RU2698720C1 - Method of producing docosahexaenoic acid - Google Patents
Method of producing docosahexaenoic acid Download PDFInfo
- Publication number
- RU2698720C1 RU2698720C1 RU2019118773A RU2019118773A RU2698720C1 RU 2698720 C1 RU2698720 C1 RU 2698720C1 RU 2019118773 A RU2019118773 A RU 2019118773A RU 2019118773 A RU2019118773 A RU 2019118773A RU 2698720 C1 RU2698720 C1 RU 2698720C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fatty acids
- acid
- dha
- urea
- crystallization
- Prior art date
Links
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 title claims abstract description 204
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 106
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 66
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 41
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 37
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 37
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 12
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 36
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 31
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- -1 fatty acid salts Chemical class 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 16
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 14
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical class [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003026 cod liver oil Substances 0.000 description 7
- 235000012716 cod liver oil Nutrition 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000000199 molecular distillation Methods 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 4
- 229940013317 fish oils Drugs 0.000 description 4
- 239000002035 hexane extract Substances 0.000 description 4
- 235000011118 potassium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 4
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 3
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Chemical compound [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001147168 Scomber australasicus Species 0.000 description 2
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFWWSZLGTLNVMS-UHFFFAOYSA-N acetic acid;ethoxyethane;hexane Chemical compound CC(O)=O.CCOCC.CCCCCC QFWWSZLGTLNVMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical class CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 2
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 2
- 238000007273 lactonization reaction Methods 0.000 description 2
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000005051 trimethylchlorosilane Substances 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 1
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241000276438 Gadus morhua Species 0.000 description 1
- 241000206581 Gracilaria Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102220547770 Inducible T-cell costimulator_A23L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001501873 Isochrysis galbana Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 239000004165 Methyl ester of fatty acids Substances 0.000 description 1
- 241000736084 Scomber japonicus Species 0.000 description 1
- 241000736062 Scomber scombrus Species 0.000 description 1
- 241000269319 Squalius cephalus Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJFYWGIWEYQMPK-UHFFFAOYSA-N ethanol;urea Chemical compound CCO.NC(N)=O XJFYWGIWEYQMPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010932 ethanolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102220229106 rs753340463 Human genes 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
- C11B7/00—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
- C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
- C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
- C11C1/04—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения композиций с высоким содержанием докозагексаеновой кислоты (ДГК), обладающей выраженным биологическим действием. Формула докозагексаеновой кислоты приведена на фиг.1.The invention relates to the food and pharmaceutical industries and can be used to obtain compositions with a high content of docosahexaenoic acid (DHA), which has a pronounced biological effect. The formula of docosahexaenoic acid is shown in figure 1.
Докозагексаеновая кислота, ДГК (Δ4,7,10,13,16,19-C22:6, 22:6ω3), наряду с арахидоновой и эйкозапентаеновой кислотами, наиболее востребованная медиками, диетологами и фармацевтической промышленностью, как жирная кислота обширного спектра действия. В организме человека она находится, преимущественно, в полярных липидах – в фосфолипидах и их плазмалогенных формах. Набольшие ее концентрации отмечены в нервной ткани, особенно в головном мозге. Данная кислота в организме практически не синтезируется и должна поступать с пищей. ДГК в составе мембранных липидов влияет на пластичность мембран, в липидных рафтах нервной ткани в составе плазмалогенов контролирует транспорт белков и холестерина, препятствуя образованию амилоидного белка β42, ответственного за развитие болезни Альцгеймера (Habeck C., Stern Y. Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative. Multivariate data analysis for neuroimaging data: overview and application to Alzheimer's disease //Cell Biochem. Biophys., 2010. Vol.58, Р. 53-67). Помимо этого, ДГК является эффективным ингибитором циклооксигиназы, снижая, тем самым, уровень провоспалительных простагландинов 2-й серии, а также является субстратом при образовании защитных для нервных тканей соединений – нейропротектина D1, резолвинов и мирисинов (Kuda О. «Bioactive metabolites of docosahexaenoic acid» // Biochimie, 2017. Р. 1-9).Docosahexaenoic acid, DHA (Δ4,7,10,13,16,19-C22: 6, 22: 6ω3), along with arachidonic and eicosapentaenoic acids, is most demanded by physicians, nutritionists and the pharmaceutical industry as an extensive spectrum fatty acid. In the human body, it is located mainly in polar lipids - in phospholipids and their plasmalogenic forms. Its highest concentrations are noted in the nervous tissue, especially in the brain. This acid in the body is practically not synthesized and must come from food. DHA as a part of membrane lipids affects the plasticity of membranes; in lipid rafts of nervous tissue as a part of plasmalogens, it controls the transport of proteins and cholesterol, preventing the formation of amyloid protein β42, responsible for the development of Alzheimer's disease (Habeck C., Stern Y. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. Multivariate data analysis for neuroimaging data: overview and application to Alzheimer's disease // Cell Biochem. Biophys., 2010. Vol. 58, P. 53-67). In addition, DHA is an effective inhibitor of cyclooxyginase, thereby reducing the level of pro-inflammatory prostaglandins of the 2nd series, and is also a substrate in the formation of compounds that are protective for nerve tissue - neuroprotectin D1, resolvines and myrisins (Kuda O. “Bioactive metabolites of docosahexaenoic acid "// Biochimie, 2017. R. 1-9).
ДГК важна для формирующегося организма в утробе матери и, в дальнейшем, при его развитии (Carlson S.E. «Docosahexaenoic acid supplementation in pregnancy and lactation» // Am.J.Clin.Nutr., 2009. Vol. 89 (suppl.), P. 678-684S). При этом дефицит ДГК на данных этапах развития может привести к снижению когнитивных функций ребенка, вплоть до умственной отсталости. У взрослых и пожилых людей по причинам несоответствия питания, наследственным заболеваниям, сбоям в метаболизме липидов содержание ДГК в нервных тканях организма падает. Поэтому необходимо компенсировать это за счет дополнительного потребления ДГК.DHA is important for the developing organism in the womb and, subsequently, during its development (Carlson SE “Docosahexaenoic acid supplementation in pregnancy and lactation” // Am.J. Clin. Nutr., 2009. Vol. 89 (suppl.), P 678-684S). Moreover, a deficiency of DHA at these stages of development can lead to a decrease in the cognitive functions of the child, up to mental retardation. In adults and the elderly, for reasons of food mismatch, hereditary diseases, and malfunctions in lipid metabolism, the content of DHA in the nerve tissues of the body decreases. Therefore, it is necessary to compensate for this due to the additional consumption of DHA.
Научные эксперименты с ДГК должны быть доступны для всех желающих принять в них участие исследовательских лабораторий. Именно поэтому, разработанные методики получения высокообогащенных концентратов ДГК, при отсутствии какого-либо дорогостоящего оборудования и возможностью их применения персоналом средней квалификации, будут востребованы, что даст импульс к интенсификации продвижения препаратов ДГК, как эффективных средств оздоровления организма.Scientific experiments with DHA should be available to all who wish to participate in research laboratories. That is why, the developed methods for producing highly enriched DHA concentrates, in the absence of any expensive equipment and the possibility of their use by mid-level personnel, will be in demand, which will give an impetus to the intensification of the promotion of DHA preparations as effective means of healing the body.
На данный момент из научной и патентной литературы нам не известно о методах получения фармацевтических композиций с высоким содержанием ДГК, получение которых проходило бы с возможно минимальным количеством стадий технологического процесса при высокой чистоте целевого продукта и кардинальном упрощении стадии концентрирования с повышением ее эффективности в отношении концентрирования ДГК. Тем самым, обеспечивается доступность для научных лабораторий и фармпредприятий к быстрому и технологически простому получению высокообогащенных препаратов ДГК для биохимических, медицинских и диетологических исследований.At the moment, we are not aware of the scientific and patent literature on methods for producing pharmaceutical compositions with a high content of DHA, the preparation of which would take place with the smallest possible number of process steps with high purity of the target product and a fundamental simplification of the concentration stage with an increase in its efficiency with respect to the concentration of DHA . This ensures accessibility for scientific laboratories and pharmaceutical enterprises to the quick and technologically simple production of highly enriched DHA preparations for biochemical, medical and nutritional studies.
Известен способ получения эфиров полиненасыщенных жирных кислот из рыбных жиров и препаратов на их основе (EP Application №0 292 846 A2 « A process for the extraction of polyunsaturated fatty acid esters from fish oils and pharmaceutical and/or dietetic compositions containing said esters», 18.05.88, Int. Cl.4 C11C 3/04, A61K 31/23, A23D 5/00, A23L 1/30). Способ основан на разной летучести эфиров жирных кислот в вакууме при высокой температуре и осуществляется следующим образом. Рыбный жир для перевода жирных кислот из триглицеридов в этиловые эфиры обрабатывают 5%-ным раствором серной кислоты в этаноле, охлаждают, добавляют воды, экстрагируют этиловые эфиры жирных кислот гексаном, для удаления окисленных производных гексановый раствор подвергают хроматографической очистке, гексан упаривают, а сам продукт используют для молекулярной дистилляции при температуре 80-1250С и остаточном давлении 10-3 мм рт. ст. Исходный рыбный жир (как и получаемые из него этиловые эфиры жирных кислот) содержит 10,7% ДГК. После описанных процедур конечный продукт содержит 39,9% ДГК.A known method for producing polyunsaturated fatty acid esters from fish oils and preparations based on them (EP Application No. 0 292 846 A2 "A process for the extraction of polyunsaturated fatty acid esters from fish oils and pharmaceutical and / or dietetic compositions containing said esters", 18.05 .88, Int. Cl. 4 C11C 3/04, A61K 31/23, A23D 5/00, A23L 1/30). The method is based on different volatility of fatty acid esters in vacuum at high temperature and is carried out as follows. To convert fatty acids from triglycerides to ethyl esters, fish oil is treated with a 5% solution of sulfuric acid in ethanol, cooled, water is added, ethyl esters of fatty acids are extracted with hexane, the hexane solution is chromatographed to remove oxidized derivatives, the hexane is evaporated, and the product itself used for molecular distillation at a temperature of 80-125 0 C and a residual pressure of 10 -3 mm RT. Art. The original fish oil (as well as the fatty acid ethyl esters derived from it) contains 10.7% of DHA. After the procedures described, the final product contains 39.9% DHA.
Способ имеет ряд недостатков:The method has several disadvantages:
1. Достаточно трудоемкая подготовка к осуществлению способа – кислотный этанолиз и хроматографическая очистка от окисленных примесей.1. A rather laborious preparation for the implementation of the method is acid ethanolysis and chromatographic purification of oxidized impurities.
