RU2610173C1 - Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human - Google Patents
Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human Download PDFInfo
- Publication number
- RU2610173C1 RU2610173C1 RU2016111859A RU2016111859A RU2610173C1 RU 2610173 C1 RU2610173 C1 RU 2610173C1 RU 2016111859 A RU2016111859 A RU 2016111859A RU 2016111859 A RU2016111859 A RU 2016111859A RU 2610173 C1 RU2610173 C1 RU 2610173C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pfm
- ifn
- coli
- recombinant
- gene
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 48
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title abstract description 9
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 title description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 18
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims abstract description 8
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 41
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 101000755953 Bacillus subtilis (strain 168) Ribosome maturation factor RimP Proteins 0.000 claims description 2
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 claims description 2
- 102220277134 rs776745497 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 abstract description 9
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 abstract description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 30
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 30
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 101150103227 IFN gene Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- PEHXUQXNPFLMHR-VIFPVBQESA-N (2r)-2-(2-pyridin-2-ylethylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](CS)NCCC1=CC=CC=N1 PEHXUQXNPFLMHR-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000944748 Quesada Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000607269 Vibrio proteolyticus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate group Chemical group [N+](=O)([O-])[O-] NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих в промышленных масштабах синтез рекомбинантного интерферона альфа-2b человека, свободного от метионина на N-конце, способа получения рекомбинантного (Met-) интерферона альфа-2b человека.The invention relates to biotechnology, genetic engineering, the microbiological and medical industries, and relates to new genetic constructs and producers providing, on an industrial scale, the synthesis of recombinant human interferon alpha-2b, free of methionine at the N-terminus, a method for producing recombinant (Met - ) interferon alpha 2b person.
Интерферон альфа-2b (далее ИФН) представляет собой белок, содержащий 165 аминокислот, с молекулярной массой около 19000 дальтон, продуцируемый в организме человека активированными лейкоцитами. ИФН ингибирует рост многих типов клеток с нормальным и трансформированным фенотипом, а также оказывает противовирусное действие, индуцируя в клетках состояние резистентности к вирусным инфекциям и модулируя ответную реакцию иммунной системы, направленную на нейтрализацию вирусов или уничтожая инфицированные ими клетки. Данные свойства определяют ценность ИФН в качестве медицинского препарата для лечения заболеваний лимфатической системы и системы кроветворения (волосато-клеточный лейкоз, миеломная болезнь, тромбоцитоз и т.д.), солидных опухолей (саркома Капоши у больных СПИДом, почечная карцинома и т.д.), вирусных заболеваний (гепатит В, С, папиллома, грипп) и т.д.Interferon alpha-2b (hereinafter IFN) is a protein containing 165 amino acids, with a molecular weight of about 19,000 daltons, produced in the human body by activated white blood cells. IFN inhibits the growth of many types of cells with a normal and transformed phenotype, and also has an antiviral effect, inducing a state of resistance to viral infections in cells and modulating the immune system response aimed at neutralizing viruses or destroying infected cells. These properties determine the value of IFN as a medicine for the treatment of diseases of the lymphatic system and blood formation system (hairy cell leukemia, myeloma, thrombocytosis, etc.), solid tumors (Kaposi’s sarcoma in patients with AIDS, renal carcinoma, etc. ), viral diseases (hepatitis B, C, papilloma, flu), etc.
Известны два основных принципа получения лейкоцитарного интерферона для терапевтических целей: получение "природного" ИФН из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами или другими индукторами ИФН, и получение "рекомбинантного" ИФН, продуцируемого рекомбинантными бактериальными клетками, дрожжевыми клетками или клеточными линиями животных.Two basic principles of producing leukocyte interferon for therapeutic purposes are known: obtaining a “natural” IFN from human blood donor white blood cells induced by viruses or other IFN inducers, and obtaining a “recombinant” IFN produced by recombinant bacterial cells, yeast cells, or animal cell lines.
"Природный" ИФН, полученный in vitro из лейкоцитов человека, является абсолютным аналогом ИФН по структуре и свойствам ИФН человека, который синтезируется в человеческом организме. Технология получения "природного" ИФН хорошо известна и описана во многих патентах (US 4745053, US 4680261, US 4548900, US 5391713, US 4873312, SU 1713591, RU 2066188, RU 2080873).“Natural” IFN obtained in vitro from human leukocytes is the absolute analogue of IFN in terms of the structure and properties of human IFN, which is synthesized in the human body. The technology for producing a “natural” IFN is well known and described in many patents (US 4745053, US 4680261, US 4548900, US 5391713, US 4873312, SU 1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Основными недостатками получения ИФН из лейкоцитов человека являются низкий выход целевого продукта, высокая себестоимость и вероятность контаминации конечного продукта вирусами гепатитов В, С, иммунодефицита и другими вирусами человека и загрязнение индукторами, используемыми при культивировании лейкоцитов.The main disadvantages of obtaining IFN from human leukocytes are the low yield of the target product, the high cost and likelihood of contamination of the final product with hepatitis B, C viruses, immunodeficiency and other human viruses and contamination with inducers used in the cultivation of leukocytes.
В настоящее время производство ИФН основано, главным образом, на использовании в качестве продуцентов микроорганизмов различной видовой принадлежности, созданных с помощью технологии рекомбинантных ДНК.At present, the production of IFN is based mainly on the use of microorganisms of various species, created using recombinant DNA technology, as producers.
Существует достаточно много разнообразных рекомбинантных экспрессионных и регуляторных плазмидных векторов и сконструированных на их основе бактериальных и дрожжевых штаммов, синтезирующих ИФН.There are a wide variety of recombinant expression and regulatory plasmid vectors and bacterial and yeast strains synthesizing IFNs constructed on their basis.
Например, известен ряд продуцентов из рекомбинантных бактерий вида Pseudomonas putida (SU1364343, SU 1640996, SU 1591484, RU 1616143, RU 2142508), вида Eschechihia coli (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т. 13, №9, с. 1186-1193; SU 1703691, RU 2054041, RU 2165455, RU 2258081, RU 2242516, RU 2319502, RU 2303063, RU 2326168), дрожжей Pichia pastoris (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12(3)., 152-155., 1995, WO/2001/068827, WO/2007/099462).For example, a number of producers of recombinant bacteria of the species Pseudomonas putida (SU1364343, SU 1640996, SU 1591484, RU 1616143, RU 2142508), Eschechihia coli (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, No. 9) are known , pp. 1186-1193; SU 1703691, RU 2054041, RU 2165455, RU 2258081, RU 2242516, RU 2319502, RU 2303063, RU 2326168), Pichia pastoris yeast (JN Garcia, JA Aguiar et. al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12 (3)., 152-155., 1995, WO / 2001/068827, WO / 2007/099462).
Несмотря на то что рекомбинантные продуценты позволяют получить целевой продукт со значительно более высоким выходом, по сравнению с технологией получения "природного" ИФН, многие известные штаммы нестабильны и имеют уровень экспрессии интерферона, недостаточный для промышленного производства.Despite the fact that recombinant producers allow to obtain the target product with a significantly higher yield, compared with the technology of obtaining "natural" IFN, many known strains are unstable and have an expression level of interferon insufficient for industrial production.
К существенным недостаткам дрожжевых продуцентов относится то, что в дрожжевых клетках существует процесс гликозилирования синтезированных белков, специфичный для дрожжевых клеток, что приводит к модификации целевого продукта. Кроме того, дрожжевые продуценты требуют крайне сложных условий для ферментации, связанных с необходимостью строго поддерживать в процессе биосинтеза концентрацию индуктора, например, концентрацию метанола.Significant disadvantages of yeast producers include the fact that in yeast cells there is a process of glycosylation of synthesized proteins specific for yeast cells, which leads to modification of the target product. In addition, yeast producers require extremely difficult conditions for fermentation, associated with the need to strictly maintain the concentration of the inducer during the biosynthesis, for example, the concentration of methanol.
Большинство из известных продуцентов вида E.coli синтезируют ИФН, содержащий на N-конце молекулы дополнительную аминокислоту метионин (Met), с которой инициируется синтез белка в бактериальной клетке. Присутствие дополнительной аминокислоты на N-конце ИФН делает продукт более иммуногенным. Длительное применение такого продукта в качестве терапевтического препарата, как правило, приводит к образованию специфических антител ко всем ИФН, как к природным, так и к рекомбинантным (Antonelli et.al. J. Inf. Disease 163:882-885, 1991; Quesada et.al. J. Clin. Oncology 3:1522-1528, 1985).Most of the known producers of E. coli synthesize IFN, which contains the additional amino acid methionine (Met) at the N-terminus of the molecule, with which protein synthesis is initiated in the bacterial cell. The presence of an additional amino acid at the N-terminus of IFN makes the product more immunogenic. Long-term use of such a product as a therapeutic drug, as a rule, leads to the formation of specific antibodies to all IFNs, both natural and recombinant (Antonelli et.al. J. Inf. Disease 163: 882-885, 1991; Quesada et .al. J. Clin. Oncology 3: 1522-1528, 1985).
