RU2614264C2 - Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека - Google Patents
Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614264C2 RU2614264C2 RU2015123831A RU2015123831A RU2614264C2 RU 2614264 C2 RU2614264 C2 RU 2614264C2 RU 2015123831 A RU2015123831 A RU 2015123831A RU 2015123831 A RU2015123831 A RU 2015123831A RU 2614264 C2 RU2614264 C2 RU 2614264C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon beta
- cells
- recombinant protein
- coli
- recombinant
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 title claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 20
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims abstract description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 33
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 31
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 14
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 14
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 101150002750 IFIT1 gene Proteins 0.000 description 11
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 5
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 5
- 102100027355 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 Human genes 0.000 description 5
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037182 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 description 3
- 101001028831 Homo sapiens Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 3
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 208000005925 vesicular stomatitis Diseases 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxane-3,4,5-triol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102220519361 Coatomer subunit alpha_C17S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004265 STAT2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010081691 STAT2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100036407 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960004461 interferon beta-1a Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 239000001047 purple dye Substances 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению интерферонов, и может быть использовано для получения рекомбинантного белка - аналога интерферона бета. Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный белок - аналог интерферона бета, оптимизирована для экспрессии в клетках Е. coli. Клетку Е. coli BL-30-B, предназначенную для продукции рекомбинантного белка интерферона бета, получают путем трансформации клеток E. coli BL(DE3) плазмидой рЕТ30а, содержащей указанную нуклеиновую кислоту. Клетку Е. coli BL-32-B, предназначенную для продукции рекомбинантного белка интерферона бета, получают путем трансформации клеток E. coli BL(DE3) плазмидой рЕТ32а, содержащей указанную нуклеиновую кислоту. Изобретение позволяет получить рекомбинантный белок - аналог интерферона бета с биологической активностью 1,8⋅109 Ед/мкмоль в системе A549/VSV. 3 н.п. ф-лы, 5 ил., 9 табл., 9 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к получению генетических конструкций, содержащих оптимизированную нуклеотидную последовательность, которая кодирует рекомбинантный белок - аналог интерферона бета.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный белок - аналог интерферона бета, оптимизирована для экспрессии в клетках Е. coli за счет использования кодонов, оптимальных для данной бактерии.
Нуклеотидная последовательность клонирована в плазмиды рЕТ30а и рЕТ32а. Эффективность экспрессии рекомбинантного белка - аналога интерферона бета составила более 50% в обоих случаях.
Биологическая активность выделенного рекомбинантного белка - аналога интерферона бета по уровню активации экспрессии гена-репортера под контролем МхА-промотера сравнима с интерфероном бета 1b.
Рассеянный склероз (PC) - хроническое воспалительное аутоиммунное заболевание, при котором поражается миелиновая оболочка головного и спинного мозга. Болезнь поражает людей в молодом возрасте, пик заболеваемости приходится на 30-35 лет. По данным ВОЗ, среди неврологических заболеваний PC является основной причиной стойкой инвалидизации лиц молодого возраста. Число вновь заболевших увеличивается во всех странах (на 5-6% ежегодно), при этом рост отмечается не только в традиционных для рассеянного склероза областях и этносах, но и в зонах, ранее свободных от него. Насчитывается 2-2,5 млн заболевших в мире, в России около 200 тысяч человек.
Для терапии данного заболевания применяют иммунномодуляторы, изменяющие течение PC, снижающие остроту обострений, увеличивающие протяженность ремиссии и тем самым замедляющие прогрессию заболевания. Одним из первых таких препаратов является интерферон бета, и до сих пор он используются в качестве лекарственного средства первой линии.
На рынке присутствуют интерферон бета 1a (Avonex, Rebif и Cinnovex) и интерферон бета 1b (Betaseron, Ронбетал). Первый является продуктом экспрессии в клетках млекопитающих и близок по структуре олигосахаридного остатка природному человеческому интерферону. Интерферон бета 1b экспрессируется в клетках E. coli, поэтому он, во-первых, не гликозилирован, во-вторых, лишен первого остатка метионина, отщепляемого клеточной протеазой. Дополнительно 25-30 лет назад в изучаемом аналоге интерферона была проведена замена Cys17Ser, что немного улучшило его физико-химические свойства. Оба типа интерферонов 1а и 1b оказывают похожее действие на больных PC, однако интерферона бета 1b необходимо брать в 10 раз большем количестве. Это связано с очень низкой остаточной антивирусной активностью интерферона бета 1b. Высокие дозы (300 мкг подкожно через день) вызывают у 48-52% пациентов, применяющих Betaseron, образование аутоантител в высоком титре. Это приводит к уменьшению эффективности лечения интерфероном бета 1b. Интерферон бета 1a Avonex применяют в дозах 22 мкг раз в неделю, антитела в высоком титре появляются только у 2-6% пациентов. Таким образом, повышение биологической активности и улучшение физико-химических свойств молекулы интерферона бета 1b является актуальной задачей. Поиски путей улучшения свойств интерферона бета 1b как отечественного препарата необходимы и по финансовым причинам. Сложность технологии получения и высокая стоимость препаратов интерферонов 1a (Avonex и Rebif) приводит к тому, что только около 10% страдающих PC проходят лечение интерферонами 1а.