2. Высокая температура, до 1250С, вызывает такие явления как окисление полиненасыщенных жирных кислот, образование диеновых конъюгатов, миграцию двойных связей в цепочке жирной кислоты, полимеризацию продукта, а также деградацию кислоты на короткоцепочечные летучие продукты.2. High temperature, up to 125 0 С, causes such phenomena as oxidation of polyunsaturated fatty acids, the formation of diene conjugates, migration of double bonds in the chain of fatty acids, product polymerization, as well as acid degradation to short-chain volatile products.
3. Использование конечного продукта, полученного по данному способу, допустимо лишь при очень тщательной хроматографической очистке, которую авторы, по какой-то причине, не указывают, поскольку привнесение в фармацевтическую композицию измененного по химической структуре продукта будет опасным для потребителей.3. The use of the final product obtained by this method is permissible only with a very thorough chromatographic purification, which the authors, for some reason, do not indicate, since introducing a product modified in the chemical composition into the pharmaceutical composition will be dangerous for consumers.
4. Способ не обеспечивает высокую концентрацию ДГК в конечном продукте (39,9%), наблюдаемое увеличение только в 3,7 раза. Полученная композиция, после очистки, действительно может быть использована в пищевых целях, но не в качестве препарата высокой эффективности.4. The method does not provide a high concentration of DHA in the final product (39.9%), the observed increase is only 3.7 times. The resulting composition, after purification, can indeed be used for food purposes, but not as a highly effective drug.
Известен способ получения композиции, содержащей докозагексаеновую кислоту (UK Patent Application GB 2 098 065 «Antithrombotic compositions containing docosahexaenoic acid», 17.11.82, Int. Cl.3 A61K 31/20, A61K 31/16). Способ основан на комбинировании различных методов – низкотемпературной кристаллизации, молекулярной дистилляции и хроматографии. Метод низкотемпературной кристаллизации использует физические свойства индивидуальных жирных кислот - разные точки их плавления, как в свободном виде, так и в растворах органических растворителей при различных температурах, что обеспечивает первичное концентрирование полиненасыщенных жирных кислот. Полученный концентрат подвергают обогащению по 2-му методу - молекулярной перегонке в вакууме и в заключении используют 3-й метод - хроматографию. Способ осуществляют следующим образом (пример 1): из свежего мяса скумбрии (100 кг) тепловым способом выделяют жир (15 кг), его гидролизуют до получения свободных жирных кислот (9 кг), смесь охлаждают до -600С, получая 4 кг ненасыщенных жирных кислот, далее концентрат подвергают молекулярной перегонке при остаточном давлении 10-2 мм рт. ст. и дополнительно концентрируют колоночной хроматографией, получая 900 г концентрата ДГК с чистотой 82%.A known method of obtaining a composition containing docosahexaenoic acid (UK Patent Application GB 2 098 065 "Antithrombotic compositions containing docosahexaenoic acid", 11/17/82, Int. Cl. 3 A61K 31/20, A61K 31/16). The method is based on a combination of various methods - low-temperature crystallization, molecular distillation and chromatography. The method of low-temperature crystallization uses the physical properties of individual fatty acids - different points of their melting, both in free form and in solutions of organic solvents at various temperatures, which provides the primary concentration of polyunsaturated fatty acids. The resulting concentrate is subjected to enrichment according to the 2nd method — molecular distillation in vacuo, and finally the 3rd method — chromatography — is used. The method is as follows (example 1): fat (15 kg) is extracted from fresh mackerel meat (100 kg), it is hydrolyzed to obtain free fatty acids (9 kg), the mixture is cooled to -60 0 C, obtaining 4 kg of unsaturated fatty acids, then the concentrate is subjected to molecular distillation at a residual pressure of 10 -2 mm RT. Art. and further concentrated by column chromatography to obtain 900 g of a DHA concentrate with a purity of 82%.
К недостаткам способа следует отнести:The disadvantages of the method include:
1. Проведение процесса при очень низкой температуре (-600С) является весьма затратным, ибо низкие температуры предполагают специализированные мощности, предназначенные для этого и, возможно, функционирование больших помещений при этой температуре, если речь идет о получении промышленных партий препарата.1. The process at a very low temperature (-60 0 C) is very expensive, because low temperatures require specialized facilities designed for this and, possibly, the operation of large rooms at this temperature, if we are talking about getting industrial batches of the drug.
2. Вторая стадия – молекулярная перегонка, использующая высокие температуры (до 1100С) способствует значительному окислению ДГК и общим потерям при ее производстве.2. The second stage - molecular distillation using high temperatures (up to 110 0 С) contributes to a significant oxidation of DHA and general losses during its production.
3. Способ изначально предполагает существенное образование окисленных и полимеризованных соединений, почему на конечном этапе используют адсорбционную хроматографию. Это достаточно дорогая процедура при получении продукта, учитывая, что сорбент (обычно силикагель) в дальнейшем не регенерируют.3. The method initially involves a significant formation of oxidized and polymerized compounds, why adsorption chromatography is used at the final stage. This is a rather expensive procedure for obtaining the product, given that the sorbent (usually silica gel) does not regenerate further.
4. Концентрирование ДГК, при столь длительных и затратных процедурах, составляет только 82% при выходе по ДГК – приблизительно 24,6% (авторы не указывают содержание ДГК в жире японской скумбрии, но основываясь на известных данных можно предположить, что это в пределах 30% (Bae J.H. Heavy Metal Contents and Chemical Compositions of Atlantic (Scomber scombrus), Blue (Scomber australasicus), and Chub (Scomber japonicus) Mackerel Muscles //Food Sci. Biotechnol., 2011. Vol.20, P. 709-714).4. The concentration of DHA, with such lengthy and costly procedures, is only 82% for DHA output - approximately 24.6% (the authors do not indicate the content of DHA in the fat of Japanese mackerel, but based on known data, it can be assumed that this is within 30 % (Bae JH Heavy Metal Contents and Chemical Compositions of Atlantic (Scomber scombrus), Blue (Scomber australasicus), and Chub (Scomber japonicus) Mackerel Muscles // Food Sci. Biotechnol., 2011. Vol.20, P. 709-714 )
Известен способ получения метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот из рыбного жира (Adolf R.O. et al., "The Isolation of Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Methyl Esters of Fish Oils by Silver Resin" //JAOCS, 1985. Vol.62, P. 1592-1595). Реализация данного способа основана на способности полиненасыщенных соединений образовывать координационные связи с атомами серебра – чем больше двойных связей, тем сильнее устойчивость таких соединений. Нанося соли серебра на хроматографические сорбенты можно регулировать равновесие в системе насыщенных - ненасыщенных жирных кислот. Способ осуществляют следующим образом: рыбный жир (американская сельдь) переводят в метиловые эфиры жирных кислот, далее, используя хроматографическую колонку со смолой, содержащей ионы серебра, хроматографируют их в системе полярных растворителей, получая при элюции концентрат с содержанием 20,4% ДГК (исходное содержание ДГК – 11,1%). A known method of producing methyl esters of polyunsaturated fatty acids from fish oil (Adolf RO et al., "The Isolation of Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids and Methyl Esters of Fish Oils by Silver Resin" // JAOCS, 1985. Vol.62, P. 1592-1595). The implementation of this method is based on the ability of polyunsaturated compounds to form coordination bonds with silver atoms - the more double bonds, the stronger the stability of such compounds. By applying silver salts to chromatographic sorbents, it is possible to adjust the equilibrium in the system of saturated - unsaturated fatty acids. The method is as follows: fish oil (American herring) is converted to methyl esters of fatty acids, then using a chromatographic column with a resin containing silver ions, they are chromatographed in a system of polar solvents to obtain a concentrate containing 20.4% of DHA during elution (initial DHA content - 11.1%).
Способ имеет следующие недостатки:The method has the following disadvantages:
1. Несмотря на возможность получения высокообогащенных концентратов полиненасыщенных жирных кислот, способ не дает высокие выходы конечного продукта.1. Despite the possibility of obtaining highly enriched concentrates of polyunsaturated fatty acids, the method does not give high yields of the final product.
2. Использование в способе солей серебра чрезвычайно удорожает стоимость конечного продукта. Системы элюции вымывают импрегнированные соли серебра с сорбента и, в дальнейшем, регенерация растворов с солями серебра, также как и сорбента с их остатками в комплексе реализуемого процесса невозможна.2. The use of silver salts in the method extremely increases the cost of the final product. Elution systems wash impregnated silver salts from the sorbent and, further, the regeneration of solutions with silver salts, as well as the sorbent with their residues in the complex of the process is impossible.
3. Производительность процесса очень мала. Используют значительные по объему колонки (340-750 мл) для разделения 0,5-10,0 г вещества. Требуются значительные количества растворителей, постоянная их регенерация.3. The productivity of the process is very small. Significant in volume columns (340-750 ml) are used to separate 0.5-10.0 g of substance. Significant amounts of solvents are required, their constant regeneration.
Известен способ получения докозагексаеновой кислоты из жира печени трески (Medina А.R. et al. Concentration and Purification of Stearidonic, Eicosapentaenoic, and Docosahexaenoic Acids from Cod Liver Oil and the Marine microalga Isochrysis galbana //JAOCS, 1995. Vol.72, P. 575-583). Способ основан на разной подвижности жирных кислот в условиях хроматографии высокого давления на специализированных сорбентах. Способ осуществляют следующим образом: жир печени трески гидролизуют с выделением свободных жирных кислот (содержание ДГК – 11%), далее разделяют по составу жирных кислот на хроматографической колонке с обращенной фазой (С-18), элюируя колонку различными системами растворителей. Способ позволяет получать концентраты ДГК с выходом 70,5-100%, но с содержанием данной кислоты не более 72-85%.A known method for producing docosahexaenoic acid from cod liver oil (Medina A.R. et al. Concentration and Purification of Stearidonic, Eicosapentaenoic, and Docosahexaenoic Acids from Cod Liver Oil and the Marine microalga Isochrysis galbana // JAOCS, 1995. Vol. 72, P 575-583). The method is based on different mobility of fatty acids under high pressure chromatography on specialized sorbents. The method is as follows: cod liver oil is hydrolyzed with the release of free fatty acids (the content of DHA is 11%), then it is separated by the composition of the fatty acids on a reverse phase chromatography column (C-18), eluting the column with various solvent systems. The method allows to obtain DHA concentrates with a yield of 70.5-100%, but with the content of this acid not more than 72-85%.