В связи с этим возникает необходимость удаления N-концевого метионина, что усложняет и повышает трудоемкость получения ИНФ при использовании известных штаммов E.coli.In this regard, there is a need to remove the N-terminal methionine, which complicates and increases the complexity of obtaining INF using known E. coli strains.
Известно несколько способов удаления N-концевого метионина у целевого продукта.Several methods are known for removing the N-terminal methionine from the target product.
В частности, N-концевой метионин может быть удален путем химического расщепления метионина in vitro реагентом бром цианом (CNBr) в кислых условиях. Однако данный метод не применим для получения Met" интерферона, в молекуле которого присутствуют внутренние метиониновые остатки (Boix, Е., et al. //Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. // J. Mol. Biol., 1996, 257: 992-1007).In particular, the N-terminal methionine can be removed by chemical cleavage of methionine in vitro with cyanogen bromide (CNBr) under acidic conditions. However, this method is not applicable for the production of Met "interferon, in the molecule of which there are internal methionine residues (Boix, E., et al. // Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. // J. Mol. Biol., 1996, 257: 992-1007).
Во-вторых, N-концевой Met может быть удален in vitro ферментом аминопептидазой, полученной из микроорганизмов вида Aeromonas proteolytica (Notomista et al., 1999; Shapiro et al., 1988, US 5,763,215) или вида Bacillus licheniformis (US 6428997). Недостатком этого метода является многостадийность и высокая себестоимость конечного продукта, т.к. сначала получают Met+ интерферон и препаративные количества очищенного фермента аминопептидазы, далее проводят ферментативную обработку Met+ белка с последующим повторным выделением Met+ целевого продукта.Secondly, the N-terminal Met can be removed in vitro by an aminopeptidase enzyme obtained from microorganisms of the Aeromonas proteolytica species (Notomista et al., 1999; Shapiro et al., 1988, US 5,763,215) or Bacillus licheniformis (US 6428997). The disadvantage of this method is the multi-stage and high cost of the final product, because First, Met + interferon and preparative amounts of the purified aminopeptidase enzyme are obtained, then the Met + protein is enzymatically processed, followed by the repeated isolation of the Met + target product.
N-концевой метионин также может быть удален из рекомбинантного белка in vivo, если белок экспрессируется в форме гибридного белка, несущего сигнальный пептид, присоединенный к его N-концу. При транспорте гибридного белка через клеточную мембрану сигнальный пептид отщепляется ферментом сигнальной пептидазой. Известные генетические конструкции на основе метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha (Frank Muller, et al., 2002, // Production of IFNα-2a in Hansenula polymorpha // Process Biochemistry., 38., 15-25) и Pichia pastoris (WO/2001/068827, WO/2007/099462) реализуют данный принцип удаления N-концевой метионина.The N-terminal methionine can also be removed from the recombinant protein in vivo if the protein is expressed in the form of a fusion protein carrying a signal peptide attached to its N-terminus. When a fusion protein is transported across a cell membrane, the signal peptide is cleaved by the signal peptidase enzyme. Known genetic constructs based on methylotrophic yeast Hansenula polymorpha (Frank Muller, et al., 2002, // Production of IFNα-2a in Hansenula polymorpha // Process Biochemistry., 38., 15-25) and Pichia pastoris (WO / 2001 / 068827, WO / 2007/099462) implement this principle of removal of the N-terminal methionine.
Недостатками известных генетический конструкций является специфичное для дрожжевых клеток гликозилирование белков и большая степень некорректного отщепления сигнального пептида от белка интерферона, что приводит к получению модифицированного ИФН. Кроме того, сложность ферментации метилотрофных дрожжей приводит к высокой себестоимости конечного продукта.The disadvantages of the known genetic constructs are protein glycosylation specific for yeast cells and a large degree of incorrect cleavage of the signal peptide from the interferon protein, which leads to the production of a modified IFN. In addition, the complexity of the fermentation of methylotrophic yeast leads to the high cost of the final product.
Известные штаммы E.coli НМ 10703, НМ10711 и НМ10712, продуцируют ИФН в форме гибридного белка, несущего модифицированный сигнальный пептид термостабильного энтеротоксина II E.coli. При транспорте гибридного белка через клеточную цитоплазматическую мембрану сигнальный пептид отщепляется бактериальным ферментом - сигнальной пептидазой и Met- ИФН накапливается в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Продуктивность штаммов составляет около 1 г ИФН/100 o.e./1 литр культуральной среды (RU2230116 от 10.06.2004).Known strains of E. coli HM 10703, HM10711 and HM10712 produce IFN in the form of a fusion protein carrying a modified signal peptide of thermostable E. coli enterotoxin II. When a hybrid protein is transported through the cell cytoplasmic membrane, the signal peptide is cleaved by the bacterial enzyme — signal peptidase and Met — IFN accumulates in the periplasmic space of the bacterial cell. The productivity of the strains is about 1 g IFN / 100 oe / 1 liter of culture medium (RU2230116 from 10.06.2004).
К существенным недостаткам указанных продуцентов относится следующее: 1) требуются сложные условия ферментации для получения высокоплотной культуры штамма продуцента (до 100 о.е.) и высокого уровня синтеза рекомбинантного белка, что приводит к повышению себестоимости продукта; 2) деградация рекомбинантного белка в периплазме; 3) высокая частота некорректного отщепления сигнального пептида от молекулы ИФН в процессе секреции в периплазму; 4) сложность масштабирования процесса выделения белков из периплазмы методом т.н. «холодного шока»; 5) высокая степень деградация рекомбинантного белка при получении «грубого экстракта» ИФН, т.к. белок находится в растворимой форме и легко подвержен воздействию бактериальных протеолитических ферментов.The significant disadvantages of these producers include the following: 1) complex fermentation conditions are required to obtain a high-density culture of the producer strain (up to 100 pu) and a high level of recombinant protein synthesis, which leads to an increase in the cost of the product; 2) degradation of the recombinant protein in the periplasm; 3) a high frequency of incorrect cleavage of the signal peptide from the IFN molecule during secretion into the periplasm; 4) the complexity of scaling the process of protein isolation from periplasm by the so-called "Cold shock"; 5) a high degree of degradation of the recombinant protein upon receipt of a "crude extract" of IFN, because the protein is in soluble form and is easily exposed to bacterial proteolytic enzymes.
Наиболее близким аналогом по технической сущности к предлагаемому изобретению является штамм E.coli BDEES4 и рекомбинантная плазмида pES4-4, содержащая промотор PT7, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, последовательность искусственного гена рекомбинантного интерферона альфа 2b, последовательность гена β-лактамазы, детерминирующего устойчивость к антибиотику ампициллин, и терминатор транскрипции фага Т7. Уровень экспрессии интерферона составляет 20-30% от всех клеточных белков (RU 2258081 от 10.08.2005).The closest analogue in technical essence to the present invention is E. coli strain BDEES4 and recombinant plasmid pES4-4 containing the promoter P T7 , translation enhancer of
Основным недостатком известной плазмиды и штамма на ее основе является использование в плазмиде селективного гена β-лактомазы, детерминирующего устойчивость штамма к антибиотику ампициллин. При культивировании штамма β-лактомаза секретируется из бактериальной клетки и разрушает антибиотик. В результате чего в процессе ферментации происходит постоянное неконтролируемое снижение селективного давления для плазмидосодержащих клеток штамма, накопление безплазмидных клеток и, как следствие, снижение выхода интерферона. Кроме того, штамм-продуцент, содержащий плазмиду pES4-4, синтезирует ИФН с дополнительной аминокислотой метионин на N-конце молекулы.The main disadvantage of the known plasmid and strain based on it is the use in the plasmid of the selective β-lactomase gene that determines the resistance of the strain to the antibiotic ampicillin. When cultivating a strain of β-lactomase is secreted from the bacterial cell and destroys the antibiotic. As a result, in the process of fermentation there is a constant uncontrolled decrease in selective pressure for plasmid-containing cells of the strain, the accumulation of plasmid-free cells and, as a consequence, a decrease in the yield of interferon. In addition, a producer strain containing plasmid pES4-4 synthesizes IFN with an additional amino acid methionine at the N-terminus of the molecule.
Предлагаемое изобретение решает задачу конструирования бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать in vivo рекомбинантный ИФН человека, не содержащий дополнительный N-концевой метионин с высоким выходом и по упрощенной технологии (от 400 мг с 1 л культуры).The present invention solves the problem of constructing a bacterial producer strain that allows to obtain in vivo recombinant human IFN that does not contain an additional N-terminal methionine in high yield and by simplified technology (from 400 mg per 1 liter of culture).
Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии получения in vivo свободного от метионина на N-конце ИФН человека, за счет создания двух рекомбинантных плазмидных ДНК pFM-IFN-17, pFM-AP и создания на их основе высокопродуктивного стабильного биплазмидного штамма Escherichia coli FM-IFN-AP (pFM-IFN-17, pFM-AP).The technical result of the invention is to simplify the technology for in vivo production of methionine-free at the N-end of human IFN, by creating two recombinant plasmid DNAs pFM-IFN-17, pFM-AP and creating a highly productive stable biplasmid strain Escherichia coli FM-IFN -AP (pFM-IFN-17, pFM-AP).
