RU2612789C2 - Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма clostridium difficile - Google Patents
Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма clostridium difficile Download PDFInfo
- Publication number
- RU2612789C2 RU2612789C2 RU2011144853A RU2011144853A RU2612789C2 RU 2612789 C2 RU2612789 C2 RU 2612789C2 RU 2011144853 A RU2011144853 A RU 2011144853A RU 2011144853 A RU2011144853 A RU 2011144853A RU 2612789 C2 RU2612789 C2 RU 2612789C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- gene
- sample
- deletion
- deletions
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 title claims abstract description 10
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 title abstract description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 112
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 112
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 83
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 83
- 101150089436 tcdB gene Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 101150032575 tcdA gene Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 101150008941 cdtA gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 17
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 17
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 101150108363 cdtB gene Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 126
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 41
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 19
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 claims description 18
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 18
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims description 8
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 8
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 4
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 37
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 37
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 37
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 27
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 14
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 4
- 102100022389 Nucleosome assembly protein 1-like 1 Human genes 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 3
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101900232935 Pyrococcus furiosus DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000902578 Pyrococcus woesei DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001235254 Thermococcus kodakarensis Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000557720 Thermus brockianus Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 108010085671 Thermus thermophilus DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 1
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 1
- 241000245032 Trillium Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229940088516 cipro Drugs 0.000 description 1
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000005447 environmental material Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 206010016766 flatulence Diseases 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 235000021055 solid food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе, в котором выполняют следующие стадии: a. предоставляют пробу; b. в мультиплексном ПЦР-анализе:
i) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина; ii) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия следующих делеций в гене tcdC: a) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347; b) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 как представлено в SEQ ID NO: 14; c) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1. При этом мультиплексная ПЦР-амплификация является количественной ПЦР реального времени, где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия делеций 1,8 т.п.н. гена tcdA энтеротоксина, где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия cdtA и/или cdtB бинарного токсина, и, где a. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эта проба оценивается как токсиногенный штамм Clostridium difficile, b. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, присутствует делеция 18 п.н. и присутствует ген бинарного токсина cdtA/B, то эта проба оценивается как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, c. если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 как представлено в SEQ ID NO: 14, и отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и d. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 как представлено в SEQ ID NO: 14, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 078 Clostridium difficile. Изобретение расширяет арсенал способов диагностики. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение относится к области биологии и химии. В частности, это изобретение относится к области молекулярной биологии. Более конкретно, это изобретение относится к области детектирования нуклеиновых кислот и ПЦР реального времени. Особенно предпочтительно это изобретение относится к детектированию и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Clostridium difficile является видом грамположительных бактерий рода Clostridium. Clostridium являются анаэробными, спорообразующими палочками (бациллами). C. difficile является наиболее серьезной причиной антибиотик-ассоциированной диареи (AAD) и может приводить к псевдомембранному колиту, тяжелой инфекции ободочной кишки, часто происходящему из уничтожения нормальной флоры кишечника антибиотиками. Бактерии C. difficile, которые природно находятся в организме, становятся избыточными: этот избыточный рост является вредным, так как эта бактерия высвобождает токсины, которые могут вызывать метеоризм, запор и диарею с болью в животе, которые могут становиться тяжелыми. Потенциальные симптомы часто имитируют некоторые подобные гриппу симптомы. Прекращение лечения антибиотиками, вызывающими болезнь, часто является полезным.
Инфекции C. difficile могут находиться в диапазоне степени тяжести от бессимптомной до тяжелой, особенно среди лиц пожилого возраста. Люди наиболее часто инфицируются в больницах, домах престарелых или инвалидов или учреждениях, хотя увеличивается инфицирование C. difficile в условиях общественных больниц, поликлиник. Степень приобретения C. difficile может быть оценена как 13% в пациентах, находящихся в больницах до 2 недель, и 50% в пациентах, находящихся в больницах более 4 недель. Частота и тяжесть вызываемого C. difficile колита остается высокой и, по-видимому, ассоциирована с увеличенными коэффициентами смертности. Раннее вмешательство и интенсивное лечение являются ключевыми факторами для выздоровления.
В 2005 г. сообщалось о появлении нового высокотоксичного штамма C. difficile, устойчивого к фторхинолоновым антибиотикам, таким как Ципро (ципрофлоксацин) и Левахин (левофлоксацин), являющегося, как считается, причиной, вызывающей географически распространенные появления эпидемии в Северной Америке (Dial S, Delaney J, Barkun A, Suissa S (2005). "Use of gastric acid-suppressive agents and the risk of community-acquired Clostridium difficile-associated disease". JAMA 294 (23): 2989-95, doi:10.100l/jama.294.23.2989).
4 июня 2003 г. сообщалось о двух вспышках от высоковирулентного штамма этой бактерии в Монреале, Квебеке и Калгари, Альберте, в Канаде. Источники информации сообщали об уровнях смертности как о низких, как 36, так и о высоких, как 89, с приблизительно 1400 случаями в 2003 г. и в первые несколько месяцев в конце 2004 г. По данным на март 2005 г. эпидемия распространилась в области Торонто, Онтарио, где были госпитализированы 10 человек.
Подобная вспышка имела место в больнице Stoke Mandeville Hospital в Соединенном Королевстве Великобритании и Северной Ирландии между 2003 и 2005 гг.
Было высказано предположение, что как канадские, так и английские эпидемии были связаны, по-видимому, с более вирулентным штаммом NAP1/BI/027 этой бактерии. Этот штамм, также известный как Квебекский штамм, участвовал также в эпидемиях в двух голландских больницах (Гардервийк и Амерсфоорт, в обеих в 2005 г.). Теория для объяснения этой увеличенной вирулентности штамма 027 заключается в том, что этот штамм является гиперпродуцентом как токсина А, так и токсина В и что некоторые антибиотики могут действительно стимулировать эти бактерии к их гиперпродуцированию.
При анализе группы пациентов с этими спорами, многие из них, у которых отсутствовала симптоматика, будут передавать этот организм индивидуумам, которые имеют ослабленный иммунитет и, следовательно, будут восприимчивы к увеличению интенсивности диареи и плохому исходу. Примечательно, что вышеописанные группы ставят перед эпидемиологами задачу попытки выяснения, каким образом эта болезнь распространяется, посредством объединения информационной технологии с клиническим обследованием.
1 октября 2006 г. сообщалось, что по меньшей мере 49 человек умерли в больницах в Лейчестере в Англии на протяжении восьми месяцев, согласно исследованию Государственного совета по здравоохранению.
27 октября 2006 г. 9 смертей были приписаны этой бактерии в Квебеке в Канаде.
27 февраля 2007 г. новая эпидемия была идентифицирована в Trillium Health Centre в Mississauga, Ontario, где 14 человек были диагностированы как имеющие эту бактерию. Эти бактерии были бактериями того же самого штамма, что и бактерии штамма в Квебеке. Официальные представители не смогли определить, является ли C. difficile ответственным за смерти четырех пациентов на протяжении двух предыдущих месяцев.
В октябре 2007 г. Национальный центр по здравоохранению Мейдстоуна и Танбриджа в Уэльсе был подвергнут серьезной критике Комиссии по здравоохранению в отношении его действий в большой эпидемии C. difficile в больницах в Кенте с апреля 2004 г. до сентября 2006 г. В ее отчете эта Комиссия оценивает, что приблизительно 90 пациентов "определенно или вероятно" умерли в результате этой инфекции (Сообщение для печати Комиссии здравоохранения: “Сторожевой пес” здравоохранения находит существенные недостатки в борьбе с инфекцией Национального центра в Мейдстоуне и Танбридже Уэльса, 11 октября 2007 г. и Daily Telegraph: Министр здравоохранения участвует в расследовании большого скандала, 11 октября 2007 г).
