RU2611386C2 - Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях - Google Patents
Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях Download PDFInfo
- Publication number
- RU2611386C2 RU2611386C2 RU2015121673A RU2015121673A RU2611386C2 RU 2611386 C2 RU2611386 C2 RU 2611386C2 RU 2015121673 A RU2015121673 A RU 2015121673A RU 2015121673 A RU2015121673 A RU 2015121673A RU 2611386 C2 RU2611386 C2 RU 2611386C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- expression
- therapy
- tgf
- endotheliotropic
- level
- Prior art date
Links
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 title description 3
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims abstract description 21
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 13
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 claims description 16
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 8
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000012937 correction Methods 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 abstract 2
- 239000011944 nitrogen(II) oxide Substances 0.000 abstract 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 abstract 1
- 206010048554 Endothelial dysfunction Diseases 0.000 description 14
- 230000008694 endothelial dysfunction Effects 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 5
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 5
- KCWZGJVSDFYRIX-YFKPBYRVSA-N N(gamma)-nitro-L-arginine methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N[N+]([O-])=O KCWZGJVSDFYRIX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 3
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 206010056489 Coronary artery restenosis Diseases 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010022562 Intermittent claudication Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030831 Peripheral arterial occlusive disease Diseases 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101001000733 Rhodococcus jostii (strain RHA1) Glucose-6-phosphate isomerase 3 Proteins 0.000 description 1
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059054 Shunt thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008828 contractile function Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 1
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000000871 hypocholesterolemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000021156 intermittent vascular claudication Diseases 0.000 description 1
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 1
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки эффективности эндотелиопротекторной терапии у экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшном отделе аорты. Для этого через 1 месяц после операции в крови животных определяют уровень супероксиддисмутазы (СОД), малонового диальдегида (МДА), оксида азота(II) NO. На срезах из зоны пластики аорты определяют экспрессию актина (а-ГМА), CD34 и трансформирующий фактор роста (TGFβ) с помощью иммуногистохимических методов. При повышении секреции оксида азота(II) и уровня супероксиддисмутазы, снижении уровня малонового диальдегида, низкой экспрессии а-ГМА и TGFβ, повышении экспрессии CD34 делают вывод об отсутствии предпосылок для развития гиперплазии эндотелия и эффективности проведенной терапии. Изобретение позволяет проводить коррекцию эндотелиотропной терапии до развития гиперплазии неоинтимы. 3 табл., 6 ил.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК).
По данным отечественных авторов более 60% больных, которые обращаются к сосудистому хирургу по поводу перемежающей хромоты, имеют IIб стадию заболевания по классификации Фонтейна-Покровского [1]. Это пациенты, которым чаще всего выполняют реконструктивные операции. Однако в течение 5 лет до 40% протезов перестают функционировать [1]. Основной причиной тромбозов шунтов является рестеноз зоны реконструкции, вследствие гиперплазии неоинтимы, обусловленной эндотелиальной дисфункцией (ЭД) [2].
Применение спектра современных гипохолестеринемических препаратов не решает проблему коррекции эндотелиальной дисфункции, а тропные средства коррекции ЭД пока не вошли в арсенал сосудистых хирургов. Это обусловлено во многом отсутствием системных исследований и малым вниманием к возможностям медикаментозной коррекции ЭД и традиционному акценту на хирургию гемодинамически значимых результатов рестеноза.
Роль же дисфункции эндотелия в прогрессировании атеросклероза и развитии гиперплазии интимы сомнений не вызывает [2].
Существует целый ряд биохимических маркеров функционального состояния эндотелия (ФСЭ), определение уровня которых может не только дать ответ о тяжести эндотелиальной дисфункции, но и показать эффективность проводимой терапии [2, 10].
Перспективным направлением является оценка иммуногистохимических тестов для определения активности внутриклеточных структур [3].
В качестве прототипа использован патент на изобретение №2503961 от 09.04.2012 [4]. Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что оценку эффективности эндотелиотропной терапии осуществляют на основании уровня биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции, динамика которых зависит от активности экспрессии внутриклеточных белков (актин, CD34 и трансформирующий фактор роста β). Это позволяет корректно интерпретировать биохимические изменения до наступления гиперплазии неоинтимы и выявить связь между уровнем биохимических маркеров и активностью внутриклеточных структур.
Анализ полученных данных позволит оценить эффективность проводимой эндотелиотропной терапии, проводить коррекцию терапии до развития гиперплазии неоинтимы.
Цель изобретения - оценка эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях и прогнозирование развития гиперплазии неоинтимы до наступления морфологических изменений.
