. Sephadex can be used to purify low molecular weight dyes, but cannot be used to immobilize protein ligands, i.e. obtaining affinity sorbents.
Процент сорбции свободного ФИТЦ на сорбентах определяли следующим образом: сорбенты отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), рН 9,5 до отсутствия спектра поглощения при длине волны 495 нм (максимальный спектр поглощения для ФИТЦ), и к 0,4 г сорбентов добавляли по 0,5 мг/мл раствора ФИТЦ. Через 1 ч процент сорбции ФИТЦ на сефадексе и неосмектине составил (80±1)%.The percentage of sorption of free FITC on sorbents was determined as follows: sorbents were washed with phosphate-buffered saline (PBS), pH 9.5 until there was an absorption spectrum at a wavelength of 495 nm (maximum absorption spectrum for FITC), and 0.4 g of sorbents were added with 0.5 mg / ml FITC solution. After 1 h, the percentage of sorption of FITC on Sephadex and neosmectin was (80 ± 1)%.
Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимые антигены, полученные из биомасс гетерологичных штаммов микроорганизмов. Для этого сорбенты отмывали ФСБ, рН 7,2 до отсутствия спектра поглощения при длине волны 280 нм (максимальный спектр поглощения для белка). К 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл комплексного водорастворимого бруцеллезного антигена с концентрацией белка 0,5; 1,5; 2,5 и 3,5 мг/мл, полученного из биомасс штаммов В. abortus 544, В. abortus 19 - ВА, В. abortus 345, дающих перекрестную реакцию с иммуноглобулинами туляремийными. Иммобилизацию антигена с матрицей вели при температуре (22±4)°C в течение 1; 2; 4; 18 ч. В результате исследований установлено, что концентрация белка 1,5 мг/мл в объеме 2,5 мл является оптимальной для полного насыщения сорбента антигеном в течение 2 ч.In order to impart biospecific properties to the neosmectin sorbent (obtaining an affinity sorbent), water-soluble antigens obtained from biomass of heterologous microorganism strains were immobilized on its surface. To do this, the sorbents were washed with FSB, pH 7.2, until the absence of an absorption spectrum at a wavelength of 280 nm (maximum absorption spectrum for protein). To 0.4 g of the sorbent was added 2.5 ml of complex water-soluble brucellosis antigen with a protein concentration of 0.5; 1.5; 2.5 and 3.5 mg / ml obtained from biomass of strains B. abortus 544, B. abortus 19 - VA, B. abortus 345, which give a cross-reaction with tularemia immunoglobulins. The antigen with the matrix was immobilized at a temperature of (22 ± 4) ° C for 1; 2; four; 18 hours. As a result of studies, it was found that a protein concentration of 1.5 mg / ml in a volume of 2.5 ml is optimal for complete saturation of the sorbent with antigen for 2 hours.
В результате отработки всех параметров получен бифункциональный аффинный сорбент, пористая структура которого и селективные свойства эффективны для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител.As a result of testing all the parameters, a bifunctional affinity sorbent was obtained, the porous structure of which and selective properties are effective for purification of fluorescent immunoglobulins from unbound dye and heterologous antibodies.
Технология получения бифункционального аффинного сорбента состояла из нескольких этапов: отмывка сорбента до нулевой экстинции на спектрофотометре; иммобилизация с гетерологичными антигенами; отмывка сорбента от несвязавшихся антигенов; очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих от свободного ФИТЦ и гетерологичных антител; оценка полноты очистки препарата от несвязавшегося красителя; контроль иммунологических показателей препарата.The technology for producing a bifunctional affinity sorbent consisted of several stages: washing the sorbent to zero extinction on a spectrophotometer; immobilization with heterologous antigens; washing the sorbent from unbound antigens; purification of fluorescent immunoglobulins from free FITC and heterologous antibodies; assessment of the completeness of purification of the drug from unbound dye; control of immunological parameters of the drug.