Способ имеет многие недостатки:The method has many disadvantages:
1. Колоночная хроматография обеспечивает разделения нужных продуктов, но при этом известно, что соотношение разделяемая смесь-сорбент обычно составляет 1 : 10-100 г/г. Это очень большое использование сорбента для разделения малых количеств веществ. К тому же после разделения веществ, сорбент на колонке необходимо регенерировать и для этого требуются растворители в не меньшем объеме, чем для выделения целевого продукта.1. Column chromatography provides separation of the desired products, but it is known that the ratio of the shared mixture-sorbent is usually 1: 10-100 g / g This is a very large use of the sorbent for the separation of small amounts of substances. In addition, after the separation of substances, the sorbent on the column must be regenerated and this requires solvents in no less volume than for the isolation of the target product.
2. Способ использует различные системы элюции при различном соотношении растворителя с водой. Это предполагает регенерацию растворителя и, исходя из приведенных объемов, она очень значительна.2. The method uses various elution systems at different ratios of solvent to water. This involves the regeneration of the solvent and, based on the volumes given, it is very significant.
3. Использование в качестве растворителя метанола, а именно в примерах с его участием в системах элюции концентрация ДГК самая высокая, вызывает опасения по дальнейшему использованию такого продукта в пищевой индустрии.3. The use of methanol as a solvent, namely, in the examples with its participation in elution systems, the concentration of DHA is the highest, causing concerns about the further use of such a product in the food industry.
4. Реализация способа не обеспечивает получение препаратов с высоким содержанием ДГК, а учитывая затраты на их производство и малую производимость, не может претендовать на массовое использование.4. The implementation of the method does not provide preparations with a high content of DHA, and taking into account the costs of their production and low productivity, it cannot pretend for mass use.
5. Способ предполагает использование препаративного жидкостного хроматографа, прибора, недоступного для многих лабораторий.5. The method involves the use of a preparative liquid chromatograph, an instrument inaccessible to many laboratories.
Известен способ получения докозагексаеновой кислоты из жира печени трески (Wright S.W., Kuo E.Y., Corey E.J. An Effective Process for the Isolation of Docosahexaenoic Acid in Quantity from Cod Liver Oil //J. Org. Chem., 1987. Vol.52, P 4399-4401). Способ осуществляли следующим образом: жир печени трески (200 г) подвергали щелочному гидролизу, отделяли неомыляемые вещества, подкисляли для выделения свободных жирных кислот (180 г). Далее полиненасыщенные жирные кислоты концентрировали методом разделения литиевых солей жирных кислот в ацетоне (получили концентрат с содержанием 42% ДГК, 50 г). Затем проводили реакцию йод-лактонизации жирных кислот в тетрагидрофуране с участием йода (соотношение 1,2 моль йода на 1 моль ДГК) и калия йодистого в течение 48 часов, после чего йод-лактоны экстрагировали этилацетатом, упаривали, перерастворяли в гексане, отмывали непрореагировавшие жирные кислоты водно-метанольным раствором карбоната калия, гексановый раствор последовательно промывали водой и солевым раствором, упаривали с получением 24,11 г йод-лактона ДГК (выход в расчете на йод-лактон ДГК 81%). Далее полученный йод-лактон ДГК раскрывали с высвобождением исходной ДГК в растворе йодистого натрия и триметилхлорсилана (соотношение йод-лактон ДГК / триметилхлорсилан, TMS-Cl – 1 : 2, моль/моль) в ацетонитриле. Выделившийся свободный йод связывали раствором сульфита натрия и цитрата натрия. Жирные кислоты экстрагировали смесью гексана и дихлорметана, объединенные экстракты промывали водой, солевым раствором, высушивали и упаривали до получения 13,55 г ДГК с чистотой 100% (выход на стадии 78%).A known method for producing docosahexaenoic acid from cod liver oil (Wright SW, Kuo EY, Corey EJ An Effective Process for the Isolation of Docosahexaenoic Acid in Quantity from Cod Liver Oil // J. Org. Chem., 1987. Vol. 52, P 4399 -4401). The method was carried out as follows: cod liver oil (200 g) was subjected to alkaline hydrolysis, unsaponifiables were separated, acidified to isolate free fatty acids (180 g). Next, polyunsaturated fatty acids were concentrated by the separation of lithium salts of fatty acids in acetone (a concentrate was obtained with a content of 42% DHA, 50 g). Then, the reaction of iodine-lactonization of fatty acids in tetrahydrofuran with the participation of iodine (ratio 1.2 mol of iodine per 1 mol of DHA) and potassium iodide for 48 hours, after which iodine-lactones were extracted with ethyl acetate, evaporated, re-dissolved in hexane, washed unreacted fatty acid with a water-methanol solution of potassium carbonate, the hexane solution was washed successively with water and brine, evaporated to obtain 24.11 g of iodine-lactone DHA (81% yield based on iodine-lactone of DHA). Next, the obtained iodine-lactone DHA was opened with the release of the starting DHA in a solution of sodium iodide and trimethylchlorosilane (ratio of iodine-lactone DHA / trimethylchlorosilane, TMS-Cl - 1: 2, mol / mol) in acetonitrile. The liberated iodine was bound with a solution of sodium sulfite and sodium citrate. Fatty acids were extracted with a mixture of hexane and dichloromethane, the combined extracts were washed with water, brine, dried and evaporated to obtain 13.55 g of DHA with a purity of 100% (yield at the stage of 78%).
Общий выход:General output:
1) при расчете от 180 г жирных кислот при среднем содержании ДГК в жире печени трески 12,5% - 58,9% (авторы не указывают исходную концентрацию ДГК, но по литературным данным в жире печени атлантической трески Gadus morhua содержится 10,5-14,3% ДГК, Gruger E.H. «Fatty acid composition». In: Fish oils/Ed. Stansby M.E. Westport, Connecticut: The AVI Publ. Comp., Inc., 1967. P. 15).1) when calculating from 180 g of fatty acids with an average DHA content in cod liver oil of 12.5% - 58.9% (the authors do not indicate the initial concentration of DHA, but according to published data, the liver oil of Atlantic cod Gadus morhua contains 10.5- 14.3% DHA, Gruger EH Fatty acid composition. In: Fish oils / Ed. Stansby ME Westport, Connecticut: The AVI Publ. Comp., Inc., 1967. P. 15).
2) при расчете от 50 г концентрата полиненасыщенных жирных кислот – 63,2%.2) when calculating from 50 g of polyunsaturated fatty acid concentrate - 63.2%.
Способ имеет следующие недостатки:The method has the following disadvantages:
1. Растворители, используемые при осуществлении способа – тетрагидрофуран и метанол чрезвычайно ядовиты и не должны быть использованы при получении препаратов, назначаемых человеку. Полученные таким способом препараты следует отнести к веществам для биохимических исследований.1. The solvents used in the implementation of the method - tetrahydrofuran and methanol are extremely toxic and should not be used to obtain drugs prescribed to humans. The preparations obtained in this way should be attributed to substances for biochemical studies.
2. Способ осуществляют в 4-е стадии, что значительно усложняет процесс и увеличивает время его осуществления почти до 3-х суток (66 часов и более).2. The method is carried out in the 4th stage, which significantly complicates the process and increases the time of its implementation to almost 3 days (66 hours or more).
3. Предварительное концентрирование, использующее метод осаждения литиевых солей насыщенных кислот из ацетона, сугубо лабораторный метод, так как объемы растворителя в 20 раз превышают объем разделяемой массы. Масштабирование такого метода для производства необоснованно и не эффективно.3. Preconcentration using the method of precipitation of lithium salts of saturated acids from acetone is a purely laboratory method, since the volume of solvent is 20 times the volume of the mass to be separated. Scaling such a method for production is unreasonable and not effective.
4. Реакция йод-лактонизации проведена с низким выходом (81%), то есть часть ДГК из полученного на предыдущей стадии концентрата просто теряется. Это увеличивает затраты на выпуск данного препарата.4. The iodine-lactonization reaction was carried out with a low yield (81%), that is, part of the DHA from the concentrate obtained at the previous stage is simply lost. This increases the cost of releasing this drug.
5. Выход на стадии раскрытия йод-лактона ДГК также низок – 78%. Можно заключить, что условия проведения реакции не оптимальны. Это зависит и от соотношения компонентов в среде и от времени проведения реакции и от других немаловажных деталей.5. The yield at the stage of disclosure of iodine-lactone of DHA is also low - 78%. It can be concluded that the reaction conditions are not optimal. It also depends on the ratio of components in the medium and on the time of the reaction and on other important details.
6. Авторы указывают, что продукт, выделенный таким образом, чистый (100%). Однако 4-х стадийное получение ДГК малоэффективно, в виду не высоких выходов на каждой из стадий, общий выход очень низкий – 58,9%, хотя достоинство любого процесса – максимальное использование исходного сырья, минимизация потерь продукта, труда и времени. Данный способ для возможного применения в промышленном производстве должен быть критически воспринят и существенным образом доработан.6. The authors indicate that the product isolated in this way is pure (100%). However, the 4-stage production of DHA is ineffective, in view of the low yields at each stage, the overall yield is very low - 58.9%, although the merit of any process is the maximum use of the feedstock, minimizing the loss of product, labor and time. This method for possible use in industrial production should be critically accepted and substantially modified.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения концентрата этиловых эфиров эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой кислот (Авторское свидетельство SU №1581737 А1 «Способ получения концентрата этиловых эфиров эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот», 30.07.90, МПК С11С 1/00, С11В 7/00). Способ осуществляют следующим образом. Рыбный жир подвергают щелочному гидролизу для получения свободных жирных кислот, после чего смесь нейтрализуют 15% серной кислотой до рН 1,5, добавляют воду и отбирают свободные жирные кислоты, которые растворяют в растворе мочевины в этаноле в соотношении 0,5:3:12 (жирные кислоты-мочевина-этанол), выдерживают смесь 1-3 часа при комнатной температуре, затем 8-12 часов при температуре от (+5) до (-40)0С, осадок отфильтровывают, а из раствора спирта выделяют концентрат ненасыщенных жирных кислот. Для этого фильтрат упаривают до 1/6 объема, добавляют 2%-ый раствор серной кислоты до рН 1,5, затем экстрагируют выделившиеся эфиры жирных кислот хлороформом. Экстракты упаривают и подвергают адсорбционной очистке. Так, из 4 г свободных жирных кислот (пример 2), полученных гидролизом рыбного жира, с содержанием ДГК 5,3% по способу получено 330 мг концентрата полиненасыщенных жирных кислот с содержанием ДГК – 37,0%. Выход по ДГК составляет 57,8%.Closest to the claimed method is a method for producing a concentrate of ethyl esters of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acids (Copyright certificate SU No. 1581737 A1 “Method for producing a concentrate of ethyl esters of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids”, 07/30/90, IPC С11С 1/00, С11В 7/7 00). The method is as follows. Fish oil is subjected to alkaline hydrolysis to obtain free fatty acids, after which the mixture is neutralized with 15% sulfuric acid to pH 1.5, water is added and free fatty acids are selected, which are dissolved in a solution of urea in ethanol in a ratio of 0.5: 3: 12 ( fatty acids-urea-ethanol), maintain the mixture for 1-3 hours at room temperature, then 8-12 hours at a temperature of (+5) to (-40) 0 С, the precipitate is filtered off, and an unsaturated fatty acid concentrate is isolated from the alcohol solution . For this, the filtrate is evaporated to 1/6 of the volume, a 2% solution of sulfuric acid is added to a pH of 1.5, then the released fatty acid esters are extracted with chloroform. The extracts are evaporated and subjected to adsorption purification. So, from 4 g of free fatty acids (Example 2) obtained by hydrolysis of fish oil with a DHA content of 5.3%, 330 mg of a polyunsaturated fatty acid concentrate with a DHA content of 37.0% were obtained by the method. The yield of DHA is 57.8%.
Способ имеет следующие недостатки:The method has the following disadvantages:
1. технология использует концентрированные растворы серной кислоты (15%-ные), которые самым негативным образом отражаются на сохранности полиненасыщенных жирных кислот – происходит их окисление, осмоление, а оставшиеся жирные кислоты могут изменить исходную структуру из-за миграции двойных связей. Концентрат ДГК в виде свободных жирных кислот, полученный по данному способу, представляет собой темно-коричневое масло с выраженным запахом окисления;1. The technology uses concentrated solutions of sulfuric acid (15%), which most negatively affect the preservation of polyunsaturated fatty acids - they are oxidized, ground, and the remaining fatty acids can change the original structure due to the migration of double bonds. The DHA concentrate in the form of free fatty acids obtained by this method is a dark brown oil with a pronounced oxidation odor;
2. концентрирование ЭПК и ДГК в продукте происходит с равным увеличением, поэтому такие концентраты следует называть концентратами омега-3 жирных кислот, но никак не концентратом докозагексаеновой кислоты. Концентраты, полученные по данному методу, не могут быть использованы в биохимических и медицинских целях для выявления индивидуальных фармакологических свойств ДГК;2. the concentration of EPA and DHA in the product occurs with an equal increase, therefore, such concentrates should be called omega-3 fatty acid concentrates, but not docosahexaenoic acid concentrate. Concentrates obtained by this method cannot be used for biochemical and medical purposes to identify the individual pharmacological properties of DHA;
3. способ не обеспечивает оптимальных условий (соотношение компонентов, температура, время) для получения концентратов разного состава, в первую очередь, ДГК;3. the method does not provide optimal conditions (ratio of components, temperature, time) to obtain concentrates of different compositions, primarily DHA;
4. в конечном итоге, концентрирование ДГК в продукте не превышает 37.0%.4. ultimately, the concentration of DHA in the product does not exceed 37.0%.
Техническая проблема, решаемая изобретением - разработка простого и экономичного способа получения целевого продукта, с высоким содержанием ДГК при одновременном снижении затрат производства.The technical problem solved by the invention is the development of a simple and economical way to obtain the target product with a high content of DHA while reducing production costs.
Поставленная техническая проблема решается тем, что в известном способе получения докозагексаеновой кислоты, включающим гидролиз рыбного жира, нейтрализацию солей жирных кислот минеральной кислотой, выделение свободных жирных кислот, двухэтапную кристаллизацию свободных жирных кислот в этиловом спирте в присутствии мочевины, фильтрацию, добавление к фильтрату воды, выделение докозагексаеновой кислоты из фильтрата органическим растворителем, упаривание с получением целевого продукта, согласно изобретению, перед проведением двухэтапной кристаллизации проводят экстракцию свободных жирных кислот гексаном; кристаллизацию ведут при следующем соотношении компонентов свободные жирные кислот – мочевина – этанол 1 : 3 : 18, кг/кг/л, на первом этапе кристаллизацию ведут 3-5 часов при температуре 18-220С, а кристаллизацию на втором этапе - 12-24 часа при температуре минус 20-250С; в качестве минеральной кислоты для нейтрализации солей жирных кислот после гидролиза применяют соляную кислоту; а в качестве органического растворителя для выделения докозагексаеновой кислоты из фильтрата используют гексан. Упаривание фильтрата с целью получения докозагексаеновой кислоты ведут под вакуумом в среде инертного газа.The technical problem posed is solved by the fact that in the known method for producing docosahexaenoic acid, including hydrolysis of fish oil, neutralization of fatty acid salts with mineral acid, isolation of free fatty acids, two-stage crystallization of free fatty acids in ethyl alcohol in the presence of urea, filtration, adding water to the filtrate, the selection of docosahexaenoic acid from the filtrate with an organic solvent, evaporation to obtain the target product according to the invention, before conducting two pnoy crystallization is performed with hexane extraction of free fatty acids; crystallization is carried out in the following ratio of components of free fatty acids - urea - ethanol 1: 3: 18, kg / kg / l, at the first stage crystallization is carried out for 3-5 hours at a temperature of 18-22 ° C, and crystallization at the second stage is 12- 24 hours at a temperature of minus 20-25 0 C; hydrochloric acid is used as a mineral acid to neutralize the salts of fatty acids after hydrolysis; and hexane is used as an organic solvent to isolate docosahexaenoic acid from the filtrate. Evaporation of the filtrate in order to obtain docosahexaenoic acid is carried out under vacuum in an inert gas medium.