Технический результат достигается следующим.The technical result is achieved as follows.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pFM-IFN-17 кодирует синтез ИФН человека под контролем триптофанового лактозного промоторов и терминатора транскрипции rrnBT1T2, содержит в качестве генетического маркера синтетический ген kan, детерминирующий устойчивости к канамицину. Моноплазмидный штамм E.coli BL21, содержащий рекомбинантную плазмиду pFM-IFN-17, обладает высоким уровнем экспрессии ИФН (не менее 1 г с 1 л культуральной среды).Recombinant plasmid DNA pFM-IFN-17 encodes the synthesis of human IFN under the control of tryptophan lactose promoters and the transcription terminator rrnBT1T2, contains the kan synthetic gene determining kanamycin resistance as a genetic marker. The monoplasmid strain E. coli BL21, containing the recombinant plasmid pFM-IFN-17, has a high level of IFN expression (at least 1 g with 1 l of culture medium).
Плазмида pFM-IFN-17 имеет 3215 пар оснований (п.о.) и характеризуется наличием следующих фрагментов:Plasmid pFM-IFN-17 has 3215 base pairs (bp) and is characterized by the presence of the following fragments:
- фрагмент ДНК размером 194 п.о., включающий триптофановый промотор E.coli и последовательность Шайн Дельгарно (SD), ответственную за инициацию трансляции;- a 194 bp DNA fragment comprising the E. coli tryptophan promoter and the Shine Delgarno (SD) sequence, responsible for the translation initiation;
- синтетический фрагмент ДНК размером 503 п.о., включающий «оптимизированную» кодирующую часть гена интерферона альфа-2b человека; при оптимизации гена ИФН из последовательности были удалены внутренние ТАТА-boxes, chi-sites, RBS последовательности, АТ-богатые и GC-богатые последовательности, повторяющиеся последовательности и потенциальные вторичные структуры мРНК; codon usage был адаптирован для Е.coli, при этом параметр CAI (codon adaptation index) = 0,99;- a synthetic DNA fragment of 503 bp in size, including the "optimized" coding portion of the human interferon alpha-2b gene; during optimization of the IFN gene, internal TATA-boxes, chi-sites, RBS sequences, AT-rich and GC-rich sequences, repeating sequences and potential secondary mRNA structures were removed from the sequence; codon usage was adapted for E. coli, with CAI (codon adaptation index) = 0.99;
- фрагмент ДНК плазмиды pKK223-3 размером 534 п.о., включающий последовательность строгого терминатора транскрипции rrnBT1T2, последовательности промотора и SD последовательность гена бета-лактомазы;- a 534 bp DNA fragment of plasmid pKK223-3, comprising the sequence of the strict termination terminator rrnBT1T2, the promoter sequence and the SD sequence of the beta-lactase gene;
- синтетический фрагмент ДНК размером 810 п.о., включающий синтетический ген kan, обеспечивающий устойчивость к канамицину - аналога гена kan из транспозона Tn903, в котором удалены сайты рестрикции AvaI, ClaI, SmaI, HindIII; фрагмент ДНК размером 1173 п.о. плазмиды pUC19, включающий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды (ori) и лактозный промотор.- a synthetic DNA fragment of 810 bp in size, including the synthetic kan gene, which provides resistance to kanamycin, an analogue of the kan gene from the transposon Tn903, in which the restriction sites AvaI, ClaI, SmaI, HindIII have been removed; 1173 bp DNA fragment pUC19 plasmids, including the sequence responsible for plasmid replication (ori) and the lactose promoter.
Физическая карта плазмиды pFM-IFN-17 представлена на Рис. 7. Нуклеотидная последовательность синтетического гена ИФН человека, встроенного в плазмиду pFM-IFN-17 приведена на Рис. 5.The physical map of plasmid pFM-IFN-17 is shown in Fig. 7. The nucleotide sequence of the synthetic human IFN gene inserted into the plasmid pFM-IFN-17 is shown in Fig. 5.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pFM-AP кодирует синтез фермента метионин-аминопептидазы E.coli под контролем лактозного промотора и содержит в качестве генетического маркера ген cm, детерминирующий устойчивость к хлорамфениколу. Моноплазмидный штамм E.coli BL21, содержащий рекомбинантную плазмиду pFM-AP обладает повышенной активностью фермента метионин-аминопептидазы E.coli, обеспечивающий направленное удаление аминокислоты метионин с N-конца белков, синтезирующихся в бактериальных клетках in vivo.Recombinant plasmid DNA pFM-AP encodes the synthesis of the E.coli methionine aminopeptidase enzyme under the control of the lactose promoter and contains the cm gene, which determines resistance to chloramphenicol, as a genetic marker. The monoplasmid strain E. coli BL21, containing the recombinant plasmid pFM-AP, has an increased activity of the E. coli methionine aminopeptidase enzyme, which provides targeted removal of the amino acid methionine from the N-terminus of proteins synthesized in bacterial cells in vivo.
Плазмида pFM-AP имеет размер 4582 п.о. и характеризуется наличием следующих фрагментов:Plasmid pFM-AP has a size of 4582 bp and is characterized by the presence of the following fragments:
- HindIII-SalI фрагмент ДНК плазмиды pACYC184 размером 3629 п.о., включающий последовательность, ответственную за репликацию плазмиды Р15А (ori) и ген cm, обеспечивающий устойчивость штамма Е.coli к хлорамфениколу;- HindIII-SalI DNA fragment of plasmid pACYC184 with a size of 3629 bp, including the sequence responsible for the replication of plasmid P15A (ori) and the cm gene, which ensures the resistance of E. coli strain to chloramphenicol;
- HindIII-NdeI - фрагмент ДНК размером 167 п.о., включающий лактозный промотор (Plac), последовательность Шайн Дельгарно (SD), ответственную за инициацию трансляции.- HindIII-NdeI - DNA fragment of 167 bp comprising lactose promoter (P lac), Shine Dalgarno sequence (SD), responsible for the initiation of translation.
- NdeI-SalI - фрагмент ДНК размером 804 п.о., включающий ген фермента метионин аминопептидазы Е.coli.- NdeI-SalI - DNA fragment with a size of 804 bp, including the gene of the enzyme methionine aminopeptidase E. coli.
Физическая карта плазмиды pFM-AP представлена на Рис. 8.The physical map of the plasmid pFM-AP is shown in Fig. 8.
Рекомбинантный штамм бактерий E.coli FM-IFN получен путем последовательной трансформацией клеток штамма Е.coli BL21 рекомбинантными плазмидными ДНК pFM-AP и pFM-IFN-17.The recombinant bacterial strain of E. coli FM-IFN was obtained by sequential transformation of cells of the E. coli strain BL21 with recombinant plasmid DNA pFM-AP and pFM-IFN-17.
Преимущества настоящего изобретения заключается, во-первых, в использовании стабильно наследуемой мультикопийной рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-17, в которой под контролем индуцибельного триптофанового и лактозного промоторов и rrnBT1T2 терминатора транскрипции расположен синтетический ген ИФН с оптимизированными для клеток бактерий E.coli кодонами кодирующими соответствующие аминокислоты и детерминирующей высокий уровень экспрессии целевого продукта. Во-вторых, в использовании стабильно наследуемой плазмиды pFM-АР, в которой под контролем индуцибельного лактозного расположен ген метионин аминопептидазы E.coli детерминирующий высокий уровень экспрессии соответствующего фермента. В третьих, в использовании двух плазмид pFM-IFN-17 и pFM-AP при получении биплазмидного штамма E.coli FM-IFN, который детерминирует высокий уровень синтеза целевого продукта ИФН и фермента метионин аминопептидазы E.coli целенаправленно удаляющий N-концевой метионин с молекулы ИФН in vivo в процессе ферментации штамма-продуцента. В четвертых, в использовании биплазмидного штамма E.coli FM-IFN при получении in vivo (Met-) интерферона альфа 2b человека.The advantages of the present invention consists, firstly, in the use of a stably inherited multicopy recombinant plasmid pFM-IFN-17, in which, under the control of the inducible tryptophan and lactose promoters and rrnBT1T2 of the transcription terminator, the synthetic IFN gene with optimized E. coli codons for bacterial cells is optimized amino acids and determining the high level of expression of the target product. Secondly, the use of a stably inherited plasmid pFM-AP, in which the E. coli methionine aminopeptidase gene is determined under the control of an inducible lactose, determines the high level of expression of the corresponding enzyme. Thirdly, in the use of two plasmids pFM-IFN-17 and pFM-AP to obtain a biplasmid strain of E. coli FM-IFN, which determines the high level of synthesis of the target product of IFN and the enzyme methionine aminopeptidase E. coli purposefully removing the N-terminal methionine from the molecule IFN in vivo during fermentation of the producer strain. Fourth, in the use of the biplasmid strain of E. coli FM-IFN when receiving in vivo (Met - ) human interferon alpha 2b.
Штамм E.coli FM-IFN-17 характеризуется следующими признаками.Strain E. coli FM-IFN-17 is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признакиCultural and morphological features
Штамм обладает свойствами типичного представителя вида Escherichia coli. Клетки мелкие, прямые, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.The strain has the properties of a typical representative of the species Escherichia coli. The cells are small, straight, thickened, rod-shaped, gram-negative, non-spore.