Иммуноглобулины флуоресцирующие диагностические освобождали от несвязавшегося флуорохрома традиционным методом хроматографии на колонке с сефадексом G-50 и с помощью разработанного аффинного сорбента, добавляя к нему (после центрифугирования при 6000 g в течение 10 мин) иммуноглобулины флуоресцирующие. Для их очистки в объеме 5 мл путем гельфильтрации необходимо 20 г сефадекса G-50, упакованного в хроматографическую колонку, а разработанного аффинного сорбента - 2,0 г.Diagnostic fluorescent immunoglobulins were freed from unbound fluorochrome using the traditional Sephadex G-50 column chromatography method and using the developed affinity sorbent, adding fluorescent immunoglobulins to it (after centrifugation at 6000 g for 10 min). For their purification in a volume of 5 ml by gel filtration, 20 g of Sephadex G-50, packed in a chromatographic column, are needed, and the developed affinity sorbent is 2.0 g.
Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон со взвесью разработанного аффинного сорбента (2,0 г) с рН 9,5, взвесь инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие туляремийные диагностические.To purify fluorescent tularemia immunoglobulins from unbound dye and heterologous antibodies, they were added in a volume of 5 ml into a vial with a suspension of the developed affinity sorbent (2.0 g) with a pH of 9.5, the suspension was incubated for 1 h at a temperature of (22 + 4) ° C and centrifuged at 6000 g for 10 min. The supernatant was a purified immunoglobulin fluorescent tularemia diagnostic.
Оценку результатов активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих определяли на фиксированных мазках гомологичных и гетерологичных штаммов прямым методом окраски препаратов в РИФ, предварительно проверив активность иммуноглобулинов до сорбции и метки ФИТЦ в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) (табл. 1).The evaluation of the results of the activity and specificity of fluorescent immunoglobulins was determined on fixed smears of homologous and heterologous strains by direct staining of the preparations in the RIF, previously checking the activity of the immunoglobulins before sorption and the FITC label in the indirect immunofluorescence (RNIF) reaction (Table 1).
Микроскопию препаратов проводили в люминесцентном микроскопе серии "Люмам", используя соответствующие фильтры согласно инструкции по эксплуатации прибора. В результате экспериментов получены высокоактивные, специфичные иммунофлуоресцирующие препараты. Проанализировано 3 серии иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных с концентрацией белка 9-10 мг/мл и молярным соотношением Мф/Мб (нагрузка красителя на белок) от 5,8 до 11,0. Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным разведению 1:64 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:32 - 1:64. Наблюдалось яркое свечение гомологичных штаммов и отсутствие свечения гетерологичных штаммов, окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих.Microscopy of the preparations was carried out in a luminescent microscope of the Lumam series, using appropriate filters according to the operating instructions for the device. As a result of the experiments, highly active, specific immunofluorescent preparations were obtained. 3 series of fluorescent tularemia immunoglobulins with a protein concentration of 9-10 mg / ml and a molar ratio of Mf / Mb (dye load on protein) from 5.8 to 11.0 were analyzed. The specific activity of all the prepared series was characterized by a coloring titer equal to a dilution of 1:64 - 1: 128 in the study of smears of homologous pathogens, working dilution of the preparations was 1:32 - 1:64. A bright luminescence of homologous strains and the absence of luminescence of heterologous strains stained by working dilution of fluorescent immunoglobulins were observed.
Полноту очистки препарата от несвязавшегося флуорохрома определяли методом восходящей хроматографии на бумаге [7]. На хроматографической бумаге обнаруживалось одно ярко флуоресцирующее пятно на месте нанесения препарата, что свидетельствовало о полной очистке иммуноглобулинов флуоресцирующих от ФИТЦ.The completeness of purification of the drug from unbound fluorochrome was determined by upward chromatography on paper [7]. On chromatographic paper, one brightly fluorescent spot was found at the site of application of the drug, indicating a complete purification of immunoglobulins fluorescent from FITC.
Для сравнения проведена очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных от несвязавшегося флуорохрома по традиционной методике, используя колонку хроматографическую с сефадексом G-50 и от гетерологичных антител, используя полиакриламидный сорбент с фиксированным комплексным бруцеллезным водорастворимым антигеном.For comparison, the fluorescent tularemia immunoglobulins were purified from unbound fluorochrome according to the traditional method using a chromatographic column with Sephadex G-50 and heterologous antibodies using a polyacrylamide sorbent with a fixed complex brucellous water-soluble antigen.