Способ заключается в следующем: экспериментальным животным проводилось моделирование L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции, затем выполнялась операция аллопластика инфраренального отдела брюшной аорты, назначалась эндотелиотропная терапия, наблюдение составляло 1 месяц, с последующим выводом животных из эксперимента, забором зоны пластики и выполнением трансмиссионной электронной микроскопии, иммуногистохимических и биохимических тестов.
Животные были разделены на 2 равнозначные группы. В первой (контрольной) группе животные в послеоперационном периоде не получали эндотелиотропной терапии. Во второй группе животные в послеоперационном периоде с целью коррекции эндотелиальной дисфункции получали L-аргинин в дозе 200 мг/кг в сутки.
В первый день эксперимента осуществляли забор крови из подкожной вены правой передней конечности животного в количестве 4-5 мл в стерильные пробирки для определения следующих показателей: малоновый диальдегид (МДА), супероксиддисмутаза (СОД), оксид азота (II) (NO).
Через 3 дня от начала эксперимента под наркозом выполнялась операция - аллопластика брюшного отдела аорты.
Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции осуществлялось путем введения в течение 7 дней N-нитро-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Для подтверждения получения модели повторно проводился забор крови и определение биохимических показателей.
В процессе наблюдения в различные сроки (до операции и через 1 месяц после вмешательства) проводится лабораторный контроль биохимических показателей с целью оценки функционального состояния эндотелия (определение малонового диальдегида колориметрическим методом по реакции 2-тиобарбитуровой кислотой [5]; определение активности супероксиддисмутазы спектрофотометрическим (кверцитиновым) методом (Бурмистров C.O., 1997) в модификации [5]; количественное определение стабильных конечных метаболитов оксида азота (II) [6].
Через 1 месяц наблюдения животные наркотизируются и выводятся из исследования, зона пластики изучается с помощью трансмисионной электронной микроскопии и определения экспрессии иммуногистохимических (ИГХ) маркеров: актин, CD34 и TGFβ на тканевых срезах [6].
Материал для исследования ИГХ методами фиксировали в 10% нейтральном формалине течение 24 ч заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37°С в течение 18 часов. Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве «2100Retrieval» («Pick Cell») при температуре 121°С в течение 20 мин с последующим остыванием на протяжении 90 мин. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 мин с 3% раствором перекиси водорода. Восстановление проводили в нитратном буфере с рН 6,0. В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» («Dako Cytomation»), в качестве хромогена - диаминобензидин (LSAB, Dako Cytomation) и АБС (LSAB, Dako Cytomation). Для получения результатов, пригодных для количественной обработки реакции, проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Autosteiner Dako».
Для ИГХ-реакций ставили положительные (в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя) и отрицательные (без первичных антител) контроли. Оценка результатов ИГХ-исследования проводилась следующим способом: интенсивность реакций с цитоплазматической экспрессией оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 (0 - отсутсвие экспрессии, 1 - слабая экспрессия - менее 20% клеток экспрессируют искомый антиген, 2 - умеренная экспрессия - 50% экспрессируют искомый антиген, 3 - сильная экспрессия - 70% клеток экспрессируют искомый антиген).
Результаты, полученные в ходе исследования, представлены в таблицах 1 и 2.
Из таблицы 1 наглядно видно, что на фоне введения L-NAME до операции наблюдается снижение секреции оксида азота (II) и высокое содержание СОД и МДА, что является убедительным признаком развития нарушения функционального состояния эндотелия. При этом наблюдается изменение экспрессии искомых антигенов, проявляющееся в усилении экспрессии а-ГМА, TGFβ и снижении экспрессии CD34. Дальнейшее колебание изучаемых биохимических показателей отражает тот факт, что на протяжении 1 месяца секреция оксида азота, как основного маркера эндотелиальной дисфункции, остается подавленной, активность МДА высокой. Также наблюдается усиление экспрессии а-ГМА, TGFβ и снижение экспрессии CD34.
Уровень СОД сохраняется высоким на протяжении всего периода наблюдения. СОД катализирует реакцию превращения супероксида в H2O2. Оксид азота (II) и СОД конкурируют за супероксид-анион. Высокая концентрация СОД в сыворотке крови животных говорит об активности антиоксидантной системы.
Малоновый диальдегид является конечным продуктом перекисного окисления липидов. Повышение активности ПОЛ ведет к угнетению секреции NO и его повышенному разрушению, что создает благоприятные условия для прогрессирования атеросклероза и развития рестеноза.
Решающая роль в патологических изменениях сосудов при различной патологии отводится факторам роста - полипептидным химическим агентам, продуцируемым in situ клетками стенки сосуда (эндотелиальными, гладкомышечными клетками) и клетками крови (тромбоцитами, лейкоцитами). Семейство фактора роста фибробластов (FGF) представлено 22 сходными по структуре полипептидными соединениями, играющими важную роль в процессах эмбрионального развития, ангиогенеза, васкулогенеза и заживления ран. Все представители семейства FGF воздействуют на клетку путем активации специфических трансмембранных тирозинкиназных рецепторов.
Трансформирующий фактор роста β (TGFβ) - фактор роста тромбоцитов в совокупности с другими факторами роста способны действовать как агенты "компетентности", повышая пролиферативную активность клеток-мишеней, или как агенты "прогрессии", стимулируя синтетическую деятельность компетентных клеток. Процессы клеточной миграции, пролиферации и биосинтеза или распада межклеточного вещества приводят к структурным изменениям стенки сосуда [7-8].
CD 34 - это мембранный белок, играющий роль на ранних этапах гемопоэза. Максимальная экспрессия данного маркера осуществляется пролиферирующими эндотелиальными клетками [8].
Существование гладкомышечных клеток (ГМК) сосудистой стенки поддерживается путем их постоянного развития из малодифференцированных, но способных к усиленной пролиферации форм, до высокодифференцированных сократительных элементов. Поскольку высокодифференцированные ГМК синтезируют большое количество α-актина - белка, отвечающего за их сократительную функцию, - снижение содержания этого белка непосредственно коррелирует с дедифференцировкой ГМК и их переходом в более пролиферирующее состояние. Было показано, что при развитии гиперплазии неоинтимы происходит активировация дифференцировки ГМК и их переход в стабильное состояние путем воздействия на ФИ-3-киназный путь, а также значительно повышается экспрессия α-актина - маркера дифференцировки ГМК сосудов [8].
Исходя из этого, выявленное в контрольной группе усиление экспрессии α-ГМА, TGFβ и снижение экспрессии CD34 в послеоперационном периоде является предиктором развития гиперплазии интимы до наступления морфологических изменений.
Из таблицы 2 видно, что прием L-аргинина ведет к коррекции эндотелиальной дисфункции. Отмечается повышение секреции оксида азота (II) и уровня супероксиддисмутазы, снижение уровня малонового диальдегида. Отмеченная тенденция характеризует нормализацию функционального состояния эндотелия и является прогностически благоприятным эффектом эндотелиотропной терапии.
На фоне приема L-аргинина снижается активность экспрессии а-ГМА, усиление экспрессии CD34 при низкой экспрессии TGFβ.
Между результатами биохимических анализов через 1 месяц от выполнения операции и показателями иммуногистохимических тестов проводился корреляционный анализ. Изучалась корреляционная связь между изучаемыми биохимическими показателями (МДА, СОД, NO) и экспрессией внутриклеточных белков (а-ГМА, CD34, TGFβ) (табл. 3).
Полученные результаты свидетельствуют об обратной зависимости между уровнем NO и а-ГМА, TGFβ, прямой зависимости между NO и CD34, обратной зависимости между уровнем МДА, СОД и CD34 и прямой зависимости между МДА, СОД и а-ГМА, TGFβ. Корреляция значима.
Таким образом, в случае высокого уровня метаболитов NO, наблюдается низкая активность гладкомышечных клеток, о чем свидетельствует его низкая экспрессия в ткани, высокая экспрессия CD34, при отсутствии экспрессии трансформирующего фактора роста. Представленный способ позволяет оценить экспрессию в стенке сосуда белков, ответственных за запуск процессов формирования неоинтимы, на основании уровня биохимических маркеров, отражающих ФСЭ, до наступления морфологических изменений и признаков, характерных для гиперплазий неоинтимы.
Приводим экспериментальное наблюдение.
До операции проводился забор крови из вен тыльной поверхности передней лапы. Были получены следующие результаты: NO=10,1 уе; СОД=0,173 (уе) на мg Hb, МДА=14,2 (уе) на мg Hb. Через 2 дня выполнялось оперативное вмешательство.
Под наркозом выполнялась полная срединная лапаротомия, выделялась брюшная аорта, продольная аортотомия, аллопластика брюшной аорты (рис. 1-3). Послойное ушивание раны.
Животные содержались в виварии с соблюдением необходимых условий содержания и пищевого рациона. С целью коррекции дисфункции эндотелия принимали L-аргинин в дозе 200 мг/кг в сутки.
Через 1 месяц проводился забор крови с целью оценки уровня биохимических показателей: NO=28,34 уе; СОД=2,69 (уе) на мg Hb, МДА=9,85 (уе) на мg Hb.
Затем животное наркотизировалось и выводилось из исследования, зона пластики изучалась с помощью трансмисионной электронной микроскопии и определялась экспрессия иммуногистохимических маркеров: актин, CD34 и TGFβ на тканевых срезах.
Были получены следующие результаты (рис. 4): низкая экспрессии а-ГМА (1 балл), выраженная экспрессия CD34 (3 балла) и отсутствие экспрессии TGFβ (0 баллов).
Согласно полученным данным, на фоне приема L-аргинина отмечается улучшение функционального состояния эндотелия, проявляющееся высоким уровнем секреции NO и СОД и низким уровнем МДА. По данным иммуногистохимического исследования также наблюдается низкая экспрессия а-ГМА, отсутствие экспрессии TGFβ и выраженная экспрессия CD34, что говорит об отсутствии предпосылок для развития гиперплазии интимы и эффективности проводимой эндотелиотропной терапии.
Источники информации, принятые во внимание
1) Клиническая ангиология: Руководство / Под ред. А.В. Покровского. В двух томах. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2004. - 1400 с.: ил.
2) Киричук В.Ф., Глыбочко П.В., Пономарева А.И. Дисфункция эндотелия. - Саратов: Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2008, - 129 с.
3) Значение сосудистых факторов роста в развитии рестеноза коронарных артерий у больных ИБС после интервенционных вмешательств / в соавт. с Бузиашвили Ю.И., Асымбековой Э.У., Мацкеплишвили С.Т., Ариповым М.А. // Материалы Международной конференции «Неинвазивная диагностика ишемической болезни сердца: настоящее и будущее». - Москва, 2001 (25-26 октября). - С. 53.
4) Патент на изобретение №2503961 от 09.04.2012 / Способ оценки функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте / Калинин Р.Е., Сучков И.А., Мнихович М.В. / Опубликовано 10.01.2014 бюл. №1.
5) Коробойникова Э.Н. Модификация определения продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело - 1989 - №7.- С. 8-9.
6) Звягина В.И., Калинин Р.Е., Пшенников А.С., Сучков И.А., Матвеева И.В. Фотоколориметрический метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови. // Астраханский медицинский журнал. Астрахань - 2010. Т. 5, №1. С. 188-189.
7) Петрова С.В., Райхлин Н.Т. под ред. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Издание 3-е, дополненное и переработанное. - Казань, 2004. - 456 с., ил.
8) Хайтлина С.Ю. Механизмы сегрегации изоформ актина в клетке // Цитология. - 2007. - Т. 49, №5. - С. 345-354.
9) Федорченко Н.П., Федорченко Н.Н. Теоретические и морфологические закономерности патогенеза атеросклероза и основных его осложнений. Новые подходы к их профилактике и лечению // Морфология - 2009 - Т. 3 - №1 - С. 14-21.
10) Эндотелиальная дисфункция и способы ее коррекции при облитерирующем атеросклерозе / Калинин Р.Е., Сучков И.А., Пшенников А.С. // Москва, изд. Дом «ГЕОТАР-МЕД», 2014, 151 с.
Claims (1)
- Способ оценки эффективности эндотелиопротекторной терапии у экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшном отделе аорты, заключающийся в том, что через 1 месяц после операции в крови животных определяют уровень супероксиддисмутазы (СОД), малонового диальдегида (МДА), оксида азота(II) NO, и на срезах из зоны пластики аорты определяют экспрессию актина (а-ГМА), CD34 и трансформирующий фактор роста (TGFβ) с помощью иммуногистохимических методов, и при повышении секреции оксида азота(II) и уровня супероксиддисмутазы, снижении уровня малонового диальдегида, низкой экспрессии а-ГМА и TGFβ, повышении экспрессии CD34 делают вывод об отсутствии предпосылок для развития гиперплазии эндотелия и эффективности проведенной терапии.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015121673A RU2611386C2 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015121673A RU2611386C2 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015121673A RU2015121673A (ru) | 2016-12-20 |
| RU2611386C2 true RU2611386C2 (ru) | 2017-02-21 |
Family
ID=57759206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015121673A RU2611386C2 (ru) | 2015-06-05 | 2015-06-05 | Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2611386C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720815C1 (ru) * | 2019-10-11 | 2020-05-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ коррекции эндотелиальной дисфункции у пациентов с вторичной лимфедемой нижних конечностей |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050085548A1 (en) * | 1997-04-10 | 2005-04-21 | Kaesemeyer Wayne H. | Method and formulation for treating vascular disease |
| RU2306930C1 (ru) * | 2005-12-28 | 2007-09-27 | Михаил Владимирович Покровский | Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и l-аргинина при l-name-индуцированном дефиците оксида азота |