Таким образом, существует потребность в способе детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы этого изобретения нашли новаторский способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе. Преимуществом является то, что многочисленные диагностические вопросы могут быть решены в одном единственном способе. Этот способ теперь позволяет определять пробу как содержащую гипервирулентный штамм Clostridium difficile. Кроме того, он позволяет оценивать пробу как штамм, не являющийся штаммом NAP1/BI/02 7. Эта проба может быть также оценена как штамм NAP1/BI/027. Она может быть оценена также как штамм риботипа 078 или оценена как штамм 017. Таким образом, в единственном анализе могут быть выполнены все эти определения.
Это изобретение относится к способу детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе, в котором выполняют следующие стадии: (а) предоставляют пробу, (b) в мультиплексном ПЦР-анализе (с) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина, (d) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия одной или нескольких из следующих делеций в гене tcdC: (а) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, (b) делеций 36 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 301 до нуклеотида 336, (с) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378, (d) делеций 54 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 313 до нуклеотида 366 и (е) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1.
Это изобретение относится также к набору для выполнения способов этого изобретения, содержащему праймеры или зонды для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеций 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378 гена tcdC, (v) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для (vi) детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
"Полимеразная цепная реакция" или "ПЦР" обозначает реакцию для амплификации in vitro специфических ДНК-последовательностей одновременным удлинением комплементарных цепей ДНК. Другими словами, ПЦР является реакцией для получения множественных копий или репликонов нуклеиновой кислоты-мишени, фланкированной сайтами связывания праймеров, причем такая реакция предусматривает одно или несколько повторений следующих стадий: (i) денатурации нуклеиновой кислоты-мишени, (ii) отжига праймеров с сайтами связывания праймеров и (iii) удлинения этих праймеров полимеразой нуклеиновых кислот в присутствии нуклеозидтрифосфатов. Обычно эта реакция является цикличной, использующей различные температуры, оптимизированные для каждой стадии, в приборе термоциклере. Конкретные температуры, продолжительности в каждой стадии и скорости изменения между стадиями зависят от многих факторов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам, например, приведенных в качестве примеров в ссылках: McPherson et al, editors, PCR: A Practical Approach and PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 и 1995, соответственно). Например, в обычной ПЦР, использующей ДНК-полимеразу Taq, двухцепочечная нуклеиновая кислота-мишень может быть денатурирована при температуре >90°C, праймеры могут отжигаться при температуре в диапазоне 50-75°C и праймеры могут удлиняться при температуре в диапазоне 72-78°C.
Термин "ПЦР" включает в себя производные формы этой реакции, в том числе, но не ограничивающиеся ими, ПЦР реального времени, ПЦР с вмонтированными праймерами, количественные ПЦР, мультиплексные ПЦР и т.п.
Объемы реакции находятся в диапазоне от нескольких сотен нанолитров, например, 200 нл, до нескольких сотен микролитров. Здесь предпочтительные объемы равны 10-50 микролитрам, более предпочтительно приблизительно 25 микролитрам на одну реакционную камеру.
"ПЦР реального времени" обозначает ПЦР, для которой количество продукта реакции, т.е. ампликона, подвергают мониторингу при протекании этой реакции. Имеются многие формы ПЦР реального времени, которые различаются в основном в химических способах детектирования, используемых для мониторинга продукта реакции, например, Gelfand et al, патент США 5210015 ("taqman"); Wittwer et al, патенты США 6174670 и 6569627 (интеркалирующие красители); Tyagi et al, патент США 5925517 (молекулярные метки). Химические способы детектирования для ПЦР реального времени рассматриваются в Mackay et al, Nucleic Acids Research, 30: 1292-1305 (2002). В ПЦР реального времени может быть также использована реакция с двумя температурными стадиями, в которой температура полимеризации равна температуре отжига, даже для типичных гибридизационных зондов, таких как праймеры Scorpion или зонды Pleiades.
"Мультиплексная ПЦР" обозначает ПЦР, в которой множественные последовательности-мишени (или единственная последовательность-мишень и одна или несколько ссылочных последовательностей), одновременно, находятся в одной и той же реакционной смеси, например, Bernard et al, Anal. Biochem., 273: 221-228 (1999) (двухцветная ПЦР реального времени). Обычно используют различные наборы праймеров для каждой амплифицируемой последовательности. Обычно количество последовательностей-мишеней в мультиплексной ПЦР находится в диапазоне от 2 до 10, или от 2 до 8, или более обычно от 3 до 6. Для данного изобретения предпочтительным количеством является количество 2-6.
"Количественная ПЦР" обозначает ПЦР, предназначенную для измерения содержания одной или нескольких конкретных последовательностей-мишеней в пробе или образце. Количественная ПЦР включает в себя определение как абсолютного, так и относительного количества таких последовательностей-мишеней. Количественные измерения выполняют с использованием одной или нескольких ссылочных последовательностей, которые могут анализироваться отдельно или вместе с последовательностью-мишенью. Ссылочная последовательность может быть эндогенной или экзогенной относительно пробы или образца, и, в последнем случае, может содержать одну или несколько конкурирующих матриц. Типичные эндогенные ссылочные последовательности включают в себя сегменты транскриптов следующих генов: пактина, GAPDH, микроглобулина, рибосомной РНК и т.п. Способы количественной ПЦР хорошо известны специалистам с обычной квалификацией в данной области, как иллюстрируется в следующих ссылках: ‘Freeman et al, Biotechniques, 26: 112-126 15 (1999); Becker-Andre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9447 (1989); Zimmerman et al, Biotechniques, 21: 268-279 (1996); Diviacco et al, Gene, 122: 3013-3020 (1992); BeckerAndre et al, Nucleic Acids Research, 17: 9437-9446 (1989) и т.п.
"Праймер" обозначает олигонуклеотид либо природный, либо синтетический, который способен при образовании дуплекса с полинуклеотидной матрицей действовать в качестве сайта инициации синтеза нуклеиновой кислоты и удлиняться от его 3’-конца вдоль этой матрицы таким образом, что образуется удлиненный дуплекс. Удлинение праймера обычно проводят с использованием полимеразы нуклеиновой кислоты, такой как ДНК- или РНК-полимераза. Последовательность нуклеотидов, добавляемых в процессе удлинения, определяется последовательностью полинуклеотида-матрицы. Обычно праймеры удлиняются ДНК-полимеразой. Праймеры обычно имеют длину в диапазоне от 14 до 40 нуклеотидов или в диапазоне от 18 до 36 нуклеотидов. Праймеры используются в разнообразных реакциях амплификации нуклеиновых кислот, например, реакциях линейной амплификации, использующих единственный праймер, или полимеразных цепных реакциях, использующих два или несколько праймеров. Руководство для выбора длин и последовательностей праймеров для конкретных применений хорошо известно специалистам с обычной квалификацией в данной области, как доказывается следующими ссылками: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003).