При сравнительном изучении в РИФ активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных диагностических, полученных традиционным и модифицированным методами, установлена сопоставимость полученных результатов, а с учетом снижения временных, трудовых и материальных затрат - превосходство предложенного одномоментного метода очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител становится очевидным (стоимость сефадекса G-50 в 25-30 раз выше стоимости неосмектина).A comparative study of the activity and specificity of immunoglobulins of fluorescent tularemia diagnostic obtained by traditional and modified methods in the RIF shows that the results are comparable, and given the reduction in time, labor and material costs, the superiority of the proposed instant method for purifying immunoglobulins fluorescent from unbound dye and heterologous antibodies becomes obvious (the cost of Sephadex G-50 is 25-30 times higher than the cost of neosmectin).
Бифункциональность свойств сорбентов позволяла выполнять две задачи. Первая - освобождение иммуноглобулинов флуоресцирующих от несвязавшегося красителя - ФИТЦ - в результате физической сорбции последнего на сорбенте. Вторая - очистка иммуноглобулинов флуоресцирующих от гетерологичных антител за счет аффинных взаимодействий последних, входящих в состав иммуноглобулинов и соответствующих антигенов, фиксированных на сорбенте. Отработанная при этом методика может быть использована как основа для получения высокоактивных, специфических иммуноглобулинов флуоресцирующих диагностических при выявлении возбудителей различных инфекций.The bifunctionality of the properties of sorbents allowed us to perform two tasks. The first is the release of fluorescent immunoglobulins from an unbound dye - FITC - as a result of the physical sorption of the latter on a sorbent. The second is the purification of immunoglobulins fluorescent from heterologous antibodies due to the affinity interactions of the latter, which are part of the immunoglobulins and corresponding antigens, fixed on the sorbent. The methodology worked out in this case can be used as the basis for obtaining highly active, specific fluorescent diagnostic immunoglobulins in identifying pathogens of various infections.
Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.The possibility of practical application of the proposed method is illustrated by examples of its specific implementation using a combination of the claimed features.
Пример 1. Получение бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, контроль в РИФ.Example 1. Obtaining a bifunctional affinity sorbent for the purification of immunoglobulins fluorescent leptospirosis from unbound dye and heterologous antibodies, control in the RIF.
При контроле специфичности иммуноглобулинов лептоспирозных установлено, что наблюдается перекрестная реакция с L. biflexa серогруппы Semaranga, серовар patoc I. Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимый антиген, полученный из биомассы L. biflexa серогруппы Semaranga, серовар patoc I. Для этого сорбент отмывали ФСБ, рН 7,2 и к 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл водорастворимого антигена с концентрацией белка 1,5 мг/мл, инкубировали 2 ч, отмывали от несвязавшегося антигена.When controlling the specificity of leptospirosis immunoglobulins, it was found that a cross reaction is observed with L. biflexa of the serogroup Semaranga, serovar patoc I. To impart biospecific properties to the sorbent neosmectin (obtaining an affinity sorbent), a water-soluble antigen obtained from the biomass L. bema biomass was immobilized on its surface serovar patoc I. For this, the sorbent was washed with FSB, pH 7.2, and 2.5 ml of a water-soluble antigen with a protein concentration of 1.5 mg / ml was added to 0.4 g of the sorbent, incubated for 2 h, washed from an unbound antigen.
Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон с разработанным аффинным сорбентом (2,0 г) с рН 9,5, инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие диагностические лептоспирозные. Далее исследовали иммунологические показатели готовых препаратов (активность, специфичность) в РИФ (табл. 2).For purification of fluorescent leptospirosis immunoglobulins from unbound dye and heterologous antibodies, they were added in a volume of 5 ml to a bottle with a developed affinity sorbent (2.0 g) with a pH of 9.5, incubated for 1 h at a temperature of (22 + 4) ° C and centrifuged at 6000 g for 10 minutes The supernatant was a purified immunoglobulin fluorescent diagnostic leptospirosis. Next, we studied the immunological parameters of the finished drugs (activity, specificity) in the RIF (table. 2).
Проанализировано 3 серии иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных с концентрацией белка 10-11 мг/мл и молярным соотношением Мф/Мб от 6,5 до 11,5. Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным 1:32 - 1:64 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:16 - 1:32.3 series of fluorescent leptospirosis immunoglobulins with a protein concentration of 10-11 mg / ml and a Mf / Mb molar ratio of from 6.5 to 11.5 were analyzed. The specific activity of all the prepared series was characterized by a coloring titer equal to 1:32 - 1:64 in the study of smears of homologous pathogens, working dilution of the preparations was 1:16 - 1:32.