Препарат на основе рекомбинантного белка - аналога интерферона бета представляет большой интерес для терапии PC, т.к. за счет высокого выхода при экспрессии в Е. coli будет иметь низкую себестоимость, а стало быть, будет более доступен для пациентов, нуждающихся в терапии PC, а проведение исследований этого препарата, в том числе доклинических и клинических, является актуальной задачей.
Природный ген, кодирующий интерферон бета человека не приспособлен для эффективной экспрессии в Е. coli. Это связано с наличием редко встречающихся в Е. coli кодонов AGG и AGA для аргинина, а также с наличием последовательностей, гомологичных регуляторным участкам генов Е. coli, что приводит к прерыванию трансляции либо инициации трансляции с внутренних участков гена (SD-сайты). Совокупность этих причин приводит к низкой эффективности экспрессии (не более 5%), что не позволяет разработать коммерчески выгодную технологию получения препаратов на основе интерферона бета.
Наличие неоптимальных для Е. coli кодонов характерно для всех генов, кодирующих интерфероны первого типа. Для преодоления этой проблемы используются оптимизированные гены, кодирующие целевые белки. В патенте RU 2354703 описана оптимизированная последовательность гена, кодирующая IL-21.
В патенте US 7642072 описана оптимизированная нуклеотидная последовательность гена, кодирующая интерферон бета 1b (прототип).
Заявителем разработана и получена нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека с SEQ ID NO: 2 и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. Нуклеотидная последовательность клонирована в плазмиды рЕТ30а и рЕТ32а, в результате получены рекомбинантные плазмиды р30-В и р32-В. Рекомбинантными плазмидами р30-В и р32-В были трансформированы клетки Е. coli штамма BL21(DE3), получены стабильные штаммы-продуценты BL-30-B и BL-32-B.
Технический результат заявленного изобретения заключается в том, что полученная генетическая конструкция - нуклеиновая кислота, представленная SEQ ID NO: 1, позволяет эффективно синтезировать в клетках E. coli рекомбинантный белок интерферон бета с SEQ ID NO: 2 в количестве более 50% от суммарного клеточного белка в обоих случаях - в штаммах-продуцентах Е. coli BL-30-B и BL-32-B. Полученный рекомбинантный белок обладает выраженной IFNβ-активностью, что позволяет использовать его для терапии рассеянного склероза.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Электрофорез клонов E. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой р30-В после индукции. Стрелкой отмечен целевой продукт - рекомбинантный аналог интерферона бета человека. Трек 7 соответствует штамму-продуценту BL-30-B.
Фиг. 2. Электрофорез клонов E. Coli, трансформированных после индукции. Стрелкой отмечен целевой продукт - рекомбинантный аналог интерферона бета человека, слитый с тиоредоксином. Трек 2 соответствует штамму-продуценту BL-32-B.
Фиг. 3. Хроматографический профиль прохождения рекомбинантного белка через SP-Sepharose. Мажорный пик соответствует выходу рекомбинантного белка - аналогу интерферона бета человека.
Фиг. 4. Хроматографический профиль элюции рекомбинантного белка - аналога интерферона бета человека с аналитической колонки Kromasil 300-5С18.
Фиг. 5. Оценка эффективности терапии рекомбинантного белка - аналога интерферона бета человека на мышиной модели ЕАЕ (ЛП-рекомбинантный аналог интерферона бета).
Изобретение иллюстрируют примеры.
ПРИМЕР 1. Оптимизация нуклеотидной последовательности
Кодоны нуклеотидной последовательности, кодирующей рекомбинантный белок - аналог интерферона бета, были оптимизированы для экспрессии в клетках Е. coli путем замены на кодоны, часто встречаемые в геноме Е. coli K12. Частота использования кодонов в геноме Е. coli взята из: Y Nakamura, K Wada, Y Wada, Н Doi, S Kanaya, T Gojobori, and T Ikemura. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases. Nucleic Acids Res. 1996 Jan 1; 24(1): 214-215.
Дополнительно часть кодонов CTG, кодирующих лейцин, были заменены на кодоны ТТА или TTG, все кодоны AGC, кодирующие серии, были заменены на кодоны ТСТ или ТСС. Замены были введены для того, чтобы ликвидировать внутренние SD-сайты. Разработанная оптимизированная нуклеотидная последовательность показана на SEQ ID NO: 1.
ПРИМЕР 2. Получение плазмиды р30-В
Оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок - аналог интерферона бета, гидролизовали ферментами рестрикции NdeI и HindIII. Коммерческую плазмиду рЕТ30а также гидролизовали ферментами рестрикции NdeI и HindIII. Продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозе, продукты выделяли из геля, объединяли и лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Лигазной смесью трансформировали клетки XL-1, высевали на чашку Петри и инкубировали 16 часов при 37°С. Выросшие клоны анализировали на присутствие целевой плазмиды методом ПЦР. Клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду, выращивали, из полученной биомассы выделяли целевой продукт - плазмиду р30-В.
