RU2614262C1 - STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI - Google Patents
STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI Download PDFInfo
- Publication number
- RU2614262C1 RU2614262C1 RU2016109722A RU2016109722A RU2614262C1 RU 2614262 C1 RU2614262 C1 RU 2614262C1 RU 2016109722 A RU2016109722 A RU 2016109722A RU 2016109722 A RU2016109722 A RU 2016109722A RU 2614262 C1 RU2614262 C1 RU 2614262C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- site
- mluvi
- endonuclease
- strain
- dna
- Prior art date
Links
- 241000191938 Micrococcus luteus Species 0.000 title claims abstract description 9
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 title abstract description 21
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 title abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 8
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 8
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 6
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150111020 GLUL gene Proteins 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000193400 Bacillus simplex Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 241000203815 Microbacterium testaceum Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N Phosphorus-32 Chemical compound [32P] OAICVXFJPJFONN-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 241000933941 bacterium 24 Species 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/265—Micrococcus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Micrococcus luteus 805 - продуцента сайт-специфической метилзависимой эндонуклеазы MluVI, которая может быть использована для крупноблочного сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.The invention relates to the field of biotechnology and relates to the production of a new bacterial strain Micrococcus luteus 805, a producer of site-specific methyl-dependent endonuclease MluVI, which can be used for large-block site-specific hydrolysis of DNA containing C5-methylcytosine bases.
На данный момент описано несколько сайт-специфических метилзависимых ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз), узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.At the moment, several site-specific methyl-dependent DNA endonucleases (MD-endonucleases) are recognized that recognize and cleave DNA only if 5-methylcytosine is recognized on the site.
Например, описан штамм бактерий Glacial ice bacterium I, являющийся продуцентом MD-эндонуклеазы Glal, которая узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов 5'-R(5mC)GY-3', где 5mC - означает 5-метилцитозин, R - пурин, a Y - пиримидин [1, 2].For example, a bacterial strain Glacial ice bacterium I is described, which is a producer of Glal MD endonuclease, which recognizes and cleaves the methylated nucleotide sequence 5'-R (5mC) GY-3 ', where 5mC means 5-methylcytosine, R is purine, and Y is - pyrimidine [1, 2].
Известны штаммы бактерий Bacillus simplex 23 [3], Bacillus subtilis 230 [4] и Glacial ice bacterium 24 [5], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы Blsl, BisI и Glul, соответственно, которые узнают и расщепляют метилированную последовательность 5'-GCNGC-3', при наличии в ней от двух до четырех 5-метилцитозиновых оснований.Bacillus simplex 23 [3], Bacillus subtilis 230 [4] and Glacial ice bacterium 24 [5] bacterial strains are known that produce site-specific endonucleases Blsl, BisI and Glul, respectively, which recognize and cleave the methylated sequence 5'-GCNGC-3 ', in the presence of from two to four 5-methylcytosine bases.
Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что продуцируемые ими MD-эндонуклеазы не способны узнавать и расщеплять обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCGCNGCGC-373'-CGCGNCGCG-5' имеющей только шесть, семь или восемь 5-метилцитозинов.The disadvantage of the above strains is that the MD endonucleases produced by them are not able to recognize and cleave both chains of the 5'-GCGCNGCGC-373'-CGCGNCGCG-5 'DNA nucleotide sequence having only six, seven or eight 5-methylcytosines.
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм бактерий Microbacterium testaceum 17В, продуцирующий сайт-специфическую метилзависимую эндонуклеазу MteI, которая узнает метилированную последовательность 5'-GCGCNGCGC-3'/3'-CGCGNCGCG-5' и расщепляет ее перед центральным нуклеотидом (N) с образованием однонуклеотидного 5'-выступающего конца при условии С5-метилирования в ней от пяти до восьми цитозинов [6].The closest to the claimed strain, the prototype, is the bacterial strain Microbacterium testaceum 17B, producing a site-specific methyl-dependent endonuclease MteI, which recognizes the methylated sequence 5'-GCGCNGCGC-3 '/ 3'-CGCGNCGCG-5' and cleaves it in front of the central nucleotide ) with the formation of a single nucleotide 5'-protruding end under the condition of C5 methylation in it from five to eight cytosines [6].
Недостатком штамма-прототипа является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза расщепляет вышеуказанную последовательность, в которой метилированы не менее пяти цитозинов, что в ряде случаев не позволяет использовать ее для получения крупных фрагментов при сайт-специфическом расщеплении ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.The disadvantage of the prototype strain is that the site-specific endonuclease produced by it cleaves the above sequence in which at least five cytosines are methylated, which in some cases does not allow it to be used to obtain large fragments in the site-specific cleavage of DNA containing C5-methylcytosine bases .
В настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами сайт-специфических метилзависимых ДНК-эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих только гиперметилированные последовательности ДНК 5'-GCGCNGCGC-3' при наличии в них не менее шести С5-метилцитозинов.Currently, bacterial strains that are producers of site-specific methyl-dependent DNA endonucleases that recognize and cleave only hypermethylated 5'-GCGCNGCGC-3 'DNA sequences in the presence of at least six C5-methylcytosines are not described.
Задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую метилзависимую ДНК-эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять обе цепи нуклеотидной последовательности 5'-GCGCNGCGC-3'/3'-CGCGNCGCG-5' только при наличии в ней не менее шести 5-метилцитозиновых оснований.The objective of the invention is to obtain a bacterial strain producing a site-specific methyl-dependent DNA endonuclease, capable of recognizing and cleaving both chains of the nucleotide sequence 5'-GCGCNGCGC-3 '/ 3'-CGCGNCGCG-5' only if it contains at least six 5-methylcytosine grounds.
Поставленная задача решается путем получения штамма Micrococcus luteus 805 - продуцента сайт-специфической метилзависимой ДНК-эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей обе цепи нуклеотидной последовательности 5'-GCGCNGCGC-3'/3'-CGCGNCGCG-5' при условии С5-метилирования в ней не менее шести 5-метилцитозиновых оснований.The problem is solved by obtaining a strain of Micrococcus luteus 805 - a producer of a site-specific methyl-dependent DNA endonuclease that recognizes and cleaves both chains of the 5'-GCGCNGCGC-3 '/ 3'-CGCGNCGCG-5' nucleotide under the condition of at least C5 methylation in it six 5-methylcytosine bases.
Техническим результатом изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом метилзависимой ДНК-эндонуклеазы с новой сайт-специфичностью, обладающей способностью узнавать и расщеплять обе цепи нуклеотидной последовательности 5'-GCGCNGCGC-3'/3'-CGCGNCGCG-5' с образованием однонуклеотидных 5'-выступающих концов, при условии С5-метилирования в ней не менее шести цитозиновых оснований.The technical result of the invention is to obtain a bacterial strain, which is a producer of methyl-dependent DNA endonuclease with a new site specificity, with the ability to recognize and cleave both chains of the 5'-GCGCNGCGC-3 '/ 3'-CGCGNCGCG-5' nucleotide with the formation of 5'- single nucleotide protruding ends, subject to C5 methylation of at least six cytosine bases in it.
Предлагаемый штамм выделен из природного источника (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска. Полученный штамм Micrococcus luteus 805 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-12410, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа MluVI.The proposed strain is isolated from a natural source (soil) as a result of a targeted systematic search. The resulting strain of Micrococcus luteus 805 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FSUE GosNII Genetics under the registration number VKPM B-12410, and the site-specific endonuclease produced by it was named MluVI.
Штамм Micrococcus luteus 805 характеризуется следующими признаками.The strain of Micrococcus luteus 805 is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological characters.
Грамположительные неподвижные кокки диметром 0,5-1,5 мкм. Могут образовывать тетрады и нерегулярные скопления. Спор не образуют.Gram-positive motionless cocci with a diameter of 0.5-1.5 microns. They can form notebooks and irregular clusters. They do not form a dispute.
На агаризованной среде Луриа-Бертрани (LB) образует лимонно-желтые, гладкие, блестящие, непрозрачные, выпуклые круглые колонии.On agar medium Luria-Bertrani (LB) forms lemon yellow, smooth, shiny, opaque, convex round colonies.
Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Оксидазоположительные. Массовая доля G/C-нуклеотидов составляет 70-75%. Растут при температуре от 4 до 40°C с температурным оптимумом роста 25-37°C, при рН от 6 до 9.Physiological and biochemical characteristics. Obligatory aerobic. Catalopositive. Oxidopositive. Mass fraction of G / C nucleotides is 70-75%. They grow at a temperature of 4 to 40 ° C with a temperature optimum of growth of 25-37 ° C, at a pH of 6 to 9.
Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [7], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК по программе BLAST [8] как вид бактерии Micrococcus luteus. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая метилзависимая эндонуклеаза MluVI названа согласно номенклатуре [9].The strain was identified by analyzing the morphological and biochemical properties of the determinant [7], as well as by analyzing the primary structure of the 16S rRNA gene fragment using the BLAST program [8] as a species of the Micrococcus luteus bacterium. The site-specific methyl-dependent endonuclease MluVI produced by the claimed strain is named according to the nomenclature [9].
Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в пробирках «Eppendorf» с 22% глицерином, 0,5% желатиной, 20 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 60 мМ NaCl, 15 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2 при -50°C.The strain is stored in the lyophilized state or in Eppendorf tubes with 22% glycerol, 0.5% gelatin, 20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 60 mM NaCl, 15 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 at -50 ° C.
Для культивирования штамма используют питательную среду следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, рН 7,5. Культивирование осуществляют при 30°C с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.For the cultivation of the strain using a nutrient medium of the following composition (g / l): tryptone - 10, yeast extract - 5, NaCl - 5, pH 7.5. Cultivation is carried out at 30 ° C with aeration until a stationary growth stage is reached.