Для изучения специфичности испытываемых серий иммуноглобулинов флуоресцирующих в опыт были взяты штаммы культур гетерологичных микроорганизмов: L. biflexa patoc I, L. biflexa Doberdo RPE, Listeria monocytogenes 1-7 серотип, Y. pseudotuberculosis I-II серовар, E.coli 0-10, F. tularensis Miura, B. abortus 19 ВА. В результате констатировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих лептоспирозных.To study the specificity of the tested series of immunoglobulins fluorescent, strains of cultures of heterologous microorganisms were taken as experiments: L. biflexa patoc I, L. biflexa Doberdo RPE, Listeria monocytogenes 1-7 serotype, Y. pseudotuberculosis I-II serovar, E. coli 0-10, F. tularensis Miura, B. abortus 19 VA. As a result, the absence of specific immunofluorescence was detected in all heterologous microorganisms taken in experience and stained by working dilution of fluorescent leptospirosis immunoglobulins.
Пример 2. Получение бифункционального аффинного сорбента для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих бруцеллезных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител, контроль в РИФ.Example 2. Obtaining a bifunctional affinity sorbent for the purification of immunoglobulins fluorescent brucellosis from unbound dye and heterologous antibodies, control in the RIF.
При контроле специфичности иммуноглобулинов бруцеллезных установлено, что наблюдаются перекрестные реакции с F. tularensis Schu и F. tularensis 890 Аз. Для придания сорбенту - неосмектину биоспецифических свойств (получение аффинного сорбента) на его поверхность иммобилизовали водорастворимые антигены, полученные из биомасс вышеназванных штаммов. Для этого сорбент отмывали ФСБ, рН 7,2 и к 0,4 г сорбента вносили 2,5 мл водорастворимого антигена с концентрацией белка 1,5 мг/мл, инкубировали 2 ч, отмывали от несвязавшегося антигена.When controlling the specificity of brucellosis immunoglobulins, it was found that cross reactions with F. tularensis Schu and F. tularensis 890 Az are observed. To impart biospecific properties to the neosmectin sorbent (obtaining an affinity sorbent), water-soluble antigens obtained from the biomass of the above strains were immobilized on its surface. For this, the sorbent was washed with FSB, pH 7.2, and 2.5 ml of a water-soluble antigen with a protein concentration of 1.5 mg / ml was added to 0.4 g of the sorbent, incubated for 2 h, and washed from an unbound antigen.
Для очистки иммуноглобулинов флуоресцирующих бруцеллезных от несвязавшегося красителя и гетерологичных антител их вносили в объеме 5 мл во флакон со взвесью разработанного аффинного сорбента (2,0 г) с рН 9,5, взвесь инкубировали 1 ч при температуре (22+4)°C и центрифугировали при 6000 g в течение 5-10 мин. Надосадочная жидкость представляла собой очищенные иммуноглобулины флуоресцирующие бруцеллезные диагностические. Далее исследовали специфическую активность готовых препаратов в РИФ (табл. 3).To purify immunoglobulins of fluorescent brucellosis from unbound dye and heterologous antibodies, they were added in a volume of 5 ml into a vial with a suspension of the developed affinity sorbent (2.0 g) with a pH of 9.5, the suspension was incubated for 1 h at a temperature of (22 + 4) ° C and centrifuged at 6000 g for 5-10 minutes. The supernatant was a purified immunoglobulin fluorescent diagnostic brucellosis. Next, we studied the specific activity of the finished drugs in the RIF (Table 3).
Специфическая активность всех приготовленных серий характеризовалась красящим титром, равным 1:64 - 1:128 при исследовании мазков гомологичных возбудителей, рабочее разведение препаратов - 1:32- 1:64.The specific activity of all the prepared series was characterized by a coloring titer equal to 1:64 - 1: 128 in the study of smears of homologous pathogens; working dilution of the preparations was 1: 32-1: 64.