Штамм хорошо растет на простых питательных средах. Колонии при росте штамма на L агаре - круглые, гладкие, выпуклые, мутные, блестящие, серые, с ровными краями. В жидких средах (в минимальной среде с глюкозой или в L-бульоне) штамм образует интенсивную ровную муть.The strain grows well on simple nutrient media. Colonies during strain growth on L agar are round, smooth, convex, cloudy, shiny, gray, with smooth edges. In liquid media (in minimal medium with glucose or in L-broth), the strain forms an intense smooth turbidity.
Физиолого-биохимические признакиPhysiological and biochemical characteristics
Штамм растет в аэробных условиях, при температуре в пределах от 4 до 42°С. Оптимум рН для роста составляет 6,5-7.5.The strain grows under aerobic conditions, at temperatures ranging from 4 to 42 ° C. The optimum pH for growth is 6.5-7.5.
В качестве источника азота клетки штамма используют минеральные соли в аммонийной или нитратной формах; органические соединения, в частности, аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт и т.д.As a source of nitrogen, the cells of the strain use mineral salts in ammonium or nitrate forms; organic compounds, in particular amino acids, peptone, tryptone, yeast extract, etc.
В качестве источника углерода клетки штамма могут использоваться аминокислоты, глицерин, углеводы.Amino acids, glycerin, carbohydrates can be used as a carbon source of the strain cells.
Устойчивость к антибиотикамAntibiotic resistance
Штамм проявляет устойчивость к канамицину (до 100 мкг/мл) и хлорамфениколу (до 100 мкг/мл).The strain is resistant to kanamycin (up to 100 μg / ml) and chloramphenicol (up to 100 μg / ml).
Особенность штаммаStrain strain
Продуцирует интерферон, не содержащий дополнительный N-концевой метионин.It produces interferon that does not contain additional N-terminal methionine.
Условия хранения штаммаThe storage conditions of the strain
Штамм хранится: под маслом в L-агаре с добавлением канамицина до концентрации 100 мкг/мл и хлорамфеникола до концентрации 20 мкг/мл; криоконсервированным в L-бульоне, содержащем 15% глицерина и соответствующие антибиотики, в ампулах при температуре минус 40°-70°С; или в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре плюс 4°С.The strain is stored: under oil in L-agar with the addition of kanamycin to a concentration of 100 μg / ml and chloramphenicol to a concentration of 20 μg / ml; cryopreserved in L-broth containing 15% glycerol and the corresponding antibiotics in ampoules at a temperature of minus 40 ° -70 ° C; or in a lyophilized state in ampoules at a temperature of plus 4 ° C.
Штамм E.coli FM-IFN стабильно синтезирует интерферон альфа-2b, не содержащий дополнительный N-концевой метионин, с высоким уровнем экспрессии (до 400 мг с 1 л культуральной жидкости). Штамм технологичен и для достижения высокой продуктивности не требует особых условий для культивирования, а также применения сложных питательных сред.The strain E. coli FM-IFN stably synthesizes interferon alpha-2b, which does not contain an additional N-terminal methionine, with a high level of expression (up to 400 mg with 1 l of culture fluid). The strain is technological and to achieve high productivity does not require special conditions for cultivation, as well as the use of complex nutrient media.
Целевой продукт накапливается в количестве более 20-30% суммарного белка клетки в виде тел включения Использование нового продуцента, содержащего плазмиды pFM-IFN-17 и pFM-AP, позволит значительно повысить выход целевого продукта, а также упростить технологический процесс получения Met- ИНФ за счет упрощения стадии культивирования штамма, а также исключения необходимости в проведении дополнительных стадий по удалению N-концевого метионина.The target product accumulates in an amount of more than 20-30% of the total protein of the cell in the form of inclusion bodies. Using a new producer containing plasmids pFM-IFN-17 and pFM-AP will significantly increase the yield of the target product, as well as simplify the process of obtaining Met - INF for by simplifying the stage of cultivation of the strain, as well as eliminating the need for additional stages to remove the N-terminal methionine.
Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.The invention is illustrated, but not limited to the following examples.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pFM-IFN, обеспечивающей экспрессию синтетического гена ИФНExample 1. Construction of a recombinant plasmid pFM-IFN, providing expression of the synthetic IFN gene
Способ получения рекомбинантной плазмиды pFM-IFN включает несколько последовательных этапов:A method of obtaining a recombinant plasmid pFM-IFN includes several sequential steps:
- конструирование векторной плазмиды pFM-V-1 (2635 п.о.);- construction of the vector plasmid pFM-V-1 (2635 bp);
- конструирование векторной плазмиды pFM-V-2 (2547 п.о.);- construction of the vector plasmid pFM-V-2 (2547 bp);
- конструирование рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-1;- construction of recombinant plasmids pFM-IFN-1;
- конструирование рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-17;- construction of recombinant plasmids pFM-IFN-17;
1.1. Конструирование векторной плазмиды pFM-V-11.1. Construction of the vector plasmid pFM-V-1
Исходным вектором при получении векторной плазмиды pFM-V-1 служит вектор pUC19, в котором кодирующая последовательность гена бета-лактомазы, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, заменена на кодирующую последовательность синтетического гена kan, обеспечивающего устойчивость к канамицину. Для получения векторной плазмиды pFM-V-1 проводят 2 раунда амплификации ДНК. Для первого раунда реакции амплификации используют два синтетических олигонуклеотида FMV1 и FMV2:The starting vector for the preparation of the vector plasmid pFM-V-1 is the vector pUC19, in which the coding sequence of the beta-lactomase gene providing resistance to ampicillin is replaced by the coding sequence of the synthetic kan gene providing resistance to kanamycin. To obtain the vector plasmid pFM-V-1
FMV1 - 5'-ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3'FMV1 - 5'-ATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3 '
FMV2 - 5'-GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3'FMV2 - 5'-GAGTAAACTTGGTCTGACAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3 '
и в качестве матрицы ДНК синтетического гена kan - аналога гена kan из транспозона Tn903, в котором удалены сайты рестрикции AvaI, ClaI, SmaI, HindIII. Нуклеотидная последовательность синтетического гена kan, приведена на рис. 1and as a DNA template for the synthetic kan gene, an analogue of the kan gene from the transposon Tn903, in which the restriction sites AvaI, ClaI, SmaI, HindIII have been removed. The nucleotide sequence of the synthetic kan gene is shown in Fig. one
Амплификацию и все последующие проводят в ДНК-амплификаторе в буферном растворе, содержащем: 20 mM Tis-HCl, рН 8.8, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.1% Triton X100, 0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM каждого dNTP, 1.25 ед. Pfu ДНК полимеразы, 100 нг ДНК матрицы при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 35 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 1 мин при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). В результате ПЦР получают фрагмент размером 852 п.о., который электрофоретически очищают.Amplification and all subsequent ones are carried out in a DNA amplifier in a buffer solution containing: 20 mM Tis-HCl, pH 8.8, 10 mM (NH4) 2 SO 4 , 10 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 0.1% Triton X100, 0.1 mg / ml BSA, 0.2 mM each dNTP, 1.25 units Pfu DNA polymerase, 100 ng DNA template under the following modes: heating - 5 min at 96 ° C, then 35 PCR cycles (single cycle modes: 30 s at 96 ° C, 30 s at 58 ° C, 1 min at 72 ° C and then the final elongation - 10 min at 72 ° C). As a result of PCR, a fragment of 852 bp is obtained, which is electrophoretically purified.
Для второго раунда амплификации используют векторную ДНК плазмиды pUC 19 и полученный фрагмент ДНК, полученный в первом раунде амплификации в эквимолярных количествах при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 6 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 3 мин при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). Полученной ДНК во втором раунде ПЦР трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 100 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 ч при 37°С, клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pFM-V-1 размером 263-5 п.о. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pFM-V-1 приведена на рис. 2.For the second round of amplification, the vector DNA of plasmid pUC 19 and the obtained DNA fragment obtained in the first round of amplification in equimolar amounts are used in the following modes: heating - 5 min at 96 ° C, then 6 PCR cycles (single-cycle modes: 30 s at 96 ° C, 30 s at 58 ° C, 3 min at 72 ° C and then the final elongation - 10 min at 72 ° C). The obtained DNA in the second round of PCR is transformed into cells of E. coli strain DH5 and plated on LA medium containing 100 μg / ml kanamycin. After incubation for 12 h at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated, restriction analysis is performed, and the primary structure of the DNA is determined. The result is the plasmid pFM-V-1 with a size of 263-5 bp The restriction map of the recombinant plasmid pFM-V-1 is shown in Fig. 2.
