RU2607527C2 - Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения - Google Patents
Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2607527C2 RU2607527C2 RU2015150089A RU2015150089A RU2607527C2 RU 2607527 C2 RU2607527 C2 RU 2607527C2 RU 2015150089 A RU2015150089 A RU 2015150089A RU 2015150089 A RU2015150089 A RU 2015150089A RU 2607527 C2 RU2607527 C2 RU 2607527C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thymosin beta
- beta
- thymosin
- monoconjugate
- polyethylene glycol
- Prior art date
Links
- UGPMCIBIHRSCBV-XNBOLLIBSA-N Thymosin beta 4 Chemical compound N([C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O UGPMCIBIHRSCBV-XNBOLLIBSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 102100035000 Thymosin beta-4 Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 108010079996 thymosin beta(4) Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 title claims 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 title claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical class CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000658157 Homo sapiens Thymosin beta-4 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 2
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001552669 Adonis annua Species 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040897 Microfilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 229940094678 diasorb Drugs 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- PGYPOBZJRVSMDS-UHFFFAOYSA-N loperamide hydrochloride Chemical compound Cl.C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(C(=O)N(C)C)CCN(CC1)CCC1(O)C1=CC=C(Cl)C=C1 PGYPOBZJRVSMDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009305 regulation of actin filament polymerization Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200027050 rs121908278 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-N sorbic acid group Chemical group C(\C=C\C=C\C)(=O)O WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 235000011044 succinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003444 succinic acids Chemical class 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 229940121397 thymosin β4 analogue Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2292—Thymosin; Related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована в медицине и фармацевтической промышленности. Разработан способ региоселективного химического N-концевого ПЭГилирования тимозина бета 4. Данным способом получен моноконъюгат ПЭГ с тимозином бета 4, обладающий улучшенными фармакокинетическими свойствами. Подтверждена модификация N-концевой альфа аминогруппы тимозина бета 4. Применение изобретения позволяет получить моноПЭГилированный тимозин бета 4 с высоким выходом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области модификации белков, в частности касается аналогов тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови. Оно может быть использовано для получения аналогов человеческого тимозина бета 4.
Уровень техники
Тимозин бета 4 - это пептид, вырабатываемый клетками тимусовой железы, который участвует в регуляции полимеризации актина, а также участвует в пролиферации, миграции и дифференциации клеток. Эти свойства тимозина бета 4 определяют его ценность в качестве медицинского препарата, особенно при лечении ишемической болезни сердца.
Тимозин бета 4 человека представляет собой 43-членный пептид ацетилированный по N-концевой α - аминогруппе.
Немодифицированный тимозин бета 4 получают биотехнологическим методом с помощью технологии рекомбинантной ДНК и далее модифицируют путем избирательного химического ацетилирования N-концевой альфа аминогруппы. Такой способ описан в работах (К.А. Бейрахова, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников, Р.С. Есипов / Биотехнологический способ получения ацетилированного тимозина бета 4 // Биоорганическая химия, 2011, том 37, №2, с. 1-10), (Д.А. Макаров, Т.И. Муравьева, В.Н. Степаненко, В.И. Швец, Р.С. Есипов, 2014. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного тимозина-бета 4 человека до пилотного производства. Биотехнология 4, 35-44).