"Проба” обозначает количество материала из биологического источника, источника окружающей среды, медицинского источника или источника пациента, в котором необходимо детектирование или измерение нуклеиновых кислот-мишеней. С одной стороны, предполагается, что этот термин включает в себя образец или культуру (например, микробиологические культуры). С другой стороны, предполагается, что этот термин включает в себя как биологические, так и происходящие из окружающей среды пробы. Проба может включать в себя образец синтетического происхождения. Биологической пробой может быть проба животного, в том числе человека, в виде жидкости, твердого вещества (например, стула) или ткани, а также проба жидких или твердых пищевых или кормовых продуктов и ингредиентов, таких как молочные продукты, овощи, мясо и мясные побочные продукты и отходы. Биологические пробы могут включать в себя материалы, взятые из пациента, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, культуры, кровь, слюну, цереброспинальную жидкость, плевральную жидкость, сперму, пункционные аспираты и т.п. Биологические пробы могут быть получены из всех из различных семейств домашних животных, а также неприрученных или диких животных, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, таких животных, как копытные, медведь, рыба, грызуны и т.д. Пробы окружающей среды включают в себя материал окружающей среды, такой как материал поверхности, почва, вода и промышленные пробы, а также пробы, полученные из инструментов переработки кормовых и молочных продуктов, устройства, оборудования, кухонной посуды, одноразовых и неодноразовых материалов. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие типы проб, применимые к данному изобретению. Термины "проба" и "образец" используются взаимозаменяемо.
Предпочтительные продукты амплификации представлены в следующей таблице:
| C. difficile | |||
| SEQ ID NO | Название мишени | Длина мишени (п.н.) | Последовательность мишени |
| 2 | tcdB (ампликон 1) | 120 |
|
| 3 | tcdB (ампликон 2) | 140 |
|
| 4 | tcdC_nt117 | 140 |
|
| 5 | делеции tcdC 18 п.н., 36 п.н. и 54 п.н. | 200; один и тот же район мишени для всех |
|
| 6 | бинарный токсин | 200 |
|
| 7 | делеция (делеции) tcdA | 540 |
|
|
|
|||
| 8 | ампликон tcdC 18 п.н. | 145 |
|
| 9 | ампликон tcdC 36 п.н. | 138 |
|
|
|
|||
| 10 | ампликон tcdC 39 п.н. | 95 |
|
| 11 | ампликон tcdC 54 п.н. | 110 |
|
| 1 | полноразмерная последовательность tcdC дикого типа (район штамма 630 REGION ACCESSION AM180355: 804310..805008) | 699 |
|
|
|
|||
| 12 | полноразмерная последовательность tcdC риботипа 027 (включающая в себя нуклеотид 117 и делецию 18 п.н.) (ACCESSION DQ861412) |
680 |
|
|
|
|||
| 13 | полноразмерная последовательность tcdC варианта с делецией 36 п.н. (ACCESSION DQ861424) |
663 |
|
|
|
|||
| 14 | полноразмерная последовательность tcdC варианта с делецией 39 п.н. (ACCESSION EF470292) |
660 |
|
|
|
| 15 | полноразмерная последовательность tcdC варианта с делецией 54 п.н. (отсутствует в публичной базе данных) | 645 |
|
| 2 | SEQ ID NO: 2 является предпочтительным ампликоном tcdB. |
| 3 | SEQ ID NO: 3 является дополнительным предпочтительным репликоном tcdB. |
| 4 | SEQ ID NO: 4 описывает делецию нуклеотида 117 tcdC |
| 5 | SEQ ID NO: 5 описывает делеции tcdC 18 п.н., 36 п.н., 39 п.н. и 54 п.н. |
| 6 | SEQ ID NO: 6 описывает бинарный токсин. |
| 7 | SEQ ID NO: 7 описывает делецию (делеции) tcdA. |
| 8 | SEQ ID NO: 8 является предпочтительным ампликоном tcdA 18 п.н. |
| 9 | SEQ ID NO: 9 является предпочтительным ампликоном tcdC 36 п.н. |
| 10 | SEQ ID NO: 10 является предпочтительным ампликоном tcdC 39 п.н. |
| 11 | SEQ ID NO: 10 является предпочтительным ампликоном tcdC 54 п.н. |
| 1 | SEQ ID NO: 1 является полноразмерной последовательностью tcdC дикого типа (штамм 630 REGION ACCESSION AM180355: 804310..805008) |
| 12 | SEQ ID NO: 12 является полноразмерной последовательностью tcdC риботипа 027 (она включает в себя делецию нуклеотида 117 и делецию 18 п.н.) ACCESSION DQ861412 |
| 13 | SEQ ID NO: 13 является полноразмерной последовательностью варианта tcdC с делецией 36 п.н. (ACCESSION DQ861424) |
| 14 | SEQ ID NO: 14 является полноразмерной последовательностью варианта tcdC с делецией 39 п.н. (ACCESSION EF470292) |
| 15 | SEQ ID NO: 15 является полноразмерной последовательностью варианта tcdC с делецией 54 п.н. |
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 показывает предпочтительные мишени в соответствии с данным изобретением.
Фиг. 2 показывает возможную установку картриджа в соответствии с данным изобретением.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Это изобретение относится к способу детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе, в котором выполняют следующие стадии: (а) предоставляют пробу, (b) в мультиплексном ПЦР-анализе (с) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина, (d) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия одной или нескольких из следующих делеций в этом гене tcdC: (а) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, (b) делеций 36 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 301 до нуклеотида 336, (с) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378, (d) делеций 54 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 313 до нуклеотида 366 и (е) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1.
Необязательно, эту пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия делеций 1,8 т.п.н. гена tcdA энтеротоксина.
Предпочтительно, эту пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия cdtA и/или cdtB бинарного токсина.
В одном варианте способа по этому изобретению эту пробу анализируют на (i) присутствие или отсутствие всех из следующих делеций: (а) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, (b) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378 и (с) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, (ii) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина, (iii) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия делеций 1,8 т.п.н. tcdA и (iv) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена cdtA/B бинарного токсина.
Предпочтительно в способе по этому изобретению, (а) если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эту пробу оценивают как токсиногенный Clostridium difficile, (b) если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117, присутствует делеция 18 п.н., присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эту пробу оценивают как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, (с) если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378, отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эту пробу оценивают как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и (d) если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эту пробу оценивают как штамм риботипа 078Clostridium difficile.
Необязательно и дополнительно могут быть анализированы следующие мишени. Они являются мишенями, ассоциированными с гипервирулентностью, такие как, но не ограничивающиеся ими, tcdCΔ36bp, tcdCΔ54bp. Штаммы, несущие делеции 36 п.н., 39 п.н. или 54 п.н., все, имеют дополнительные специфические мутации выше по ходу транскрипции в гене tcdC, которые приводят к укороченному и нефункциональному белку TcdC, который предпочтительно является частью этого анализа.
Специфические вариации в 3’-части гена tcdB сообщались в отношении штаммов non-NAP1/BI/027, которые предпочтительно находятся в этом анализе.
Предпочтительно продукты амплификации мультиплексного ПЦР-анализа имеют размер между 60 и 200 п.н.
В одном варианте осуществления реакцию мультиплексной амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в реакции амплификации.
В способе по этому изобретению эта замкнутая система дает оптические выходные данные для пользователя, указывающие оценивание, описанное в общих чертах выше.