1.2. Конструирование векторной плазмиды pFM-V-21.2. Construction of the vector plasmid pFM-V-2
Векторная плазмида pFM-V-2 представляет собой плазмиду pFM-V-1, в которой после сайта BamHI последовательность ДНК, кодирующая альфа LacZ пептид и промотор бета-лактомазы заменена на последовательность ДНК, кодирующая терминатор транскрипции rrnBT1T2 и промотор бета-лактомазы из ДНК вектора pKK223-3. Генетическое конструирование плазмиды pFV-V-2 осуществляют в два раунда амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для первого раунда реакции амплификации используют два синтетических олигонуклеотида FMV3 и FMV4:The vector plasmid pFM-V-2 is a plasmid pFM-V-1 in which, after the BamHI site, the DNA sequence encoding the LacZ alpha peptide and beta-lactomase promoter is replaced by a DNA sequence encoding the rrnBT1T2 transcription terminator and the beta-lactomase promoter from the vector DNA pKK223-3. The genetic construction of plasmid pFV-V-2 is carried out in two rounds of DNA amplification using polymerase chain reaction (PCR). For the first round of the amplification reaction, two synthetic oligonucleotides FMV3 and FMV4 are used:
FMV3 - 5-FMV3 - 5-
CAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACCTGCAGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAA-3'CAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGACCTGCAGCTGTTTTTGGCGGATGAGAGAA-3 '
FMV4 - 5'-ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAG-3'FMV4 - 5'-ACTCTTCCTTTTTTCAATATTATTGAAG-3 '
и в качестве матрицы ДНК плазмиды pKK223-3. ПЦР проводят при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 35 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 1 мин при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). В результате ПЦР получают фрагмент размером 549 п.о., который электрофоретически очищают.and as the DNA template of plasmid pKK223-3. PCR is carried out under the following conditions: heating - 5 min at 96 ° C, then 35 cycles of PCR (single cycle modes: 30 s at 96 ° C, 30 s at 58 ° C, 1 min at 72 ° C and then the final elongation - 10 min at 72 ° C). As a result of PCR, a 549 bp fragment is obtained, which is electrophoretically purified.
Для второго раунда амплификации используют векторную ДНК плазмиды pFM-V-1 и, полученный фрагмент ДНК в первом раунде амплификации, в эквимолярных количествах при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 6 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 3 мин при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). Полученную ДНК во втором раунде ПЦР трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 100 мкг/мл канамицина, IPTG, X-gal. После инкубирования в течение 12 ч при 37°С, белые колонии пересевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК. В результате получают плазмиду pFM-V-2 размером 2547 п.о. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pFM-V-2 приведена на рис. 3.For the second round of amplification, the vector DNA of the plasmid pFM-V-1 is used and the DNA fragment obtained in the first round of amplification is used in equimolar amounts under the following conditions: heating - 5 min at 96 ° C, then 6 PCR cycles (single-cycle modes: 30 s at 96 ° С, 30 s at 58 ° С, 3 min at 72 ° С and then final elongation - 10 min at 72 ° С). The obtained DNA in the second round of PCR is transformed into cells of E. coli strain DH5 and plated on LA medium containing 100 μg / ml kanamycin, IPTG, X-gal. After incubation for 12 h at 37 ° C, the white colonies are reseeded, plasmid DNA is isolated, restriction analysis is performed, and the primary structure of DNA is determined. The result is the plasmid pFM-V-2 with a size of 2547 bp The restriction map of the recombinant plasmid pFM-V-2 is shown in Fig. 3.
1.3. Конструирование векторной плазмиды pFM-IFN-11.3. Construction of the vector plasmid pFM-IFN-1
Рекомбинантная плазмида pFM-IFN-1 представляет собой векторную плазмиду pFM-V-2, в которую клонирован синтетический фрагмент ДНК синтетический фрагмент ДНК размером 513 п.о., кодирующий альфа-2b интеферон человека по сайтам XbaI и BamHI. Этот фрагмент был получен стандартным методом химико-ферментативного синтеза и клонирован в составе рекомбинантной плазмиды 0833123_Synth_IFN_1pMA, размером 2885 п.о. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды 0833123_Synth_IFN_1pMA приведена на рис. 4. Нуклеотидная последовательность синтетического гена интерферона альфа 2b человека приведена на рис. 5.The recombinant plasmid pFM-IFN-1 is a vector plasmid pFM-V-2 into which a synthetic DNA fragment was cloned a synthetic DNA fragment 513 bp in size that encodes human alpha-2b interferon at the XbaI and BamHI sites. This fragment was obtained by the standard method of chemical-enzymatic synthesis and cloned into the recombinant plasmid 0833123_Synth_IFN_1pMA,
Конструирование рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-1 проводят следующим образом:The construction of the recombinant plasmid pFM-IFN-1 is carried out as follows:
Плазмиды pFM-V-2 и 0833123_Synth_IFN_1pMA обрабатывают ферментами рестрикции XbaI и BamHI. Полученные фрагменты XbaI-BamHI фрагмент ДНК размером 2547 п.о. из плазмиды pFM-V-2 и фрагмент ДНК размером 513 п.о. из плазмиды 0833123_Synth_IFN_1pMA очищают с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Далее электрофоретически очищенные фрагменты объединяют, лигируют ферментом лигазой фага Т4.Plasmids pFM-V-2 and 0833123_Synth_IFN_1pMA are treated with restriction enzymes XbaI and BamHI. The resulting XbaI-BamHI fragments are a 2547 bp DNA fragment. from plasmid pFM-V-2 and a 513 bp DNA fragment from plasmid 0833123_Synth_IFN_1pMA purified by electrophoresis in 1% agarose gel. Further, electrophoretically purified fragments are combined, ligated with the T4 phage ligase enzyme.
ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH и высевают на среду LA, содержащую 100 мкг/мл канамицина. После инкубирования в течение 12 ч при 37°С, клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК.DNA is transformed into cells of the E. coli DH strain and plated on LA medium containing 100 μg / ml kanamycin. After incubation for 12 h at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated, restriction analysis is performed, and the primary structure of the DNA is determined.
В результате получают плазмиду pFM-IFN-1 размером 3242 п.о., содержащая синтетический ген интерферона альфа-2b человека. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-1 приведена на рис. 6.As a result, a 3242 bp plasmid pFM-IFN-1 containing the synthetic human interferon alpha-2b gene is obtained. The restriction map of the recombinant plasmid pFM-IFN-1 is shown in Fig. 6.
1.4. Конструирование векторной плазмиды pFM-IFN-171.4. Construction of the vector plasmid pFM-IFN-17
Плазмида pFM-IFN-17 представляет собой плазмиду pFM-IFN-1, в которую клонирован фрагмент ДНК, кодирующий бактериальный триптофановый промотор Е.coli и SD последовательность по сайтам рестрикции HindIII-XbaI, размером 196 п.о.Plasmid pFM-IFN-17 is a plasmid pFM-IFN-1 into which a DNA fragment encoding a bacterial tryptophan promoter of E. coli and an SD sequence of 196 bp HindIII-XbaI restriction sites have been cloned.
HindIII-XbaI фрагмент ДНК размером 196 п.о., кодирующий триптофановый промотор Е.coli и SD последовательность, получают методом ПЦР, используя в качестве матрицы тотальную ДНК E.coli и праймеры FMV5 и FMV6 с последующей обработикой амплифицированного фрагмента ферментами рестрикции HindIII и XbaI.A 196 bp HindIII-XbaI DNA fragment encoding the E. coli tryptophan promoter and SD sequence were obtained by PCR using total E. coli DNA and FMV5 and FMV6 primers as a template followed by treatment of the amplified fragment with HindIII and XbaI restriction enzymes .
FMV5 - 5'-AGCGAAGCTTCGTAAATCACTGCATAATTCGT-3'FMV5 - 5'-AGCGAAGCTTCGTAAATCACTGCATAATTCGT-3 '
FMV6 - 5'-AGGCTCTAGAGGCCTCCTGAATTCCTGGCGATACCCTTTTTACGT-3'FMV6 - 5'-AGGCTCTAGAGGCCTCCTGAATTCCTGGCGATACCCTTTTTACGT-3 '
Далее, предварительно очищенный фрагмент HindIII-XbaI, и плазмида pFM-IFN-1, обработанная ферментами рестрикции HinIII и XbaI объединяют, лигируют ферментом лигазой фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5D и высевают на среду LA, содержащую 100 мкг/мл ампициллина. После инкубирования в течение 12 ч при 37°С, клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК.Next, the pre-purified HindIII-XbaI fragment and the plasmid pFM-IFN-1 treated with restriction enzymes HinIII and XbaI are combined, ligated with T4 phage ligase enzyme, DNA is transformed into E. coli DH5D strain cells and plated on LA medium containing 100 μg / ml ampicillin. After incubation for 12 h at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated, restriction analysis is performed, and the primary structure of the DNA is determined.
В результате получают плазмиду pFM-IFN-17 размером 3242 п.о., которая содержит синтетический ген интерферона альфа 2-b человека. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-17 приведена на рис. 7.The result is the plasmid pFM-IFN-17 3232 bp in size, which contains the synthetic gene for human interferon alpha 2-b. The restriction map of the recombinant plasmid pFM-IFN-17 is shown in Fig. 7.
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pFM-AP (4582 п.о.)Example 2. Construction of a recombinant plasmid pFM-AP (4582 bp)
При получении рекомбинантной плазмиды pFM-AP ДНК плазмиды pACYC184 обрабатывают ферментами рестрикции HindIII и SalI с последующей электрофоретической очисткой в 1% агарозном геле размером 3629 п.о.Upon receipt of the recombinant plasmid pFM-AP, the DNA of plasmid pACYC184 is treated with the restriction enzymes HindIII and SalI, followed by electrophoretic purification in 1% 3629 bp agarose gel.