Природный тимозин бета 4 - коротко живущий пептид, и период его полувыведения из крови напрямую зависит от вводимой дозы в организм [Mora СА, Baumann СА, Paino JE, Goldstein AL, Badamchian M / Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice // Int. J. Immunopharmacol. 1997 Jan; 19 (1): 1-8], что создает трудности при его администрировании. Стандартный подход, применяемый для повышения стабильности терапевтического белка, заключается в присоединении к нему химическими или энзиматическими методами различных защитных групп, обеспечивающих защиту от протеалитических ферментов [Jevsevar S, Kunstelj М, Porekar VG. PEGylation of the therapeutic proteins. Biotechnol J. 2010 Jan; 5 (1): 1 13-28; Schlapschy M, Binder U, Börger C, Theobald I, Wachinger K, Kisling S, Haller D, Skerra A. PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. ProteinEngDesSel. 2013 Aug; 26 (8): 489-501; Susanne M Mumby. Reversible palmitoylation of signaling proteins / Current Opinionin Cell Biology Volume 9, Issue 2, April 1997, Pages 148-154]. Но принципиальная сложность такого подхода по отношению к тимозину бета 4 заключается в том, что химическая модификация тимозина бета 4 предпочтительна только по N-концевой альфа аминогруппе. Присоединение функциональной группы к любому другому аминокислотному остатку внутри пептида изменит его нативную структуру, что в свою очередь, приведет к потере его биологической активности. Известно, что биологическая активность тимозина бета 4 определяется активными сайтами в коротких пептидных последовательностях, так например, его основной актин-связывающий сайт расположен в аминокислотных остатках 17-22, основной сайт, проявляющий антиапоптозную активность и осуществляющий защиту от токсичности располагается в аминокислотных остатках 1-15, а сайт, представляющий собой первые четыре аминокислотных остатка Ac-SPDK, первый из которых ацетилирован по N-концевой – альфа-аминогруппе, обладает широким спектром биологической активности. Связано это с тем, что природная пострансляционная модификация пептида - присоединение ацетильной группы происходит именно по N-концевой альфа аминогруппе тимозина бета 4. Поскольку концентрация тимозина бета 4 в крови уже через 2 часа падает до базального уровня после его администрирования [Mora СА, Baumann СА, Paino JE, Goldstein AL, Badamchian M. Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice. Int JImmunopharmacol. 1997 Jan; 19 (1): 1-8], существует потребность в аналогах тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к созданию стабильного в токе крови аналога тимозина бета 4 посредством региоселективного химического ПЭГилирования тимозина бета 4. Конкретнее, настоящее изобретение раскрывает способ получения модифицированного тимозина бета 4 с пролонгированной стабильностью в токе крови с высоким выходом, за счет региоспецифической моноконъюгации тимозина бета 4 с ПЭГ-альдегидом по свободной N-концевой альфа аминогруппе тимозина бета 4.
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг 1. Формула пропиональдегидного производного ПЭГ.
Фиг 2. А - Профиль полупрепаративной ОФ ВЭЖХ выделения моноПЭГилированного тимозина бета 4. 1 - дезацетилтимозин бета 4, 2 - моноПЭГилированный тимозин бета 4, 2 - побочные продукты реакции. В - Электрофоретический анализ фракций полупрепаративной ОФ ВЭЖХ. М - стандарт универсальных масс, 1 - дезацетилтимозин бета 4, Р - ПЭГ, 2 - моноПЭГилированный тимозин бета 4, 3 - диПЭГилированный тимозин бета 4.
Фиг 3. Хроматографический профиль продуктов протеолитического расщепления конъюгата ПЭГ с тимозином бета 4.
Фиг 4. Однобуквенная последовательность дезацетилтимозина бета 4. Результаты протеолитического расщепления моноПЭГилированного тимозина бета 4.
Подробное описание изобретения
Химическая модификация молекулы белка ПЭГом адресно направлена на улучшение переносимости препарата, снижение иммуногенности и повышение периода его полужизни. Также важными свойствами модифицированных ПЭГ - молекул являются высокая гидрофильность и способность обволакивать молекулу белка, которые формируют принципиально новые физико-химические свойства измененного пептида.
Высокое содержание атомов водорода позволяет молекуле ПЭГ связаться с молекулами воды, что влечет за собой формирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ-белок", за счет чего значительно повышается ее гидродинамический радиус. Характерным аспектом изобретения является региоспецифический способ ПЭГилирования, включающий моноселективную конъюгацию ПЭГ-альдегида с тимозином бета 4 по свободной N-концевой альфа аминогруппе пептида в буферном растворе для ПЭГилирования при мольном соотношении белок/ПЭГ 1:4. Техническим результатом региоселективной химической модификации является образование моноПЭГилированного тимозина бета 4, выход которого составляет не ниже 70%.