Для изучения специфичности испытываемых серий иммуноглобулинов флуоресцирующих в опыт были взяты штаммы культур гетерологичных микроорганизмов: Y. pseudotuberculosis серовар 1, 2; Y. enterocolitica 64,178; E.coli 0-10, 0-11; F. tularensis Miura; F. tularensis 890 Аз; F. tularensis Schu; F. tularensis 15 НИИЭГ; F. tularensis 503/840. В результате констатировано отсутствие специфической иммунофлуоресценции у всех гетерологичных микроорганизмов, взятых в опыт и окрашенных рабочим разведением иммуноглобулинов флуоресцирующих туляремийных.To study the specificity of the tested series of immunoglobulins fluorescent, strains of cultures of heterologous microorganisms were taken as an experiment: Y. pseudotuberculosis serovar 1, 2; Y. enterocolitica 64.178; E. coli 0-10, 0-11; F. tularensis Miura; F. tularensis 890 az; F. tularensis Schu; F. tularensis 15 NIIEG; F. tularensis 503/840. As a result, the absence of specific immunofluorescence was detected in all heterologous microorganisms taken in experiment and stained by working dilution of immunoglobulins of fluorescent tularemia.
Источники информацииInformation sources
1. Патент РФ №2429484. Дондурей Е.А., Осидак Л.В., Потапенко Л.Б., Голованова А.К., Милькинт К.К., Суховецкая В.Ф., Сироткин А.К. Способ экспресс-диагностики ротавирусной инфекции в материалах из верхних дыхательных путей, иммуноглобулин флуоресцирующий сухой для его осуществления. Опубликован 20.09.2011 г. Бюл. №26.1. RF patent No. 2429484. Dondurey E.A., Osidak L.V., Potapenko L.B., Golovanova A.K., Milkint K.K., Sukhovetskaya V.F., Sirotkin A.K. A method for rapid diagnosis of rotavirus infection in materials from the upper respiratory tract, dry fluorescent immunoglobulin for its implementation. Published on September 20, 2011 Byul. No. 26.
2. Кретенчук О.Ф., Алексеева Л.П., Маркина О.В. Оптимизация условий получения диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации холерных вибрионов O1 и O139-серогрупп // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - Вып. №12 - С. 32-34.2. Kretenchuk O.F., Alekseeva L.P., Markina O.V. Optimization of the conditions for obtaining diagnostic fluorescent monoclonal immunoglobulins for the identification of cholera vibrios of O1 and O139 serogroups // Clinical Laboratory Diagnostics. - 2012. - Issue. No. 12 - S. 32-34.
3. Патент РФ №2175558. Пантюхина А.Н., Кротова М.Л. Способ получения сухого флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума. Опубликован 10.11.2001 г. Бюл. №31.3. RF patent No. 2175558. Pantyukhina A.N., Krotova M.L. A method of obtaining a dry fluorescent salmonella diagnosticum. Published November 10, 2001 Byul. No. 31.
4. Патент РФ №2200324. Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Жданова Е.В. Способ сорбции иммунной сыворотки крови. Опубликован 10.03.2003 г. Бюл. №7.4. RF patent No. 2200324. Afanasyev E.N., Efremenko V.I., Tyumentseva I.S., Zhdanova E.V. A method of sorption of immune serum. Published March 10, 2003 Byul. Number 7.
5. Ибрагимов А.Н., Бикмуллин А.Г., Сатаева Д.А., Лопухов Л.В., Зайнуллин Л.И., Алимова Ф.К. Хроматографические методы очистки белков. Учебно-методическое пособие. - Казань: ФГАОУВПОКФУ, 2013. - 48 с.5. Ibragimov A.N., Bikmullin A.G., Sataeva D.A., Lopukhov L.V., Zaynullin L.I., Alimova F.K. Chromatographic methods for protein purification. Teaching aid. - Kazan: FGAOUVPOKFU, 2013 .-- 48 p.
6. Носков Ф.С. Очистка конъюгатов от непрореагировавшего флюорохрома // Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / Под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. - М., 1985. - С. 254.6. Noskov F.S. Purification of conjugates from unreacted fluorochrome // Immunological diagnosis of viral infections / Ed. T.V. Peradze, P. Halonen. - M., 1985 .-- S. 254.
7. Шторц X. Иммунофлюоресценция: Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - С. 128-148.7. Storz X. Immunofluorescence: Immunological methods. - M .: Medicine, 1987 .-- S. 128-148.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016114997A RU2614960C1 (en) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016114997A RU2614960C1 (en) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2614960C1 true RU2614960C1 (en) | 2017-03-31 |
Family
ID=58506863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016114997A RU2614960C1 (en) | 2016-04-18 | 2016-04-18 | Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2614960C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2246968C2 (en) * | 2003-03-31 | 2005-02-27 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method for preparing magnetic immunosorbent for detection of bacterial antigens |
| RU2558091C2 (en) * | 2013-07-04 | 2015-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Трейдсервис" | Dispersible tablet of dioctahedral smectite and method for producing it |
| RU2565196C1 (en) * | 2014-09-19 | 2015-10-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of producing enterosorbent |
-
2016
- 2016-04-18 RU RU2016114997A patent/RU2614960C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2246968C2 (en) * | 2003-03-31 | 2005-02-27 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method for preparing magnetic immunosorbent for detection of bacterial antigens |
| RU2558091C2 (en) * | 2013-07-04 | 2015-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Трейдсервис" | Dispersible tablet of dioctahedral smectite and method for producing it |
| RU2565196C1 (en) * | 2014-09-19 | 2015-10-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Method of producing enterosorbent |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| МАЕВ И.В. и др. Аспекты клинического применения энтеросорбента Неосмектин.//РМЖ. 2008. N 2. с.62. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2593793B1 (en) | A method of detecting surrogate markers for active tuberculosis in a serum sample | |
| JP2894841B2 (en) | Compositions and methods for control of reactivity between diagnostic reagents and microorganisms | |
| IL105119A (en) | Immunoglobins and antigens for the treatment of staphylococcus infections methods of the identification and preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same | |
| US4493825A (en) | Purified and antigenically selective vaccines for domestic animals | |
| US20200355682A1 (en) | Apparatus and method for detecting microbial contamination | |
| JP5009478B2 (en) | Bacterial toxin adsorbent, adsorption removal method thereof and adsorber filled with the adsorbent | |
| FI60319B (en) | FOERFARANDE FOER PAOVISNING ELLER BESTAEMNING AV ANTIKROPPAR I KROPPSVAETSKOR MED HJAELP AV KAENDA ANTIGENER ELLER FOER BESTTAEMNING AV ANTIGENER MED HJAELP AV KAENDA ANTIKROPPAR FRAON KROPPSVAETSKOR SAMT MED | |
| RU2614960C1 (en) | Method for bifunctional affinity sorbent preparation for chromatographic purification of fluorescent immunoglobulins | |
| Finger | Immobilizing and precipitating antigens of Paramecium | |
| RU2470307C1 (en) | Method of determining presence of anthrax protective antigen based on immunodetection, associated with polymerase chain reaction | |
| RU2246968C2 (en) | Method for preparing magnetic immunosorbent for detection of bacterial antigens | |
| Alasel et al. | A new platform for serological analysis based on porous 3-dimensional polyethylene sinter bodies | |
| CN117230015A (en) | Hybridoma cell strain secreting monoclonal antibody against human bocavirus VP1 protein, monoclonal antibody, application and kit | |
| RU2805871C1 (en) | Method of obtaining dry erythrocyte anthrax antigen diagnosticum | |
| WO2016196323A1 (en) | Serodiagnosis of melioidosis and glanders using polysaccharides | |
| HARDY Jr et al. | A study of the properties of sorbent, the reagent employed in the fluorescent treponemal antibody-absorption test | |
| Lewis et al. | Indirect hemagglutination test for chlamydial antibodies | |
| RU2545909C2 (en) | Method of immunochromatographic determination of specific antibodies | |
| Kobayashi et al. | Microcapsule agglutination test for Treponema pallidum antibodies. A new serodiagnostic test for syphilis. | |
| RU2271540C2 (en) | Method for production of biomagnetic immunosorbent for bacterial antigen detection (variants) | |
| RU2200324C2 (en) | Method for immune serum sorption | |
| RU2329505C1 (en) | Method of immunosorbent production for virus-specific antibody binding | |
| JPH1123576A (en) | Measuring method for antibody of salmonella germ | |
| RU2582941C1 (en) | Composite plague antigen f1-diagnosticum for indication of specific antibodies | |
| Zharnikova et al. | Immobilized Ligands and their Application to the Production of Diagnostic Fluorescent Immunoglobulins to Indicate Pathogens of Infectious Diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180419 |