ПРИМЕР 3. Получение плазмиды р32-В
Оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок - аналог интерферона бета, гидролизовали ферментами рестрикции KpnI и HindIII. Коммерческую плазмиду рЕТ32а также гидролизовали ферментами рестрикции KpnI и HindIII. Продукты гидролиза разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозе, продукты выделяли из геля, объединяли и лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Лигазной смесью трансформировали клетки XL-1, высевали на чашку Петри и инкубировали 16 часов при 37°С. Выросшие клоны анализировали на присутствие целевой плазмиды методом ПЦР. Клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду, выращивали, из полученной биомассы выделяли целевой продукт - плазмиду р32-В.
ПРИМЕР 4. Получение штаммов-продуцентов
Плазмидами р30-В и р32-В трансформировали клетки Е. coli штамма BL21(DE3), высевали на чашку Петри и инкубировали 16 часов при 37°С. Выросшие клоны анализировали на экспрессию целевого белка методом электрофореза в ПААГ. Клоны, экспрессирующие наибольшее количество белка (Фиг. 1 и Фиг. 2), были отобраны как штаммы-продуценты BL-30-B и BL-32-B. Клетки штаммов-продуцентов выращивали и хранили при -70°С.
ПРИМЕР 5. Выделение рекомбинантного белка
Клетки штамма-продуцента пересевали в культуральную колбу с 200 мл LB, содержащим 25 мг/мл антибиотика канамицина. Культура выращивалась на шейкере при 280 об/мин при температуре 37°С до достижения оптической плотности значения OD585=0,8E. Индукция экспрессии белка проводилась добавлением IPTG до концентрации 1 mM. Культура дополнительно культивировалась 4 часа, далее клетки осаждались центрифугированием при 5000g. Осадок клеток лизировали в 8 М мочевине и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе. Лизат клеток центрифугировали при 20000g 2 часа. Супернатант фильтровали через колонку с Q-Sepharose. Фракцию, не связавшуюся с данным сорбентом, хроматографировали на SP-Sepharose в градиенте NaCl (стартовый буфер: 20 mM TrisHCl рН 6,8, 20 mM NaCl, итоговый буфер 20 mM TrisHCl рН 6,8, 400 mM NaCl). Хроматографический профиль представлен на Фиг. 3. Фракции, содержащие целевой продукт объединяли и диализовали в 10 mM уксусную кислоту. Чистоту продукта анализировали методом ВЭЖХ (Фиг. 4). Биологическая активность выделенного рекомбинантного белка - аналога интерферона бета в системе A549/VSV составила 1,8⋅109 Ед/мкмоль.
ПРИМЕР 6. Дизайн экспресс-теста биологической активности полученного рекомбинантного белка-аналога интерферона бета
Для анализа биологической активности полученного рекомбинантного белка используют метод иммуноферментного анализа (ELISA), известный специалисту в данной области техники.
В экспресс-тесте на нитроцеллюлозную мембрану сорбируют антитела к rec-IFNβ (1 мкл) и 1 мкл мышиных антител. Мембрану блокируют ФБСТ и помещают на адсорбирующий носитель. На мембрану в районе нанесения мишени наносят пробы, промывают ФБСТ и наносят цветной реагент. В качестве реагента в тесте использованы антитела, полученные при истощении сыворотки компонентами rec-IFNβ и конъюгированные с кумасси R250, и антимышиные антитела (Sigma), конъгированные с этим же красителем. Если в растворе есть rec-IFNβ, она взаимодействует с мембраной и проявляется цветным конъюгатом. В результате появляются два интенсивных пятна. В противном случае проявляется только пятно контроля проведения теста.
Получение данных для валидации по рекомбинантному аналогу интерферона бета - оценка предела обнаружения
В анализируемом растворе определяли подлинность рекомбинантного аналога интерферона бета (rec-IFNβ). Готовили водные растворы с различной концентрацией rec-IFNβ. Результаты представлены в таблице 1.
Все растворы, до концентрации 1 нг/мл были определены с точностью на 100% как положительные, растворы с концентрацией 200 пг/мл были определены как положительные с точностью 90%, с концентрации от 50 пг/мл и ниже точность определения ниже.
Получение данных для валидации по рекомбинантному белку аналогу интерферона бета - определение специфичности
Готовили раствор, содержащий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета в концентрации 1000 мкг/мл в воде. Разбавляя данный раствор, получали растворы с концентрациями: 500 мкг/мл, 50 мкг/мл, 5 мкг/мл, 500 нг/мл, 50 нг/мл и 5 нг/мл. Все растворы тестировались экспресс-методикой. Результаты представлены в таблице 2.
ПРИМЕР 7. Изучение специфической активности и механизмов действия in vitro рекомбинантного белка - аналога интерферона бета
Рекомбинантный аналог интерферона бета (rec-IFNβ) предназначен для лечения рассеянного склероза. Патогенез рассеянного склероза связан с пролиферацией аутореактивных клонов Т- и В-клеток, которые способны взаимодействовать с миелиновой оболочкой нервной ткани спинного и головного мозга и индуцировать воспаление, что в итоге приводит к нарушению функции центральной нервной системы и двигательной функции организма (развитие паралича). Учитывая особенности патогенеза этого заболевания, разрабатываемые препараты для его лечения должны обладать антипролиферативной активностью, т.е. подавлять рост и деление клеток. Поэтому в рамках данного этапа работы было запланировано изучение антипролиферативной активности рекомбинантного аналога интерферона бета и механизмов его действия.