HindIII-SalI фрагмент ДНК размером 965 п.о., кодирующий лактозный промотор, SD последовательность и ген метионин аминопептидазы Е.coli, получают методом ПЦР в три этапа.A 965 bp HindIII-SalI DNA fragment encoding the lactose promoter, SD sequence, and E. coli methionine aminopeptidase gene was obtained in three steps by PCR.
Для первого раунда реакции амплификации используют два синтетических олигонуклеотида FM-AP-1 и FM-AP-2 и в качестве матрицы ДНК вектора pUC19:For the first round of the amplification reaction, two synthetic oligonucleotides FM-AP-1 and FM-AP-2 are used and as the DNA template of the vector pUC19:
FM-AP-1 - 5' GTGAAAGCTTAACGCAATTAATGTGAGTTAG-3'FM-AP-1 - 5 'GTGAAAGCTTAACGCAATTAATGTGAGTTAG-3'
FM-AP-2 - 5'FM-AP-2 - 5 '
GGGTCTTGATTGAGATAGCCATATGTATATCTCCTGAATTAGCTTGGCGTAATCATGGGGTCTTGATTGAGATAGCCATATGTATATCTCCTGAATTAGCTTGGCGTAATCATG
GTCATAGC-3'GTCATAGC-3 '
ПЦР проводят при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 35 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 30 с при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). В результате ПЦР получают фрагмент размером 186 п.о., содержащий лактозный промотор и SD последовательность, электрофоретически очищают в 1% агарозном геле.PCR is carried out under the following conditions: warming up - 5 min at 96 ° C, then 35 cycles of PCR (single cycle modes: 30 s at 96 ° C, 30 s at 58 ° C, 30 s at 72 ° C and then the final elongation - 10 min at 72 ° C). As a result of PCR, a 186 bp fragment is obtained containing the lactose promoter and the SD sequence, electrophoretically purified on a 1% agarose gel.
Во втором раунде амплификации используют два синтетических олигонуклеотида FM-AP-3 и FM-AP-4, а в качестве матрицы тотальную ДНК E.coli.In the second round of amplification, two synthetic oligonucleotides FM-AP-3 and FM-AP-4 are used, and total E. coli DNA as a template.
FM-АР-3-5'FM-AR-3-5 '
GCTATGACCATGATTACGCCAAGCTAATTCAGGAGATATACATATGGCTATCTCAAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTAATTCAGGAGATATACATATGGCTATCTCAA
ТСААОАССС-3'TSAAOASSS-3 '
FM-AP-4 - 5'-GGATGTCGACTTATTCGTCGTGCGAGATTATC-3'FM-AP-4 - 5'-GGATGTCGACTTATTCGTCGTGCGAGATTATC-3 '
ПЦР проводят при следующих режимах: прогревание - 5 мин при 96°С, далее 35 циклов ПЦР (режимы одного цикла: 30 с при 96°С, 30 с при 58°С, 1 мин при 72°С и затем финальная элонгация - 10 мин при 72°С). В результате ПЦР получают фрагмент размером 844 п.о., содержащий ген метионин аминопептидазы E.coli электрофоретически очищают в 1% агарозном геле.PCR is carried out under the following conditions: heating - 5 min at 96 ° C, then 35 cycles of PCR (single cycle modes: 30 s at 96 ° C, 30 s at 58 ° C, 1 min at 72 ° C and then the final elongation - 10 min at 72 ° C). As a result of PCR, a fragment of 844 bp is obtained containing the E. coli methionine aminopeptidase gene and electrophoretically purified on a 1% agarose gel.
В третьем раунде амплификации используют два синтетических олигонуклеотида FM-AP-1 и FM-AP-4, а в качестве матрицы два фрагмента полученных в первых двух амплификациях, с целью их объединения в один фрагмент. Размер объединенного фрагмента составляет 965 п.о.In the third round of amplification, two synthetic oligonucleotides FM-AP-1 and FM-AP-4 are used, and two fragments obtained in the first two amplifications are used as a matrix in order to combine them into one fragment. The size of the combined fragment is 965 bp
Фрагмент размером 965 п.о. обрабатывают ферментами HindIII и SalI и электрофоретически очищают. Далее фрагменты HindIII/SalI вектора pACYC184 и объединенный HindIII/SalI размером 965 п.о. лигируют ферментом лигазой фага Т4, ДНК трансформируют в клетки штамма E.coli DH5 и высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл хлорамфеникола. После инкубирования в течение 12 ч при 37°С, клоны отсевают, выделяют плазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и определяют первичную структуру ДНК.A fragment of 965 bp treated with HindIII and SalI enzymes and electrophoretically purified. Next, fragments of HindIII / SalI vector pACYC184 and the combined HindIII / SalI size of 965 bp are ligated with T4 phage ligase enzyme, DNA is transformed into cells of E. coli strain DH5 and plated on LA medium containing 20 μg / ml chloramphenicol. After incubation for 12 h at 37 ° C, the clones are plated, plasmid DNA is isolated, restriction analysis is performed, and the primary structure of the DNA is determined.
В результате получают плазмиду pFM-AP, размером 4582 п.о., кодирующая синтез метионин аминопептидазы E.coli, регулируемый лактозным промотором. Рестрикционная карта рекомбинантной плазмиды pFM-IFN-17 приведена на рис. 8.The result is a plasmid pFM-AP,
Пример 3. Конструирование рекомбинантного штамма Escherichia coli FM-IFNExample 3. Construction of a recombinant strain of Escherichia coli FM-IFN
Путем трансформации клеток штамма Е.coli BL21 рекомбинантной плазмидой pFM-AP получают сначала реципиентный штамм Escherichia coli BL21 (pFM-AP). Трансформанты высевают на среду LA, содержащую 20 мкг/мл хлорамфеникола.By transforming the cells of the E. coli BL21 strain with the recombinant plasmid pFM-AP, the recipient Escherichia coli BL21 strain (pFM-AP) is first obtained. Transformants are plated on LA medium containing 20 μg / ml chloramphenicol.
Далее реципиентный штамм Escherichia coli BL21 (pFM-AP) трансформируют рекомбинантной плазмидой pFM-IFN-17 и высевают на среду LA, содержащую 100 мкг/мл канамицина и 20 мкг/мл хлорамфеникола.Next, the recipient strain Escherichia coli BL21 (pFM-AP) is transformed with the recombinant plasmid pFM-IFN-17 and plated on LA medium containing 100 μg / ml kanamycin and 20 μg / ml chloramphenicol.
В результате получают биплазмидный штамм Escherichia coli FM-IFN, несущий две плазмиды pFM-IFN-17 и pFM-AP.The result is a biplasmid strain of Escherichia coli FM-IFN, carrying two plasmids pFM-IFN-17 and pFM-AP.
Пример 4. Культивирование штамма Е.coli FM-IFNExample 4. Cultivation of E. coli FM-IFN strain
Посевной материал штамма Е.coli FM-IFN культивируют в течение 12 ч при 32°С в 1 л богатой среды LB и асептически вносят в ферментер, содержащий 9 л стерильной синтетической минерально-солевой среды, содержащей 2×М9, 1% глюкозы, 0,2% лактозы, следовые количества металлов 100 мг/мл канамицина и 40 мкг/мл хлорамфеникола.Inoculum of E. coli FM-IFN strain was cultured for 12 h at 32 ° C in 1 L of rich LB medium and aseptically introduced into a fermenter containing 9 L of sterile synthetic mineral-salt medium containing 2 × M9, 1% glucose, 0 , 2% lactose, trace amounts of
Культивирование в ферментере проводят при температуре 32+1°С, поддерживая рН 6,9±0,15 путем автоматической подтитровки 40%-ным раствором гидроокиси натрия. Концентрацию растворенного кислорода в диапазоне (30±0,5)% от насыщения поддерживают путем изменения скорости оборотов мешалки от 100 до 800 об/мин и подачи воздуха от 1 до 15 л/мин. Концентрацию субстратов, в частности глюкозы и лактозы, поддерживают в течение ферментации путем подачи концентрированного раствора перистальтическим насосом используя pO2 и гравиметрический контроллеры.Cultivation in the fermenter is carried out at a temperature of 32 + 1 ° C, maintaining a pH of 6.9 ± 0.15 by automatically subtitling with a 40% sodium hydroxide solution. The concentration of dissolved oxygen in the range (30 ± 0.5)% of saturation is maintained by changing the speed of the mixer from 100 to 800 rpm and air supply from 1 to 15 l / min. The concentration of substrates, in particular glucose and lactose, is maintained during fermentation by supplying a concentrated solution with a peristaltic pump using pO 2 and gravimetric controllers.
Накопление интерферона в виде нерастворимой формы - "телец включений" контролируют с помощью фазово-контрастной микроскопии. Ферментацию останавливают по достижении максимальной оптической плотности (~25-30 о.е.). Содержание интерферона в биомассе клеток, получаемой с 1 л культуры, составляет 0.9-1.0 г интерферона.The accumulation of interferon in the form of an insoluble form - “inclusion bodies” is monitored by phase contrast microscopy. Fermentation is stopped upon reaching maximum optical density (~ 25-30 p.u.). The content of interferon in the biomass of cells obtained from 1 l of culture is 0.9-1.0 g of interferon.