Мультиплексная ПЦР-амплификация является количественной ПЦР-реакцией реального времени. Эта ПЦР реального времени (также обозначаемая здесь как количественная ПЦР и/или количественная ПЦР реального времени (кПЦР)) является способом одновременной амплификации и количественного определения нуклеиновых кислот с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Количественная ПЦР реального времени с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) является количественным ПЦР-способом реального времени, предусматривающим дополнительно обратную транскрипцию РНК в ДНК, например, мРНК в кДНК. В кПЦР-способах амплифицированную нуклеиновую кислоту определяют количественно по мере ее накапливания. Обычно используют флуоресцентные красители, которые интеркалируются двухцепочечной ДНК (например, этидийбромид или SYBR® Green I), или модифицированные зонды нуклеиновых кислот ("репортерные зонды"), которые флуоресцируют при гибридизации с комплементарной нуклеиновой кислотой (например, накапливающейся ДНК), для количественного определения в способах на основе кПЦР. В частности, в качестве репортерных зондов могут быть использованы флуорогенные праймеры, гибридизационные зонды (например, зонды LightCycler (Roche)), гидролизные зонды (например, зонды TaqMan (Roche)) или шпилечные зонды, такие как молекулярные метки, праймеры Scorpion (DxS), праймеры Sunrise (Oncor), праймеры LUX (Invitrogen), праймеры Amplifluor (Intergen) или т.п. Согласно данному изобретению, флуорогенные праймеры или зонды могут быть, например, праймерами или зондами, к которым могут быть присоединены, например ковалентно присоединены, флуоресцентные красители. Такими флуоресцентными красителями могут быть, например, FAM (5- или 6-карбоксифлуоросцеин), VIC, NED, Флуоросцеин, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, CAL Fluor® Gold, CAL Fluor® Red 610, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Quasar™ 705, LightCycler Red705® и т.п. Конкретные репортерные зонды могут дополнительно содержать гасители флуоресценции.
Для вариантов данного изобретения в количественной мультиплексной ПЦР реального времени могут быть использованы селективные праймеры.
Термин "праймер" обозначает здесь олигонуклеотид, содержащий последовательность, которая комплементарна транскрибируемой нуклеиновой кислоте ("матрице"). Во время репликации полимеразы присоединяют нуклеотиды, комплементарные соответствующим нуклеотидам этой матрицы, к 3’-концу праймера.
В конкретных вариантах осуществления этого изобретения полимеразой, используемой для количественной ПЦР реального времени, является полимераза из термофильного организма, или термостабильная полимераза, или полимераза, выбранная из группы, состоящей из ДНК-полимеразы Thermus thermophilus (Tth), ДНК-полимеразы Thermus acquaticus (Taq), ДНК-полимеразы Thermotoga maritima (Tma), ДНК-полимеразы Thermococcus litoralis (Tli), ДНК-полимеразы Pyrococcus furiosus (Pfu), ДНК-полимеразы Pyrococcus woesei (Pwo), ДНК-полимеразы Pyrococcus kodakaraensis (KOD), ДНК-полимеразы Thermus filiformis (Tfi), ДНК-полимеразы Sulfolobus solfataricus (Dpo4), ДНК-полимеразы Thermus pacificus (Tpac), ДНК-полимеразы Thermus eggertssonii (Teg), ДНК-полимеразы Thermus brockianus (Tbr) и ДНК-полимеразы Thermus flavus (Tfl).
В частности, эти флуоресцентно меченные зонды метят красителем, выбранным из группы, состоящей из FAM, VIC, NED, Флуоросцеина, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, ТЕТ, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon Green, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor и PET.
В частности, гибридизационным зондом является зонд LightCycler (Roche) или гидролизным зондом является зонд TaqMan (Roche). В других вариантах осуществления шпилечный зонд выбран из группы, состоящей из молекулярной метки, праймера Scorpion, праймера Sunrise, праймера LUX и праймера Amplifluor. Предпочтительными являются зонды TaqMan.
Это изобретение относится к картриджу замкнутой системы амплификации, содержащему один или несколько каналов или камер, содержащих праймеры и/или зонды, для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеций 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378 гена tcdC, (v) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
Это изобретение относится также к набору для выполнения способов этого изобретения, содержащему праймеры или зонды для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеций 1,8 т.п.н. в гене tcdA gene, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 37 8 гена tcdC, (v) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для (vi) детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
В предпочтительных вариантах осуществления этот набор дополнительно содержит ферменты, такие как полимераза, буфер и другие ингредиенты.
В одном варианте осуществления этот способ может выполняться в картридже, который предназначен для выполнения приготовления пробы и мультиплексной ПЦР реального времени. Имеются системы, способы и устройство для замкнутых мультистадийных реакций амплификации нуклеиновых кислот, в которых часть реакционной смеси предшествующей стадии служит в качестве пробы для реакции последующей стадии. Это изобретение обеспечивает способ, описанный в общих чертах выше, для контроля амплификации, предусматривающий стадии: (i) амплификации указанной мультиплексной реакции в присутствии флуоресцентного индикатора в реакционной смеси, причем этот флуоресцентный индикатор способен генерировать оптический сигнал для количественного определения ампликона в этой реакции амплификации; (ii) мониторинга этого оптического сигнала этого флуоресцентного индикатора в этой реакции амплификации.
Это изобретение относится также к картриджу замкнутой системы амплификации, содержащему один или несколько каналов или камер, содержащих праймеры и/или зонды, для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) гена tcdC, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, (iv) делеций 36 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 301 до нуклеотида 336, (v) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 340 до нуклеотида 378, (vi) делеций 54 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 313 до нуклеотида 366, (vii) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1. Такая замкнутая система описана, например, в WО 2006/047777. Этот картридж может дополнительно содержать одну или несколько камер для приготовления проб, например, лизиса клеток и/или экстракции нуклеиновых кислот. Предпочтительно, эти ПЦР-камеры включают в себя оптически прозрачную поверхность, такую как стеклянная, хрустальная или пластиковая поверхность, которая позволяет выполнять взаимосвязанное детектирование продукта амплификации.
После выделения этой ДНК в картридже ее повторно солюбилизируют в основной смеси, которая хранится в лиофилизированной форме внутри картриджа. Затем имеет место гомогенизация элюата в основном растворе. Наполнение по меньшей мере 3-5 ПЦР-камер (или их подмножества, если это требуется для данного применения) таким образом, что воздух не проникает в эти камеры, выполняется в картридже. Амплификация может требовать менее 5 камер, в этом случае используют соответствующий вариант картриджа. Требуемый объем элюции может быть адаптирован посредством протокола анализа. Выполняется закрытие этих камер во время амплификации, так чтобы ампликоны не могли выйти в окружающую среду, и воздух не мог проникнуть в эти камеры. Выполняется температурная циклизация камер. Эта циклизация является синхронизированной между всеми камерами, с индивидуальными заданными значениями температуры. Затем выполняется детектирование флуоресценции в 6 длинах волн. Детектирование может запускаться в любой момент в этом цикле. Расчет Ct-величин, исходных концентраций и конечных результатов теста выполняется на основании данных измерений и, возможно, дополнительных калибровочных данных. Результат теста генерируют на основании этих Ct-величин для мишеней этого изобретения.