Оценка антипролиферативной активности рекомбинантного аналога интерферона бета в экспериментах in vitro
Обоснование выбора модели
Исследование проведено с использованием следующих клеточных линий: OVCAR3, DAUDI, А549, т.к. они имеют рецепторы к интерферонам и часто используются для проведения исследований антипролиферативной активности интерферонов. Исследование антипролиферативной активности проведено при широком диапазоне концентраций: 1000 пМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 0,1 пМ, 0,01 пМ.
Материалы и методы
Клеточная линия OVCAR3 - это клетки карциномы яичника человека. Данная культура является адгезионной и широко используется в исследованиях in vitro.
Клеточная линия DAUDI - это клетки лимфомы Беркитта. Данная культура является суспензионной, имеет поверхностные маркеры для Fc фрагмента IgG, рецепторов комплемента и поверхностно связанных иммуноглобулинов.
Клеточная линия А549 - это клетки карциномы легкого человека. Данная культура является адгезионой, чувствительна к вирусам (аденовирус, простой герпес, парагрипп 2 и 3, цитомегаловирус, везикулярный стоматит, полиовирусы) и имеет рецепторы к интерферонам.
Клетки OVCAR3, DAUDI и А549 засеивали в 96-луночный планшет в количестве 5 тыс. кл./лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки, 300 мг/л L-глутамина и антибиотик гентамицин 100 мг/л. Инкубировали клетки в течение суток в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После инкубации клетки отмывали от сывороточной среды DMEM, для этого отбирали из лунок старую среду DMEM и, не касаясь монослоя с помощью многоканальной пипетки, вносили по 100 мкл/лунку стерильного физиологического раствора, инкубировали в течение 5 мин, затем отбирали физиологический раствор, не касаясь монослоя клеток. После проведения отмывки вносили образцы исследуемого препарата в следующих разведениях: 1000 пМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 0,1 пМ, 0,01 пМ, в объеме 100 мкл полной среды DMEM. В качестве контроля использовали коммерческий препарат «Бетаферон», который вносили в аналогичных концентрациях. Далее клетки инкубировали 48 часов, в CO2-инкубаторе при 37С в 5% атмосфере CO2. После инкубации определяли жизнеспособность клеток в колориметрическом тесте с использованием красителя МТТ. Для этого к клеткам вносили краситель МТТ (концентрация 4 мг/мл) в количестве 25 мкл/лунку и инкубировали в течение 4 часов в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После инкубации для лизиса клеток вносили SDS в количестве 50 мкл/лунку и проводили инкубацию 24 часа, в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После инкубации измеряли оптическую плотность с помощью спектрофотометра Reader MPR1 (ScoTech, Германия) при длинах волн 570 и 650 нм.
Как уже упомянуто выше, в качестве метода контроля антипролиферативной активности использовали колориметрический тест, основанный на способности живых клеток восстанавливать бледно-желтый краситель МТТ в краситель формазан интенсивного пурпурного цвета. При этом интенсивность окрашивания клеток снижается со снижением их роста (пролиферации). Интенсивность окрашивания клеток оценивали с помощью спектрофотометра Reader MPR1 (ScoTech, Германия) при длинах волн 570 и 650 нм.
Полученные значения интенсивности окрашивания (оптической плотности) клеток, не обработанных каким-либо препаратом (концентрация испытуемых веществ = 0 пМ), принимали за 100% и относительного этого значения выражали в процентах остальные значения интенсивности окрашивания для всех концентраций исследуемых веществ. Затем строили график зависимости интенсивности окрашивания (в процентах) от концентрации тестируемых веществ и рассчитывали значения ЕС50 - концентрацию тестируемого вещества, необходимую для снижения роста клеток на 50%, измеряемую в пикомолях (пМ).
Статистический анализ данных
Статистический анализ полученных данных проводят методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости.
Расчет выполняют на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp.USA) и пакета статистического анализа данных Statistica 8.0 for Windows (StatSoft Inc., USA).
Результаты
Антипролиферативная активность в сравнении с коммерческим препаратом Бетаферон была изучена в шести десятикратных разведениях. Как и ожидалось, коммерческий препарат сравнения "Бетаферон" проявлял выраженную антиролиферативную активность; ЕС50 составила от 0,3±0,46 до 0,1±0,03 пМ в зависимости от культуры клеток. При этом антипролиферативная активность рекомбинантного аналога интерферона бета превосходит таковую у коммерческого препарата Бетаферон, т.к. требуется меньшая концентрация полученного рекомбинантного белка для аналогичного ингибирования клеточной пролиферации (таблица 3).
Таким образом, рекомбинантный аналог интерферона бета по антипролиферативной активности превосходит активность коммерческого препарата Бетаферон (интерферон бета 1b).
ПРИМЕР 8. Изучение противовирусной активности рекомбинантного белка - аналога интерферона бета в экспериментах in vitro
Помимо изучения антипролиферативной активности необходимо изучение противовирусных свойств, поскольку в международной практике мерилом биологической активности интерфероновых препаратов служит именно противовирусная активность, измеряемая в международных единицах (ME).
Обоснование выбора модели
Для проведения исследований была выбрана клеточная линия А549 (карцинома легкого человека), т.к. она имеет рецепторы к интерферонам и часто применяется для изучения антивирусных свойств различных типов интерферонов, включая разные варианты бета-интерферонов. Кроме того, данная клеточная линия чувствительна к инфекции вирусом везикулярного стоматита (VSV штамм Indiana).
Для изучения механизмов противовирусного действия использована клеточная линия А549 (карцинома легкого человека), т.к. она имеет рецепторы к интерферонам. Известно, что после связывания с рецептором на поверхности клеток интерферон бета 1b индуцирует передачу внутриклеточного сигнала посредством белковых факторов STAT1 и STAT2 в ядро клетки и тем самым запускает экспрессию генов противовирусной защиты, таких как гены MX и ISG56. В связи с этим в рамках данной тест-системы в клетки А549, содержащие на своей поверхности рецепторы к интерферону бета 1b, методом трансфекции внедряют плазмиды, кодирующие репортреный ген галактозидазы Gal под контролем промоторов генов MX и ISG56; соответствующие названия плазмид pMX-Gal и pISG56-Gal. Таким образом, выбранная тест-система позволяет оценить механизм противовирусного действия, в частности оценить, опосредуется ли противовирусная активность активацией генов MX и ISG56, как это описано для природного интерферона бета 1b.
Для исследования противовирусной активности был выбран широкий диапазон концентраций: 10000 пМ, 1000 пМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 0,1 пМ и 0,01 пМ. В качестве препарата сравнения использовали идентичные концентрации коммерческого препарата Бетаферон.
Материалы и методы
Тестирование противовирусной активности проводили с использованием культуры клеток А549. Для этого клетки засеивали в 96-луночный планшет в количестве 20 тыс. кл./лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды Игла-MEM (содержащей 10% фетальной сыворотки 300, мг/л L-глутамина и антибиотик гентамицин 100 мг/мл). Затем инкубировали в течение суток CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После инкубации культуру клеток отмывали от сывороточной среды Игла-MEM, для этого снимали старую среду и, не касаясь монослоя, с помощью многоканальной пипетки вносили по 100 мкл/лунку стерильного физиологического раствора, инкубировали в течение 5 мин, затем отбирали физиологический раствор, не касаясь монослоя клеток, и вносили по 100 мкл/лунку безсывороточной среды Игла-MEM.
После отмывки в культуру клеток вносили исследуемый рекомбинантный белок, а также препарат сравнения в десятикратных разведениях (10000 пМ, 1000 пМ, 100 пМ, 10 пМ, 1 пМ, 0,1 пМ, 0,01 пМ) с последующим ингибированием в течение 1 суток в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, не обработанные каким-либо препаратом.
После инкубации в культуру клеток вносили вирус VSV, штамм Indiana в дозе 100 LD50 на лунку. После внесения вируса в лунки, клетки инкубировали в течение 2 суток в CO2-инкубаторе при 37°С до появления цитопатического действия. После чего проводили визуальную оценку противовирусной активности препарата с помощью световой микроскопии, а именно подсчитывали количество лунок с клетками, погибшими в результате репродукции вируса.
Противовирусную активность исследуемых препаратов изучали с использованием вируса везикулярного стоматита VSV, штамм Indiana, взятого в дозе 100 LD50/лунку. Результат оценивали с помощью световой микроскопии и выражали в ЕС50 - эффективная концентрация препарата, при которой наблюдается 50% протективный противовирусный эффект.
где ЕС50 - концентрация препарата, дающего 50%-ный противовирусный эффект;
Dmax - двоичный логарифм разведения, выше которого произошла 100%-ная защита;
d - двоичный логарифм шага разведения (1 в случае двоичного титрования);
n - количество лунок на каждую дозу препарата (4);
р - количество лунок, давших защиту в Dmax и в последующих разведениях.
Изучение механизмов противовирусной активности препаратов проводили с использованием культуры клеток А549. Для этого клетки засеивали в 96-луночный планшет в количестве 20 тыс. кл./лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды Игла-MEM. Инкубировали в течение суток в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После инкубации культуру клеток отмывали от сывороточной среды Игла-MEM, для этого снимали старую среду и, не касаясь монослоя, с помощью многоканальной пипетки, вносили по 100 мкл/лунку стерильного физиологического раствора, инкубировали в течение 5 мин, затем отбирали физиологический раствор, не касаясь монослоя клеток, и вносили по 100 мкл/лунку бессывороточной среды Игла-MEM.
После отмывки проводили трансфекцию клеток 300 нг плазмиды pMX-Gal или pISG56-Gal с использованием набора реагентов Escort IV (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя. Трансфецированная культура клеток инкубировалась в течение суток в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. Далее повторяли процедуру отмывки и вносили исследуемые препараты и коммерческий препарат сравнения Бетаферон (стандарт) в пяти следующих концентрациях: 10 нM, 1 нM, 100 пM, 10 пM, 1 пM. После внесения проводили инкубацию в течение 18 часов в CO2-инкубаторе при 37°С в 5% атмосфере CO2. После окончания инкубации клетки промывали, как описано выше, и лизировали лизирующим буфером (Sigma), в дальнейшем в лизаты вносили 50 мкл субстрата p-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside (Sigma) и измеряли оптическую плотность раствора лизата с помощью микропланшетного фотометра Reader MPR1 (ScoTech, Германия) при длине волны 360 нм. Значения оптической плотности раствора лизата клеток были прямо пропорциональны количеству фермента галактозидазы, которая закодирована плазмидами.
Для изучения механизма противовирусной активности полученного рекомбинантного белка использовали тест-систему на основе клеток А549, которые имеют на своей поверхности рецепторы к интерферону бета 1b, а также на основе двух рекомбинантных плазмид, которые методом химической трансфекции внедряли в данные клетки, несущие репортерный ген галактозидазы Gal, под контролем либо MX- либо ISG56-промотера. В результате данная тест система по степени окрашивания галактозидазой субстрата позволяла оценивать, активируются ли гены MX и ISG56 в ответ на обработку клеток полученным рекомбинантным белком. При этом активность галактозидазы (определяемая по оптической плотности) была прямо пропорциональна степени активации генов MX и ISG56.
Результаты
Было показано, что коммерческий препарат сравнения "Бетаферон" проявлял выраженную противовирусную активность по отношению к модельному вирусу VSV, а значения ЕС50 составили 0,3 пМ. Противовирусная активность rec-IFNβ статистически значимо превосходила таковую у коммерческого препарата Бетаферон, т.к. требуется меньшая концентрация rec-IFNβ для аналогичного ингибирования клеточной пролиферации (Таблица 4).
Для rec-IFNβ и коммерческого препарата Бетаферон был изучен механизм специфического противовирусного действия на культуре клеток А549 с использованием pMX-Gal и pISG56-Gal. Было показано, что коммерческий препарат сравнения, как и ожидалось, активирует промоторы генов противовирусной защиты MX и ISG56, о чем можно судить по дозозависимому увеличению содержания репортерного фермента - галактозидзы; значения оптической плотности возрастали от 0,01 до 0,044 оптических единиц для промотора MX и 0,04 до 0,35 для промотора ISG56.
При этом рекомбинантный аналог интерферона бета проявил более выраженную способность активировать промоторы генов MX (0,82) и ISG56 (1,52) соответственно. Результаты активации промоторов генов MX и ISG56 полученного rec-IFNβ в сравнении с коммерческим препаратом сравнения представлены в таблице 5 и таблице 6.
Таким образом, rec-IFNβ проявляют выраженную противовирусную активность, превосходящую таковую у коммерческого препарата Бетаферон. Механизмы действия рекомбинантного аналога интреферона бета аналогичны механизму действия коммерческого препарата Бетаферон и опосредуются активацией генов противовирусной защиты MX и ISG56.
ПРИМЕР 9. Изучение специфической активности и механизмов действия in vivo рекомбинантного аналога интреферона бета
Помимо исследований in vitro для rec-IFNβ крайне важно было изучить специфическую активность в экспериментах in vivo на лабораторных животных, чтобы оценить, каким образом внутримышечное введение влияет на клинические проявления рассеянного склероза (паралич).
Обоснование выбора модели
В данном исследовании в качестве тест-системы использовали экспериментальную модель аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) на мышах линии C57BL/6, которые являются стандартным объектом для воспроизведения данной патологии. Рассеянный склероз - это аутоиммунное заболевание, связанное с развитием и пролиферацией аутореактивных клонов Т- и В-клеток, направленных против белка миелина спинного и головного мозга. Разрушение миелина приводит к нарушениям в центральной нервной системе и к нарушению двигательной функции организма (к параличу). Модель ЕАЕ у мышей по соответствующим молекулярным механизмам близка патологической картине человека.
Для индукции ЕАЕ мышам в дозе 20-50 мкг/мышь вводили пептид MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK), который имитирует эпитоп миелина в смеси с 100 мкг/мышь полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), усиливающего иммунный ответ на пептид. В итоге у животных развивалась иммунная реакция на пептид, заключающаяся в пролиферации Т- и В-лимфоцитов и продукции антител, специфичных к пептиду. Поскольку данный пептид гомологичен миелину, то пролиферирующие Т- и В-клетки, а также антитела связывались с миелином, индуцировали при этом воспалительную реакцию, что в итоге приводило к нарушению центральной нервной системы мышей и развитию паралича.
Полученный рекомбинантный белок вводили внутримышечно, т.к. данный способ введения рекомендуем для последующего клинического использования. Разрабатываемый препарат исследовали в двух дозах 0,1 и 1 мМоль/мышь, что соответствовало 1 и 10 ТД.
Материалы и методы
Для индукции экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) мышам двукратно вводили пептид MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) в дозе 100 мкг, эмульгированый в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), содержащий туберкулин в концентрации 5 мг/мл. Инъекции MOG35-55 на 1-й день производили подкожно в двух точках, вдоль позвоночного столба, а на 3-й день в подошвы задних лап.