Под буферным раствором для ПЭГилирования подразумевается многокомпонентный водно-органический буферный раствор, содержащий 10% ацетонитрила, который обеспечивает постоянное значение pH 4,0 для осуществления моноселективной конъюгации ПЭГ-альдегида с тимозином бета 4 по свободной N-концевой альфа аминогруппе пептида. Такой буфер с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ может содержать соли уксусной, лимонной, глутаминовой, фосфорной, сорбиновой, янтарной кислот или 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), список не ограничивается перечисленным.
Техническим результатом изобретения является получение моноПЭГилированного тимозина бета 4, обладающего в 5 раз большим временем полувыведения из плазмы крови по сравнению с тимозином бета 4.
Осуществление изобретения
Пример 1
Получение моноПЭГилированного тимозина бета 4.
К растворенному в буфере (50 мМ ацетат натрия, 10% ацетонитрила, pH 4) дезацетилтимозину бета 4 добавляют 80 мг цианборгидрида натрия и 80 мг пропиональдегидного производного ПЭГ, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 3 ч при 25°С. Реакционную смесь разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и наносят на колонну Диасорб 130 С16Т, 8 мкм, 15×250 мм. Разделение проводят в градиенте 80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ (30-70% за 60 мин). Идентификацию образующегося моноПЭГилированного тимозина бета 4 проводят методом электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие моноПЭГилированный тимозин бета 4 более 98%, объединяют и лиофилизуют. На фигуре 2 под буквой А изображен профиль полупрепаративной хроматографической очистки моноПЭГилированного тимозина бета 4, где пик 1 соответствует дезацетилтимозину бета 4, пик 2 - моноПЭгилированнй тимозин бета 4, пик 3 - смесь ди и триПЭГилированных тимозинов бета 4. Под буквой В изображен электрофоретический анализ фракций полупрепаративной очистки моноПЭГилированного тимозина бета 4, где М - универсальный стандарт масс, 1 - дезацетилтимозин бета 4, Р - ПЭГ, 2 - моноПЭГилированный тимозин бета 4, 3 - смесь ди- и триПЭгилированных тимозинов бета 4.
Пример 2
Подтвержедение структуры моноПЭГилированного тимозина бета 4.
Лиофилизованный аналог тимозина бета 4 и химически синтезированный тимозин бета 4 в количестве 200 мкг (считают по пептиду), растворяют в 50 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, pH 8,0), затем добавляют 5 мкл 0,067 мг/мл раствора Asp-N протеиназы (0,335 мкг) и инкубируют в течение 3 ч при 37°С. Протеолитическую смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Хроматографические профили продуктов протеолитического расщепления соответствуют профилям на фиг 3. Молекулярные массы фрагментов пептидов соответствуют значениям на фиг 4.
Пример 3
Тестирование стабильности аналога тимозина бета 4 и химически синтезированного тимозина бета 4 на сыворотке крови.
Стабильность определяют как время, за которое в сыворотке крови остается 50% пептида от исходного количества (Т1/2). Сыворотку крови выделяют из крови кролика по стандартным протоколам. Расфасовывают по 50 мкл и замораживают на -70°С. Расфасованную сыворотку крови используют однократно. Тестируемые образцы растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в концентрации 10 мг/млв 50 мкл сыворотки крови и инкубируют в течение 1-24 ч при 37°С. Смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Стабильность измеряют по изменению площади поглощения исследуемого образца со временем. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов определяют параметрическим методом. Для тимозина бета 4 Т1/2 соответствует 2 ч, для ПЭГилированного тимозина бета 4 Т1/2 соответствует 10 ч.
Claims (2)
1. Способ получения моноконъюгата полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, включающий растворение дезацетилтимозина бета 4 в многокомпонентном водно-органическом буфере со значением рН 4, обеспечивающем региоселективное ПЭГилирование и содержащем цианборгидрид натрия и пропиональдегидное производное ПЭГ, тщательное перемешивание и инкубирование в течение 3 ч при 25°С, очистку методом ОФ ВЭЖХ и лиофилизацию.
2. Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, полученный способом по п. 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150089A RU2607527C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150089A RU2607527C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015150089A RU2015150089A (ru) | 2016-03-20 |
| RU2607527C2 true RU2607527C2 (ru) | 2017-01-10 |
Family
ID=55530812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015150089A RU2607527C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2607527C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9173951B2 (en) * | 2008-09-19 | 2015-11-03 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
-
2015
- 2015-11-23 RU RU2015150089A patent/RU2607527C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9173951B2 (en) * | 2008-09-19 | 2015-11-03 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| D. RUFF et al. A randomized, placebo-controlled, single and multiple dose study of intravenous thymosin β4 in healthy volunteers. Vol. 1194, Thymosins in Health and Disease: 2nd International Symposium. PP. 223-229. LIVANIOU E. et al. A thymosin beta 4 ELISA using an antibody against the N terminal fragment thymosin beta 4 [1-14]. J. Immunol. Methods. 1992 Apr 8, 148, (1-2), PP. 9-14. JOSHUA K. AU. et al. Widely Distributed Residues in Thymosin Beta-4 Affect the Kinetics and Stability of Actin Binding. Vol. 1112, Thymosins in Health and Disease First International Symposium. PP. 38-44. * |
| МАКАРОВ Д.А., ЕСИПОВ.Р.С. Получение конъюгатов полисиаловой кислоты и пэг с рекомбинантным тимозином бета-4. VI РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ ";БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ";Уфа, 11-15 июня 2013 г. C.215. Найдено в Интернет 08.08.2016 на http://propep.ru/docs/sbornik_tezisov.pdf. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015150089A (ru) | 2016-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2544573T3 (es) | Inhibidores diméricos de afinidad elevada de PSD-95 y su uso para el tratamiento del daño cerebral isquémico y del dolor | |
| AU2015222135B2 (en) | An A22K, desB27, B29R, des B30, at epsilon position of lysine 22 acylated human insulin analogue | |
| Mero et al. | A new method to increase selectivity of transglutaminase mediated PEGylation of salmon calcitonin and human growth hormone | |
| KR101502645B1 (ko) | 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ｂ, 이의 제조 방법 및 용도 | |
| Wu et al. | Precise and combinatorial PEGylation generates a low-immunogenic and stable form of human growth hormone | |
| CN116115629A (zh) | 核酸产品及其施用方法 | |
| AU2016311283B2 (en) | Novel insulin derivatives and the medical uses hereof | |
| EP3808369B1 (en) | Use of il-22 dimers in manufacture of a medicament for intravenous administration | |
| JP2008509889A (ja) | ペグ化インターフェロンα−１ｂ | |
| BR112020004567A2 (pt) | polipeptídeos para o tratamento de doenças | |
| ES2417131T3 (es) | Modificación química de proteínas para mejorar la biocompatibilidad y la bioactividad | |
| CN107108712A (zh) | 提高重组蛋白产量的方法 | |
| BR112021008797A2 (pt) | Polipeptídeos para o tratamento de síndromes de estresse, imunorreação e derrame | |
| US20110003741A1 (en) | Novel neurturin conjugates for pharmaceutical use | |
| JP2011507913A (ja) | Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用 | |
| AU2014236728B2 (en) | Method of treating metabolic disorders using PLA2G12A polypeptides and PLA2G12A mutant polypeptides | |
| KR101483814B1 (ko) | 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형된 인터페론 알파 2ａ, 이의 합성 방법 및 용도 | |
| KR101521674B1 (ko) | 이중-가닥 폴리에틸렌 글리콜-수식된 성장 호르몬, 이의 제조 방법 및 용도 | |
| US7638481B2 (en) | Treatment of spinal cord injury | |
| CN103923209A (zh) | 一种Lambda干扰素突变体及聚乙二醇衍生物 | |
| RU2607527C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
| IE61444B1 (en) | Process for preparing and purifying interferon | |
| CN101880326B (zh) | 干扰素‑β复合物 | |
| RU2604686C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
| RU2605385C2 (ru) | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови |