RU2600873C1

RU2600873C1 - Method of identifying native pairs of dna or rna fragments present in the same living cells

Info

Publication number: RU2600873C1
Application number: RU2015124477/10A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Михайлович Чудаков; Мария Андреевна Турчанинова
Original assignee: Закрытое акционерное общество "ЕВРОГЕН"
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2016-10-27

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. Invention describes a method of identifying pairs of DNA or RNA fragments, initially present in the same living or fixed cells, in particular method of identifying native pairs of genes of light and heavy chains of antibodies, as well as native pairs of alpha- and beta-chains of T-cell receptor (TCR). Method is based on emulsion PCR or RT-PCR, carried out on living or fixed cells, during which PCR-amplification of DNA or RNA fragments pairs takes place, followed by physical coupling of PCR amplification products. All the above reactions are carried out within emulsion with separate cells, each of which is placed in separate emulsion drop. Method is characterized by new type of PCR-lock, which enables, selective amplification of library of gene fragments coupled in emulsion after emulsion reactions. Selective suppression of PCR participation of uncoupled fragments enables amplification mainly of target pairs of fragments, previously successfully coupled within drops in emulsion compared to amplification of pairs of fragments, capable of non-target coupling after extraction of nucleic acids' mixture from the emulsion.

EFFECT: method of identifying pairs of DNA or RNA fragments, initially present in the same living or fixed cells is proposed.

9 cl, 7 dwg, 5 tbl, 1 ex

Description

Область изобретенияField of Invention

Данное изобретение относится к области молекулярной биологии и иммунологии, в частности к технологии идентификации пар фрагментов молекул ДНК или РНК, которые присутствуют в одних и тех же клетках, например, нативных пар фрагментов генов тяжелых и легких цепей антител или нативных пар фрагментов генов альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов.This invention relates to the field of molecular biology and immunology, in particular to a technology for identifying pairs of fragments of DNA or RNA molecules that are present in the same cells, for example, native pairs of fragments of the genes of heavy and light chains of antibodies or native pairs of fragments of alpha and beta chains of T cell receptors.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Антитела и Т-клеточные рецепторы (ТКР) - оружие адаптивного иммунитета, способное избирательно узнавать специфические антигены - представляют собой бесценный источник средств для биологических исследований и медицинского применения (Leavy О., 2010, Nat Rev Immunol, 10, 297; Schumacher T.N., 2002, Nat Rev Immunol, 2, 512-519).Antibodies and T-cell receptors (TCRs) - a weapon of adaptive immunity that can selectively recognize specific antigens - are an invaluable source of funds for biological research and medical use (Leavy O., 2010, Nat Rev Immunol, 10, 297; Schumacher TN, 2002 , Nat Rev Immunol, 2, 512-519).

Антитело состоит из двух пар полипептидных цепей: тяжелых Н (Heavy) с молекулярным весом около 50000 и легких L (Light) - около 25000, соединенных друг с другом дисульфидными связями.The antibody consists of two pairs of polypeptide chains: heavy H (Heavy) with a molecular weight of about 50,000 and light L (Light) - about 25,000 connected to each other by disulfide bonds.

Т-клеточный рецептор также представляет собой гетеродимер, состоящий из пары различных полипептидных цепей - α и β (либо γ и δ для γδ Т клеток) - с молекулярным весом около 50000. α- и β-цепи соединены между собой дисульфидной связью.A T-cell receptor is also a heterodimer consisting of a pair of different polypeptide chains - α and β (or γ and δ for γδ T cells) with a molecular weight of about 50,000. The α and β chains are interconnected by a disulfide bond.

Н-, L-, α- и β-цепи имеют сходный план строения и относятся к одному суперсемейству белков - иммуноглобулинов. Каждая цепь имеет константный (С) и вариабельный (V) районы. Вариабельные участки Н- и L-цепей (для антител) либо α- и β-цепей (для ТКР) выполняют функцию специфического распознавания и связывания антигенов и образуют активные центры. Благодаря симметричной структуре иммуноглобулина, каждая молекула антитела имеет два центра связывания с антигеном: в V-доменах тяжелых и легких цепей каждой пары. Таким образом, функциональной единицей антитела или ТКР, то есть частью, определяющей специфичность и обеспечивающей связывание антигена, является в случае антитела пара Н- и L-цепей, а в случае ТКР - пара α- и β-цепей.H-, L-, α- and β-chains have a similar structural plan and belong to the same superfamily of proteins - immunoglobulins. Each chain has a constant (C) and variable (V) regions. The variable regions of the H and L chains (for antibodies) or the α and β chains (for TCR) perform the function of specific recognition and binding of antigens and form active centers. Due to the symmetric structure of immunoglobulin, each antibody molecule has two binding sites to the antigen: in the V domains of the heavy and light chains of each pair. Thus, in the case of an antibody, the functional unit of an antibody or TCR, that is, the part that determines specificity and ensures the binding of antigen, is a pair of H and L chains, and in the case of TCR, a pair of α and β chains.

Гены, кодирующие структуру одной полипептидной цепи антитела или ТКР, разделены на 2 или 3 сегмента (V/J или V/D/J) и расположены в одном участке хромосомы в определенном порядке. Согласно структуре каждого из сегментов гены, кодирующие синтез Н- и L-цепей антител и α- и β-цепей ТКР, объединены в семейства. Число таких семейств может насчитывать несколько десятков. Так, например, для вида homo sapiens, количество семейств генов β-цепи ТКР - более 50, количество семейств генов тяжелой цепи антител - более 60.Genes encoding the structure of a single antibody or TCR polypeptide chain are divided into 2 or 3 segments (V / J or V / D / J) and are located in the same chromosome region in a specific order. According to the structure of each of the segments, genes encoding the synthesis of H- and L-chains of antibodies and α- and β-chains of TCR are combined into families. The number of such families can be several tens. So, for example, for the species homo sapiens, the number of TCR β-chain gene families is more than 50, the number of antibody heavy chain gene families is more than 60.

В процессе созревания лимфоцита фрагменты случайным образом рекомбинируют в один ген. Для различных цепей антител или ТКР число вариантов комбинаций достигает значений от тысяч до десятков тысяч. Кроме того, в процессе сборки происходит относительно случайная достройка и укорачивание соединяемых сегментов, что резко увеличивает число возможных комбинаций. Дальнейшее разнообразие активных центров возникает за счет объединения вариабельных районов пар цепей, составляющих эти центры. Таким образом, благодаря сборке V-гена из сегментов и формированию активных центров из разных цепей, может создаваться более 10¹⁵ теоретических вариантов уникальных по своей структуре участков молекул антител и ТКР, формирующих впоследствии репертуар антител и ТКР (Arstila, Т.P. et al. Science 2000, 288, 1135).During the maturation of the lymphocyte, the fragments randomly recombine into one gene. For different chains of antibodies or TCR, the number of combinations reaches a value from thousands to tens of thousands. In addition, a relatively random completion and shortening of the connected segments occurs during the assembly process, which sharply increases the number of possible combinations. A further variety of active centers arises due to the union of the variable regions of the pairs of chains that make up these centers. Thus, due to the assembly of the V gene from segments and the formation of active centers from different chains, more than 10 ¹⁵ theoretical variants of antibody and TCR molecule sections unique in their structure can be created, which subsequently form a repertoire of antibodies and TCR (Arstila, T.P. et al Science 2000, 288, 1135).

Анализ репертуара ТКР и антител важен для фундаментальных исследований адаптивного иммунитета в норме и патологии (Miles J.J., et al., 2011, Immunol Cell Biol, 89, 375-387).Analysis of the TCR repertoire and antibodies is important for basic studies of normal adaptive immunity and pathology (Miles J.J., et al., 2011, Immunol Cell Biol, 89, 375-387).

В течение десятилетий велся поиск эффективного способа идентификации их функциональных единиц - нативных пар тяжелых и легких цепей антител или альфа- и бета-цепей ТКР.For decades, a search has been conducted for an effective way of identifying their functional units — native pairs of heavy and light chains of antibodies or alpha and beta TCR chains.

С этой целью были разработаны различные подходы. Одним из них стало получение гибридом (Schwaber J., et al., 1973, Nature, 244, 444-447): клеточная линия, секретирующая антитела, образуется путем слияния антителообразующей клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного и клетки плазмацитомы, находящейся на сходной стадии дифференцировки. Полученная в результате гибридома наследует от одной родительской клетки способность к секреции антител определенной специфичности, а от другой (клетки плазмацитомы) способность к неограниченному росту in vitro. Отобранные по специфичности гибридомы могут быть использованы как для идентификации ативных пар тяжелых и легких цепей антител, так и для продукции моноклональных антител.To this end, various approaches have been developed. One of them was the production of hybridomas (Schwaber J., et al., 1973, Nature, 244, 444-447): the cell line secreting antibodies is formed by fusion of the antibody-forming cell of the lymphoid tissue of the immunized animal and the plasmacytoma cell, which is at a similar stage of differentiation . The resulting hybridoma inherits from one parent cell the ability to secrete antibodies of a specific specificity, and from another (plasmacytoma cells) the ability to grow unlimitedly in vitro. Hybridomas selected for specificity can be used both for identification of ative pairs of heavy and light chains of antibodies, and for the production of monoclonal antibodies.

Другой технологией является ПЦР с одиночных клеток (Lagerkvist А.С., et al. 1995 Biotechniques, 18, 862-869; Babcook J.S., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 7843-7848; Meijer P.J., et al., 2006, J Mol Biol, 358, 764-772). Метод основан на молекулярном клонировании участков ДНК либо кДНК вариабельных участков иммуноглобулинов, полученных из одного единственного лимфоцита, например из отсортированных клеток кролика или мыши, продуцирующих специфические антитела.Another technology is single cell PCR (Lagerkvist A.S., et al. 1995 Biotechniques, 18, 862-869; Babcook JS, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 7843-7848; Meijer PJ, et al., 2006, J Mol Biol, 358, 764-772). The method is based on molecular cloning of DNA or cDNA regions of immunoglobulin variable regions obtained from a single lymphocyte, for example, from sorted rabbit or mouse cells producing specific antibodies.

Также применяется спаривание молекул на основе частоты их встречаемости (Reddy S.T., et al., 2010, Nat Biotechnol, 28, 965-969). Данный метод, как и в предыдущем случае, включает иммунизацию с последующей изоляцией клеток, продуцирующих специфические антитела, и получением кДНК вариабельных участков иммуноглобулиновых цепей. Далее для определения репертуара вариабельных участков цепей антител используются высокопроизводительные методы секвенирования и биоинформатический анализ. В данном методе выявление пар α- и β-цепей производится на основе простого анализа относительной частоты встречаемости наиболее представленных молекул, что может быть применимо лишь для нескольких наиболее представленных пар в образце.Mating is also used based on the frequency of their occurrence (Reddy S.T., et al., 2010, Nat Biotechnol, 28, 965-969). This method, as in the previous case, involves immunization, followed by isolation of cells producing specific antibodies, and obtaining cDNA of variable regions of the immunoglobulin chains. Further, high-performance sequencing methods and bioinformatics analysis are used to determine the repertoire of variable regions of antibody chains. In this method, the identification of pairs of α and β chains is based on a simple analysis of the relative frequency of occurrence of the most represented molecules, which may be applicable only to a few of the most represented pairs in the sample.

Кроме того, нативные пары цепей ТКР или антител могут быть найдены после культивирования клонов лимфоцитов (Lagerkvist А.С., et al., 1995, Biotechniques, 18, 862-869), а также с помощью сортировки антиген-специфичных популяций Т-клеток (Trautmann L., et al., 2005, J Immunol, 175, 6123-6132) или В-клеток (Franz В., et al., 2011, Blood, 118, 348-357).In addition, native pairs of TCR chains or antibodies can be found after culturing lymphocyte clones (Lagerkvist A.S., et al., 1995, Biotechniques, 18, 862-869), as well as by sorting antigen-specific populations of T cells (Trautmann L., et al., 2005, J Immunol, 175, 6123-6132) or B cells (Franz B., et al., 2011, Blood, 118, 348-357).

Все перечисленные методы позволяют выявлять нативные пары тяжелых и легких цепей антител или альфа- и бета-цепей ТКР, однако только для ограниченного числа клонов и по одной или несколько пар за один трудоемкий эксперимент.All these methods allow us to identify native pairs of heavy and light chains of antibodies or alpha and beta chains of TCR, but only for a limited number of clones and one or more pairs in one laborious experiment.

Идентификация нативных пар цепей ТКР или антител для сложной смеси лимфоцитов с высокой точностью и высокой производительностью долгое время оставалась невыполнимой задачей.Identification of native pairs of TCR chains or antibodies for a complex mixture of lymphocytes with high accuracy and high productivity has long remained an impossible task.

Одним из высокопроизводительных решений является использование так называемых дисплейных технологий. При использовании метода фагового дисплея (Smith, G.P., 1985, Science, 228,1315-1317) в геном бактериофагов встраивают ген гибридного белка, представляющего собой продукт объединения фрагментов тяжелой и легкой цепей антитела и поверхностного белка фаговой частицы. Фрагменты тяжелой и легкой цепей антитела оказываются экспонированными на поверхности вирусных частиц. Отбор фаговых частиц производится на основе сродства фрагментов антител к антигену. Как правило, для получения фагового дисплея используется фаг М13, и фрагменты антител экспрессируют в виде гибридных белков с белками оболочки фага pIII, pIV и pVIII (Benhar, I., Pastan, I., 1994, Protein Eng., 7, 1509-1515). Из отобранных фаговых частиц затем выделяют фаговую кДНК и определяют нуклеотидную последовательность фрагментов антител. На основе этой последовательности в дальнейшем создают полноразмерные рекомбинантные антитела (Luginbuhl, B.,et al., 2006, J. Mol. Biol., 363, 75-97; Krebber, A., et al., 1997, J. Immunol. Methods, 201, 35-55; Maynard, J., Georgiou, G., 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-376.9; Winter, G. et al., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 433-455). Одним из видов дисплея в эукариотах является дрожжевой дисплей. Для экспонирования рекомбинантных фрагментов антител на поверхности дрожжевых клеток создают гибридные белки, состоящие из антитела или его фрагментов и субъединицы агглютинина Aga2p, которая ковалентно соединена при помощи двух дисульфидных связей с агглютинином Aga1, заякоренным в клеточной стенке дрожжевой клетки (Boder, Е.Т. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci, 97, 10701-10705; Boder, E.T., Wittrup, K.D. 1998, Biotechnol. Prog., 14, 55-62; Boder, E.T., Wittrup, K.D. 1997, Nat. Biotechnol., 15, 553-557; Siegel R.W. 2009, Methods Mol. Biol., 504, 351-383). Фаговые и дрожжевые дисплейные технологии, хотя и эффективны для выделения антиген-специфичных антител (Hoogenboom H.R. et al., 1991, Nucleic Acids Res, 19, 4133-4137; Marks J.D. et al., 1991, J Mol Biol, 222, 581-597; Bowley D.R. et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106, 1380-1385), но основываются на случайных спариваниях молекул и не предоставляют информацию о нативности найденных пар.One of the high-performance solutions is the use of so-called display technologies. When using the phage display method (Smith, G.P., 1985, Science, 228.1315-1317), a hybrid protein gene is inserted into the bacteriophage genome, which is the product of combining fragments of the heavy and light chains of an antibody and the surface protein of a phage particle. Fragments of the heavy and light chains of the antibodies are exposed on the surface of the viral particles. The selection of phage particles is based on the affinity of fragments of antibodies to the antigen. Typically, phage M13 is used to obtain a phage display, and antibody fragments are expressed as fusion proteins with coat proteins of the phage pIII, pIV and pVIII (Benhar, I., Pastan, I., 1994, Protein Eng., 7, 1509-1515 ) Phage cDNA is then isolated from the selected phage particles and the nucleotide sequence of antibody fragments is determined. Based on this sequence, full-length recombinant antibodies are subsequently created (Luginbuhl, B., et al., 2006, J. Mol. Biol., 363, 75-97; Krebber, A., et al., 1997, J. Immunol. Methods, 201, 35-55; Maynard, J., Georgiou, G., 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-376.9; Winter, G. et al., 1994, Annu. Rev. Immunol. , 12, 433-455). One type of display in eukaryotes is a yeast display. To expose recombinant antibody fragments on the surface of yeast cells, hybrid proteins are created consisting of the antibody or its fragments and the Aga2p agglutinin subunit, which is covalently linked by two disulfide bonds to Aga1 agglutinin anchored in the cell wall of the yeast cell (Boder, E.T. et et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci, 97, 10701-10705; Boder, ET, Wittrup, KD 1998, Biotechnol. Prog., 14, 55-62; Boder, ET, Wittrup, KD 1997, Nat. Biotechnol., 15, 553-557; Siegel RW 2009, Methods Mol. Biol., 504, 351-383). Phage and yeast display technologies, although effective in isolating antigen-specific antibodies (Hoogenboom HR et al., 1991, Nucleic Acids Res, 19, 4133-4137; Marks JD et al., 1991, J Mol Biol, 222, 581- 597; Bowley DR et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA, 106, 1380-1385), but are based on random pairings of molecules and do not provide information on the nativeness of the pairs found.

Еще один потенциально высокопроизводительный подход основан на амплификации и сборке фрагментов генов тяжелых и легких цепей антител в фиксированных клетках (Embleton M.J., 1992, Nucleic Acids Res, 20, 3831-3837; Chapal N., 1997, Biotechniques, 23, 518-524). При этом подходе клетки предварительно фиксируются, после чего в них проводится ОТ-ПЦР с использованием набора праймеров, с последующим объединением посредством лигирования или достраивания удлинением, также в пределах фиксированных клеток. Однако применение данного подхода на практике оказалось малопригодным для анализа. Подход не позволяет детектировать нативные пары цепей антител или ТКР для сложных смесей клеток, вероятно по причинам низкой эффективности реакций в фиксированных клетках, а также высокого фона от соединяемых фрагментов генов цепей из разных клеток.Another potentially high-performance approach is based on the amplification and assembly of antibody heavy and light chain gene fragments in fixed cells (Embleton MJ, 1992, Nucleic Acids Res, 20, 3831-3837; Chapal N., 1997, Biotechniques, 23, 518-524) . In this approach, the cells are pre-fixed, after which RT-PCR is performed using a set of primers, followed by combining by ligation or extension by extension, also within the fixed cells. However, the application of this approach in practice proved to be of little use for analysis. The approach does not allow the detection of native pairs of antibody chains or TCR for complex cell mixtures, probably due to the low efficiency of reactions in fixed cells, as well as the high background from the connected fragments of gene chains from different cells.

Недавно была опубликована технология для идентификации нативных пар цепей антител (DeKosky B.J. et al., Nature Biotechnology, 2013). В этой технологии B-лимфоциты исходно распределяют по многолуночной плашке, содержащей микробусины, несущие поли-Т олигонуклеотиды. Затем клетки лизируют, и содержащаяся в них мРНК, в том числе мРНК, кодирующая легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, гибридизуется на бусины. Затем бусины извлекают из плашки и помещают в эмульсию «вода в масле», в которой проводится обратная транскрипция, ПЦР и слияние фрагментов по методу «перекрывания-удлинения» (overlap extension) (Но S.N., et al., 1989, Gene, 77, 51-59). Выход реакции представляет собой сложную смесь продуктов ПЦР, в которой присутствуют как спаренные в ходе эмульсионной ОТ-ПЦР молекулы А-Б, так и неспаренные одиночные молекулы А и Б, амплифицированные с генетического материала разных клеток.A technology has recently been published to identify native pairs of antibody chains (DeKosky B.J. et al., Nature Biotechnology, 2013). In this technology, B-lymphocytes are initially distributed over a multi-well plate containing microbeads carrying poly-T oligonucleotides. Then the cells are lysed, and the mRNA contained in them, including the mRNA encoding the light and heavy chains of immunoglobulins, hybridizes to beads. The beads are then removed from the plate and placed in a water-in-oil emulsion, in which reverse transcription, PCR, and fragment fusion are performed using the overlap extension method (But SN, et al., 1989, Gene, 77, 51-59). The reaction yield is a complex mixture of PCR products, in which both AB molecules paired during emulsion RT-PCR and unpaired single molecules A and B amplified from the genetic material of different cells are present.

Авторами настоящего изобретения показано, что дальнейшая ПЦР амплификация, необходимая для подготовки образца для секвенирования по предложенной технологии, приводит к неспецифическому спариванию одиночных молекул А и Б из разных клеток, и таким образом исходная информация о нативных парах цепей теряется.The authors of the present invention showed that further PCR amplification necessary for preparing the sample for sequencing according to the proposed technology leads to non-specific pairing of single molecules A and B from different cells, and thus the initial information about the native pairs of chains is lost.

Таким образом, идентификация нативных пар цепей ТКР или антител для сложной смеси лимфоцитов с высокой точностью и высокой производительностью остается нерешенной задачей. Создание таких технологий востребовано для и диагностики и терапии заболеваний, а также фундаментальных исследований.Thus, the identification of native pairs of TCR chains or antibodies for a complex mixture of lymphocytes with high accuracy and high productivity remains an unresolved problem. The creation of such technologies is in demand for the diagnosis and treatment of diseases, as well as basic research.

Настоящим изобретением предлагается оригинальный способ подавления неспецифического спаривания одиночных молекул А и Б из разных клеток с использованием нового метода ПЦР-блокировки.The present invention provides an original method for suppressing non-specific pairing of single molecules A and B from different cells using a new method of PCR blocking.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способу идентификации нативных пар фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), присутствующих в одних и тех же живых клетках.The present invention relates to a method for identifying native pairs of nucleic acid fragments (DNA or RNA) present in the same living cells.

Способ настоящего изобретения включает:The method of the present invention includes:

(1) амплификацию и физическое спаривание целевых фрагментов А и Б, проводимое в эмульсии;(1) amplification and physical pairing of target fragments A and B, carried out in an emulsion;

(2) внеэмульсионную ПЦР-амплификацию спаренных целевых фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих спаривание фрагментов, ранее не спаренных в одной капле в эмульсии на стадии (1).(2) non-emulsion PCR amplification of paired target fragments in the presence of oligonucleotides that block the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion in step (1).

Стадия (1) метода состоит из следующих шагов: (а) получение эмульсии «вода в масле», в которой клетки заключены в каплях водной фазы; (б) амплификации целевых фрагментов А и Б, проводимую в эмульсии; (в) физическое спаривание целевых амплифицированных фрагментов А с целевыми амплифицированными фрагментами Б, находящимися в одной капле. В преимущественных воплощениях шаги (б) и (в) происходят одновременно в ходе амплификации в эмульсии.Stage (1) of the method consists of the following steps: (a) obtaining a water-in-oil emulsion in which cells are enclosed in drops of an aqueous phase; (b) amplification of target fragments A and B, carried out in an emulsion; (c) physical pairing of the target amplified fragments A with the target amplified fragments B in one drop. In preferred embodiments, steps (b) and (c) occur simultaneously during amplification in the emulsion.

Стадия (2) метода состоит из следующих шагов: (г) выделение фракции нуклеиновых кислот, содержащих спаренные фрагменты, из эмульсии; (д) амплификация целевых спаренных фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих спаривание фрагментов, ранее не спаренных в одной капле в эмульсии в ходе шага (в);Stage (2) of the method consists of the following steps: (d) isolation of the fraction of nucleic acids containing paired fragments from the emulsion; (e) amplification of the target paired fragments in the presence of oligonucleotides blocking the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion during step (c);

В преимущественных воплощениях метод также включает стадию (3) секвенирование полученных ПЦР-ампликонов.In preferred embodiments, the method also includes the step of (3) sequencing the obtained PCR amplicons.

В одном из воплощений указанный способ относится к идентификации двух различных фрагментов ДНК (фрагменты А и Б), находящихся в одной клетке. Например, указанный способ относится к идентификации фрагментов молекул ДНК, кодирующих альфа-цепь (фрагмент А) и бета-цепь (фрагмент Б) Т-клеточного рецептора, присутствующих в геноме одной клетки и представляющих функциональную единицу Т-клеточного рецептора. Указанный способ также относится к идентификации фрагментов молекул ДНК, кодирующих тяжелую цепь (фрагмент А) и легкую цепь (фрагмент Б) антитела, присутствующих в геноме одной клетки и представляющих функциональную единицу антитела.In one embodiment, said method relates to the identification of two different DNA fragments (fragments A and B) located in the same cell. For example, this method relates to the identification of fragments of DNA molecules encoding an alpha chain (fragment A) and beta chain (fragment B) of a T-cell receptor, present in the genome of one cell and representing a functional unit of the T-cell receptor. The method also relates to the identification of fragments of DNA molecules encoding a heavy chain (fragment A) and light chain (fragment B) of an antibody present in the genome of one cell and representing the functional unit of the antibody.

В другом воплощении указанный способ относится к идентификации двух фрагментов различных молекул РНК (фрагменты А и Б), синтезирующихся в одной клетке. Например, указанный способ относится к идентификации фрагментов молекул мРНК, кодирующих альфа-цепь (фрагмент А) и бета-цепь (фрагмент Б) Т-клеточного рецептора, коэкспрессирующихся в одной клетке и представляющих функциональную единицу Т-клеточного рецептора. Указанный способ также относится к идентификации фрагментов молекул мРНК, кодирующих тяжелую цепь (фрагмент А) и легкую цепь (фрагмент Б) антитела, коэкспрессирующиеся в одной клетке и представляющих функциональную единицу антитела.In another embodiment, the method relates to the identification of two fragments of different RNA molecules (fragments A and B) synthesized in one cell. For example, this method relates to the identification of fragments of mRNA molecules encoding an alpha chain (fragment A) and beta chain (fragment B) of a T-cell receptor, co-expressed in one cell and representing a functional unit of the T-cell receptor. This method also relates to the identification of fragments of mRNA molecules encoding a heavy chain (fragment A) and light chain (fragment B) of an antibody coexpressed in a single cell and representing a functional unit of the antibody.

Способ настоящего изобретения позволяет проводить массовую идентификацию пар фрагментов А и Б в популяции живых или фиксированных клеток.The method of the present invention allows for the mass identification of pairs of fragments A and B in a population of living or fixed cells.

В некоторых воплощениях, стадия (б) способа настоящего изобретения (амплификация целевых фрагментов А и Б, проводимая в эмульсии) осуществляется с помощью эмульсионной ПЦР, где матрицей служат целевые фрагменты ДНК.In some embodiments, step (b) of the method of the present invention (amplification of target fragments A and B carried out in an emulsion) is carried out using emulsion PCR, where the target DNA fragments are the template.

В других воплощениях, стадия (б) способа настоящего изобретения осуществляется с помощью эмульсионной обратной-транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР), где матрицей служат целевые фрагменты РНК.In other embodiments, step (b) of the method of the present invention is carried out using emulsion reverse transcription-PCR (RT-PCR), where the target are RNA fragments.

В некоторых воплощениях, стадия (в) способа настоящего изобретения (физическое спаривание целевых амплифицированных фрагментов А с целевыми амплифицированными фрагментами Б, находящимися в одной капле) осуществляется с помощью технологии «перекрывания-удлинения» (overlap extension). В других воплощениях эта стадия осуществляется с помощью лигирования, амплификации на бусинах или рекомбинации.In some embodiments, step (c) of the method of the present invention (physical pairing of the target amplified fragments A with the target amplified fragments B located in one drop) is carried out using the overlap extension technology. In other embodiments, this step is accomplished by ligation, bead amplification, or recombination.

В преимущественных воплощениях стадия (д) настоящего изобретения осуществляется в ходе одной или нескольких последовательных ПЦР. Настоящее изобретение отличается тем, что на этой стадии используется оригинальный способ селективного подавления амплификации неспаренных целевых амплифицированных фрагментов А и неспаренных целевых амплифицированных фрагментов Б, полученных на стадии (а) и присутствующих в смеси нуклеиновых кислот. Подавление неспецифической амплификации неспаренных фрагментов А и Б является неотъемлемой и принципиальной составляющей этой стадии.In preferred embodiments, step (e) of the present invention is carried out during one or more sequential PCR. The present invention is characterized in that at this stage an original method is used to selectively suppress the amplification of unpaired target amplified fragments A and unpaired target amplified fragments B obtained in stage (a) and present in the nucleic acid mixture. Suppression of nonspecific amplification of unpaired fragments A and B is an integral and fundamental component of this stage.

Селективное подавление амплификации неспаренных целевых фрагментов достигается за счет добавления в реакционную смесь блокирующего олигонуклеотида. Блокирующий олигонуклеотид содержит:Selective suppression of amplification of unpaired target fragments is achieved by adding a blocking oligonucleotide to the reaction mixture. A blocking oligonucleotide contains:

(а′) 3′-концевую последовательность, комплементарную последовательности 3′-концевого участка фрагмента ДНК, амплификация которого должна быть подавлена;(a ′) a 3′-terminal sequence complementary to the sequence of the 3′-terminal portion of a DNA fragment whose amplification is to be suppressed;

(б′) 5′-концевую последовательность, служащую матрицей для достройки нового 3′-конца для указанного фрагмента ДНК, где новая 3′-концевая последовательность не имеет комплементарности с предполагаемыми матрицами и исключает дальнейшее участие этого фрагмента в амплификации в качестве затравки.(b ′) a 5′-terminal sequence that serves as a template for completing a new 3′-end for the indicated DNA fragment, where the new 3′-terminal sequence is not complementary to the putative matrices and excludes further participation of this fragment in amplification as a seed.

Изобретенный новый тип ПЦР-блокировки позволяет, после проведения эмульсионных реакций, селективно амплифицировать библиотеку спаренных в эмульсии фрагментов генов. Суть изобретения состоит в том, что селективное подавление участия в ПЦР неспаренных фрагментов позволяет преимущественно амплифицировать целевые пары фрагментов, ранее успешно спаренные в пределах капель в эмульсии, по сравнению с амплификацией пар фрагментов, способных к нецелевому спариванию уже после выделения смеси нуклеиновых кислот из эмульсии.The invented new type of PCR blocking allows, after carrying out emulsion reactions, to selectively amplify the library of gene fragments paired in the emulsion. The essence of the invention is that the selective suppression of the participation of unpaired fragments in PCR allows mainly amplification of the target pairs of fragments previously successfully paired within the droplets in the emulsion, compared with the amplification of pairs of fragments capable of non-targeted pairing after the nucleic acid mixture is isolated from the emulsion.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Фиг. 1 показывает поэтапную схему получения спаренных альфа- и бета-цепей ТКР. Эмульгированные белые клетки крови разрушаются при кратковременном нагревании до 62°C; вышедшая из клеток мРНК альфа- и бета-цепей ТКР подвергается обратной транскрипции при 50°C со специфичными праймерами, после чего в каждой капле осуществляется реакция амплификации с последующем спариванием методом перекрывания-удлинения. Продукты реакции извлекаются из эмульсии, и представляющие интерес спаренные молекулы селективно амплифицируются, в то время как аплификация неспаренных молекул блокируется.FIG. 1 shows a step-by-step scheme for producing paired TCR alpha and beta chains. Emulsified white blood cells are destroyed by short-term heating to 62 ° C; The TCR alpha and beta mRNA that emerged from the cells undergoes reverse transcription at 50 ° C with specific primers, after which an amplification reaction is carried out in each drop, followed by pairing by the overlap-extension method. The reaction products are recovered from the emulsion, and the paired molecules of interest are selectively amplified, while the aplification of unpaired molecules is blocked.

Фиг. 2 показывает схему получения спаренных альфа- и бета-цепей ТКР в пределах эмульсионной капли. Вышедшая из клеток мРНК альфа- и бета-цепей ТКР подвергается обратной транскрипции при 50°C со специфичными праймерами, после чего в каждой капле осуществляется реакция амплификации с последующем спариванием методом перекрывания-удлинения.FIG. 2 shows a scheme for producing paired alpha and beta TCR chains within an emulsion droplet. The TCR alpha and beta chains mRNA emerging from cells undergo reverse transcription at 50 ° C with specific primers, after which an amplification reaction is carried out in each drop, followed by pairing by the overlap-extension method.

Фиг. 3 показывает схему ПЦР-блокировки. Представляющие интерес спаренные молекулы селективно амплифицируются, в то время как амплификация неспаренных молекул блокируется.FIG. 3 shows a PCR blocking scheme. The paired molecules of interest are selectively amplified, while the amplification of unpaired molecules is blocked.

Фиг. 4. Пост-эмульсионная реакция амплификации спаренных молекул ТКР, полученных в одной эмульсии, содержащей все праймеры (αβ), либо объединенных после получения в двух отдельных эмульсиях, одна из которых содержит праймеры для амплификации альфа-цепей ТКР, а другая - бета-цепей ТКР (α+β после ОТ-ПЦР, то есть контроль случайных реакций перекрывания-удлинения после высвобождения из эмульсии), либо полученных в двух отдельных эмульсиях, одна из которых содержит праймеры для амплификации альфа-цепей ТКР, а другая - бета-цепей ТКР и объединенных после обратной транскрипции (α+β после ОТ, то есть контроль случайных реакций перекрывания-удлинения за счет слияния капель эмульсии). Все реакции проводили с или без использования ПЦР-блокировки.FIG. 4. Post-emulsion amplification reaction of paired TCR molecules obtained in one emulsion containing all primers (αβ), or combined after preparation in two separate emulsions, one of which contains primers for amplification of TCR alpha chains, and the other - beta chains TCR (α + β after RT-PCR, that is, control of random overlap-extension reactions after release from the emulsion), or obtained in two separate emulsions, one of which contains primers for amplification of TCR alpha chains, and the other - TCR beta chains and united last reverse transcription (α + β after OT, i.e. control random overlap-extension reactions due to the merging of the emulsion droplets). All reactions were performed with or without PCR blocking.

Фиг. 5 показанывает результаты эксперимента по подбору концентрации блокирующих олигонуклеотидов в эмульсионных реакциях с живых клеток. Показаны результаты второй пост-эмульсионной амплификации спаренных альфа- и бета-цепей ТКР. Предшествующая первая пост-эмульсионная амплификация проводилась в присутствии 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 или 12.8 мкМ каждого блокирующего олигонуклеотида; указанная амплификация проводилась, в одном случае, с продукта полной эмульсионной реакции, проводившейся в присутствии праймеров для амплификации и реакции перекрывания-удлинения и альфа, и бета-цепей ТКР (а); в другом случае указанная амплификация проводилась со смеси продуктов, полученной после объединения двух отдельных эмульсий, каждая из которых содержала праймеры для амплификации и перекрывания-удлинения либо альфа-, либо бета-цепей (б).FIG. 5 shows the results of an experiment for selecting the concentration of blocking oligonucleotides in emulsion reactions from living cells. The results of the second post-emulsion amplification of paired TCR alpha and beta chains are shown. The previous first post-emulsion amplification was carried out in the presence of 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 or 12.8 μM of each blocking oligonucleotide; said amplification was carried out, in one case, from the product of a complete emulsion reaction carried out in the presence of primers for amplification and the overlap-extension reaction and alpha, and TCR beta chains (a); in another case, said amplification was carried out with a mixture of products obtained after combining two separate emulsions, each of which contained primers for amplification and overlap-extension of either alpha or beta chains (b).

На Фиг. 6 представлена иллюстрация образования 400 теоретически наиболее вероятных пар из 20 альфа-цепей CDR3 и 20 бета-цепей CDR3, которые были преимущественно представлены в контрольной реакции. Показан процент каждой из наблюдаемых пар среди всех обнаруженных пар в эмульсии (а) и контрольной безэмульсионной реакции (б). Вычтены случайные спаривания, ожидаемые исходя из частоты встречаемости. Показаны круговые диаграммы спаривания альфа- и бета-цепей ТКР, созданные с помощью Circos (Krzywinski М., et al., 2009, Genome Res., 19, 1639-1645). Размеры сегментов указывают на представленность варианта цепи в контроле, ширина лент соотносится с числом прочтений данной пары в указанной эмульсии. Идентифицированные нативные пары обозначены номерами (P1-P6) (см. Пример 1, Табл. 3).In FIG. Figure 6 illustrates the formation of 400 theoretically most probable pairs of 20 CDR3 alpha chains and 20 CDR3 beta chains, which were predominantly present in the control reaction. The percentage of each of the observed pairs among all detected pairs in the emulsion (a) and the control emulsion-free reaction (b) is shown. Random mating expected based on frequency of occurrence is subtracted. Shows pie charts pairing alpha and beta TCR chains created using Circos (Krzywinski M., et al., 2009, Genome Res., 19, 1639-1645). The sizes of the segments indicate the representativeness of the chain variant in the control, the width of the tapes is related to the number of readings of this pair in the specified emulsion. Identified native pairs are indicated by numbers (P1-P6) (see Example 1, Table 3).

Фиг. 7 показавает результат проточного флуоресцентного сортинга (FACS - Fluorescence-activated cell sorting) CD8+ HLA-A*02-CMV (NLV пептид)-специфичных Т-клеток. Показана популяция клеток CD8+. Из 20 млн мононуклеарных клеток периферической крови было отсортировано более 100000 Т-клеток интересующей субпопуляции (область R1). Область R1 содержит 3,8% из CD8+ Т-клеток и 1,7% всех клеток. Чистота отсортированной популяции более 97%.FIG. 7 shows the result of fluorescence-activated cell sorting (FACS) of CD8 + HLA-A * 02-CMV (NLV peptide) -specific T cells. A population of CD8 + cells is shown. Of the 20 million peripheral blood mononuclear cells, more than 100,000 T cells of the subpopulation of interest were sorted (region R1). The R1 region contains 3.8% of CD8 + T cells and 1.7% of all cells. The purity of the sorted population is more than 97%.

Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к способу идентификации двух различных фрагментов нуклеиновых кислот, присутствующих в одних и тех же живых клетках. Схематическое изображение способа отображено на Фиг. 1-3.The present invention relates to a method for identifying two different nucleic acid fragments present in the same living cells. A schematic representation of the method is shown in FIG. 1-3.

Стадию (1): амплификацию и физическое спаривание целевых фрагментов А и Б, проводимое в эмульсии;Stage (1): amplification and physical pairing of the target fragments A and B, carried out in an emulsion;

Стадию (2) внеэмульсионную ПЦР-амплификацию спаренных целевых фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих спаривание фрагментов, ранее не спаренных в одной капле в эмульсии на стадии (1).Stage (2) non-emulsion PCR amplification of paired target fragments in the presence of oligonucleotides blocking the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion in step (1).

В одном из воплощений указанный способ относится к идентификации двух различных фрагментов ДНК (фрагменты А и Б), находящихся в одной клетке. В другом воплощении указанный способ относится к идентификации двух фрагментов различных молекул РНК (фрагменты А и Б), синтезирующихся в одной клетке. Например, указанный способ относится к идентификации фрагментов молекул ДНК и мРНК, кодирующих альфа-цепь (фрагмент А) и бета-цепь (фрагмент Б) Т-клеточного рецептора, присутствующих в одной клетке и представляющих функциональную единицу Т-клеточного рецептора. Указанный способ также относится к идентификации фрагментов молекул мРНК, кодирующих тяжелую цепь (фрагмент А) и легкую цепь (фрагмент Б) антитела, присутствующих в одной клетке и представляющих функциональную единицу антитела.In one embodiment, said method relates to the identification of two different DNA fragments (fragments A and B) located in the same cell. In another embodiment, the method relates to the identification of two fragments of different RNA molecules (fragments A and B) synthesized in one cell. For example, this method relates to the identification of fragments of DNA and mRNA molecules encoding an alpha chain (fragment A) and beta chain (fragment B) of a T-cell receptor, present in one cell and representing a functional unit of the T-cell receptor. The method also relates to the identification of fragments of mRNA molecules encoding a heavy chain (fragment A) and light chain (fragment B) of an antibody present in one cell and representing a functional unit of the antibody.

Способ настоящего изобретения позволяет проводить массовую идентификацию пар фрагментов А и Б в популяции живых или фиксированных клеток. В частности, способ настоящего изобретения позволяет идентифицировать нативные пары альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов и тяжелых и легких цепей антител, представляющие собой функциональные единицы, в образцах крови. Способ востребован в исследованиях адаптивного иммунитета и созданий функциональных моноклональных антител и ТКР для клинических и научных приложений.The method of the present invention allows for the mass identification of pairs of fragments A and B in a population of living or fixed cells. In particular, the method of the present invention allows the identification of native pairs of alpha and beta chains of T cell receptors and heavy and light chains of antibodies, which are functional units, in blood samples. The method is in demand in studies of adaptive immunity and the creation of functional monoclonal antibodies and TCR for clinical and scientific applications.

Как здесь используется термин «нативная пара» означает пару альфа- и бета-цепей Т-клеточного рецептора, либо пару тяжелых и легких цепей антитела, экспрессируемых в одном и том же лимфоците живого организма и составляющих соответственно функциональную единицу - Т-клеточный рецептор либо антитело, соответственно.As used here, the term “native pair” means a pair of alpha and beta chains of a T-cell receptor, or a pair of heavy and light chains of an antibody expressed in the same lymphocyte of a living organism and constituting a functional unit, a T-cell receptor or an antibody, respectively , respectively.

Как здесь используется термин «функциональная единица» означает пару Н- и L-цепей антител или альфа и бета-цепей ТКР, которые определяют специфичность и обеспечивают связывание антигена с антителом или ТКР, соответственно.As used here, the term "functional unit" means a pair of H and L chains of antibodies or alpha and beta chains of TKR, which determine the specificity and ensure the binding of antigen to antibody or TKR, respectively.

Стадия 1. Амплификация и физическое спаривание целевых фрагментов А и Б, проводимое в эмульсииStage 1. Amplification and physical pairing of target fragments A and B, carried out in emulsion

А) Получение эмульсии клетокA) Obtaining an emulsion of cells

Ключевым требованием для успешного применения указанного способа является получение репрезентативной библиотеки ДНК или кДНК фрагментов А и Б, спаренных в процессе эмульсионной реакции, полученной из клеток, каждая из которых изолирована в отдельной капле минимального объема, достаточного для проведения ПЦР (Фиг. 1).A key requirement for the successful application of this method is to obtain a representative library of DNA or cDNA fragments A and B, paired in an emulsion reaction obtained from cells, each of which is isolated in a separate drop of a minimum volume sufficient for PCR (Fig. 1).

Важными качествами, позволяющими успешно применить эмульсию для нужд данного изобретения, являются ее стабильность (в т.ч. и при изменении температуры в ходе ПЦР), интактность по отношению к клеткам, заключенным в капли, и способность формировать капли эффективного объема. Под термином «эффективный объем» подразумевается объем капли, достаточный для того, чтобы вместить клетку, и объем реакционной смеси, по крайней мере, сравнимый с объемом клетки. В предпочтительных воплощениях, «эффективный объем» достаточен для того, чтобы вместить клетку и объем реакционной смеси, который больше объема клетки по крайней мере в 2 раза, предпочтительно по крайней мере в 5 раз, например в 10 и более раз, чаще всего в 20 и более раз.Important qualities that make it possible to successfully use the emulsion for the needs of this invention are its stability (including when the temperature changes during PCR), intactness with respect to cells enclosed in droplets, and the ability to form droplets of effective volume. By the term “effective volume” is meant a droplet volume sufficient to accommodate a cell, and a volume of the reaction mixture at least comparable to the volume of the cell. In preferred embodiments, the “effective volume” is sufficient to accommodate the cell and the volume of the reaction mixture, which is at least 2 times larger than the cell volume, preferably at least 5 times, for example 10 times or more, most often 20 and more times.

Существуют различные технические решения для получения эмульсии клеток «вода в масле», отвечающей указанным требованиям и пригодной для дальнейшего проведения ПЦР (ОТ-ПЦР).There are various technical solutions for obtaining a water-in-oil emulsion of cells that meets the specified requirements and is suitable for further PCR (RT-PCR).

Предпочтительным вариантом получения эмульсии клеток является приготовление эмульсии типа «вода в масле», в которой клетки и все реагенты для ПЦР (или ОТ-ПЦР) заключены в капли воды. Критическим компонентом в этой композиции является сурфактант (эмульгатор), необходимый для стабилизации водных капель в масляной фазе.A preferred embodiment of a cell emulsion is the preparation of a water-in-oil emulsion in which cells and all PCR reagents (or RT-PCR) are enclosed in drops of water. A critical component in this composition is a surfactant (emulsifier), necessary to stabilize water droplets in the oil phase.

Одним из подходов является приготовление эмульсии типа «агароза в масле». В этом случае компоненты водной фазы (клетки и все реагенты для ПЦР либо ОТ-ПЦР) заключены в капли из легкоплавкой агарозы, которая способна сохранять жидкое агрегатное состояние при температуре выше 16°C, тем самым обеспечивая эффективное протекание реакции в эмульсии (Zhang Н et al, Anal Chem. 2012 Apr 17; 84(8):3599-606; Leng X, Yang CJ., Methods Mol Biol. 2013; 949:413-22; Zhi Zhu et al., Lab Chip, 2012, 12, 3907-3913).One approach is to prepare an agarose in oil emulsion. In this case, the components of the aqueous phase (cells and all reagents for PCR or RT-PCR) are enclosed in droplets of low-melting agarose, which is able to maintain a liquid state of aggregation at temperatures above 16 ° C, thereby ensuring the efficient reaction in the emulsion (Zhang H et al, Anal Chem. 2012 Apr 17; 84 (8): 3599-606; Leng X, Yang CJ., Methods Mol Biol. 2013; 949: 413-22; Zhi Zhu et al., Lab Chip, 2012, 12, 3907-3913).

В некоторых вариантах реализации данного изобретения в качестве масляной дисперсионной среды при приготовлении эмульсии может использоваться фторуглеродное масло. Предпочтительными эмульгаторами, применяющимися для стабилизации водных капель в фторуглеродном масле являются сурфактанты - производные перфторполиэфира (ПФПЭ):In some embodiments of the invention, fluorocarbon oil may be used as the oil dispersion medium in the preparation of the emulsion. Preferred emulsifiers used to stabilize water droplets in fluorocarbon oil are surfactants derived from perfluoropolyether (PFPE):

Krytox (DuPont) (С. Holtze, А.С. Rowat, J.J. Agresti, J.В. Hutchison, F.E. Angile, C.H.J. Schmitz, S. Koster, H. Duan, K.J. Humphry, R.A. Scanga, J.S. Johnson, D. Pisignano, D.A. Weitz, Lab Chip 2008, 8, 1632-1639.),Krytox (DuPont) (C. Holtze, A.S. Rowat, JJ Agresti, J. B. Hutchison, FE Angile, CHJ Schmitz, S. Koster, H. Duan, KJ Humphry, RA Scanga, JS Johnson, D. Pisignano , DA Weitz, Lab Chip 2008, 8, 1632-1639.),

полиэтиленгликоль-ПФПЭ (J. Clausell-Tormos, D. Lieber, J.C. Baret, A. El-Harrak, O.J. Miller, L. Frenz, J. Blouwolff, K.J. Humphry, S. Koster, H. Duan, C. Holtze, D.A. Weitz, A.D. Griffiths, C.A. Merten, Chem. Biol. 2008, 15, 427-437.),polyethylene glycol-PFPE (J. Clausell-Tormos, D. Lieber, JC Baret, A. El-Harrak, OJ Miller, L. Frenz, J. Blouwolff, KJ Humphry, S. Koster, H. Duan, C. Holtze, DA Weitz, AD Griffiths, CA Merten, Chem. Biol. 2008, 15, 427-437.),

гексаэтиленгликоль-ПФПЭ (D.J. Holt, R.J. Payne, W.Y. Chow, C. Abell, J. Colloid Interface Sci. 2010, 350, 205-211).hexaethylene glycol-PFPE (D.J. Holt, R.J. Payne, W.Y. Chow, C. Abell, J. Colloid Interface Sci. 2010, 350, 205-211).

В других вариантах реализации настоящего изобретения в качестве масляной дисперсионной среды при приготовлении эмульсии может использоваться углеводородное (минеральное) масло. Известны следующие системы сурфактантов, применяемые для стабилизации водных капель в минеральном масле:In other embodiments of the present invention, a hydrocarbon (mineral) oil may be used as the oil dispersion medium in the preparation of the emulsion. The following surfactant systems are known to be used to stabilize water droplets in mineral oil:

- 4.5% Span-80, 0.4% Tween 80, 0.05% Triton Х-100 (Williams et al., Nat Methods, vol. 3 no. 7, 545-550);- 4.5% Span-80, 0.4% Tween 80, 0.05% Triton X-100 (Williams et al., Nat Methods, vol. 3 no. 7, 545-550);

- 73% Tegosoft DEC, 7% ABIL WE (Schutze et al., Anal. Biochem. 2011 March 1; 410(1):155-7);- 73% Tegosoft DEC, 7% ABIL WE (Schutze et al., Anal. Biochem. 2011 March 1; 410 (1): 155-7);

- 3% ABIL-EM90 (Schaerli Y et al, 2009 Anal Chem 81:302-306);- 3% ABIL-EM90 (Schaerli Y et al, 2009 Anal Chem 81: 302-306);

- 2% ABIL-EM90, 0.05% Triton X-100 (Hatch AC et al., 2011, Lab Chip 11:3838-3845).- 2% ABIL-EM90, 0.05% Triton X-100 (Hatch AC et al., 2011, Lab Chip 11: 3838-3845).

В некоторых вариантах реализации данного изобретения (амплификация ДНК) в качестве водного компонента эмульсии используется реакционная смесь для ПЦР, в которую помещают клетки.In some embodiments of the invention (DNA amplification), the PCR reaction mixture in which the cells are placed is used as the aqueous component of the emulsion.

В других вариантах реализации данного изобретения (амплификация РНК) в качестве водного компонента эмульсии используется смесь для ОТ-ПЦР, в которую помещают клетки.In other embodiments of the invention (RNA amplification), an RT-PCR mixture in which cells are placed is used as the aqueous component of the emulsion.

Составы реакционных смесей и ферменты для ПЦР и ОТ-ПЦР хорошо известны из уровня техники и доступны в виде коммерческих наборов реактивов. Особенности реакционных смесей, используемых для реализации данного изобретения описаны подробно в разделе «Б» Эульсионная ПЦР либо ОТ-ПЦР», ниже. Примеры конкретных смесей приведены в разделе «Примеры».The compositions of the reaction mixtures and enzymes for PCR and RT-PCR are well known in the art and are available as commercial reagent kits. Features of the reaction mixtures used to implement this invention are described in detail in section "B" Emulsion PCR or RT-PCR "below. Examples of specific mixtures are given in the Examples section.

В некоторых вариантах реализации изобретения для приготовления эмульсии клеток могут использоваться живые клетки непосредственно сразу после выделения из биологического материала. Например, для осуществления предлагаемого способа идентификации нативных пар тяжелых и легких цепей антител или пар альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов могут быть использованы мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), полученные при центрифугировании цельной крови в градиенте плотности фиколл-урографин.In some embodiments of the invention, living cells can be used immediately after isolation from the biological material to prepare the cell emulsion. For example, to implement the proposed method for identifying native pairs of heavy and light chains of antibodies or pairs of alpha and beta chains of T-cell receptors, mononuclear cells of peripheral blood (MCPC) obtained by centrifuging whole blood in a density gradient of ficoll-urographin can be used.

В других вариантах реализации изобретения для приготовления эмульсии клеток могут использоваться клетки, подвергшиеся процедуре заморозки. В предпочтительном варианте для заморозки клеток используется среда с добавлением сыворотки и DMSO. Перед приготовлением эмульсии клетки необходимо разморозить и отмыть от криоконсервационной среды. Соответствующие протоколы хорошо известны и описаны например, в (Kreher et al. (2003) Journal of Immunological Methods 278:79-93, Reimann, et al. (2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7:352-359, and Romeu et al. (1992) J. Immunol. Methods 154:7-10.) В других вариантах реализации изобретения для приготовления эмульсии клеток могут использоваться клетки, подвергшиеся процедуре фиксации. In other embodiments of the invention, cells subjected to a freezing procedure can be used to prepare a cell emulsion. In a preferred embodiment, serum supplemented with DMSO is used to freeze the cells. Before preparing the emulsion, the cells must be thawed and washed from the cryopreservation medium. Appropriate protocols are well known and described, for example, in (Kreher et al. (2003) Journal of Immunological Methods 278: 79-93, Reimann, et al. (2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7: 352-359, and Romeu et al. (1992) J. Immunol. Methods 154: 7-10.) In other embodiments, cells that have undergone a fixation procedure can be used to prepare a cell emulsion.

Предпочтительным вариантом фиксации клеток является фиксация формальдегидом. Перед приготовлением эмульсии клетки необходимо отмыть от фиксирующего реагента.A preferred embodiment of cell fixation is formaldehyde fixation. Before preparing the emulsion, the cells must be washed from the fixing reagent.

Важным параметром, влияющим на качество приготовляемой эмульсии, является количество клеток, добавляемое в реакцию. При добавлении в реакцию слишком малого числа клеток становится невозможным получить детектируемое количество целевых спаренных фрагментов А-Б. При добавлении в реакцию избыточного числа клеток увеличивается вероятность попадания нескольких клеток в одну каплю эмульсии. Тем не менее, концентрация клеток при различных вариантах реализации изобретения может варьировать в широких пределах и составлять от 100 штук до 100 миллионов штук и более на 100 мкл водной фазы приготовляемой эмульсии. В предпочтительном варианте реализации изобретения, концентрация клеток составляет от 10 тысяч до 1 миллиона штук на 100 мкл водной фазы приготовляемой эмульсии.An important parameter affecting the quality of the prepared emulsion is the number of cells added to the reaction. If too few cells are added to the reaction, it becomes impossible to obtain a detectable amount of target paired AB fragments. When an excessive number of cells is added to the reaction, the likelihood of several cells entering one drop of emulsion increases. However, the concentration of cells in various embodiments of the invention can vary within wide limits and range from 100 units to 100 million units or more per 100 μl of the aqueous phase of the prepared emulsion. In a preferred embodiment of the invention, the cell concentration is from 10 thousand to 1 million units per 100 μl of the aqueous phase of the prepared emulsion.

Эмульсия готовится путем перемешивания масляного компонента и водного компонента, например, в соотношении 9:1. Перемешивание происходит, например, при температуре 25°C. Варианты приготовления эмульсии хорошо известны из уровня техники. В некоторых воплощениях заявленного способа для перемешивания масляного (смесь масла и эмульгаторов) и водного (смесь реагентов для ПЦР/ОТ-ПЦР и клеток) компонентов эмульсии используются микрофлюидные чипы, представляющие собой организованную систему микроканалов в объеме тонкой твердой подложки из стекла, кремния или полимеров (Eric Brouzes et al., 2009, PNAS, vol. 106, no. 34, 14195-14200; Zeng et al., Anal. Chem. 2010, 82, 3183-3190; Zhang et al., Anal. Chem. 2012, 84, 3599-3606). В других воплощениях заявленного способа для достижения этой цели используется механическое перемешивание компонентов эмульсии с помощью магнитной мешалки и магнитного якоря (Williams et al., Nat Methods, vol. 3 no. 7, 545-550; Dekosky BJ et al., Nat Biotechnol. 2013 Jan 20; 31(2):166-9; Shao et al., PLoS One. 2011; 6(9):e24910).The emulsion is prepared by mixing the oil component and the water component, for example, in a ratio of 9: 1. Stirring occurs, for example, at a temperature of 25 ° C. Variants for preparing an emulsion are well known in the art. In some embodiments of the claimed method, microfluidic chips are used to mix the oil (a mixture of oil and emulsifiers) and water (a mixture of reagents for PCR / RT-PCR and cells) emulsion components, which are an organized system of microchannels in the volume of a thin solid substrate of glass, silicon or polymers (Eric Brouzes et al., 2009, PNAS, vol. 106, no. 34, 14195-14200; Zeng et al., Anal. Chem. 2010, 82, 3183-3190; Zhang et al., Anal. Chem. 2012 84, 3599-3606). In other embodiments of the inventive method, mechanical mixing of the emulsion components using a magnetic stirrer and a magnetic armature (Williams et al., Nat Methods, vol. 3 no. 7, 545-550; Dekosky BJ et al., Nat Biotechnol. 2013 Jan 20; 31 (2): 166-9; Shao et al., PLoS One. 2011; 6 (9): e24910).

После перемешивания масляного и водного компонентов, подготовленная эмульсия распределяется по пробиркам для ПЦР-амплификации, количество которых зависит от объема реакционной смеси.After mixing the oil and water components, the prepared emulsion is distributed into tubes for PCR amplification, the amount of which depends on the volume of the reaction mixture.

Б) Эмульсионная ПЦР либо ОТ-ПЦРB) Emulsion PCR or RT-PCR

В некоторых воплощениях, стадия амплификации целевых фрагментов А и Б, проводимая в эмульсии клеток, способа настоящего изобретения осуществляется с помощью эмульсионной ПЦР, где матрицей служат целевые фрагменты ДНК. В других воплощениях стадия амплификации целевых фрагментов А и Б, проводимая в эмульсии клеток, осуществляется с помощью эмульсионной обратной-транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР), где матрицей служат целевые фрагменты РНК.In some embodiments, the step of amplifying the target fragments A and B in an emulsion of cells of the method of the present invention is carried out using emulsion PCR, where the target DNA fragments are the template. In other embodiments, the step of amplifying the target fragments A and B in the cell emulsion is carried out using emulsion reverse transcription-PCR (RT-PCR), where the target RNA fragments are the template.

Для выделения из клеток, изолированных в каплях эмульсии, фракции нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) могут применяться различные технические решения. В некоторых вариантах реализации способа изобретения возможно использование технологии лазерного фотолизиса клеток (М. Не, J.S. Edgar, G.D.М. Jeffries, R.М. Lorenz, J.P. Shelby, D.Т. Chiu, Anal. Chem. 2005, 77, 1539-1544). В других вариантах реализации способа предлагаемого изобретения возможно использование технологии температурного лизиса клеток. Авторами изобретения показано, что при нагревании эмульсии, содержащей живые мононуклеарные клетки периферической крови, до температуры 65°C и инкубации при такой температуре в течение более 30 секунд, например, в течение 2 минут, происходит разрушение клеток внутри капель эмульсии и выход нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) в реакционную среду.Various technical solutions can be used to isolate nucleic acid fractions (DNA / RNA) from cells isolated in emulsion droplets. In some embodiments of the method of the invention, it is possible to use the technology of laser photolysis of cells (M. He, JS Edgar, GDM. Jeffries, R. M. Lorenz, JP Shelby, D. T. Chiu, Anal. Chem. 2005, 77, 1539- 1544). In other embodiments of the method of the invention, it is possible to use the technology of thermal lysis of cells. The inventors have shown that when the emulsion containing live peripheral blood mononuclear cells is heated to a temperature of 65 ° C and incubated at this temperature for more than 30 seconds, for example, for 2 minutes, the cells are destroyed inside the emulsion droplets and the nucleic acids exit ( DNA / RNA) into the reaction medium.