Дополнительно в день инъекций MOG35-55, мышам внутрибрюшинно вводили раствор Pertussis toxin (Calbiochem, США) в количестве 500 нг/мышь в 200 мкл ФБС для увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера, чтобы пролиферируюцие аутореактивные клоны Т- и В-клеток достигали головного мозга.
Полученный рекомбинантный белок и контрольный препарат сравнения - Бетаферон вводили животным через день внутримышечно в объеме 100 мкл попеременно в правую и левую заднюю лапу в дозе 0,1 и 1 нМоль/мышь. Экспериментальные группы и дизайн доз вводимых препаратов представлены в таблице 7.
Для оценки специфической активности рекомбинантного аналога интерферона бета у животных определяли неврологический статус. Его оценку проводили ежедневно с момента начала эксперимента, регистрируя продолжительность течения болезни, тяжесть проявления заболевания. Параметр тяжести заболевания оценивается по шкале неврологических нарушений в баллах по клиническим индексам (КИ), приведенным в таблице 8.
Мышей с КИ 1-3 считали легко болеющими, с КИ 4-6 - тяжело болеющими. Мышей с КИ более 7 выводили из эксперимента в соответствии с инструкциями по уходу за животными.
Как уже было упомянуто, патогенез рассеянного склероза (PC) включает в себя опосредованное Т- и В-лимфоцитами повреждение миелиновой оболочки нервных волокон, что приводит к разрушению аксонов и нейронов и потере функций центральной нервной системы, связанной с физическим и психоэмоциональным состоянием больного.
Патофизиология ЕАЕ основана на реакции иммунной системы против мозгоспецифических антигенов. Эта реакция вызывает воспаление и разрушение основных несущих конструкций нервной ткани - аксонов и нейронов, что сопоставимо с нарушениями, наблюдаемыми у больных PC, следовательно, данную модель можно считать адекватной для изучения рассматриваемых нами параметров.
В процессе исследования rec-IFNβ мы получили следующие результаты, представленные на фиг. 5 и в таблице 9. Через неделю после индукции у мышей состояния ЕАЕ мы наблюдали рост КИ у всех экспериментальных групп, однако максимальный рост КИ происходил у животных без терапии (получавших ФСБ), особи, получавшие препарат rec-IFNβ, демонстрировали дозозависимое снижение клинических проявлений заболевания. Максимальный КИ был зарегистрирован у животных без терапии на 13-14 дни эксперимента и составлял 6 единиц. Животные, получавшие терапию Бетафероном, демонстрировали незначительный спад в тяжести течения заболевания (КИ 5,5 и 4,5 единицы в зависимости от дозы). Группы, которым вводился исследуемый rec-IFNβ, показывали самое мягкое течение болезни с максимальным зарегистрированным КИ 3,2 при дозе препарата 0,1 нМ/мышь, что соответствовало 1 ТД, и 2,5 при дозе препарата 1,0 нМ/мышь, что соответствовало 10 ТД.
Полученные на мышиной модели ЕАЕ данные свидетельствуют о том, что разработанный рекомбинантный аналог интерферона проявляет выраженную специфическую активность и более эффективен для терапии рассеянного склероза по сравнению с препаратом Бетаферон.
Таким образом, полученная генетическая конструкция - нуклеиновая кислота, представленная SEQ ID NO: 1, позволяет эффективно синтезировать в клетках E. coli рекомбинантный белок интерферон бета с SEQ ID NO: 2 в количестве более 50% от суммарного клеточного белка в обоих случаях - в штаммах-продуцентах Е. coli BL-30-B и BL-32-B. Полученный рекомбинантный белок обладает выраженной IFNβ-активностью, что позволяет использовать его для для терапии рассеянного склероза.
Перечень последовательностей
<110> ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России
<120> «Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок-аналог интерферона бета человека»
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS: 2
<210> SEQ ID NO 1
<211> 496
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 1:
TCTTATAATTTATTAGGATTTTTACAACGTTCTTCTAATTTTCAATCTCAAAAATTATT TGGCAGCTGAACGGTCGTCTGGAATACTGCCTGAAAGATCGTATGAACTTCGATATC CCAGAAGAAATCAAACAGCTGCAACAGTTCCAGAAAGAAGATGCAGCTCTGACCATCTACGAAATGCTGCAGAACATCTTCGCAATCTTCCGTCAAGATAGCTCCTCTACTGGTTGGAACGAAACCATCGTTGAAAATCTGTTAGCTAACGTGTACCATCAGATCAATCATCTGAAAACCGTGCTTGAAGAAAAACTCGAAAAAGAAGATTTCACTCGTGGTAAACTGATGAGTTCTCTGCATCTGAAACGTTACTATGGTCGTATCCTCCACTACCTGAAAGCTAAAGAGTACAGCCATTGCGCATGGACGATCGTGCGTGTTGAAATTCTGCGTAACTTCTACTTTATCAATCGCCTCACCGGCTACCTGCGTAAC
<210> SEQ ID NO 2
<211> 165
<212> AA (amino acid)
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2:
SYNLLGFLQRSSNFQSQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN
Claims (3)
1. Нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека с SEQ ID NO:2 и характеризующаяся нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.
2. Клетка Е. coli BL-30-B для продукции рекомбинантного белка интерферона бета с SEQ ID NO:2, полученная путем трансформации клеток E. coli BL(DE3) плазмидой рЕТ30а, содержащей нуклеиновую кислоту по п. 1.
3. Клетка Е. coli BL-32-B для продукции рекомбинантного белка интерферона бета с SEQ ID NO:2, полученная путем трансформации клеток E. coli BL(DE3) плазмидой рЕТ32а, содержащей нуклеиновую кислоту по п. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015123831A RU2614264C2 (ru) | 2015-06-19 | 2015-06-19 | Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015123831A RU2614264C2 (ru) | 2015-06-19 | 2015-06-19 | Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015123831A RU2015123831A (ru) | 2017-01-10 |
| RU2614264C2 true RU2614264C2 (ru) | 2017-03-24 |
Family
ID=57955448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015123831A RU2614264C2 (ru) | 2015-06-19 | 2015-06-19 | Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2614264C2 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2354703C2 (ru) * | 2002-12-13 | 2009-05-10 | Займодженетикс, Инк. | Продуцирование il-21 в прокариотических клетках-хозяевах |
| US7642072B2 (en) * | 2004-07-26 | 2010-01-05 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Optimized interferon-beta gene |
| US20110104752A1 (en) * | 2008-03-14 | 2011-05-05 | Merck Serono S.A. | Variation of Recombinant Expression Titres By Optimising Bacterial Ribosome Binding Sites |
| US20120197006A1 (en) * | 2007-05-02 | 2012-08-02 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
-
2015
- 2015-06-19 RU RU2015123831A patent/RU2614264C2/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2354703C2 (ru) * | 2002-12-13 | 2009-05-10 | Займодженетикс, Инк. | Продуцирование il-21 в прокариотических клетках-хозяевах |
| US7642072B2 (en) * | 2004-07-26 | 2010-01-05 | Enzon Pharmaceuticals, Inc. | Optimized interferon-beta gene |
| US20120197006A1 (en) * | 2007-05-02 | 2012-08-02 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| US20110104752A1 (en) * | 2008-03-14 | 2011-05-05 | Merck Serono S.A. | Variation of Recombinant Expression Titres By Optimising Bacterial Ribosome Binding Sites |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015123831A (ru) | 2017-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7611951B2 (ja) | キメラ抗原受容体、組成物及び方法 | |
| JP7048494B2 (ja) | 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 | |
| US20100143353A1 (en) | POLYPEPTIDES COMPRISING Fc FRAGMENTS OF IMMUNOGLOBULIN G (lgG) AND METHODS OF USING THE SAME | |
| Zhang et al. | Potential therapeutic value of the STING inhibitors | |
| US20200277349A1 (en) | N-terminally truncated interleukin-38 | |
| MX2012013899A (es) | Proteinas de fusion vstm3 dimericas y composiciones y metodos relacionados. | |
| US20160102127A1 (en) | Targeted modulation of macrophages | |
| CN116322785A (zh) | 包含il-10的双细胞因子融合蛋白 | |
| Shatov et al. | The heterooligomerization of human small heat shock proteins is controlled by conserved motif located in the N-terminal domain | |
| JP2015057387A (ja) | クロスベータ構造体でのタンパク質の凝集の標的化誘導 | |
| JP7751581B2 (ja) | Ｉｌ－３７融合タンパク質及びその使用 | |
| JP2021536256A (ja) | 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体 | |
| Stacchiotti et al. | Neuroinflammation and Amyotrophic Lateral Sclerosis: Recent Advances in Anti-Inflammatory Cytokines as Therapeutic Strategies | |
| Alejo et al. | Addition of a viral immunomodulatory domain to etanercept generates a bifunctional chemokine and TNF inhibitor | |
| WO2020116498A1 (ja) | Ｃｘｃｒ３リガンド | |
| Capron et al. | Eosinophils: from low‐to high‐affinity immunoglobulin E receptors | |
| RU2614264C2 (ru) | Оптимизированный ген, кодирующий рекомбинантный белок - аналог интерферона бета человека | |
| Patidar et al. | Development of Stable Chimeric IL-15 for Trans-Presentation by the Antigen Presenting Cells | |
| Fabilane et al. | Cytokine/antibody fusion protein design and evaluation | |
| Jalali et al. | Expression, Purification, and Evaluation of Anti-IL-2R α Antibody Secreted by Leishmania tarentolae | |
| Khan et al. | Increased binding of circulating systemic lupus erythematosus autoantibodies to recombinant interferon alpha 2b | |
| Walsh et al. | Evidence for differential roles for NKG2D receptor signaling in innate host defense against coronavirus-induced neurological and liver disease | |
| KR20060053966A (ko) | 슈퍼-항원 융합 단백질들 및 그 용도 | |
| Lee et al. | A glycoengineered interferon-β mutein (R27T) generates prolonged signaling by an altered receptor-binding kinetics | |
| CA3124941A1 (en) | Mrna display antibody library and methods |