Полученная сайт-специфическая MD-эндонуклеаза MluVI характеризуется следующими свойствами:The resulting site-specific MD-endonuclease MluVI is characterized by the following properties:
1. Узнает и расщепляет в ДНК последовательность нуклеотидов 5'-GCGCNGCGC-3', в которой С5-метилированы не менее шести цитозинов.1. Recognizes and cleaves in DNA the nucleotide sequence of 5'-GCGCNGCGC-3 ', in which at least six cytosines are C5-methylated.
2. Расщепляет межнуклеотидные связи перед центральным нуклеотидом (N) в обеих цепях узнаваемой последовательности.2. Cleaves internucleotide bonds in front of the central nucleotide (N) in both chains of a recognizable sequence.
3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, не содержащую С5-метилцитозиновых оснований или содержащую менее шести метилированных цитозинов.3. Does not cleave the above sequence that does not contain C5-methylcytosine bases or contains less than six methylated cytosines.
4. Оптимальная температура действия фермента 37°C.4. The optimum temperature of the enzyme is 37 ° C.
5. Оптимальное значение рН для действия фермента 7,5-9,0.5. The optimal pH for the action of the enzyme is 7.5-9.0.
6. Для проявления активности MluVI требуются ионы Mg2+, оптимальная концентрация - 5-10 мМ.6. For the manifestation of MluVI activity, Mg 2+ ions are required, the optimal concentration is 5-10 mm.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических метилзависимых ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз) является то, что новый штамм продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCGC^NGCGC-3' только при наличии в ней не менее шести 5-метилцитозинов.The defining difference of the proposed strain from all currently known strains producing site-specific methyl-dependent DNA endonucleases (MD-endonucleases) is that the new strain produces a site-specific endonuclease, which recognizes and cleaves both chains of the methylated nucleotide sequence of DNA 5'- GCGC ^ NGCGC-3 'only if it contains at least six 5-methylcytosines.
Таким образом, MD-эндонуклеаза MluVI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент, который может быть использован для выявления и анализа участков ДНК, содержащих избыточное количество С5-метилцитозинов.Thus, MluVI MD endonuclease is a new, unparalleled enzyme that can be used to identify and analyze DNA regions containing an excess of C5-methylcytosines.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции, никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».Since the proposed strain was obtained for the first time and was never used to isolate a site-specific endonuclease that recognizes and cleaves the above nucleotide sequence, it can be concluded that the proposed strain meets the criteria of the invention of “novelty” and “inventive step”.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Выращивание штамма-продуцента и выделение фермента MluVI.Example 1. Growth of a producer strain and isolation of the MluVI enzyme.
Для получения колоний штамм Micrococcus luteus 805 высевают на агаризованную среду LB в чашку Петри и выращивают в течение 48 часов при 22-25°C. Для ферментации штамм выращивают при встряхивании в 0,5-литровых колбах, содержащих по 300 мл среды (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, рН 7,5) при 120-140 об/мин в течение 20 часов при 30°C. Клетки осаждают на центрифуге J2-21 («Весктап», США) в роторе JA-10 при 8000 об/мин и хранят при -20°C. С 1 л среды получают 6-8 г биомассы.To obtain colonies, the strain Micrococcus luteus 805 is seeded on agarized LB medium in a Petri dish and grown for 48 hours at 22-25 ° C. For fermentation, the strain is grown with shaking in 0.5-liter flasks containing 300 ml of medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.5) at 120-140 rpm for 20 hours at 30 ° C. Cells are pelleted on a J2-21 centrifuge (Veskstap, USA) in a JA-10 rotor at 8000 rpm and stored at -20 ° C. 6-8 g of biomass are obtained from 1 liter of medium.
Разрушение клеток ультразвуком, выделение и очистку фермента проводят с использованием модификации известной методики [10]. Фермент хранится при - 20°C в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,2 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,08% Тритон Х-100, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин.Destruction of cells by ultrasound, isolation and purification of the enzyme is carried out using a modification of the known method [10]. The enzyme is stored at - 20 ° C in a buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.08% Triton X-100, 7 mM 2-mercaptoethanol, 50% glycerin.
За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10 [6], дополнительно метилированной метилазой Fsp4HI и линеаризованной эндонуклеазой рестрикции Dril, в течение 1 часа при температуре 37°C в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 1500 ед/г сырой биомассы, концентрация 2000 ед/мл.The unit of activity is the minimum amount of enzyme required for complete cleavage of 1 μg DNA of plasmid pHspAI10 [6], additionally methylated with Fsp4HI methylase and linearized Dril restriction endonuclease, for 1 hour at 37 ° C in 20 μl of the reaction mixture. The yield of the enzyme is 1500 u / g of raw biomass, the concentration of 2000 u / ml.
Пример 2. Определение специфичности MD-эндонуклеазы MluVI.Example 2. Determination of the specificity of MD-endonuclease MluVI.