Этот картридж выполняет ПЦР в устройстве. Контейнер с образцом или также описанный здесь картридж входит в систему управления, и пользователь регистрирует интерпретирующую программу (например, штриховой код, бумажную форму заказа и т.д.), ассоциированную с этим заказом. Система управления извлекает ассоциированный заказ из локальной консольной базы данных. Затем пользователь сканирует тег RFID этого картриджа. Этот картридж проверяют на его адекватность (например, насколько тип картриджа соответствует типу теста, срок окончания действия и т.д.). В случае допустимости применения картриджа, его присоединяют к заказу в базе данных системы управления. Главный сервис системы управления запрашивает доступный слот (паз) прибора. Подсистема управления прибора возвращает доступный слот (паз) после применения к нему балансирования нагрузки. После уведомления пользователя о вставлении этого картриджа пользователь вставляет картридж в предполагаемый слот. Подсистема управления прибора уведомляется о том, что картридж вставлен, и главная служба системы управления проверяет, связан ли этот картридж с данным заказом. В том случае, если картридж связан с этим заказом, принимающая база данных доступна для поиска запрошенных данных, соответствующих тест-типу в данном заказе. После приема этого подтверждения подсистема управления прибора дает команду о загрузке запрошенных данных и начинает испытание (тест) для слота, в который вставлен картридж. После завершения этого теста результат испытания получают с использованием подсистемы управления прибора и будут выполняться следующие стадии.
Этот результат испытания будет передаваться в сервер результата измерения. Этот сервер результата измерения будет хранить этот результат в базе данных системы управления. Затем этот результат будет отсылаться во внешнюю систему информации IS через подсистему информационного обмена внешней IS, и пользователь будет информирован, что это испытание завершено. Пользователь получает оптический и/или акустический результат, касающийся этого оценивания.
Как изображено на фиг.2, картридж разделен на 6 модулей. Эти модули объясняются детально в следующих абзацах. Модуль внутри картриджа определяется по его функциональности. Вся функциональная часть этого картриджа сгруппирована тесно, как только возможно, и осуществляется с минимальным количеством частей. Общая последовательность операций процесса является следующей: оператор заполняет пробой камеру лизиса вручную и закрывает крышку введения пробы. Этот картридж помещают на лоток слота и при помощи этого лотка загружают в этот слот. После загрузки в слот этот процесс начинается разжижением и лизисом пробы. Все это осуществляется при помощи, например, энергии HiFU в камере лизиса. К пробе добавляют различные реагенты один за другим таким образом, что конечный результат может быть промыт через мембрану для экстракции. Все эти стадии выполняются в одной камере для возможности манипулирования также пробами с высокой вязкостью, такими как стул (фекалии). Для всех этих процессов требуется только одна поверхность раздела и один источник HiFU. Транспорт реагентов в эту камеру выполняют при помощи модуля транспорта жидкости. В этом модуле реагенты хранятся в течение срока хранения, вынимаются из резервуаров и транспортируются в камеру лизиса. Этот модуль транспортирует также обработанную пробу из камеры лизиса через мембрану для экстракции в отходы. Таким же образом манипулируют промыванием модуля лизиса, модулем транспорта жидкости, модулем экстракции, ПЦР-модулем, мануальным введением пробы, закрыванием реагентов, взятых из резервуара и транспортируемых через мембрану в отходы. Посредством централизации активизации жидкости и манипулирования жидкостью минимизируются количество поверхностей раздела и количество компонентов в картридже для этой вспомогательной функции. Ранее упомянутая мембрана для экстракции реализована внутри модуля экстракции. Этот модуль гарантирует хороший поток через мембрану и хороший перенос тепла к этой мембране. Это тепло требуется для удаления этанола и элюции ДНК. Модуль манипулирования отходами используется для направления всех жидкостей, за исключением элюата, в отходы, и это выполняется таким же типом клапана, какой используется в модуле манипулирования жидкостями. Это осуществляется для минимизации различных способов, используемых внутри картриджа, для одной и той же функциональности. Второй функцией этого модуля является всасывание элюционного буфера через мембрану для экстракции. Активизация осуществляется этим модулем для минимизации риска загрязнения элюата. Этот риск мог бы быть более высоким при использовании модуля транспорта жидкости также для этой функции. Перед транспортировкой элюата в ПЦР-камеру сначала должна быть добавлена основная смесь и ДНК-содержимое должно быть гомогенизировано во всем общем объеме. Это также может быть выполнено в этом модуле. Наконец, эта жидкость транспортируется в ПЦР-камеру. Активизация выполняется тем же самым актюатором, используемым ранее для транспорта элюата через мембрану для экстракции. Для этой функции транспорта выбран также производимый давлением транспорт. Вскоре после этого функциональность для производимого давлением транспорта жидкости находится внутри картриджа. ПЦР-камеры, помещенные в ПЦР-модуле, должны заполняться без воздуха. Для гарантии этого помещают деаэрирующую мембрану внутри канала подачи для удаления прохождения пузырьков, образующихся при смешивании, в эту ПЦР-камеру. Эти ПЦР-камеры выполнены таким образом, что геометрия камеры ограничивает этот объем. Это гарантирует, что камеры наполняются из одного канала подачи. Эти камеры расположены параллельно в жидкостной структуре для предотвращения любой перекрестной наводки праймеров и/или зондов, которые являются специфическими, на камеру. Имеется также деаэрирующий фильтр для применения после наполнения.
Пробы или образцы, содержащие полинуклеотиды-мишени (Clostridum difficile), могут происходить из большого разнообразия источников для применения с данным изобретением, в том числе из культур клеток, тканей животного или человека, биопсий пациента, проб окружающей среды или т.п. Пробы готовят для анализов этого изобретения с использованием общепринятых способов, которые обычно зависят от источника, из которого берется проба или образец. Пробы или образцы берутся таким образом, чтобы минимизировать шанс загрязнения этой пробы или этого образца наружными элементами, или окружающей среды этой пробой, или этим образцом, если они содержат вредные компоненты. Обычно это выполняется введением пробы для анализа, например, ткани, крови, слюны и т.д., непосредственно в камеру сбора проб в замкнутой в отношении текучих сред системе. Обычно предотвращение перекрестного загрязнения этой пробы может выполняться прямой инжекцией этой пробы в камеру сбора проб посредством необязательно герметизируемого отверстия, например, инжекционного клапана, или перегородки. Обычно герметизируемые клапаны являются предпочтительными для уменьшения любой потенциальной угрозы подтекания во время или после инжекции пробы. Кроме вышеуказанного, часть сбора проб этого устройства/картриджа может также включать в себя реагенты и/или обеспечивать способы нейтрализации инфекционных агентов, стабилизации образца или пробы, коррекции рН и т.п. Способы для стабилизации и коррекции рН могут включать в себя, например, введение гепарина для предотвращения свертывания проб крови, добавление буферящих агентов, добавление протеазы, консервантов и т.п. Такие реагенты могут обычно храниться в камере сбора проб этого устройства/картриджа или могут храниться в отдельно доступной камере, причем эти реагенты могут добавляться к пробе или смешиваться с пробой после введения этой пробы в устройство. Эти реагенты могут быть включены в устройстве в жидкой или лиофилизированной форме в зависимости от природы и стабильности конкретного используемого реагента.
Здесь предпочтительной пробой являются фекалии человека или животного.
Перед проведением реакций амплификации на пробе часто будет желательным выполнение одной или нескольких операций приготовления пробы на этой пробе. Как правило, эти операции приготовления проб будут включать в себя такие манипуляции, как экстракция внутриклеточного материала, например, нуклеиновых кислот, из цельных проб и т.п. Одна или несколько из этих различных операций может быть легко включена в замкнутые относительно текучих сред системы, рассматриваемые данным изобретением.