Во варианте реализации предлагаемого изобретения, в котором в качестве матрицы для синтеза целевых фрагментов используется РНК, стадия (б) настоящего способа начинается с процесса обратной транскрипции. Обратная транскрипция представляет собой синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК и обеспечивает переход от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам кДНК.In an embodiment of the invention, in which RNA is used as a template for the synthesis of target fragments, stage (b) of the present method begins with a reverse transcription process. Reverse transcription is a synthesis of single-stranded cDNA on an RNA matrix and provides a transition from unstable RNA molecules to more stable cDNA molecules.

В этом случае, в преимущественном варианте воплощения предлагаемого изобретения, в составе реакционной смеси на стадии (б) настоящего способа должен присутствовать ингибитор РНКаз, например ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.In this case, in an advantageous embodiment of the invention, the RNAse inhibitor, for example, an RNAsin inhibitor of placental or recombinant origin or a vanadyl riboside complex, a non-specific broad-spectrum RNAse inhibitor, should be present in the reaction mixture in step (b) of the present method.

Синтез первой цепи кДНК на матрице РНК происходит при участии фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Для проведения реакции обратной транскрипции могут использоваться различные коммерчески доступные препараты термостабильных обратных транскриптаз, способных сохранять свою активность после инкубации реакционной смеси при 65°C в течение 2 минут, например, обратная транскриптаза MMLV (Евроген) или SuperScript III (Invitrogen).The synthesis of the first cDNA strand on the RNA matrix occurs with the participation of the enzyme RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase). For the reverse transcription reaction, various commercially available thermostable reverse transcriptase preparations can be used, which can retain their activity after incubating the reaction mixture at 65 ° C for 2 minutes, for example, reverse transcriptase MMLV (Eurogen) or SuperScript III (Invitrogen).

Амплификация целевых фрагментов А и Б на матрице ДНК или кДНК происходит при участии фермента - ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. Для проведения амплификации могут использоваться различные коммерчески доступные препараты термостабильных ДНК-полимераз, например полимераза Encyclo (Евроген). Для амплификации кДНК, ключевым свойством используемой ДНК-полимеразы является способность работать в одном и том же буфере с обратной транскриптазой, так как реакция происходит в пределах эмульсии, не оставляя возможности для замены реакционного буфера.Amplification of target fragments A and B on a DNA or cDNA template occurs with the participation of an enzyme, a DNA-dependent DNA polymerase. For the amplification, various commercially available thermostable DNA polymerase preparations can be used, for example, Encyclo polymerase (Eurogen). For the amplification of cDNA, a key property of the DNA polymerase used is the ability to work in the same reverse transcriptase buffer, since the reaction takes place within the emulsion, leaving no room for replacing the reaction buffer.

Для проведения амплификации целевых фрагментов А и Б на матрице ДНК или кДНК на стадии (б) настоящего способа необходимо присутствие в составе реакционной смеси по крайней мере двух пар специфических праймеров (прямого и обратного) - для амплификации фрагмента «А» (праймеры «а») и для амплификации фрагмента «Б» (праймеры «б»).In order to amplify target fragments A and B on a DNA or cDNA template in stage (b) of the present method, it is necessary to have at least two pairs of specific primers (direct and reverse) in the reaction mixture — to amplify fragment “A” (primers “a” ) and for amplification of fragment “B” (primers “b”).

Праймеры - синтетические олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента и ориентированные таким образом, что достраивание новой цепи ДНК проходит только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического фрагмента ДНК или кДНК.Primers are synthetic oligonucleotides that are complementary to the DNA sequences on the left and right borders of the amplified fragment and are oriented in such a way that the completion of a new DNA chain passes only between them. As a result of PCR, a multiple increase in the number of copies (amplification) of a specific DNA or cDNA fragment occurs.

Один из пары праймеров обозначается термином «прямой», а второй - «обратный». Для нужд настоящего изобретения термином «прямой праймер» обозначен праймер, который повторяет последовательность кодирующей цепи ДНК, а термином «обратный праймер» - праймер, который комплементарен кодирующей цепи. Как здесь используется «кодирующая цепь ДНК» обозначает цепь идентичную мРНК, а комплементарная ей цепь используется как матрица при транскрипции.One of the pair of primers is designated by the term “direct”, and the second by “reverse”. For the needs of the present invention, the term “forward primer” refers to a primer that repeats the sequence of the DNA coding chain, and the term “reverse primer” refers to a primer that is complementary to the coding chain. As used herein, the “DNA coding strand" refers to a strand identical to mRNA, and its complementary strand is used as a template for transcription.

В варианте реализации предлагаемого изобретения, в котором в качестве матрицы для синтеза целевых фрагментов используется РНК, два обратных праймера, кроме того, служат для затравки синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК. Два прямых праймера служат для ПЦР-амплификации целевых фрагментов А и Б.In an embodiment of the invention, in which RNA is used as a template for the synthesis of target fragments, two reverse primers also serve to seed the synthesis of the first cDNA strand on the RNA matrix. Two direct primers serve for PCR amplification of target fragments A and B.

Оптимальные концентрации праймеров в реакционной смеси варьируют в пределах 0.1-1 мкМ, как правило, в пределах 0.2-0.5 мкМ.The optimal concentration of primers in the reaction mixture varies between 0.1-1 μM, as a rule, between 0.2-0.5 μM.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых проводится идентификация нескольких пар фрагментов нуклеиновых кислот, присутствующих в одних и тех же живых клетках, на стадии (б) предлагаемого способа используются смеси прямых и обратных праймеров, специфичных к парам исследуемых целевых фрагментов.In embodiments of the present invention, in which identification of several pairs of nucleic acid fragments present in the same living cells is carried out, at the stage (b) of the proposed method, mixtures of forward and reverse primers specific to the pairs of target fragments under study are used.

Помимо нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) - матриц для синтеза целевых фрагментов А и Б, ферментов, осуществляющих этот синтез (обратной транскриптазы, ДНК-полимеразы) и праймеров в состав реакционной смеси заявленного способа вводят следующие компоненты:In addition to nucleic acids (DNA / RNA) - matrices for the synthesis of target fragments A and B, enzymes performing this synthesis (reverse transcriptase, DNA polymerase) and primers, the following components are introduced into the reaction mixture of the claimed method:

- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Концентрация dNTP может варьировать от 0.2 мМ до 0.6 мМ для каждого dNTP, причем все четыре dNTPs должны использоваться в эквивалентных концентрациях для минимизации ошибок присоединения. В предпочтительном варианте реализации изобретения используется концентрация dNTP 0.6 мМ.- a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). The concentration of dNTPs can vary from 0.2 mM to 0.6 mM for each dNTP, with all four dNTPs being used in equivalent concentrations to minimize attachment errors. In a preferred embodiment, a dNTP concentration of 0.6 mM is used.

- реакционный буферный раствор, в котором используемые ферменты сохраняют функциональность. Состав буферного раствора зависит от того, какие именно ферменты используются для ПЦР или ОТ-ПЦР.- a reaction buffer solution in which the enzymes used retain their functionality. The composition of the buffer solution depends on which enzymes are used for PCR or RT-PCR.

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что фермент может функционировать для указанного испытания или задачи. Например, термин "функциональный", используемый для описания ДНК полимеразы означает, что она способна осуществлять синтез на подходящей ДНК или РНК-матрице.As used here, the term "functional" means that the enzyme can function for the specified test or task. For example, the term "functional" used to describe DNA polymerase means that it is capable of synthesizing on a suitable DNA or RNA template.

Реакция амплификации целевых фрагментов А и Б проводится с использованием специализированного оборудования - амплификаторов, согласно температурному режиму, показанному в таблице 1.The amplification reaction of target fragments A and B is carried out using specialized equipment - amplifiers, according to the temperature regime shown in table 1.

Стадия обратной транскрипции присутствует в программе амплификации только в тех вариантах реализации способа, в которых в качестве матрицы для синтеза целевых фрагментов А и Б служит РНК.The stage of reverse transcription is present in the amplification program only in those versions of the method in which RNA serves as the template for the synthesis of target fragments A and B.

Температура Tm стадии отжига зависит от структуры праймеров и обычно варьирует в пределах от 50°C до 72°C.The temperature Tm of the annealing step depends on the structure of the primers and usually ranges from 50 ° C to 72 ° C.

Для амплификации целевых фрагментов А и Б в эмульсии, как правило, необходимо не менее 15 циклов, однако в некоторых приложениях настоящего изобретения их число может быть и меньше.To amplify the target fragments A and B in an emulsion, as a rule, at least 15 cycles are necessary, however, in some applications of the present invention, their number may be less.

Для амплификации целевых фрагментов А и Б в эмульсии не рекомендуется проводить более 30 циклов, так как многократный нагрев и охлаждение эмульсии снижают ее стабильность.For amplification of target fragments A and B in the emulsion, it is not recommended to conduct more than 30 cycles, since repeated heating and cooling of the emulsion reduces its stability.

Оптимальные условия амплификации (температура, время инкубации и количество циклов ПЦР) могут варьировать в зависимости от характеристик амплификатора, объема амплифицируемой реакционной смеси, структуры праймеров.Optimal amplification conditions (temperature, incubation time and the number of PCR cycles) can vary depending on the characteristics of the amplifier, the volume of the amplified reaction mixture, and the structure of the primers.

В) Физическое спаривание целевых амплифицированных фрагментов А с целевыми амплифицированными фрагментами Б, находящимися в одной капле.C) Physical pairing of target amplified fragments A with target amplified fragments B in one drop.

Указанный в настоящем изобретении способ идентификации производится с помощью физического спаривания амплифицированных на стадии (б) фрагментов ДНК или РНК. В предпочтительном варианте реализации способа спаривание производится с помощью технологии перекрывания-удлинения (Но S.N., et al., 1989, Gene, 77, 51-59) в пределах каждой капли эмульсии.The identification method specified in the present invention is performed by physical pairing of DNA or RNA fragments amplified in step (b). In a preferred embodiment of the method, pairing is performed using overlap-extension technology (Ho S.N., et al., 1989, Gene, 77, 51-59) within each drop of emulsion.

В данном варианте осуществления спаривания обеспечивается спаривание лишь тех продуктов амплификации фрагментов ДНК или РНК, которые присутствуют в одной и той же капле.In this embodiment, pairing provides pairing only those amplification products of DNA or RNA fragments that are present in the same drop.

В данном варианте осуществления спаривания процесс амплификации целевых фрагментов ДНК или РНК и процесс перекрывания-удлинения амплифицированных целевых фрагментов происходят одновременно и в одном и том же объеме.In this mating embodiment, the amplification process of the target DNA or RNA fragments and the overlap-extension process of the amplified target fragments occur simultaneously and in the same volume.

В данном варианте осуществления спаривания путем перекрывания-удлинения амплифицированных целевых фрагментов используются те же праймеры, что и для процесса амплификации целевых фрагментов ДНК или РНК.In this embodiment, the mating by overlapping-elongation of the amplified target fragments uses the same primers as for the amplification process of the target DNA or RNA fragments.

Для обеспечения перекрывания в последовательности праймеров вводят дополнительные последовательности, так называемые «перекрывающиеся хвосты», как показано на схеме (Фиг. 2).To ensure overlap in the sequence of primers, additional sequences are introduced, the so-called "overlapping tails", as shown in the diagram (Fig. 2).

В одном из вариантов способа настоящего изобретения «перекрывающиеся хвосты» для реакции перекрывания-удлинения вводят в прямые праймеры, специфические для фрагментов «А» и «Б». 5′-концевые участки двух прямых праймеров, предназначенных для спаривания целевых фрагментов А и Б, представляют собой взаимокомплементарные последовательности. В этом случае два обратных праймера (один, специфический для фрагмента «А», а второй - для фрагмента «Б») используются для ПЦР-амплификации фрагментов А и Б и последующей ПЦР-амплификации спаренных цепей А-Б. При старте с кДНК, те же два обратных праймера могут служить для затравки синтеза кДНК.In one embodiment of the method of the present invention, “overlapping tails” for overlapping-extension reactions are introduced into direct primers specific for fragments “A” and “B”. The 5′-terminal regions of two direct primers designed for pairing of target fragments A and B are mutually complementary sequences. In this case, two reverse primers (one specific for fragment “A” and the second for fragment “B”) are used for PCR amplification of fragments A and B and subsequent PCR amplification of paired chains A-B. When starting with cDNA, the same two reverse primers can serve to seed cDNA synthesis.

В другом варианте реализации способа изобретения «перекрывающиеся хвосты» вводят в обратные праймеры. Обратные праймеры также могут использоваться для амплификации фрагментов. Обратные праймеры также могут выполнять функцию затравки синтеза кДНК. В этом варианте реализации способа изобретения, два прямых праймера (один, специфический для фрагмента «А», а второй - для фрагмента «Б») используются только для ПЦР-амплификации фрагментов А и Б и последующей ПЦР-амплификации спаренных цепей А-Б.In another embodiment of the inventive method, “overlapping tails” are introduced into the reverse primers. Reverse primers can also be used to amplify fragments. Reverse primers can also serve as a seed primer for cDNA synthesis. In this embodiment of the method of the invention, two direct primers (one specific for fragment “A” and the second for fragment “B”) are used only for PCR amplification of fragments A and B and subsequent PCR amplification of paired chains A-B.

В третьем варианте реализации способа изобретения «перекрывающиеся хвосты» вводят в прямой праймер «а» и обратный праймер «б». В этом случае для ПЦР-амплификации фрагментов А и Б и последующей ПЦР-амплификации спаренных цепей А-Б используют обратный праймер «а» и прямой праймер «б».In a third embodiment of the method of the invention, “overlapping tails” are introduced into the forward primer “a” and the reverse primer “b”. In this case, the reverse primer “a” and the forward primer “b” are used for PCR amplification of fragments A and B and subsequent PCR amplification of paired chains A-B.

В четвертом варианте реализации способа изобретения «перекрывающиеся хвосты» вводят в адаптер, на который обратная транскриптаза переходит после синтеза кДНК по технологии синтеза кДНК со сменой матрицы (Template switching cDNA synthesis approach, Matz, M., et al., Nucleic Acids Res. 1999. 27:1558-1560.).In a fourth embodiment of the method of the invention, “overlapping tails” are inserted into an adapter, to which reverse transcriptase is transferred after cDNA synthesis using cDNA synthesis technology with matrix change (Template switching cDNA synthesis approach, Matz, M., et al., Nucleic Acids Res. 1999 . 27: 1558-1560.).

Длина последовательности для перекрывания-удлинения может варьировать от 8 до 75 нуклеотидов, однако в предпочтительном варианте реализации способа изобретения составляет 15-28 нуклеотидов. Использование более длинных 5′-концевых последовательностей для перекрывания с одной стороны может повысить эффективность спаривания целевых фрагментов, с другой стороны - снизить эффективность связывания с целевыми фрагментами 3′-концевого участка праймера. Использование слишком коротких 5′-концевых последовательностей для перекрывания может привести к преобладанию процесса амплификации целевых фрагментов над процессом их спаривания. При разработке структуры последовательности для перекрывания следует учитывать способность Taq-полимеразы нематрично добавлять дополнительный аденозин (dATP) к 3′-концу вновь синтезированной молекулы ДНК. Кроме того, необходимо принимать во внимание общие правила создания праймеров для ПЦР: праймеры с последовательностью для перекрывания не должны образовывать шпилек, димеров, иметь сайтов для неспецифического отжига.The length of the sequence for overlapping-extension may vary from 8 to 75 nucleotides, however, in a preferred embodiment of the method of the invention is 15-28 nucleotides. The use of longer 5'-terminal sequences for overlapping on the one hand can increase the efficiency of pairing of target fragments, on the other hand, reduce the efficiency of binding to target fragments of the 3'-terminal portion of the primer. Using too short 5′-terminal sequences for overlapping can lead to a predominance of the amplification process of target fragments over the process of their pairing. When developing the sequence structure for overlapping, one should take into account the ability of Taq polymerase to add an additional adenosine (dATP) to the 3′-end of the newly synthesized DNA molecule unmatched. In addition, it is necessary to take into account the general rules for creating primers for PCR: primers with a sequence for overlapping should not form hairpins, dimers, and have sites for non-specific annealing.

В предпочтительном варианте реализации изобретения концентрация праймеров с участком для перекрывания-удлинения должна быть ниже концентрации праймеров, использующихся только для ПЦР-амплификации целевых фрагментов А и Б. Суммарная концентрация олигонуклеотидов в реакции перекрывания-удлинения может достигать 1-2 мкМ и более. В случае, когда целевой фрагмент А амплифицируется с меньшей эффективностью, чем целевой фрагмент Б, выровнять эффективности амплификации можно, увеличив концентрацию прямого и обратного праймеров «а» или снизив концентрацию прямого и обратного праймеров «б». Например, концентрация праймера может быть повышена до 5 мкМ или снижена до 0.03 мкМ. Оптимальные концентрации каждого праймера находятся в диапазоне 0.1-0.5 мкМ.In a preferred embodiment of the invention, the concentration of primers with a section for overlapping-extension should be lower than the concentration of primers used only for PCR amplification of target fragments A and B. The total concentration of oligonucleotides in the overlapping-extension reaction can reach 1-2 μM or more. In the case when the target fragment A is amplified with lower efficiency than the target fragment B, the amplification efficiency can be equalized by increasing the concentration of the forward and reverse primers “a” or by reducing the concentration of the forward and reverse primers “b”. For example, the concentration of the primer can be increased to 5 μM or reduced to 0.03 μM. The optimal concentrations of each primer are in the range of 0.1-0.5 μM.

В другом варианте указанное спаривание может быть осуществлено с помощью лигирования. В другом варианте настоящего изобретения спаренные молекулы могут быть получены посредством амплификации на бусинах. В еще одном варианте изобретения пары молекул могут быть получены рекомбинацией.In another embodiment, the specified pairing can be carried out using ligation. In another embodiment of the present invention, paired molecules can be obtained by amplification on beads. In yet another embodiment of the invention, pairs of molecules can be obtained by recombination.

Стадия 2. Внеэмульсионная ПЦР-амплификацию спаренных целевых фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих спаривание фрагментов, ранее не спаренных в одной капле в эмульсии на стадии.Stage 2. Non-emulsion PCR amplification of paired target fragments in the presence of oligonucleotides that block the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion at the stage.

(Г) Выделение фракции нуклеиновых кислот, содержащих спаренные фрагменты, из эмульсии(D) Isolation of the fraction of nucleic acids containing paired fragments from the emulsion

Для осуществления предлагаемого способа изобретения после окончания эмульсионной ПЦР/ОТ-ПЦР и физического спаривания фрагментов А и Б необходимо провести выделение из эмульсии продукта реакции, содержащего спаренные целевые молекулы А-Б.To implement the proposed method of the invention, after the completion of emulsion PCR / RT-PCR and physical pairing of fragments A and B, it is necessary to isolate from the emulsion a reaction product containing paired target molecules AB.

Это может быть осуществлено многими способами разбиения эмульсии «вода в масле», включая использование коагулирующих агентов. Одним из подходов является использование в качестве коагулирующих агентов неорганических соединений - KCl, NaCl, AlCl₃, FeCl₃, Al₂(SO₄)₃, Fe₂(SO₄)₃ (Japanese Unexamined Patent Publication No. 54-156268, No. 50-116369, No. 46-49899, No. 46-33131).This can be accomplished in many ways of breaking the water-in-oil emulsion, including the use of coagulating agents. One approach is to use inorganic compounds as coagulating agents - KCl, NaCl, AlCl ₃ , FeCl ₃ , Al ₂ (SO ₄ ) ₃ , Fe ₂ (SO ₄ ) ₃ (Japanese Unexamined Patent Publication No. 54-156268, No. 50-116369, No. 46-49899, No. 46-33131).

Другим подходом является использование в качестве коагулирующих агентов органических растворителей - водонасыщенного диэтилового эфира, этилацетата (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550).Another approach is the use of organic solvents as coagulating agents - water-saturated diethyl ether, ethyl acetate (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550).

В еще одном варианте разбиение эмульсии может осуществляться механически путем фильтрации (Japanese Unexamined Patent Publication No. 53-91462).In yet another embodiment, the breakdown of the emulsion can be carried out mechanically by filtration (Japanese Unexamined Patent Publication No. 53-91462).

В предпочтительном варианте реализации способа изобретения на стадии выделения нуклеиновых кислот из эмульсии для блокировки активности полимеразы в реакцию добавляется хелатирующий агент, например, ЭДТА в концентрации не менее 0.5 мМ, предпочтительно в концентрации 1 мМ и более.In a preferred embodiment of the method of the invention, a chelating agent, for example, EDTA at a concentration of at least 0.5 mM, preferably at a concentration of 1 mM or more, is added to the reaction in the step of isolating nucleic acids from the emulsion to block the polymerase activity.

В предпочтительном варианте реализации способа изобретения продукт эмульсионной ПЦР/ОТ-ПЦР после выделения из эмульсии очищают с использованием любого коммерчески доступного набора для очистки ПЦР-продуктов, например набора PCR CleanUp Kit (Qiagen, США).In a preferred embodiment of the method of the invention, the emulsion PCR / RT-PCR product after isolation from the emulsion is purified using any commercially available kit for the purification of PCR products, for example, the PCR CleanUp Kit (Qiagen, USA).

В одном из вариантов реализации способа изобретения очистке и дальнейшей амплификации подвергается суммарная фракция нуклеиновых кислот, выделенная из эмульсии.In one embodiment of the method of the invention, the total fraction of nucleic acids isolated from the emulsion is subjected to purification and further amplification.

В другом варианте реализации способа изобретения суммарная фракция нуклеиновых кислот, выделенная из эмульсии, разделяется с помощью агарозного гель-электрофореза согласно размеру ампликонов. Очистке и дальнейшей амплификации подвергается лишь та часть суммарного послеэмульсионного ПЦР-продукта, которая соответствует по размеру спаренному ПЦР-продукту А-Б.In another embodiment of the method of the invention, the total fraction of nucleic acids isolated from the emulsion is separated by agarose gel electrophoresis according to the size of the amplicons. Only that part of the total post-emulsion PCR product, which corresponds in size to the paired PCR product AB, is subjected to purification and further amplification.

Д) ПЦР-амплификация целевых спаренных фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих спаривание фрагментов, ранее не спаренных в одной капле в эмульсии в ходе шага (в)E) PCR amplification of the target paired fragments in the presence of oligonucleotides blocking the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion during step (c)

Непосредственный результат эмульсионной ПЦР/ОТ-ПЦР на базе живых клеток представляет собой сложную смесь продуктов ПЦР, в которой присутствуют, но не обязательно доминируют целевые продукты, то есть спаренные в эмульсии продукты перекрывания-удлинения А-Б.The direct result of emulsion PCR / RT-PCR based on living cells is a complex mixture of PCR products in which the target products are present, but not necessarily dominate, that is, products of overlap-extension AB paired in the emulsion.

Для наработки детектируемого количества целевых продуктов перекрывания-удлинения А-Б предлагаемый способ реализации изобретения подразумевает применение вложенной (nested) ПЦР-амплификации (ПЦР с заглубленными праймерами) (Porter-Jordan К., et al. 1990, J Med Virol, 30, 85-91).To produce a detectable amount of target products of overlapping-extension AB, the proposed method for implementing the invention involves the use of nested PCR amplification (PCR with recessed primers) (K. Porter-Jordan, et al. 1990, J Med Virol, 30, 85 -91).

В ходе вложенной ПЦР используют праймеры, амплифицирующие спаренный фрагмент, но расположенные чуть ближе к центру спаренного фрагмента относительно праймеров, фланкировавших спаренный фрагмент в ходе эмульсионной ПЦР. Оптимальные концентрации праймеров, использующихся в ходе вложенной ПЦР, как правило, варьируют от 0.2 до 0.5 мкМ.During nested PCR, primers are used that amplify the paired fragment, but are located slightly closer to the center of the paired fragment relative to the primers flanking the paired fragment during emulsion PCR. Optimum concentrations of primers used during nested PCR typically range from 0.2 to 0.5 μM.

Кроме продукта эмульсионной ПЦР, выступающего в качестве матрицы для вложенной ПЦР, и праймеров в состав реакционной смеси на стадии (д) вводят смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) в концентрации 0.2 мМ каждого из dNTP, фермент, осуществляющий синтез ДНК на матрице ДНК (ДНК-зависимая ДНК-полимераза) и реакционный буферный раствор.In addition to the emulsion PCR product, which acts as a template for the attached PCR, and primers, a mixture of four types of deoxyribonucleotide triphosphates (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) at a concentration of 0.2 mM of each of dNTP is introduced into the reaction mixture in step (e), the synthesis enzyme DNA on a DNA matrix (DNA-dependent DNA polymerase) and reaction buffer solution.

Реакция амплификации проводится с использованием специализированного оборудования - амплификаторов, согласно температурному режиму, указанному в таблице 2.The amplification reaction is carried out using specialized equipment - amplifiers, according to the temperature regime specified in table 2.

После разрушения эмульсии на стадии (г) настоящего способа спаренные в ходе эмульсионной ПЦР/ОТ-ПЦР молекулы А-Б, а также неспаренные одиночные молекулы А и Б, амплифицированные с генетического материала разных клеток, объединяются в одном и том же реакционном объеме. Авторами настоящего изобретения показано, что амплификация спаренных молекул А-Б, образовавшихся в результате перекрывания-удлинения фрагментов А и Б внутри эмульсии (целевой продукт), происходит с той же эффективностью, что и амплификация молекул А-Б, спаривание которых происходит в результате случайного постэмульсионного перекрывания-удлинения фрагментов А и Б в ходе ПЦР на стадии «Д».After the emulsion is destroyed in stage (d) of the present method, AB molecules, paired during emulsion PCR / RT-PCR, as well as unpaired single molecules A and B, amplified from the genetic material of different cells, are combined in the same reaction volume. The authors of the present invention have shown that the amplification of paired AB molecules formed as a result of overlap-extension of fragments A and B inside the emulsion (target product) occurs with the same efficiency as the amplification of AB molecules, pairing of which occurs as a result of random post-emulsion overlap-extension of fragments A and B during PCR at stage "D".

Для селективной блокировки такого случайного перекрывания-удлинения, а также для селективной блокировки мега-праймирования (то есть затравки амплификации спаренного фрагмента с продукта ПЦР неспаренного фрагмента, выступающего в роли праймера) одиночных неспаренных продуктов ПЦР А и Б, амплификация целевых спаренных фрагментов А-Б, выделенных из эмульсии, проводится в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих эти процессы. Авторами изобретения показана возможность подавления нежелательной амплификации при добавлении блокирующих олигонуклеотидов в концентрации более 1.6 мкМ более чем в 100 раз (фиг. 5).For selective blocking of such random overlap-extension, as well as for selective blocking of mega-priming (that is, the seed of amplification of a paired fragment from the PCR product of an unpaired fragment acting as a primer) of single unpaired PCR products A and B, amplification of the target paired fragments A-B isolated from the emulsion is carried out in the presence of oligonucleotides that block these processes. The inventors have shown the possibility of suppressing unwanted amplification by adding blocking oligonucleotides at a concentration of more than 1.6 μM more than 100 times (Fig. 5).

5′-концы блокирующих олигонуклеотидов представлены последовательностями, комплементарными 3′-концам неспаренных одиночных молекул А и Б, и обеспечивают гибридизацию блокирующих олигонуклеотидов с неспаренными фрагментами А и Б, потенциально способными вступить в реакцию случайного перекрывания-удлинения.The 5′-ends of the blocking oligonucleotides are represented by sequences complementary to the 3′-ends of the unpaired single molecules A and B, and provide hybridization of the blocking oligonucleotides with unpaired fragments A and B, potentially capable of entering into a random overlap-extension reaction.

Длина комплементарной последовательности зависит от ее GC состава и должна обеспечивать эффективную гибридизацию блокирующих нуклеотидов на неспаренные фрагменты А и Б при температуре отжига праймера, используемого для ПЦР. Как правило, длина комплементарной последовательности блокирующего олигонуклеотида составляет не менее 12 нуклеотидов, например 18 или 22 нуклеотида или более.The length of the complementary sequence depends on its GC composition and should provide efficient hybridization of blocking nucleotides to unpaired fragments A and B at the annealing temperature of the primer used for PCR. Typically, the length of the complementary sequence of a blocking oligonucleotide is at least 12 nucleotides, for example 18 or 22 nucleotides or more.

3′-концы блокирующих олигонуклеотидов представляют собой некодирующие последовательности и служат матрицей для удлинения неспаренных фрагментов А и Б на несколько несмысловых нуклеотидов. Удлиненные продукты теряют сайт отжига на 3′-конце с парной молекулой (фрагмент А с фрагментом Б и/или фрагмент Б с фрагментом А) и, следовательно, способность вступать в реакцию перекрывания-удлинения. Предлагаемый в данном изобретении способ ПЦР-блокировки проиллюстрирован на фиг. 3.The 3′-ends of the blocking oligonucleotides are non-coding sequences and serve as a template for lengthening unpaired fragments A and B by several non-sense nucleotides. Elongated products lose the annealing site at the 3′-end with a paired molecule (fragment A with fragment B and / or fragment B with fragment A) and, therefore, the ability to enter into an overlap-extension reaction. The PCR blocking method of the invention is illustrated in FIG. 3.

В предлагаемом варианте реализации указанного способа блокировки 3′-концы блокирующих олигонуклеотидов защищены от простраивания терминальным нуклеотидом. В некоторых вариантах реализации способа изобретения в качестве терминального нуклеотида может использоваться дидекзинуклеотидтрифосфат (ddNTP′s). В других вариантах для блокирования простраивания 3′-концов может использоваться фосфатная группа (PO_4-). Наличие терминального нуклеотида предотвращает возможность достраивания блокирующих нуклеотидов в ходе ПЦР.In the proposed embodiment, the implementation of this method of blocking the 3′-ends of the blocking oligonucleotides are protected from splicing by the terminal nucleotide. In some embodiments of the method of the invention, didexinucleotide triphosphate (ddNTP′s) may be used as the terminal nucleotide. In other embodiments, a phosphate group (PO _4- ) may be used to block the construction of the 3 ′ ends. The presence of a terminal nucleotide prevents the possibility of completing blocking nucleotides during PCR.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения длина блокирующей части может быть 1 и более нуклеотидов, преимущественно 2 и более нуклеотидов, или 3 и более нуклеотидов. В преимущественных воплощениях длина блокирующей части составляет не менее 7 нуклеотидов, например 7-25 нуклеотидов.In some embodiments of the present invention, the length of the blocking portion may be 1 or more nucleotides, preferably 2 or more nucleotides, or 3 or more nucleotides. In preferred embodiments, the length of the blocking portion is at least 7 nucleotides, for example 7-25 nucleotides.

Блокирующие олигонуклеотиды добавляют в реакцию в избытке концентрации по сравнению с концентрацией праймеров. Оптимальная концентрация блокирующих олигонуклеотидов в каждом конкретном случае подбирается экспериментально путем титрования. Слишком низкая концентрация не обеспечивает эффективной блокировки нежелательной амплификации. Слишком высокая концентрация дополнительных олигонуклеотидов в реакции приводит к подавлению амплификации целевых фрагментов.Blocking oligonucleotides are added to the reaction in an excess of concentration compared to the concentration of primers. The optimal concentration of blocking oligonucleotides in each case is selected experimentally by titration. Too low a concentration does not effectively block unwanted amplification. Too high a concentration of additional oligonucleotides in the reaction suppresses amplification of the target fragments.

В некоторых воплощениях настоящего изобретения, концентрация блокирующего нуклеотида в реакционной смеси превышает концентрацию праймеров по крайней мере в 2 раза. Однако предпочтительным является использование максимальной возможной концентрации блокирующих олигонуклеотидов, не вызывающей ингибирования амплификации целевых фрагментов. В случае, проиллюстрированном в «Примере 1», такой концентрацией блокирующих олигонуклеотидов является концентрация, превышающая концентрацию праймеров в 32 раза, и составившая 3.2 мкМ.In some embodiments of the present invention, the concentration of the blocking nucleotide in the reaction mixture is at least 2 times the concentration of primers. However, it is preferable to use the maximum possible concentration of blocking oligonucleotides, not causing inhibition of amplification of the target fragments. In the case illustrated in Example 1, such a concentration of blocking oligonucleotides is a concentration that is 32 times higher than the concentration of primers, and is 3.2 μM.

В предпочтительном варианте реализации указанного способа амплификации целевых спаренных фрагментов в присутствии олигонуклеотидов, блокирующих амплификацию неспаренных фрагментов, используют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, лишенную корректирующей активности, например Taq-полимеразу.In a preferred embodiment of the method for amplification of target paired fragments in the presence of oligonucleotides that block the amplification of unpaired fragments, a DNA-dependent DNA polymerase lacking corrective activity, for example Taq polymerase, is used.

Продукт ПЦР, полученный в результате вложенной ПЦР-амплификации с добавлением блокирующих олигонуклеотидов, представляет собой продукт преимущественной амплификации спаренных во время эмульсии целевых фрагментов А-Б.The PCR product obtained by nested PCR amplification with the addition of blocking oligonucleotides is the product of preferential amplification of target AB fragments paired during the emulsion.

Таким образом, новый тип ПЦР-блокировки позволяет устранить фоновую амплификацию, производимую из-за случайных реакций перекрывания-удлинения после эмульсионной ПЦР или эмульсионной ОТ-ПЦР.Thus, a new type of PCR blocking eliminates background amplification due to random overlap-extension reactions after emulsion PCR or emulsion RT-PCR.

Стадия 3. Секвенирование полученных ПЦР-апликоновStage 3. Sequencing of the obtained PCR applicons

Секвенирование полученных ПЦР-апликонов может проводиться любым известными методами и технологиям секвенирования. Предпочтительным вариантом секвенирования является высокопроизводительное секвенирование, например двустороннее секвенирования по технологии Illumina, позволяющее получать сотни тысяч и миллионы парных прочтений для анализируемой библиотеки ПЦР-фрагментов. Секвенирование может проводиться по стандартным протоколам производителя.Sequencing of the obtained PCR applicons can be carried out by any known sequencing methods and techniques. The preferred sequencing option is high-throughput sequencing, for example two-sided sequencing using Illumina technology, which allows hundreds of thousands and millions of paired reads for the analyzed PCR fragment library. Sequencing can be performed according to standard manufacturer protocols.

Способы примененияApplication methods

Метод настоящего изобретения востребован при идентификации уникальных нуклеиновых кислот, присутствующих в одной клетке, в частности для идентификации нативных пар Т клеточных рецепторов и нативных пар тяжелых и легких цепей также антител.The method of the present invention is useful in identifying unique nucleic acids present in one cell, in particular for identifying native pairs of T cell receptors and native pairs of heavy and light chains and antibodies.

Идентификация нативных пар Т клеточных рецепторов необходима для рационального анализа Т клеточных репертуаров при исследовании иммунной системы, а также для непосредственной идентификации специфичных ТКР, в том числе ТКР, специфичных к вирусным и бактериальным пептидам, аутологичным пептидам, пептидам, экспонированным на тех или иных опухолевых клетках. Соответственно, идентификация нативных пар альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов может быть эффективно использована при разработке методов точной диагностики, а также методов высокоспецифичной индивидуальной терапии инфекционных, аутоиммунных, и онкологических заболеваний.Identification of native pairs of T cell receptors is necessary for the rational analysis of T cell repertoires in the study of the immune system, as well as for the direct identification of specific TCRs, including TCRs specific for viral and bacterial peptides, autologous peptides, peptides exposed to particular tumor cells . Accordingly, the identification of native pairs of alpha and beta chains of T-cell receptors can be effectively used in the development of accurate diagnostic methods, as well as methods for highly specific individual therapy of infectious, autoimmune, and oncological diseases.

Идентификация нативных пар тяжелых и легких цепей антител необходима для рационального исследования адаптивного иммунитета в норме и патологии. Кроме того, идентификация нативных пар тяжелых и легких цепей антител необходима при разработке моноклональных терапевтических антител высокой специфичности, которые с каждым годом все активнее используются для лечения самых различных заболеваний.Identification of native pairs of heavy and light chains of antibodies is necessary for a rational study of adaptive immunity in normal and pathological conditions. In addition, the identification of native pairs of heavy and light chains of antibodies is necessary when developing monoclonal therapeutic antibodies of high specificity, which are increasingly used every year to treat a wide variety of diseases.

Следующий пример предлагается в качестве иллюстративного, но не ограничивающего.The following example is offered as illustrative, but not limiting.

ПримерыExamples

Пример 1. Выявление нативных пар альфа- и бета-цепей ТКР для мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) из образца человеческой донорской крови.Example 1. Identification of native pairs of TCR alpha and beta chains for peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a sample of human donor blood.

Данный пример иллюстрирует применение предлагаемого способа для выявления нативных пар ТКР, для спектра 16 вариантов V-сегментов альфа-цепей (TRAV4, 8, 12, 13, 14, 21, 22, 24, 25, 26-1, 26-2, 27, 29, 38, 39, 41) и 1 семейства бета-цепей (TRBV7) ТКР для МКПК образца человеческой донорской крови.This example illustrates the application of the proposed method for detecting native TCR pairs for a spectrum of 16 variants of V-segments of alpha chains (TRAV4, 8, 12, 13, 14, 21, 22, 24, 25, 26-1, 26-2, 27 , 29, 38, 39, 41) and 1 TCR beta chain family (TRBV7) for the PBMC sample of human donor blood.

Эксперимент включал следующие этапы:The experiment included the following steps:

- выделение клеток МКПК и помещение их эмульсию,- the selection of cells MCPC and placing their emulsion,

- эмульсионная ОТ-ПЦР,- emulsion RT-PCR,

- пост-эмульсионная ПЦР с вложенными праймерами, с эффектом ПЦР-блокировки неспаренных фрагментов,- post-emulsion PCR with embedded primers, with the effect of PCR blocking of unpaired fragments,

- массированное секвенирование полученной библиотеки спаренных фрагментов и анализ полученных данных,- massive sequencing of the obtained library of paired fragments and analysis of the obtained data,

- подтверждение верности идентифицированных пар с использованием сортировки антиген-специфичных клеток и секвенирования полученных библиотек альфа- и бета-цепей генов ТКР.- confirmation of the fidelity of identified pairs using sorting of antigen-specific cells and sequencing of the obtained libraries of alpha and beta chains of TCR genes.

Выделение МКПК и помещение их эмульсиюIsolation of MCPC and placing their emulsion

МКПК были выделены из образца периферической крови 45-летнего мужчины (с информированного согласия) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографин (Paneco). 1×10⁶ живых МКПК предварительно инкубировали в течение ночи с 10 Ед/мл IL2 (Roche) и использовали для каждой из 8 эмульсионных и 2 контрольных реакций. Эмульсии были получены согласно описанию (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550) при температуре 25, из 900 мкл смеси масло-сурфактант (2% ABIL EM 90 и 0,05% Тритон Х-100 в минеральном масле) и 100 мкл водной фазы, содержавшей МКПК в 10 мкл 150 мМ NaCl, 7,5 UE полимеразы Encyclo (Евроген, Россия), 5 мкл 10х буфера для полимеразы Encyclo, 5 UE обратной транскриптазы MMLV (Евроген), 3,5 мМ MgCl₂, 1,4 мМ DTT, 0,5 г/л BSA, 30 UE RNAsin (Promega, США), 2,4 мМ смесь dNTP, и олигонуклеотиды: BC_R4_s (0,2 мкм), AC_R2_s (0,2 мкм), Z_BV7 (0,2 мкм), смесь из 12 праймеров TRBA: Z_AV14_BV_s, Z_AV26-1/4_BV_s, Z_AV26-2/4_BV_s, Z_AV39/24_BV_s, AV38_2_Z, AV13_2_Z, AV25_2_Z, Z_AV41/22_BV, Z_AV8_BV, Z_AV29/23_BV, Z_AV12S3_BV, AV27_BV_l (0,02 мкМ каждого), и Z_BV_CompRev (0,2 мкм). Все олигонуклеотиды, использованные на этом этапе исследования, а также их функции приведены в Таблице 3.MCPCs were isolated from a peripheral blood sample of a 45-year-old man (with informed consent) by density gradient centrifugation of ficoll-urographin (Paneco). 1 × 10 ⁶ live MCPCs were preincubated overnight with 10 U / ml IL2 (Roche) and used for each of 8 emulsion and 2 control reactions. Emulsions were prepared as described (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550) at a temperature of 25, from 900 μl of a mixture of oil-surfactant (2% ABIL EM 90 and 0.05% Triton X- 100 in mineral oil) and 100 μl of the aqueous phase containing MCPC in 10 μl of 150 mM NaCl, 7.5 UE Encyclo polymerase (Eurogen, Russia), 5 μl of 10x Encyclo polymerase buffer, 5 UE reverse transcriptase MMLV (Eurogen), 3 , 5 mM MgCl _2, 1.4 mM DTT, 0,5 g / l BSA, 30 UE RNAsin (Promega, USA), 2.4 mM mixture of dNTP, and oligonucleotides: BC_R4_s (0,2 micron), AC_R2_s (0 , 2 μm), Z_BV7 (0.2 μm), a mixture of 12 TRBA primers: Z_AV14_BV_s, Z_AV26-1 / 4_BV_s, Z_AV26-2 / 4_BV_s, Z_AV39 / 24_BV_s, AV38_2_Z, AV13_2_Z, AV25_2_Z, Z_AV_41_V_V_41, ZB_41_V_41_V_V_41, AV__V_41, ZB_41_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V_V, / 23_BV, Z_AV12S3_BV, AV 27_BV_l (0.02 μM each), and Z_BV_CompRev (0.2 μm). All oligonucleotides used at this stage of the study, as well as their functions are shown in Table 3.

Эмульсионная ОТ-ПЦРEmulsion RT-PCR

Содержащая клетки эмульсия была прогрета в течение 2 мин при температуре 65°C для разрушения МКПК и высвобождения РНК в реакционный объем.The emulsion containing the cells was heated for 2 min at a temperature of 65 ° C to destroy MCPC and release RNA into the reaction volume.

Для проведения дальнейших реакций, показанных на Фиг. 2, был использован следующий температурный режим: 30 мин инкубации при 50°C для специфичного отжига праймеров на РНК и синтеза кДНК, 27 циклов для ПЦР-амплификации и перекрывания-удлинения: 94°C 10 сек, 53°C 10 сек, 72°C 20 сек.For the further reactions shown in FIG. 2, the following temperature regime was used: 30 min incubation at 50 ° C for specific annealing of primers on RNA and cDNA synthesis, 27 cycles for PCR amplification and overlap elongation: 94 ° C 10 sec, 53 ° C 10 sec, 72 ° C 20 sec.

Для блокировки активности полимеразы, сразу после амплификации в эмульсии в реакцию был добавлен ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ. Продукт реакции был экстрагирован из эмульсии согласно описанию с помощью диэтилового эфира/этилацетата/диэтилового эфира (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550) и очищен с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Qiagen).To block the activity of polymerase, immediately after amplification in the emulsion, EDTA was added to the reaction to a final concentration of 1 mM. The reaction product was extracted from the emulsion as described with diethyl ether / ethyl acetate / diethyl ether (Williams R., et al., 2006, Nat Methods, 3, 545-550) and purified using a PCR purification kit (Qiagen) .

Пост-эмульсионная ПЦР со вложенными праймерами, с эффектом ПЦР-блокировки неспаренных фрагментовPost-emulsion PCR with embedded primers, with the effect of PCR blocking of unpaired fragments

Вся полученная в эмульсии ДНК амплифицировалась с помощью двух последовательных вложенных ПЦР с углубленными праймерами, специфичными для константных участков генов альфа- и бета-цепей ТКР (Таблица 4) с использованием метода ПЦР-блокировки, предусмотренного в данном изобретении, чтобы блокировать амплификацию неспаренных во время эмульсии фрагментов генов альфа- и бета-цепей ТКР, как показано на Фиг. 3.All DNA obtained in the emulsion was amplified using two consecutive inserted PCR with in-depth primers specific for the constant regions of the TCR alpha and beta chain genes (Table 4) using the PCR blocking method provided in this invention to block unpaired amplification during emulsions of fragments of TCR alpha and beta chain genes, as shown in FIG. 3.