| RU2503961C2 (ru) * | 2012-04-09 | 2014-01-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГБОУ ВПО "РязГМУ Минздравсоцразвития России") | Способ оценки функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте |
-
2015
- 2015-06-05 RU RU2015121673A patent/RU2611386C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050085548A1 (en) * | 1997-04-10 | 2005-04-21 | Kaesemeyer Wayne H. | Method and formulation for treating vascular disease |
| RU2306930C1 (ru) * | 2005-12-28 | 2007-09-27 | Михаил Владимирович Покровский | Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией лозартана и l-аргинина при l-name-индуцированном дефиците оксида азота |
| RU2503961C2 (ru) * | 2012-04-09 | 2014-01-10 | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" (ГБОУ ВПО "РязГМУ Минздравсоцразвития России") | Способ оценки функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СУЧКОВ И. А., Коррекция эндотелиальной дисфункции в комплексном лечении больных облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей, Рязань, 2013, автореф. дис. д. м.н., с.48.. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720815C1 (ru) * | 2019-10-11 | 2020-05-13 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ коррекции эндотелиальной дисфункции у пациентов с вторичной лимфедемой нижних конечностей |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015121673A (ru) | 2016-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yu et al. | MARK4 controls ischaemic heart failure through microtubule detyrosination | |
| Frey et al. | Cellular senescence in gastrointestinal diseases: from pathogenesis to therapeutics | |
| Schreml et al. | Luminescent dual sensors reveal extracellular pH-gradients and hypoxia on chronic wounds that disrupt epidermal repair | |
| Ritschka et al. | The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration | |
| Manetti et al. | The IL1-like cytokine IL33 and its receptor ST2 are abnormally expressed in the affected skin and visceral organs of patients with systemic sclerosis | |
| Greenhalgh | Models of wound healing | |
| Kim et al. | Impact of high‐mobility group box 1 on melanocytic survival and its involvement in the pathogenesis of vitiligo | |
| TW394844B (en) | In-vitro angiogenesis assay | |
| Clements et al. | PREX1 drives spontaneous bone dissemination of ER+ breast cancer cells | |
| Jardin et al. | Melatonin downregulates TRPC6, impairing store-operated calcium entry in triple-negative breast cancer cells | |
| Nunez-Toldra et al. | Mechanosensitive molecular mechanisms of myocardial fibrosis in living myocardial slices | |
| Dormond et al. | CD40-induced signaling in human endothelial cells results in mTORC2-and Akt-dependent expression of vascular endothelial growth factor in vitro and in vivo | |
| Walraven et al. | In vitro cultured fetal fibroblasts have myofibroblast-associated characteristics and produce a fibrotic-like environment upon stimulation with TGF-β1: Is there a thin line between fetal scarless healing and fibrosis? | |
| Tan et al. | Endothelial progenitor cells control remodeling of uterine spiral arteries for the establishment of utero-placental circulation | |
| JP2021519302A (ja) | 微小残存がんを治療する方法 | |
| Ferraro et al. | Modulation of endothelial organelle size as an antithrombotic strategy | |
| Liu et al. | BCAT1 alleviates early brain injury by inhibiting ferroptosis through PI3K/AKT/mTOR/GPX4 pathway after subarachnoid hemorrhage | |
| Wu et al. | Activation of PAR1 contributes to ferroptosis of Schwann cells and inhibits regeneration of myelin sheath after sciatic nerve crush injury in rats via Hippo-YAP/ACSL4 pathway | |
| RU2611386C2 (ru) | Способ оценки эффективности эндотелиотропной терапии после реконструктивных операций на артериях | |
| Wang et al. | Activation of EphrinB2 signaling promotes adaptive venous remodeling in murine arteriovenous fistulae | |
| JP2013540276A (ja) | 創傷を治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、およびその使用方法 | |
| Kodama et al. | Sarpogrelate hydrochloride reduced intimal hyperplasia in experimental rabbit vein graft | |
| Guan et al. | 3D pancreatic ductal adenocarcinoma desmoplastic model: Glycolysis facilitating stemness via ITGAV-PI3K-AKT-YAP1 | |
| JP5016676B2 (ja) | 免疫系の活性化または細胞死の程度の検出のための方法 | |
| Yu et al. | The myristoylated alanine-rich C kinase substrate differentially regulates kinase interacting with stathmin in vascular smooth muscle and endothelial cells and potentiates intimal hyperplasia formation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170606 |