Для вариантов, в которых анализируют цельные клетки или другие пробы тканей, обычно будет необходимо экстрагировать нуклеиновые кислоты из этих клеток, фекалий, крови или других жидкостей тела перед продолжением различных операций приготовления проб. Таким образом, после сбора проб нуклеиновые кислоты могут высвобождаться из собранных клеток в неочищенный экстракт, с последующими дополнительными обработками, для приготовления пробы для последующих операций, например, денатурации загрязняющих (ДНК-связывающих) белков, очистки, фильтрования, обессоливания и т.п. Выделение нуклеиновых кислот из клеток проб и денатурация ДНК-связывающих белков могут в основном выполняться химическими, физическими или электролитическими способами лизиса. Например, химические способы используют обычно лизирующие агенты для разрушения клеток и экстракции нуклеиновых кислот из этих клеток с последующей обработкой этого экстракта хаотропными солями, такими как гуанидинийизотиоцианат или мочевина, для денатурации любых загрязняющих и потенциально вредных белков. Как правило, при использовании химических способов экстракции и/или денатурации подходящие реагенты могут быть включены в камеру для приготовления проб, в отдельную доступную камеру или могут вводиться снаружи.
Для экстракции нуклеиновых кислот и денатурации ДНК-связывающих белков могут быть использованы физические способы. Патент США № 5304481 раскрывает использование физических выступов в микроканалах или частиц с острыми краями в камере или канале для прокалывания мембран клеток и экстрации их содержимого. Объединения таких структур с пьезоэлектрическими элементами для перемешивания могут обеспечивать подходящие сдвигающие усилия для лизиса. Такие элементы описаны более подробно в отношении фрагментации нуклеиновых кислот ниже. Более традиционные способы экстракции клеток также могут быть использованы, например, способы, использующие канал с ограничивающим поперечным размером, который вызывает лизис клеток. Альтернативно, экстракция клеток и денатурация загрязняющих белков могут проводиться приложением переменного тока к этой пробе. Более конкретно, пробу клеток пропускают через ряд микротрубочек при подаче переменного электрического тока сквозь поток жидкости. В устройстве данного изобретения могут быть использованы различные другие способы для выполнения лизиса/экстракции клеток, в том числе, например, подвергание клеток ультразвуковому перемешиванию или принудительное пропускание клеток через малые отверстия, с подверганием посредством этого этих клеток высокому стрессу сдвигом, приводящему к разрыву клеток.
После экстракции часто бывает желательным отделение нуклеиновых кислот от других элементов неочищенного экстракта, например денатурированных белков, частиц клеточных мембран, солей и т.п. Удаление материала макрочастиц обычно выполняют фильтрованием, флокуляцией или т.п. В это устройство могут быть включены различные типы фильтров. Далее, при использовании способов химической денатурации может быть желательным обессоливание пробы перед переходом к следующей стадии. Обессоливание пробы и выделение нуклеиновой кислоты может проводиться в единой стадии, например, связыванием нуклеиновых кислот с твердой фазой и вымыванием загрязняющих солей или выполнением гель-фильтрационной хроматографии на этой пробе, пропусканием солей через диализные мембраны и т.п. Подходящие твердые носители для связывания нуклеиновых кислот включают в себя, например, диатомовую землю, диоксид кремния (т.е. стекловату) или т.п. Подходящие гель-фильтрационные среды, также хорошо известные в данной области, могут быть также легко включены в устройство/картридж данного изобретения и коммерчески доступны, например, от Pharmacia и Sigma Chemical.
Выделение и/или гель-фильтрация/обессоливание могут проводиться в дополнительной камере, или, альтернативно, конкретные хроматографические среды могут быть включены в канал или проход для жидкости, ведущий в камеру следующей реакции. Альтернативно, внутренние поверхности одного или нескольких проходов для жидкости или камер могут быть сами дериватизованы для обеспечения функциональных групп, подходящих для желаемой очистки, например заряженных групп, групп аффинного связывания и т.п. Альтернативно, способы обессоливания могут обычно использовать преимущество высокой электрофоретической подвижности и отрицательного заряда ДНК в сравнении с другими элементами. Электрофоретические способы могут быть также использованы в очистке нуклеиновых кислот от других клеточных загрязнителей и остатков клеток. В одном примере разделительный канал или камера этого устройства находятся в жидкостной связи с двумя отдельными “полевыми” каналами или камерами, имеющими электроды, например платиновые электроды, расположенные в них. Эти два полевых канала отделены от канала разделения с использованием подходящего барьера или "улавливающей мембраны", которая делает возможным прохождение тока и препятствует прохождению нуклеиновых кислот или других больших молекул. Этот барьер обычно исполняет две основные функции: во-первых, этот барьер действует для удержания нуклеиновых кислот, которые мигрируют в направлении положительного электрода в камере для разделения; и, во-вторых, эти барьеры препятствуют переносу вредных эффектов, ассоциированных с электролизом при электроде, в камеру для реакции (например, действуя в качестве солевого сочленения). Такие барьеры могут включать в себя диализные мембраны, плотные гели, PEI-фильтры или другие подходящие материалы. После включения подходящего электрического поля нуклеиновые кислоты, присутствующие в пробе, будут мигрировать в направлении положительного электрода и становиться уловленными на улавливающей мембране. Затем загрязнения пробы, остающиеся свободными от этой мембраны, вымывают из этой камеры применением подходящего потока жидкости. После изменения полярности напряжения эти нуклеиновые кислоты высвобождаются из этой мембраны в существенно более чистой форме. Полевые каналы могут быть помещены на одной и той же стороне или на противоположных сторонах или концах камеры или канала разделения и могут использоваться вместе с описанными здесь смешивающими элементами для гарантии максимальной эффективности операции. Кроме того, на этих барьерах могут быть помещены фильтры грубой очистки во избежание засорения этих барьеров состоящим из частиц материалом, белками или нуклеиновыми кислотами, для позволения повторного использования. В сходном аспекте высокая электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот с их отрицательными зарядами может быть использована для отделения нуклеиновых кислот от загрязнителей с использованием короткой колонки геля или другого подходящего матрикса или геля, которые будут замедлять или ингибировать поток других загрязнителей, делая возможным более быстрое прохождение нуклеиновых кислот.
В одном предпочтительном варианте эти зонды и/или праймеры распределяются в каналах или камерах следующим образом. Конкретная смесь праймеров и зондов стабильно хранится в виде высушенного материала в каждой отдельной ПЦР-камере. При заполнении этой ПЦР-камеры предварительно смешанной реакционной смесью матрица/ПЦР эти хранящиеся праймеры/зонды образуют гомогенный раствор с концентрациями, оптимальными для их предполагаемых реакций.