Состав первой постэмульсионной ПЦР: 5 UE Taq полимеразы (Евроген), 2.5 мкл 10х буфера для Taq полимеразы (Евроген), 2,4 мМ смесь dNTP, и олигонуклеотиды: BC_R5_l (0,2 мкм), AC_R3_l (0,2 мкм), Z_BV_block (3,2 мкм), Z-AV-block (3,2 мкм). Объем реакции составлял 25 мкл. Амплификация проводилась при следующем температурном режиме:Composition of the first post-emulsion PCR: 5 UE Taq polymerase (Eurogen), 2.5 μl of 10x Taq polymerase buffer (Eurogen), 2.4 mM dNTP mixture, and oligonucleotides: BC_R5_l (0.2 μm), AC_R3_l (0.2 μm), Z_BV_block (3.2 μm), Z-AV-block (3.2 μm). The reaction volume was 25 μl. Amplification was carried out at the following temperature conditions:

- предварительная денатурация ДНК 95С - 1 мин 30 сек,- preliminary denaturation of DNA 95C - 1 min 30 sec,

- 15 циклов (денатурация 95С - 10 сек, отжиг 62С - 10 сек, элонгация 72С - 20 сек).- 15 cycles (denaturation 95С - 10 sec, annealing 62С - 10 sec, elongation 72С - 20 sec).

Продукт первой постэмульсионной ПЦР разводили в 25 раз и проводили вторую постэмульсионную амплификацию. Состав второй постэмульсионной ПЦР: 5 UE Taq полимеразы (Евроген), 2.5 мкл 10х буфера для Taq полимеразы (Евроген), 2,4 мМ смесь dNTP, и олигонуклеотиды: acj1-indN (0,2 мкм), bcj1-indN (0,2 мкм), bcj2-indN (0,2 мкм). Объем реакции составлял 25 мкл. Амплификация проводилась при следующем температурном режиме:The product of the first post-emulsion PCR was diluted 25 times and a second post-emulsion amplification was performed. Composition of the second post-emulsion PCR: 5 UE Taq polymerase (Eurogen), 2.5 μl of 10x Taq polymerase buffer (Eurogen), 2.4 mM dNTP mixture, and oligonucleotides: acj1-indN (0.2 μm), bcj1-indN (0, 2 μm), bcj2-indN (0.2 μm). The reaction volume was 25 μl. Amplification was carried out at the following temperature conditions:

Последовательности олигонуклеотидов, использованных на данном этапе исследования представлены в Таблице 4.The sequences of oligonucleotides used at this stage of the study are presented in Table 4.

Массированное секвенирование полученной библиотеки спаренных фрагментов и анализ полученных данныхMassive sequencing of the resulting library of paired fragments and analysis of the data

Полученная библиотека ДНК-фрагментов была просеквенирована на секвенаторе нового поколения MiSeq, длина чтения 150 нуклеотидов с каждой стороны.The resulting library of DNA fragments was sequenced on a new generation sequencer MiSeq, reading length 150 nucleotides on each side.

Чтобы извлечь сиквенсы фрагментов альфа- и бета-цепей ТКР и исправить ошибки ПЦР, которые приводят к большему разнообразию последовательностей и к искусственному увеличению вариантов прочтений, сырые данные секвенирования Ilumina были проанализированы согласно описанию (Bolotin D.A., et al., 2012 Eur J Immunol. 42(11), 3073-83).In order to extract sequences of fragments of TK alpha and beta chains and to correct PCR errors that lead to a greater variety of sequences and to artificially increase reading options, raw Ilumina sequencing data was analyzed as described (Bolotin DA, et al., 2012 Eur J Immunol. 42 (11), 3073-83).

Чтобы свести к минимуму шум от случайных событий, таких как выход из-под ПЦР-блокировки, перекрывание-удлинение недостроенных продуктов ПЦР в процессе амплификации библиотеки, и амплификации между группами клонов на чипе ("cross-bridge" амплификация на уровне секвенирования Illumina), мы отбросили пары с незначительным количеством прочтений последовательности (менее 0,05% от общего числа прочтений в каждой выборке). В целом после такой обработки осталось 664 пары.In order to minimize noise from random events, such as getting out from under PCR blocking, overlapping-lengthening of unfinished PCR products during library amplification, and amplification between groups of clones on a chip ("cross-bridge" amplification at the Illumina sequencing level), we discarded pairs with a small number of readings in the sequence (less than 0.05% of the total number of readings in each sample). In total, after such processing, 664 pairs remained.

Дальнейший анализ показал, что в эмульсионной реакции было выборочно увеличено некоторое количество пар CDR3 за счет специфичного спаривания, в отличие от контрольной реакции, где встречаемость пар почти равнялась ожидаемому количеству случайных спариваний в соответствии с частотой встречаемости.Further analysis showed that in the emulsion reaction a certain number of CDR3 pairs was selectively increased due to specific pairing, in contrast to the control reaction, where the occurrence of pairs was almost equal to the expected number of random pairings in accordance with the frequency of occurrence.

Альфа-бета пары ТКР CDR3, которыми были наиболее значительно и селективно обогащена каждая эмульсионная реакция, были идентифицированы на основании количества их прочтений.Alpha-beta pairs of TCR CDR3, which each emulsion reaction was most significantly and selectively enriched in, were identified based on the number of readings.

425 (64%) из наблюдаемых пар были значительно (p-значение менее 0,01) и селективно амплифицированы в эмульсии по сравнению с контрольной реакцией и были получены для последующего анализа.425 (64%) of the observed pairs were significantly (p-value less than 0.01) and selectively amplified in emulsion compared to the control reaction and were obtained for subsequent analysis.

Для того чтобы исключить случайные события, которые могут произойти в результате попадания во время эмульгирования в одну каплю двух различных Т-клеток или, в редких случаях, в результате слияния капель, содержащих клетки, мы считали достоверными только пары, идентифицированные, по крайней мере, в двух различных эмульсиях. Этот строгий критерий отсеял наивные Т-клетки и мало представленные клоны Т-клеток и, следовательно, большинство выявленных пар (большей частью, вероятно, правильных) были потеряны на данном этапе. Тем не менее, мы считаем этот отсев необходимым для получения однозначной информации, так как он обеспечивает независимое подтверждение для каждой идентифицированной пары.In order to exclude accidental events that can occur as a result of two different T-cells falling into one drop during emulsification or, in rare cases, as a result of the fusion of drops containing cells, we considered only pairs identified at least as reliable in two different emulsions. This strict criterion eliminated naive T cells and poorly represented clones of T cells and, therefore, most of the identified pairs (mostly, probably correct) were lost at this stage. Nevertheless, we consider this screening necessary to obtain unambiguous information, as it provides independent confirmation for each identified pair.

В результате всем критериям соответствовали 30 альфа/бета пар ТКР (Фиг. 6, Табл. 5).As a result, 30 alpha / beta TCR pairs met all criteria (Fig. 6, Table 5).

Подтверждение верности идентифицированных пар с использованием сортировки антиген-специфичных клеток и секвенирования полученных библиотек альфа- и бета-цепей генов ТКР.Validation of identified pairs using sorting of antigen-specific cells and sequencing of the obtained libraries of alpha and beta chains of TCR genes.

Для подтверждения правильности спаривания цепей ТКР, мы отсортировали субпопуляцию клонов CD8+ Т-клеток того же пациента, специфичных к NLV-пептиду цитомегаловируса, с помощью метода проточной сортировки клеток. С этой целью МКПК выделяли из образцов периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографин (Paneco), инкубировали с CD8-специфичными антителами (клон ЕТК 182,20, Abcam), CD4-специфичными антителами (клон S3.5, Invitrogen), и мультимером HLA-A*02-CMV (NLV) pelimer (Sanquin) в течение 20 мин при комнатной температуре, дважды промывали PBS и сортировавали на клеточном сортере MoFlo (DakoCytomation). Было отсортировано более 100,000 клеток с 97% чистотой (Фиг. 7).To confirm the correct pairing of the TCR chains, we sorted a subpopulation of clones of CD8 + T cells of the same patient specific for the cytomegalovirus NLV peptide using the flow cell sorting method. For this purpose, PBMCs were isolated from peripheral blood samples using centrifugation in a density gradient ficoll-urographin (Paneco), incubated with CD8-specific antibodies (clone ETK 182.20, Abcam), CD4-specific antibodies (clone S3.5, Invitrogen) and multimer HLA-A * 02-CMV (NLV) pelimer (Sanquin) for 20 min at room temperature, washed twice with PBS and sorted on a MoFlo cell sorter (DakoCytomation). More than 100,000 cells were sorted with 97% purity (Fig. 7).

РНК экстрагировали с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen). Библиотеки альфа- и бета-цепей ТКР получали с использованием технологии смены матрицы, согласно описанию (Mamedov I.Z., et al., 2011, EMBO Mol Med, 3, 201-207). Библиотеки генов альфа- и бета-цепей были проанализированы с помощью секвенирования Illumina MiSeq со спаренными концами с единовременным прочтением фрагментов размером до 150 нуклеотидов. Для каждой из двух библиотек было получено и проанализировано более 20,000 CDR3-содержащих последовательностей.RNA was extracted using TRIZOL reagent (Invitrogen). Libraries of TCR alpha and beta chains were obtained using matrix change technology as described (Mamedov I.Z., et al., 2011, EMBO Mol Med, 3, 201-207). Alpha and beta chain gene libraries were analyzed by sequencing Illumina MiSeq with double ends with a single reading of fragments up to 150 nucleotides in size. For each of the two libraries, more than 20,000 CDR3-containing sequences were obtained and analyzed.

Глубокое профилирование показало основные альфа- и бета-цепи ТКР CDR3 специфичные к HLA-A*02-CMV (NLV), а также предоставило статистику о вероятности спаривания на основе частоты встречаемости (Reddy S.T., et al., 2010, Nat Biotechnol, 28, 965-969). Вариант CDR3 бета CASSLAPGATNEKLFF-1 составил примерно 90% всех NLV-специфичных бета-цепей ТКР, что примерно равно общему количеству вариантов альфа-цепей ТКР CDR3 CIRDNNNDMRF и CAGYSGGGADGLTF.Deep profiling showed the main alpha and beta TCR CDR3 chains specific for HLA-A * 02-CMV (NLV) and also provided statistics on mating probability based on frequency of occurrence (Reddy ST, et al., 2010, Nat Biotechnol, 28 965-969). Variant CDR3 beta CASSLAPGATNEKLFF-1 accounted for approximately 90% of all NLV-specific TCR beta chains, which is approximately equal to the total number of variants of TCR alpha chains CDR3 CIRDNNNDMRF and CAGYSGGGADGLTF.

Таким образом, анализ сортированных клеток установил 2 пары цепей ТКР, специфичных к HLA-A*02-CMV (NLV): пара CDR3-альфа CIRDNNNDMRF/CDR3-бета CASSLAPGATNEKLFF, подтвержденной существованием практически идентичного NLV-специфичного Т-клеточного клона, идентифицированного в независимом исследовании (Trautmann L., et al., 2005, J Immunol, 175, 6123-6132), а также пара CDR3-альфа CAGYSGGGADGLTF/CDR3-бета CASSLAPGATNEKLFF. Алгоритм созревания Т-клеток подразумевает, что одна и та же бета-цепь ТКР может быть сопряжена с несколькими альфа-цепями ТКР альфа, в результате чего образуется несколько Т-клеточных клонов с похожей специфичностью (Arstila Т.Р., et al., 2000, Science, 288, 1135). Соответственно, наличие двух Т-клеточных клонов с одинаковыми бета-цепями ТКР не было неожиданностью.Thus, analysis of sorted cells revealed 2 pairs of HLA-A * 02-CMV specific TKR chains: a pair of CDR3 alpha CIRDNNNDMRF / CDR3 beta CASSLAPGATNEKLFF, confirmed by the existence of an almost identical NLV-specific T cell clone identified in an independent study (Trautmann L., et al., 2005, J Immunol, 175, 6123-6132), as well as a pair of CDR3 alpha CAGYSGGGADGLTF / CDR3 beta CASSLAPGATNEKLFF. The T-cell maturation algorithm implies that the same TCR beta chain can be coupled to several TCR alpha alpha chains, resulting in the formation of several T-cell clones with similar specificity (Arstila T.R., et al., 2000, Science, 288, 1135). Accordingly, the presence of two T-cell clones with the same TCR beta chains was not a surprise.

Обе пары, идентифицированные по данным секвенирования библиотек, полученных для сортированных Т-клеток, были также успешно идентифицированы методом эмульсионной ОТ-ПЦР (пары P1 и P4, Фиг 6, Табл. 5). Таким образом, эмульсионный подход позволяет однозначно идентифицировать функциональные пары альфа- и бета-цепей ТКР, по крайней мере, для относительно крупных клонов Т-клеток.Both pairs identified by sequencing libraries obtained for sorted T cells were also successfully identified by emulsion RT-PCR (pairs P1 and P4, Fig 6, Table 5). Thus, the emulsion approach allows us to uniquely identify functional pairs of TK alpha and beta chains, at least for relatively large T cell clones.

Принимая во внимание, что с помощью нашего набора праймеров был проанализирован относительно узкий пул фрагментов генов семейства TRBV7, этот результат можно экстраполировать на сотни функциональных пар цепей ТКР, которые могут быть однозначно определены для данного образца крови с использованием того же метода, но различных наборов праймеров. Кроме того, глубина указанного анализа может быть увеличена за счет большего числа и объема эмульсионных реакций, а следовательно, большего числа, независимо выявленных в двух реакциях.Taking into account that using our primer set, a relatively narrow pool of fragments of genes of the TRBV7 family was analyzed, this result can be extrapolated to hundreds of functional pairs of TCR chains that can be uniquely determined for a given blood sample using the same method, but different sets of primers . In addition, the depth of this analysis can be increased due to the larger number and volume of emulsion reactions, and therefore, a larger number, independently identified in the two reactions.

Claims

1. A method for identifying pairs of nucleic acid fragments present in the same cells, including:
(1) amplification and physical pairing of target fragments A and B, carried out in an emulsion;
(2) non-emulsion PCR amplification of paired target fragments in the presence of oligonucleotides that block the pairing of fragments not previously paired in one drop in the emulsion in step (1).

2. The method of claim 1, further comprising the step of (3) sequencing the resulting PCR amplicons.

3. The method of claim 1, wherein the nucleic acids are DNA molecules.

4. The method of claim 2, wherein the nucleic acids are RNA molecules.

5. The method according to p. 1, where the physical pairing in the emulsion is carried out using the technology of overlap-extension.

6. The method according to claim 4, where the pairs of RNA fragments are native pairs of mRNA fragments of alpha and beta chains of T-cell receptors.

7. The method of claim 4, wherein the pairs of RNA fragments are native pairs of mRNA fragments of the heavy and light chains of antibodies.

8. The method of claim 3, wherein the pairs of DNA fragments are native pairs of DNA fragments of the alpha and beta chains of T cell receptors.

9. The method according to p. 3, where the pairs of DNA fragments are native pairs of DNA fragments of the heavy and light chains of antibodies.