Обработку субстратных ДНК MD-эндонуклеазой MluVI проводят в оптимальных условиях (37°C, реакционный буфер - 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9 (при 25°C), 10 мМ магния ацетат, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) в течение 1 часа. Продукты расщепления ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ, содержащем 0,04 М Трис-HCl (рН 8,4 при 25°C), 0,02 М уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА.The substrate DNA was treated with MluVI MD-endonuclease under optimal conditions (37 ° C, reaction buffer 33 mM Tris acetate, pH 7.9 (at 25 ° C), 10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 1 mM dithiothreitol) within 1 hour. DNA cleavage products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE buffer containing 0.04 M Tris-HCl (pH 8.4 at 25 ° C), 0.02 M acetic acid, 1 mM EDTA.
В качестве субстратов для определения специфичности фермента используют различные плазмидные ДНК: метилированные и неметилированные (контрольные ДНК, которые не расщепляются MluVI вследствие отсутствия метилированных сайтов узнавания). Для подтверждения возможности сайт-специфического расщепления последовательности 5'-GCGCNGCGC-3' с различными узорами метилирования используют следующий набор сконструированных плазмид, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы HspAI, метилирующей первый цитозин в положении С5 на обеих цепях последовательности 5'-GCGC-3' [6]:Various plasmid DNAs are used as substrates for determining the specificity of the enzyme: methylated and unmethylated (control DNAs that are not cleaved by MluVI due to the absence of methylated recognition sites). To confirm the possibility of site-specific cleavage of the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequence with different methylation patterns, the following set of constructed plasmids containing the HspAI DNA methyltransferase gene methylating the first cytosine at position C5 on both chains of the 5'-GCGC-3' sequence is used [ 6]:
1) Плазмида pHspAI4 содержит единственный гиперметилированный участок:1) Plasmid pHspAI4 contains a single hypermethylated site:
то есть последовательность 5'-GCGCNGCGC-3' с четырьмя 5-метилцитозинами.that is, the sequence of 5'-GCGCNGCGC-3 'with four 5-methylcytosines.
2) Плазмида pHspAI10 содержит единственный гиперметилированный участок:2) Plasmid pHspAI10 contains a single hypermethylated site:
то есть последовательность 5'-GCGCNGCGC-3' с шестью 5-метилцитозинами.that is, the sequence of 5'-GCGCNGCGC-3 'with six 5-methylcytosines.
3) Плазмида pHspAI12 содержит единственный гиперметилированный участок:3) Plasmid pHspAI12 contains a single hypermethylated site:
то есть последовательность 5'-GCGCNGCGC-3' с пятью 5-метилцитозинами.that is, the sequence of 5'-GCGCNGCGC-3 'with five 5-methylcytosines.
Кроме того, для анализа использовались эти же три плазмиды, pHspAI4, pHspAI10 и pHspAI12, но предварительно метилированые метилазой Fsp4HI по сайту 5'-GCNGC-3', в результате чего в уникальных последовательностях 5'-GCGCNGCGC-3' этих плазмид дополнительно метилировались цитозины перед центральным нуклеотидом на обеих цепях. В результате в последовательностях 5'-GCGCNGCGC-3' этих гиперметилированных плазмид к уже имеющимся 5-метилцитозиновым остаткам добавилось еще по два модифицированных остатка.In addition, the same three plasmids, pHspAI4, pHspAI10, and pHspAI12, but pre-methylated with Fsp4HI methylase at the 5'-GCNGC-3 'site, were used for analysis, as a result of which the cytosines were additionally methylated in the unique 5'-GCGCNGCGC-3' sequences of these plasmids in front of the central nucleotide on both chains. As a result, in the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequences of these hypermethylated plasmids, two more modified residues were added to the existing 5-methylcytosine residues.
Для оценки возможности гидролиза MD-эндонуклеазой MluVI метилированного внутреннего сайта 5'-G(5mC)NGC-3' также использовали плазмиду pFsp4HI3, несущую ген ДНК-метилтрансферазы Fsp4HI [5, 6], метилирующей как раз первый цитозин в последовательности 5'-GCNGC-3'. Поэтому в составе плазмиды pFsp4HI3 встречаются последовательности 5'-GCNGC-3' с двумя, а в случае перекрывания сайтов - с тремя или четырьмя 5-метилцитозинами. Так, в данной плазмиде имеется гиперметилированный участок, содержащий несколько перекрывающихся сайтов узнавания ДНК-метилтрансферазы Fsp4HI:To evaluate the possibility of hydrolysis of the methylated internal site 5'-G (5mC) NGC-3 'by MD-endonuclease MluVI, the plasmid pFsp4HI3 carrying the Fsp4HI DNA methyltransferase gene [5, 6], which methylates the first cytosine in the 5'-GCNGC sequence -3 '. Therefore, in the composition of plasmid pFsp4HI3, 5'-GCNGC-3 'sequences are found with two, and in the case of overlapping sites, with three or four 5-methylcytosines. So, in this plasmid there is a hypermethylated site containing several overlapping recognition sites of Fsp4HI DNA methyltransferase:
Следовательно, в плазмиде имеется единственная метилированная последовательность 5'-GCNGC-3' (подчеркнута), в которой все четыре цитозина метилированы, в качестве центрального нуклеотида выступает G/C-пара, и данная последовательность фланкирована с 5'-конца нуклеотидом «С», а с 3'-конца - нуклеотидом «А».Therefore, the plasmid has the only methylated sequence 5'-GCNGC-3 '(underlined), in which all four cytosines are methylated, the G / C pair acts as the central nucleotide, and this sequence is flanked from the 5'-end of nucleotide "C" , and from the 3'-end - nucleotide "A".