По окончании ферментации культуральную жидкость сепарируют центрифугированием, бактериальную биомассу фасуют в полиэтиленовые пакеты и замораживают при температуре минус 70°С.After fermentation, the culture fluid is separated by centrifugation, the bacterial biomass is Packed in plastic bags and frozen at a temperature of minus 70 ° C.
Пример 5. Способ получения (Met-) интерферона альфа-2b человека из биомассы штамма Е.coli FM-IFNExample 5. The method of obtaining (Met - ) interferon alpha-2b person from the biomass of E. coli strain FM-IFN
Получение интерферона проводят в три этапа.Obtaining interferon is carried out in three stages.
1 этап. Выделение и очистка нерастворимой формы (Met-) интерферона альфа-2b человека
Выделение и очистку нерастворимой формы интерферона проводят по стандартной схеме (US Patent 5789551, RU 2165455, RU 2242516, A. Beldarrain, Y. Cruz, O. Cruz, M. Navarro, M.Gil., "Purification and conformational properties of human interferon alfa-2b produced in E.coli"., Biotechnol.Appl. Biochem., 2001., 33., 173-182). В конце процесса выделения и очистки нерастворимой формы интерферона (тельца включений или т.вкл.) из 200 грамм биомассы полученный материал суспендируют в 100 мл буфера (20 мМ Tris/HCl, рН 8.0).Isolation and purification of the insoluble form of interferon is carried out according to the standard scheme (US Patent 5789551, RU 2165455, RU 2242516, A. Beldarrain, Y. Cruz, O. Cruz, M. Navarro, M. Gil., "Purification and conformational properties of human interferon alfa-2b produced in E. coli. ", Biotechnol. Appl. Biochem., 2001., 33., 173-182). At the end of the process of isolation and purification of the insoluble form of interferon (inclusion body or so on) from 200 grams of biomass, the resulting material is suspended in 100 ml of buffer (20 mM Tris / HCl, pH 8.0).
2 этап. Растворение и ренатурация (Met-) интерферона альфа-2b человека Тельца включений растворяют добавлением гуанидин гидрохлорида до 6М и дитиотреитол до концентрации 5 мМ в конечном объеме 1,7 литров, инкубируют 2 час при комнатной температуре, центрифугируют (20000 g) и фильтруют (0,22 микрон). Полученный раствор интерферона вливают в емкость, содержащая 20 литров буфера - 20 мМ Tris/HCl, рН8.0, 150 μМ NaCl, 50 μМ CuSO4 при температуре 150°С. Далее добавляют PMSF до концентрации 0,2 мМ. Ренатурацию проводят в течение 10-12 часов при 150°С. Далее раствор интерферона фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 микрона, проводят замену буфера на буфер - 20 мМ Tris/HCl, рН7.0, 0.1 мМ ЭДТА диафильтрацией на тангенциальных касетах (диаметр пор 10К) и окончательно концентрируют до объема 5 литров. Далее добавляют концентрированный раствор ацетата натрия 2,5 М до концентрации 25 мМ и инкубируют 10 12 часов при 40 С. Раствор интерферона фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 микрон.2 stage. Dissolution and renaturation of (Met - ) human interferon alpha-2b Taurus inclusions are dissolved by adding guanidine hydrochloride to 6M and dithiothreitol to a concentration of 5 mM in a final volume of 1.7 liters, incubated for 2 hours at room temperature, centrifuged (20,000 g) and filtered (0 , 22 microns). The resulting interferon solution is poured into a container containing 20 liters of buffer — 20 mM Tris / HCl, pH8.0, 150 μM NaCl, 50 μM CuSO4 at a temperature of 150 ° C. Then add PMSF to a concentration of 0.2 mm. Renaturation is carried out for 10-12 hours at 150 ° C. Next, the interferon solution is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.22 microns, the buffer is replaced with a buffer of 20 mM Tris / HCl, pH7.0, 0.1 mM EDTA by diafiltration on tangential cartridges (pore diameter 10K) and finally concentrated to a volume of 5 liters . Then a concentrated solution of sodium acetate 2.5 M is added to a concentration of 25 mM and incubated for 10 12 hours at 40 C. The interferon solution is filtered through a membrane filter with a pore diameter of 0.22 microns.
3 этап. Хроматографическая очистка (Met-) интерферона альфа-2b человека3 stage. Chromatographic purification of (Met - ) human interferon alpha-2b
Полученный раствор интерферона очищают на катионообменной смоле CM Sepharose FF (GE Healthcare). Интерферон элюируют градиентом создаваемый буфером 20 мМ Na цитрат, рН 5.0, 0.1 мМ ЭДТА и буфером 20 мМ Na цитрат, рН 5.0, 0.1 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl.The resulting interferon solution was purified on a CM Sepharose FF cation exchange resin (GE Healthcare). Interferon is eluted with a gradient created with 20 mM Na citrate buffer, pH 5.0, 0.1 mM EDTA and 20 mM Na citrate buffer, pH 5.0, 0.1 mM EDTA, 0.5 M NaCl.
Раствор интерферона после катионообменника очищают на гидрофобной смоле Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare).The interferon solution after the cation exchanger is purified on a Phenyl Sepharose HP hydrophobic resin (GE Healthcare).
Раствор интерферона после гидрофобной хроматографии очищают с помощью обратно-фазной хроматографии на сорбенте С18. Элюцию интерферона проводят градиентом двух буферов - буфер А (30% ацетонитрил, 0,1% трифторуксусная кислота) и буфер Б (80%) ацетонитрил, 0,1% трифторуксусная кислота).After hydrophobic chromatography, the interferon solution is purified by reverse phase chromatography on a C18 sorbent. Interferon elution is carried out by a gradient of two buffers - buffer A (30% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) and buffer B (80%) acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid).
Далее интерферон очищают на катионообменнике MacroPrep High S (BioRad).Next, interferon is purified on a MacroPrep High S cation exchanger (BioRad).
Интерферон элюируют градиентом создаваемый буферами 20 мМ Na цитрат, рН 5.0, 0.1 мМ ЭДТА и 20 мМ Na цитрат, рН 5.0, 0.1 мМ ЭДТА, 1.0 М NaCl.Interferon is eluted with a gradient created with buffers of 20 mM Na citrate, pH 5.0, 0.1 mM EDTA and 20 mM Na citrate, pH 5.0, 0.1 mM EDTA, 1.0 M NaCl.
Окончательно интерферон очищают методом колоночной гель-фильтрации на смоле Sephacryl S200 или Superdex 75 (GE Healthcare). Хроматографию проводят в буфере 20 мМ Na цитрат, рН 5.0, 0,15 М NaCl, 0.1 мМ ЭДТА.Finally, interferon is purified by column gel filtration on Sephacryl S200 or Superdex 75 resin (GE Healthcare). Chromatography was carried out in a buffer of 20 mm Na citrate, pH 5.0, 0.15 M NaCl, 0.1 mm EDTA.
Описанный способ выделения и очистки рекомбинантного (Met-) интерферона альфа-2b человека дает возможность получать не менее 1-1,5 грамма субстанции интерферона фармакопейного качества за один цикл из примерно 200 грамм биомассы, получаемой с 10 л ферментационной среды. Полученный в результате использования указанной технологии конечный продукт сохраняет свои свойства в течение более 3 лет при хранении в замороженном состоянии при температуре не выше минус 40°С. Результаты исследования стабильности (Met-) интерферона альфа 2-b человеческий, рекомбинантный, концентрированный раствор (субстанция) при хранении минус 40°С, производства Биотехнологической компанией «Фирн М» на примере серии ФМ07 представлены в таблице 1.The described method for the isolation and purification of recombinant (Met-) interferon alpha-2b human makes it possible to obtain at least 1-1.5 grams of a substance of pharmacopoeial quality interferon per cycle from about 200 grams of biomass obtained from 10 l of fermentation medium. The final product obtained as a result of using this technology retains its properties for more than 3 years when stored in a frozen state at a temperature not exceeding minus 40 ° С. The results of the stability study of (Met - ) interferon alpha 2-b human, recombinant, concentrated solution (substance) during storage minus 40 ° C, manufactured by Biotechnological company Firn M using the example of the FM07 series are presented in table 1.
Пример 6. Определение N-концевой последовательности интерферона, полученного из штамма E.coli FM-IFNExample 6. Determination of the N-terminal sequence of interferon obtained from E. coli FM-IFN strain
Анализ проводят на секвенаторе Precise 491-0 фирмы Applied Biosystems (Stafford, Texas, USA) в соответствии с классическим методом П. Эдмана, позволяющим последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки и анализировать их в оn-line режиме при помощи ВЭЖХ в виде фенилтиогидантоинов аминокислот (ФТГ).The analysis is performed on a Precise 491-0 sequencer (Applied Biosystems (Stafford, Texas, USA)) in accordance with the classical method of P. Edman, which allows sequentially cleaving N-terminal amino acid residues and analyzing them on-line using HPLC in the form of amino acid phenylthiohydantoins (FTG).