Claims (32)
1. Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе, в котором выполняют следующие стадии:
a. предоставляют пробу;
b. в мультиплексном ПЦР-анализе
i) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия гена tcdB цитотоксина;
ii) эту пробу анализируют в отношении присутствия или отсутствия следующих делеций в гене tcdC:
a) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347;
b) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14;
c) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1,
где мультиплексная ПЦР-амплификация является количественной ПЦР реального времени,
где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия делеций 1,8 т.п.н. гена tcdA энтеротоксина,
где пробу дополнительно анализируют в отношении присутствия или отсутствия cdtA и/или cdtB бинарного токсина, и, где
a. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н., то эта проба оценивается как токсиногенный штамм Clostridium difficile,
b. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, присутствует делеция 18 п.н. и присутствует ген бинарного токсина cdtA/B, то эта проба оценивается как штамм риботипа 027 Clostridium difficile,
c. если присутствует последовательность гена tcdB, присутствует делеция tcdA, не присутствует ни делеция единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1, ни делеция 18 п.н., ни делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14, и отсутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 017 Clostridium difficile, и
d. если присутствует последовательность гена tcdB, отсутствует делеция tcdA, присутствует делеция 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14, присутствует ген cdtA/B бинарного токсина, то эта проба оценивается как штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
2. Способ по п. 1, где эту пробу анализируют на:
a. присутствие или отсутствие всех из следующих делеций:
b. делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347, делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14,
c. делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1,
d. присутствие или отсутствие гена tcdB цитотоксина,
e. присутствие или отсутствие делеций 1,8 т.п.н. tcdA и
f. присутствие или отсутствие гена cdtA/B бинарного токсина.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
4. Способ по п. 1, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
5. Способ по п. 2, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
6. Способ по п. 1, где мультиплексную реакцию амплификации выполняют в замкнутой системе в присутствии флуоресцентных индикаторов в реакционной смеси (реакционных смесях), причем эти флуоресцентные индикаторы способны генерировать оптический сигнал, связанный с присутствием и/или количеством каждого ампликона в этой реакции амплификации, и позволяют осуществлять мониторинг этого оптического сигнала флуоресцентных индикаторов в этой реакции амплификации.
7. Способ по п. 3, где эта замкнутая система дает оптические выходные данные для пользователя, указывающие оценивание пробы как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, штамм риботипа 017 Clostridium difficile или штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
8. Способ по любому из пп. 4-6, где эта замкнутая система дает оптические выходные данные для пользователя, указывающие оценивание пробы как штамм риботипа 027 Clostridium difficile, штамм риботипа 017 Clostridium difficile или штамм риботипа 078 Clostridium difficile.
9. Способ по п. 1, где продукты амплификации в мультиплексном ПЦР-анализе имеют размер от 60 до 200 п.н.
10. Способ по п. 1, где эта проба является фекалиями человека или животного.
11. Картридж замкнутой системы амплификации для осуществления способа по любому из пп. 1-10, содержащий праймеры и/или зонды, для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеций 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14 гена tcdC, (v) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
12. Набор для выполнения способа по любому из пп. 1-10, содержащий праймеры и/или зонды для амплификации и/или детектирования (i) гена tcdB цитотоксина, (ii) делеций 1,8 т.п.н. в гене tcdA, (iii) делеций 18 п.н. в SEQ ID NO: 1 от нуклеотида 330 до нуклеотида 347 гена tcdC, (iv) делеций 39 п.н. в SEQ ID NO: 1, как представлено в SEQ ID NO: 14 гена tcdC, (v) делеций единственного нуклеотида в положении 117 SEQ ID NO: 1 и праймеры и/или зонды для (vi) детектирования гена cdtA/B бинарного токсина.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP09157547 | 2009-04-07 | ||
| EP09157547.2 | 2009-04-07 | ||
| PCT/IB2010/051396 WO2010116290A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-03-31 | Method for the detection and characterization of a toxinogenic clostridium difficile strain |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011144853A RU2011144853A (ru) | 2013-05-20 |
| RU2612789C2 true RU2612789C2 (ru) | 2017-03-13 |
Family
ID=42224104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011144853A RU2612789C2 (ru) | 2009-04-04 | 2010-03-31 | Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма clostridium difficile |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20120028819A1 (ru) |
| EP (1) | EP2419527B1 (ru) |
| JP (1) | JP5859424B2 (ru) |
| KR (1) | KR101798211B1 (ru) |
| CN (1) | CN102378817B (ru) |
| BR (1) | BRPI1006757A2 (ru) |
| RU (1) | RU2612789C2 (ru) |
| WO (1) | WO2010116290A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2841390C1 (ru) * | 2024-11-27 | 2025-06-06 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО СПбГАУ) | Способ оценки генов токсинов Clostridium perfringens и Clostridioides difficile в консервированных объемистых кормах для крупного рогатого скота |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102378817B (zh) | 2009-04-07 | 2015-09-30 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法 |
| WO2012087135A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Genetic markers specific for clostridium difficile ribotypes 027 (nap01/b1; rt 027) and 078 (nap7/8; rt 078) and their use |
| GB201110712D0 (en) | 2011-06-23 | 2011-08-10 | Univ Ulster | Diagnostic methods |
| MX345557B (es) | 2011-07-06 | 2017-02-02 | Quest Diagnostics Invest Inc | Amplificacion y deteccion directa de patogenos virales y bacteriales. |
| GB201207998D0 (en) * | 2012-05-08 | 2012-06-20 | Univ Cardiff | A screening method for the detection of clostridium difficle |
| US9133527B2 (en) * | 2012-05-11 | 2015-09-15 | Techlab, Inc. | Cell wall protein CwpV (CD0514) as a diagnostic marker for Clostridium difficile ribotype 027 |
| KR101955329B1 (ko) * | 2012-06-08 | 2019-03-07 | 삼성전자주식회사 | 클로스트리디움 디피실리 균주 검출용 조성물과 키트 및 이를 이용한 검출 방법 |
| CN102952886A (zh) * | 2012-11-28 | 2013-03-06 | 中华人民共和国张家港出入境检验检疫局 | 艰难梭菌肠毒素a、b双重荧光定量pcr检测方法及检测用试剂盒 |
| US20140274770A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-18 | Quidel Corporation | Pcr assays and reagents for molecular detection of infectious agents |
| TWI504751B (zh) * | 2013-09-25 | 2015-10-21 | Univ Nat Cheng Kung | 檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法 |
| FI126289B (en) * | 2014-12-19 | 2016-09-15 | Mobidiag Ltd | Method for detecting the presence of a hypervirulent strain of Clostridium difficile |
| US20190211377A1 (en) * | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| EP3724354A1 (en) | 2017-12-15 | 2020-10-21 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile |
| EP3822370A1 (en) | 2019-11-15 | 2021-05-19 | Curiosity Diagnostics Sp. z o.o. | Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample |
| CN111705150B (zh) * | 2020-08-19 | 2020-12-25 | 中南大学湘雅医院 | 用于检测艰难梭菌核糖体027型毒力调节基因tcdC的方法、引物和试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348695C2 (ru) * | 2006-05-23 | 2009-03-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа |
| WO2009030031A1 (en) * | 2007-09-06 | 2009-03-12 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Detection of toxigenic strains of clostridium difficile |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5298421A (en) | 1990-04-26 | 1994-03-29 | Calgene, Inc. | Plant medium-chain-preferring acyl-ACP thioesterases and related methods |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| AU726501B2 (en) | 1996-06-04 | 2000-11-09 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring hybridization during PCR |
| FR2812306B1 (fr) * | 2000-07-28 | 2005-01-14 | Gabriel Festoc | Systeme d'amplification en chaine par polymerse de sequences nucleiques cibles |
| WO2006047777A2 (en) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Cepheid | Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions |
| US20070026426A1 (en) * | 2005-04-26 | 2007-02-01 | Applera Corporation | System for genetic surveillance and analysis |
| JP5596893B2 (ja) * | 2006-11-10 | 2014-09-24 | キヤノン株式会社 | プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
| US7687084B2 (en) | 2007-08-06 | 2010-03-30 | Tien Linsheng W | Cool-pet system |
| WO2009100215A2 (en) * | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of clostridium difficile |
| CN102378817B (zh) | 2009-04-07 | 2015-09-30 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 用于检测和表征产毒性艰难梭菌菌株的方法 |
-
2010
- 2010-03-31 CN CN201080014449.3A patent/CN102378817B/zh active Active
- 2010-03-31 KR KR1020117026359A patent/KR101798211B1/ko active Active
- 2010-03-31 RU RU2011144853A patent/RU2612789C2/ru active
- 2010-03-31 US US13/262,844 patent/US20120028819A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-31 WO PCT/IB2010/051396 patent/WO2010116290A1/en not_active Ceased
- 2010-03-31 JP JP2012504107A patent/JP5859424B2/ja active Active
- 2010-03-31 EP EP10713524.6A patent/EP2419527B1/en not_active Revoked
- 2010-03-31 BR BRPI1006757-4A patent/BRPI1006757A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2017
- 2017-06-08 US US15/617,010 patent/US10876174B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2348695C2 (ru) * | 2006-05-23 | 2009-03-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Дифференцирующий и специфический олигонуклеотиды для идентификации последовательностей днк инфекционных агентов в биологических материалах, способ видовой идентификации инфекционных агентов, биочип и набор для осуществления этого способа |
| WO2009030031A1 (en) * | 2007-09-06 | 2009-03-12 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Detection of toxigenic strains of clostridium difficile |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| BOUVET P.J. et al., Genetic relatedness of Clostridium difficile isolates from various origins determined by triple-locus sequence analysis based on toxin regulatory genes tcdC, tcdR, and cdtR, J Clin Microbiol. 2008, v.46, no.11, p. 3703-3713. * |
| CURRY S.R. et al., tcdC genotypes associated with severe TcdC truncation in an epidemic clone and other strains of Clostridium difficile, J Clin Microbiol, 2007, v.45, no.1, p. 215-221. * |
| MACCANNELL D.R. et al., Molecular analysis of Clostridium difficile PCR ribotype 027 isolates from Eastern and Western Canada, J Clin Microbiol, 2006, v.44, no.6, p. 2147-2152. * |
| PERSSON S. et al., New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A (tcdA) and toxin B (tcdB) and the binary toxin (cdtA/cdtB) genes applied to a Danish strain collection, Clin Microbiol Infect, 2008, v.14, no.11, p.1057-1064. * |
| SPIGAGLIA P. et al., Molecular analysis of the pathogenicity locus and polymorphism in the putative negative regulator of toxin production (TcdC) among Clostridium difficile clinical isolates, J Clin Microbiol, 2002, v.40, no.9, p. 3470-3475. * |
| SPIGAGLIA P. et al., Molecular analysis of the pathogenicity locus and polymorphism in the putative negative regulator of toxin production (TcdC) among Clostridium difficile clinical isolates, J Clin Microbiol, 2002, v.40, no.9, p. 3470-3475. CURRY S.R. et al., tcdC genotypes associated with severe TcdC truncation in an epidemic clone and other strains of Clostridium difficile, J Clin Microbiol, 2007, v.45, no.1, p. 215-221. BOUVET P.J. et al., Genetic relatedness of Clostridium difficile isolates from various origins determined by triple-locus sequence analysis based on toxin regulatory genes tcdC, tcdR, and cdtR, J Clin Microbiol. 2008, v.46, no.11, p. 3703-3713. PERSSON S. et al., New multiplex PCR method for the detection of Clostridium difficile toxin A (tcdA) and toxin B (tcdB) and the binary toxin (cdtA/cdtB) genes applied to a Danish strain collection, Clin Microbiol Infect, 2008, v.14, no.11, p.1057-1064. WOLFF D. et al., Rapid detection of the Clostridium difficile ribotype 0 * |
| VAN DEN BERG R.J. et al., Characterization of toxin A-negative, toxin B-positive Clostridium difficile isolates from outbreaks in different countries by amplified fragment length polymorphism and PCR ribotyping, J Clin Microbiol, 2004, v.42, no.3, p.1035-1041. * |
| WOLFF D. et al., Rapid detection of the Clostridium difficile ribotype 027 tcdC gene frame shift mutation at position 117 by real-time PCR and melt curve analysis, Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, v.28, no.8, p. 959-962. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2841390C1 (ru) * | 2024-11-27 | 2025-06-06 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО СПбГАУ) | Способ оценки генов токсинов Clostridium perfringens и Clostridioides difficile в консервированных объемистых кормах для крупного рогатого скота |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102378817A (zh) | 2012-03-14 |
| JP5859424B2 (ja) | 2016-02-10 |
| BRPI1006757A2 (pt) | 2020-03-10 |
| WO2010116290A1 (en) | 2010-10-14 |
| CN102378817B (zh) | 2015-09-30 |
| EP2419527A1 (en) | 2012-02-22 |
| JP2012528567A (ja) | 2012-11-15 |
| EP2419527B1 (en) | 2013-06-26 |
| US10876174B2 (en) | 2020-12-29 |
| RU2011144853A (ru) | 2013-05-20 |
| US20180237827A1 (en) | 2018-08-23 |
| KR101798211B1 (ko) | 2017-11-15 |
| KR20120005019A (ko) | 2012-01-13 |
| US20120028819A1 (en) | 2012-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2612789C2 (ru) | Способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма clostridium difficile | |
| JP7055020B2 (ja) | 薬剤に対する生物の応答のマイクロ流体測定 | |
| EP2271767B1 (en) | Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplificaton of multiple targets | |
| TWI697560B (zh) | 用於偵測細菌污染之方法及組合物 | |
| CA2895945C (en) | Target capture system | |
| Amita et al. | Qualitative evaluation of mycobacterial DNA extraction protocols for polymerase chain reaction | |
| US8895240B2 (en) | Method, kit and system for collecting and processing samples for DNA and RNA detection | |
| BRPI0517131B1 (pt) | Métodos para simplificar ácidos nucléicos microbiais por modificação química de citosinas | |
| CN103476945A (zh) | 使用基于分子核酸的技术确定细胞活性的改进方法 | |
| WO2009061752A1 (en) | Methods for detecting toxigenic microbes | |
| De Felice et al. | Latest trends in biosensors powered by nucleic acid isothermal amplification for the diagnosis of joint infections: From sampling to identification towards the point-of-care | |
| Hockman et al. | Comparison of multiplex PCR hybridization-based and singleplex real-time PCR-based assays for detection of low prevalence pathogens in spiked samples | |
| US20250290165A1 (en) | Viral variant detection | |
| EP1851325B1 (en) | Method for detecting viable cells in a sample by using a virus | |
| EP3438280A1 (en) | Haemoplasma detection method | |
| Mohammed et al. | Review on polymerase chain reaction and its diagnostic merit over conventional techniques in animal disease | |
| KR101911017B1 (ko) | 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단용 조성물, 타일로렐라 에퀴제니탈리스의 검출방법, 및 타일로렐라 에퀴제니탈리스 감염에 의한 말전염성자궁염의 진단방법 | |
| RU2814556C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| TELLI | PRINCIPLES of POLYMERASE CHAIN REACTION TECHNOLOGY an d APPLICATIONS n THE FOOD SCIENCE | |
| WO2016209938A1 (en) | Compositions and methods for processing a biological sample | |
| De Bruin et al. | Molecular detection and typing of Coxiella burnetii | |
| CN120752352A (zh) | 可存活细胞检测及其实施方案 | |
| EP3169796A1 (en) | Methods of detecting trichomonas vaginalis |