Все используемые плазмиды предварительно были линеаризованы путем расщепления эндонуклеазой рестрикции Dril (сайт узнавания 5'-GACNNN^NNGTC-3').All plasmids used were previously linearized by digestion with the Dril restriction endonuclease (recognition site 5'-GACNNN ^ NNGTC-3 ').
На фиг. 1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления MD-эндонуклеазами MluVI и MteI (контроль) ДНК вышеназванных плазмид, в том числе дополнительно метилированных метилазой Fsp4HI.In FIG. 1 is an electrophoregram of the cleavage products of MD-endonucleases MluVI and MteI (control) of DNA of the above plasmids, including those additionally methylated with Fsp4HI methylase.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 1: 1 - pHspAI4/DriI; 2 - pHspAI4/DriI + MteI; 3 - pHspAI4/DriI + MluVI; 4 - pHspAI10/Dril; 5 - pHspAI1O/Dril + MteI; 6 - pHspAI10/Dril + MluVI; 7 - pHspAI12/DriI; 8 - pHspAI12/DriI + MteI; 9 - pHspAI12/DriI + MluVI; 10 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb; 11 - pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI; 12 - pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI+MteI; 13 - pHspAI4/DriI + M.Fsp4HI + MluVI; 14 - pHspAI10/Dril + M.Fsp4HI; 15 - pHspAI10/Dril + M.Fsp4HI + MteI; 16 - pHspAI10/Dril + M.Fsp4HI + MluVI; 17 - pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI; 18 - pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + MteI; 19 - pHspAI12/DriI + M.Fsp4HI + MluVI; 20 - pFsp4HI3/DriI; 21 - pFsp4HI3/DriI + MluVI; 22 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb.Description of tracks on the electrophoregram depicted in FIG. 1: 1 - pHspAI4 / DriI; 2 - pHspAI4 / DriI + MteI; 3 - pHspAI4 / DriI + MluVI; 4 - pHspAI10 / Dril; 5 - pHspAI1O / Dril + MteI; 6 - pHspAI10 / Dril + MluVI; 7 - pHspAI12 / DriI; 8 - pHspAI12 / DriI + MteI; 9 - pHspAI12 / DriI + MluVI; 10 - DNA
Как видно из фиг. 1, MD-эндонуклеаза MluVI, подобно MteI, не расщепляет плазмиду, метилированую метилазой HspAI, в которой в последовательности 5'-GCGCNGCGC-3' имеется только четыре 5-метилцитозиновых остатка (pHspAI4, дор. 3). Однако, в отличие от MteI, новый фермент MluVI не расщепляет и плазмиду, в которой в последовательности 5'-GCGCNGCGC-3' присутствует пять 5-метилцитозиновых остатков (pHspAI12, дор. 9).As can be seen from FIG. 1, MluVI MD endonuclease, like MteI, does not cleave a plasmid methylated with HspAI methylase, in which there are only four 5-methylcytosine residues in the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequence (pHspAI4, dor. 3). However, unlike MteI, the new MluVI enzyme does not cleave a plasmid in which five 5-methylcytosine residues are present in the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequence (pHspAI12, extension 9).
В то же время MD-эндонуклеаза MluVI расщепляет последовательность 5'-GCGCNGCGC-3' лишь в случаях, если она содержит шесть (pHspAI10, дор. 6 и pHspAI4 + M.Fsp4HI, дор. 13), семь (pHspAI12+M.Fsp4HI, дор. 19) или восемь (pHspAI10 + M.Fsp4HI, дор. 16) 5-метилцитозиновых остатковAt the same time, MluVI MD endonuclease cleaves the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequence only if it contains six (pHspAI10, D.6 and pHspAI4 + M.Fsp4HI, D13), seven (pHspAI12 + M.Fsp4HI , extension 19) or eight (pHspAI10 + M.Fsp4HI, extension 16) of 5-methylcytosine residues
Более наглядно эти данные представлены в таблице 1.More clearly, these data are presented in table 1.