Для определения аминокислоты цистеин в полипептидной цепи, образцы предварительно обрабатывают алкилирующим агентом 4-винилпиридином. Алкилирующий агент модифицирует цистеин после разрыва дисульфидных связей.To determine the amino acid cysteine in the polypeptide chain, the samples are pretreated with an alkylating agent 4-vinylpyridine. Alkylating agent modifies cysteine after rupture of disulfide bonds.
После обработки образец обессоливают с применением картриджей ProSorb (Applied Biosystems). Эта стадия пробоподготовки необходима для детектирования цистеина в виде пиридилэтил-ФТГ-производной.After processing, the sample is desalted using ProSorb cartridges (Applied Biosystems). This sample preparation step is necessary for detecting cysteine as a pyridylethyl-FTG derivative.
В результате анализа установлено, что последовательность для восьми N-концевых аминокислот интерферона, синтезирующегося в штамме E.coli pFM-IFN, соответствует последовательности природного человеческого интерферона альфа-2b: Cys (в виде пиридилэтилцистеина)-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser и не содержит N-концевого метионина.The analysis showed that the sequence for the eight N-terminal amino acids of interferon synthesized in the E. coli strain pFM-IFN corresponds to the sequence of natural human interferon alpha-2b: Cys (in the form of pyridylethylcysteine) -Asp-Leu-Pro-Gln-Thr -His-Ser and does not contain N-terminal methionine.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111859A RU2610173C1 (en) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111859A RU2610173C1 (en) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2610173C1 true RU2610173C1 (en) | 2017-02-08 |
Family
ID=58457365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016111859A RU2610173C1 (en) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2610173C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107603937A (en) * | 2017-05-18 | 2018-01-19 | 江南大学 | A kind of recombination bacillus coli and its construction method for expressing lysine aminopeptidase |
| RU2697375C2 (en) * | 2017-12-21 | 2019-08-13 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Plasmid vector prh15a for producing methionine-free interferon alpha-2b, bacterial strain escherichia coli bl21 de3 - producer of methionine-free interferon alpha-2b and method for producing methionine-free interferon alpha-2b |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992001055A1 (en) * | 1990-07-10 | 1992-01-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | O-glycosylated ifn-alpha |
| RU2165455C1 (en) * | 1999-11-23 | 2001-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing |
| RU2242516C1 (en) * | 2003-12-18 | 2004-12-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization |
| RU2326168C1 (en) * | 2006-10-20 | 2008-06-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | RECOMBINANT PLASMID DNA pIF TREN CODING HUMAN POLYPEPTIDE OF ALFA-2b INTERFERON AND POLYPEPTIDE OF Escherichia BACTERIA RACE coli-PRODUCER OF HUMAN ALFA-2b INTERFERON |
-
2016
- 2016-03-30 RU RU2016111859A patent/RU2610173C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992001055A1 (en) * | 1990-07-10 | 1992-01-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | O-glycosylated ifn-alpha |
| RU2165455C1 (en) * | 1999-11-23 | 2001-04-20 | Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing |
| RU2242516C1 (en) * | 2003-12-18 | 2004-12-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Фармапарк" | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization |
| RU2326168C1 (en) * | 2006-10-20 | 2008-06-10 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | RECOMBINANT PLASMID DNA pIF TREN CODING HUMAN POLYPEPTIDE OF ALFA-2b INTERFERON AND POLYPEPTIDE OF Escherichia BACTERIA RACE coli-PRODUCER OF HUMAN ALFA-2b INTERFERON |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107603937A (en) * | 2017-05-18 | 2018-01-19 | 江南大学 | A kind of recombination bacillus coli and its construction method for expressing lysine aminopeptidase |
| RU2697375C2 (en) * | 2017-12-21 | 2019-08-13 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Plasmid vector prh15a for producing methionine-free interferon alpha-2b, bacterial strain escherichia coli bl21 de3 - producer of methionine-free interferon alpha-2b and method for producing methionine-free interferon alpha-2b |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strandberg et al. | Factors influencing inclusion body formation in the production of a fused protein in Escherichia coli | |
| JP5909172B2 (en) | Production of recombinant protein by self-proteolytic cleavage of fusion protein | |
| Hellebust et al. | Different approaches to stabilize a recombinant fusion protein | |
| AU2001284914B2 (en) | Phage-dependent superproduction of biologically active protein and peptides | |
| JP5308333B2 (en) | Recombinant host producing L-asparaginase II | |
| RU2610173C1 (en) | Recombinant plasmid pfm-ifn-17 providing expression of interferon alpha-2b of human, recombinant plasmid pfm-ap, providing expression of enzyme methionine-aminopeptidase e coli, biplasmid strain escherichia coli fm-ifn-ap (pfm-ifn-17, pfm-ap) - producer (met-) of recombinant interferon alpha -2b of human | |
| RU2165455C1 (en) | Recombinant plasmid dna pss5 encoding synthesis of recombinant human alpha-2b interferon, strain of escherichia coli ss5 as producer of recombinant human alpha-2b interferon and method of alpha-2b interferon preparing | |
| AU2007333395A1 (en) | Improved expression system for recombinant human arginase I | |
| RU2453604C1 (en) | Hybrid protein (versions), bacterial strain escherichia coli - hybrid protein producer (versions) and method for producing methionine-free human interferon alpha-2 | |
| RU2242516C1 (en) | Method for preparing recombinant human alpha-2b-interferon, recombinant plasmid and strain-producer for its realization | |
| RU2354702C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pHINS11 CODING HYBRID PROTEIN-HUMAN INSULIN PRECURSOR, Escherichia coli CELL, TRANSFORMED WITH RECOMBINANT PLASMID DNA pHINS11, Escherichia coli BACTERIA STRAIN JM109/pHINS11 - PRODUCER OF HYBRID PROTEIN-HUMAN INSULIN PRECURSOR, AND METHOD OF OBTAINING HUMAN INSULIN | |
| RU2441072C1 (en) | FUSION PROTEIN, ESCHERICHIA COLI STRAIN BEING FUSION PROTEIN PRODUCER AND METHOD FOR PRODUCING METHIONINE-FREE HUMAN INTERFERON ALPHA-2b OF SUCH FUSION PROTEIN | |
| RU2697375C2 (en) | Plasmid vector prh15a for producing methionine-free interferon alpha-2b, bacterial strain escherichia coli bl21 de3 - producer of methionine-free interferon alpha-2b and method for producing methionine-free interferon alpha-2b | |
| RU2426780C2 (en) | EXPRESSION PLASMID DNA p6E-tTF CODING EXTRACELLULAR AND TRANSMEMBRANE DOMAINS OF HUMAN TISSUE FACTOR AND E.coli BL21 [DE3]/p6E-tTF STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN TISSUE FACTOR | |
| JPH06311884A (en) | Plasmid and Escherichia coli transformed with it | |
| RU2143492C1 (en) | Recombinant plasmid encoding fused protein as precursor of human insulin (variants), strain of bacterium escherichia coli - producer of fused protein as precursor of human insulin (variants), method of human insulin preparing | |
| CN102485890A (en) | Expression of recombined human protein disulphide isomerase (hPDI491) with Pichia pastoris in secretion manner | |
| RU2140453C1 (en) | Recombinant plasmid dna puabc 22 encoding modified activator of uricase type plasminogen, nontranslated dna-element - artificial intergene sequence mgp-14 and strain of bacterium escherichia coli - producer of modified activator of uricase type plasminogen | |
| SU1703690A1 (en) | Recombinant plasmid dna pvn22, encoding human interferon @@@-i1 synthesis, and the strain of bacterium pseudomonas sp - a producer of human interferon @@@-i1 | |
| RU2680886C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID pFM-GCSF5 THAT PROVIDES EXPRESSION OF SYNTHETIC HUMAN GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR, ESCHERICHIA COLI FM-GCSF BACTERIA STRAIN - PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN GRANULOCYTE COLONY-STIMULATING FACTOR AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF | |
| RU2283128C1 (en) | Method for production of protein preparation belonging to stress genus and hsp70 protein preparation obtained by said method | |
| SU1703693A1 (en) | Dna ppr-il 2-19 recombination plasmid which codes human interleucine-2 synthesis and structure escherichia coli strain, human interleucine-2 producent | |
| RU2593172C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pER-TA1 GyrA-AcSer CODING SERINE ACETYLTRANSFERASE CAPABLE OF in vivo ACETYLATION OF N-TERMINAL SERINE DEACETYL-THYMOSIN α1 AND HYBRID PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM HUMAN THYMOSIN α1, STRAIN OF Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHOD OF PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED HUMAN THYMOSIN | |
| RU2582569C2 (en) | Dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36, dna coding full-size human interleukin-receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag, plasmid expression vector (versions), escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf),-producer of full-size receptor antagonist 36 and strain of bacteria escherichia coli bl21 [de3] star (pet-il36raf-his),-producer of full-size receptor antagonist 36 with c-end poligistidine tag | |
| KR100890187B1 (en) | Method for producing recombinant protein using TBS as a fusion partner |