Из фиг. 1 также видно, что MD-эндонуклеаза MluVI не расщепляет ДНК плазмиды pFsp4HI3, содержащей последовательности 5'-GCNGC-3' с двумя, тремя и четырьмя С5-метилированными цитозинами. Данный факт свидетельствует о том, что для гидролиза MluVI недостаточно только внутренней метилированной последовательности 5'-GCNGC-3', даже при условии модификации всех цитозинов в ней. Однако данная последовательность является частью сайта узнавания MluVI - 5'-GCGCNGCGC-3'.From FIG. 1 also shows that the MluVI MD endonuclease does not cleave the DNA of the plasmid pFsp4HI3 containing 5'-GCNGC-3 'sequences with two, three, and four C5 methylated cytosines. This fact indicates that for the hydrolysis of MluVI, only the internal methylated sequence of 5'-GCNGC-3 'is not enough, even if all cytosines in it are modified. However, this sequence is part of the MluVI recognition site - 5'-GCGCNGCGC-3 '.
Пример 3. Анализ сайт-специфичности и определение позиции гидролиза MluVI на синтетических олигонуклеотидных дуплексах.Example 3. Site-specific analysis and determination of the position of MluVI hydrolysis on synthetic oligonucleotide duplexes.
Для подтверждения правильности определения узнаваемой новым ферментом последовательности и узора метилирования, а также для определения позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания, проводили гидролиз MD-эндонуклеазой MluVI синтетических олигонуклеотидных дуплексов, образованных из олигонуклеотидов следующей структуры:To confirm the correct determination of the sequence and pattern of methylation recognized by the new enzyme, as well as to determine the position of DNA hydrolysis in the recognition site, the MluVI MD endonuclease was hydrolyzed with synthetic oligonucleotide duplexes formed from oligonucleotides of the following structure:
При этом олигонуклеотид Mte7 является комплементарным олигонуклеотидам Mte8 и Mte14, которые, в свою очередь различаются по количеству включенных 5-метилцитозинов (три - в Mte8 и два - в Mte14).Moreover, the Mte7 oligonucleotide is complementary to the Mte8 and Mte14 oligonucleotides, which, in turn, differ in the number of included 5-methylcytosines (three in Mte8 and two in Mte14).
На фиг. 2 приведен радиоавтограф электрофореграммы, полученной в результате расщепления ферментами MluVI или MteI радиоактивно-меченных дуплексов Mte7/Mte14, Mte7/Mte8 и последующего нанесения продуктов на 20% полиакриламидный гель, содержащий 7 М мочевину.In FIG. Figure 2 shows a radio-autograph of an electrophoregram obtained by cleavage of Mte7 / Mte14, Mte7 / Mte8 radioactively labeled duplexes with MluVI or MteI enzymes and subsequent application of the products to a 20% polyacrylamide gel containing 7 M urea.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 2:Description of tracks on the electrophoregram depicted in FIG. 2:
1 - исходный дуплекс Mte7*/Mte14; 2 - дуплекс Mte7*/Mte14, обработанный MluVI; 3 - дуплекс Mte7*/Mte14, обработанный MteI; 4 - исходный дуплекс Mte7*/Mte8; 5 - дуплекс Mte7*/Mte8, обработанный MluVI; 6 - дуплекс Mte7*/Mte8, обработанный MteI. Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором Р32 по 5'-концу, обозначены знаком *.1 - source duplex Mte7 * / Mte14; 2 - duplex Mte7 * / Mte14 processed by MluVI; 3 - duplex Mte7 * / Mte14 processed by MteI; 4 - source duplex Mte7 * / Mte8; 5 - duplex Mte7 * / Mte8 processed by MluVI; 6 - Mte7 * / Mte8 duplex processed by MteI. Oligonucleotides labeled with radioactive phosphorus P 32 at the 5'-end are indicated by *.
Из фиг. 2 видно, что олигонуклеотидный дуплекс Mte7*/Mte14, содержащий сайт 5'-GCGCNGCGC-3' с пятью 5-метилцитозинами расщепляется MteI (дор. 3), но не расщепляется MluVI (дор. 2).From FIG. Figure 2 shows that the Mte7 * / Mte14 oligonucleotide duplex containing the 5'-GCGCNGCGC-3 'site with five 5-methylcytosines is cleaved by MteI (dor. 3), but not MluVI (dor. 2).
При этом олигонуклеотидный дуплекс Mte7*/Mte8, содержащий сайт 5'-GCGCNGCGC-3' с шестью 5-метилцитозинами расщепляется как MteI (дор. 6), так и MluVI (дор. 5).Moreover, the Mte7 * / Mte8 oligonucleotide duplex containing the 5'-GCGCNGCGC-3 'site with six 5-methylcytosines is cleaved by both MteI (dor. 6) and MluVI (dor. 5).
Таким образом, MluVI на олигонуклеотидном дуплексе расщепляет последовательность 5'-GCGCNGCGC-3' с шестью 5-метилцитозинами и не расщепляет эту же последовательность с пятью 5-метилцитозинами.Thus, MluVI on the oligonucleotide duplex cleaves the 5'-GCGCNGCGC-3 'sequence with six 5-methylcytosines and does not cleave the same sequence with five 5-methylcytosines.
Из фиг. 2 также видно, что электрофоретические подвижности фрагментов ДНК, образованных в результате гидролиза ферментами MteI и MluVI дуплекса Mte7*/Mte8, совпадают.From FIG. Figure 2 also shows that the electrophoretic mobilities of DNA fragments formed as a result of hydrolysis by the MteI and MluVI enzymes of the Mte7 * / Mte8 duplex coincide.
Следовательно, можно заключить, что оба фермента имеют одинаковые позиции гидролиза в сайте узнавания, то есть MD-эндонуклеаза MluVI расщепляет обе цепи последовательности узнавания перед центральным нуклеотидом (N), так же, как и MteI, с образованием однонуклеотидных 5'-выступающих концов: 5'-G(5mC)G(5mC)^NG(5mC)G(5mC)-3'/3'-(5mC)G(5mC)GN^(5mC)G(5mC)G-5'.Therefore, it can be concluded that both enzymes have the same hydrolysis positions in the recognition site, i.e., the MluVI MD endonuclease cleaves both chains of the recognition sequence in front of the central nucleotide (N), just like MteI, with the formation of single nucleotide 5'-protruding ends: 5'-G (5mC) G (5mC) ^ NG (5mC) G (5mC) -3 '/ 3' - (5mC) G (5mC) GN ^ (5mC) G (5mC) G-5 '.
Использование предлагаемого штамма-продуцента позволит получать новую сайт-специфическую метилзависимую эндонуклеазу MluVI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-GCGCNGCGC-3', при условии С5-метилирования в ней не менее шести цитозиновых остатков. Данная MD-эндонуклеаза может быть использована в молекулярной биологии, биотехнологии и генной инженерии для крупноблочного сайт-специфического расщепления метилированной ДНК, в частности для выявления и анализа метилированной хромосомной ДНК млекопитающих и человека.Using the proposed producer strain will make it possible to obtain a new site-specific methyl-dependent endonuclease MluVI that recognizes and cleaves both chains of the 5'-GCGCNGCGC-3 'DNA nucleotide sequence, subject to C5 methylation of at least six cytosine residues in it. This MD endonuclease can be used in molecular biology, biotechnology and genetic engineering for large-block site-specific cleavage of methylated DNA, in particular for the detection and analysis of methylated chromosomal DNA of mammals and humans.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИINFORMATION SOURCES
1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5'-GCGC-3'. // Биотехнология. - 2006. - 4. - С. 31-35.1. Chernukhin V.A., Nayakshina T.N., Abdurashitov M.A., Tomilova Yu.E., Mezentseva N.V., Dedkov BC, Mikhnenkova N.A., Gonchar D.A., Degtyarev S. X. // New GlaI restriction endonuclease recognizes the methylated sequence 5'-GCGC-3 '. // Biotechnology. - 2006. - 4. - S. 31-35.
2. G.V. Tarasova, Т.N. Nayakshina, S. Kh. Degtyarev. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9:7.2. G.V. Tarasova, T.N. Nayakshina, S. Kh. Degtyarev. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9: 7.
3. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж E.B., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BIsI узнает последовательности ДНК 5'-G(5mC)NGC-3' и расщепляет ее с образованием 3'-выступающих концов. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007. - Т. 3. - 1. - С. 28-33.3. Chernukhin V.A., Tomilova Yu.E., Chmuzh E.B., Sokolova O.O., Dedkov B.C., Degtyarev S.Kh. Site-specific endonuclease BIsI recognizes 5'-G (5mC) NGC-3 'DNA sequences and cleaves it to form 3'-protruding ends. // Bulletin of biotechnology and physico-chemical biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2007. - T. 3. - 1. - S. 28-33.
4. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis Т30 узнает метилированную последовательность ДНК 5'G(m5C)^NGC-3' // Биотехнология. - 2005. - 3. - C. 22-26.4. Chmuzh E.V., Kashirina Yu.G., Tomilova Yu.E., Mezentseva N.V., Dedkov B.C., Gonchar D.A., Abdurashitov M.A., Degtyarev S.Kh. New BisI restriction endonuclease from Bacillus subtilis T30 recognizes the methylated DNA sequence 5'G (m5C) ^ NGC-3 '// Biotechnology. - 2005. - 3. - C. 22-26.
5. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонклеаза Glul узнает метилированную последовательность ДНК 5'-G(5mC)NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN(5mC)G-5' // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007. - Т. 3. - 2. - С. 13-17.5. Chernukhin V.A., Chmuzh E.V., Tomilova Yu.E., Nayakshina T.N., Gonchar D.A., Dedkov B.C., Degtyarev S.Kh. The new site-specific endonclease Glul recognizes the methylated DNA sequence 5'-G (5mC) NG (5mC) -3 '/ 3' - (5mC) GN (5mC) G-5 '// Journal of Biotechnology and Physico-Chemical Biology named after Yu .BUT. Ovchinnikov. - 2007. - T. 3. - 2. - S. 13-17.
6. Чернухин В.А., Гончар Д.А., Килева Е.В., Соколова В.А., Голикова Л.Н., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI расщепляет девятинуклеотидную последовательность 5'-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3'/3'-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5'. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2012. - Т. 8. - №1. - С.16-26.6. Chernukhin V.A., Gonchar D.A., Kileva E.V., Sokolova V.A., Golikova L.N., Dedkov B.C., Mikhnenkova N.A., Degtyarev S.Kh. The new methyl-dependent site-specific DNA endonuclease MteI cleaves the nine-nucleotide sequence 5'-G (5mC) G (5mC) NG (5mC) GC-3 '/ 3'-CG (5mC) GN (5mC) G (5mC) G-5 '. // Bulletin of biotechnology and physico-chemical biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2012. - T. 8. - No. 1. - S.16-26.
7. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. - М., 1997.7. The determinant of bacteria Bergey. / Ed. J. Houlta et al .: (9th edition in 2 volumes: Translated from English under the editorship of the academician of the Russian Academy of Sciences G.A. Zavarzin. - M., 1997.
8. Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol - 1996. -. V. 266 - P. 131-141.8. Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol - 1996. -. V. 266 - P. 131-141.
9. Smith, H.O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 81. - P. 419-423.9. Smith, H. O., Nathans, D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 81. - P. 419-423.
10. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V. 4 - P. 561-2572.10. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V. 4 - P. 561-2572.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016109722A RU2614262C1 (en) | 2016-03-17 | 2016-03-17 | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016109722A RU2614262C1 (en) | 2016-03-17 | 2016-03-17 | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2614262C1 true RU2614262C1 (en) | 2017-03-24 |
Family
ID=58453254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016109722A RU2614262C1 (en) | 2016-03-17 | 2016-03-17 | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2614262C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1738853A1 (en) * | 1989-08-28 | 1992-06-07 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Method for preparation of micrococcus luteus vkpm-2836 biomass - a producer of restrictase mlui |
| US20110207139A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-08-25 | Fermentas Uab | Restriction endonucleases and their applications |
| RU2475533C1 (en) * | 2011-12-12 | 2013-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI |
-
2016
- 2016-03-17 RU RU2016109722A patent/RU2614262C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1738853A1 (en) * | 1989-08-28 | 1992-06-07 | Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ | Method for preparation of micrococcus luteus vkpm-2836 biomass - a producer of restrictase mlui |
| US20110207139A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-08-25 | Fermentas Uab | Restriction endonucleases and their applications |
| RU2475533C1 (en) * | 2011-12-12 | 2013-02-20 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗЕМЛЯНСКАЯ Е.В., ДЕГТЯРЕВ С.Х., Субстратная специфичность и свойства метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз.//Молекулярная биология, 2013, т.47, N 6, с.900-913. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102623312B1 (en) | Enzyme with RUVC domain | |
| US12024727B2 (en) | Enzymes with RuvC domains | |
| JP7546689B2 (en) | Class 2 Type II CRISPR System | |
| Kropocheva et al. | Prokaryotic Argonaute proteins as a tool for biotechnology | |
| US9029087B2 (en) | Compositions, methods and related uses for cleaving modified DNA | |
| WO2021226363A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
| KR102353464B1 (en) | Filamentous fungal genome editing method by direct introduction of genome editing protein | |
| US12435323B2 (en) | Enzymes with RUVC domains | |
| US20220220460A1 (en) | Enzymes with ruvc domains | |
| RU2614262C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI | |
| US20250002881A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
| RU2340670C1 (en) | Arthrobacter luteus B BACTERIA STRAIN-PRODUCER OF SITE-SPECIFIC Alu BI ENDONUCLEASE | |
| RU2475534C1 (en) | BACTERIA STRAIN Planomicrobium koreense 78K-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PkrI | |
| RU2593723C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA Plantibacter flavus 3Kz - PRODUCER OF METHYL-DEPENDENT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PfsI | |
| RU2377294C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM Paracoccus carotinifaciens 3K - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PcsI | |
| RU2475533C1 (en) | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI | |
| RU2399663C1 (en) | Arthrobacter oxydans BACTERIA STRAIN - AoxI SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PRODUCER | |
| RU2394099C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA Kocuria rasea-PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASES KroI | |
| RU2270859C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS SUBTILIS AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Bisi | |
| RU2322492C1 (en) | Glacial ice bacterium microorganism strain as producer of site-specific endonuclease glu i | |
| RU2597987C1 (en) | RECOMBINANT BACTERIAL STRAIN Escherichia coli N42 (pElmI) - PRODUCER OF METHYL-DEPENDANT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE ElmI | |
| RU2322494C1 (en) | MICROORGANISM STRAIN BACILLUS SIMPLEX AS PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE BlsI | |
| US20230183662A1 (en) | Novel dna methyltransferase | |
| RU2287012C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM Glacial ice bacterium I AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Gla I | |
| Zemlyanskaya et al. | Substrate specificity and properties of methyl-directed site-specific DNA endonucleases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200318 |