Щелочной гидролиз морского жира ведут раствором гидроксидов калия или натрия. Как показали наши предыдущие исследования, для проведения технологического процесса это не имеет значения, так как гидролиз проходит быстро и полностью, но это значимо, если в наличие только один из реагентов.Alkaline hydrolysis of sea fat is a solution of potassium or sodium hydroxides. As our previous studies showed, this does not matter for the technological process, since hydrolysis proceeds quickly and completely, but this is significant if only one of the reagents is present.
Важным фактором, выступающим за сохранность ДГК, является применение в технологии малоагрессивных веществ. Отсутствие серной кислоты при производстве ДГК можно рассматривать как правильный прием работы с высоко неустойчивыми соединениями. Серная кислота, самая доступная на рынке по цене, но, в какой бы концентрации она не присутствовала, она может повредить значительную часть ПНЖК. Фактически, в свободных жирных кислотах после стадии гидролиза присутствует определенное количество окисленных смолоподобных соединений. Поэтому применение в процессе гидролиза соляной кислоты, не обладающей разрушительными свойствами на липиды, положительно отразится на качестве продукта.An important factor advocating the preservation of DHA is the use of slightly aggressive substances in the technology. The absence of sulfuric acid in the production of DHA can be considered as the correct way to work with highly unstable compounds. Sulfuric acid, the most affordable on the market, but, in whatever concentration it is present, it can damage a significant part of the PUFA. In fact, in free fatty acids, after the hydrolysis step, a certain amount of oxidized resin-like compounds is present. Therefore, the use in the process of hydrolysis of hydrochloric acid, which does not have destructive properties on lipids, will positively affect the quality of the product.
Для полного выделения свободных жирных кислот из нейтрализованной смеси на стадии гидролиза и после кристаллизации с мочевиной используют гексан. Данная процедура обеспечивает деликатное выделение лабильных веществ из раствора. К тому же продукт, а это жировые субстанции, полностью переходит в растворитель, что снижает производственные потери, позволяет легко отделять этот объем от водной части и сохраняет продукт из-за снижения его прямого контакта с кислородом воздуха.Hexane is used to completely isolate free fatty acids from the neutralized mixture at the stage of hydrolysis and after crystallization with urea. This procedure provides a delicate allocation of labile substances from the solution. In addition, the product, and this is fatty substances, completely passes into the solvent, which reduces production losses, makes it easy to separate this volume from the water part and saves the product due to a decrease in its direct contact with atmospheric oxygen.
При кристаллизации с мочевиной используют соотношение компонентов свободные жирные кислоты – мочевина – этанол 1 : 3 : 18, кг/кг/л. Данное соотношение очень критичный показатель. В данном случае мы имеем баланс компонентов, нарушение которого приводит к невозможности получения целевого продукта - концентрата ДГК.During crystallization with urea, the ratio of the components of free fatty acids - urea - ethanol 1: 3: 18, kg / kg / l, is used. This ratio is a very critical indicator. In this case, we have a balance of components, the violation of which makes it impossible to obtain the target product - DHA concentrate.
Именно данное соотношение приводит к оптимальному образованию кристаллов жирных кислот с мочевиной. Оно обеспечивает, даже при низких температурах, достаточность количества мочевины для ускоряющегося процесса образования кристаллов. Если взять бόльшее количество мочевины, то процесс протекает неконтролируемо, в образующиеся кристаллы захватываются значительные количества полиненасыщенных жирных кислот, в том числе и ДГК. Обогащение продукта ДГК уже не происходит, мочевина забирает из раствора все кислоты без всякой селективности. Происходит неоправданная потеря вещества, так как осадок – это отход, и, в итоге низкий выход без всякого увеличения концентрации ДГК.It is this ratio that leads to the optimal formation of crystals of fatty acids with urea. It provides, even at low temperatures, a sufficient amount of urea for the accelerating process of crystal formation. If we take a larger amount of urea, the process proceeds uncontrollably, significant amounts of polyunsaturated fatty acids, including DHA, are captured in the crystals formed. The enrichment of the DHA product no longer occurs, urea takes all acids from the solution without any selectivity. An unjustified loss of substance occurs, since the precipitate is a waste, and, as a result, a low yield without any increase in the concentration of DHA.
При уменьшении содержания мочевины в растворе, наблюдается обратный эффект – мочевины недостаточно для образования кристаллов с другими кислотами. Процесс, в результате, усложняется. Необходимо использовать низкие температуры, чтобы остатки мочевины выпадали из раствора, образуя кристаллы с кислотами, что крайне неэкономично.With a decrease in the urea content in the solution, the opposite effect is observed - urea is not enough to form crystals with other acids. The process, as a result, is complicated. It is necessary to use low temperatures so that urea residues precipitate from the solution, forming crystals with acids, which is extremely uneconomical.
Другим важным показателем, характеризующим систему кристаллизации, является соотношение количеств мочевины и растворителя (в данном случае этанола). Поскольку при температурах 0-50С, как показывает прототип, высокообогащенный концентрат ДГК получить нельзя, так как другие менее ненасыщенные жирные кислоты еще слабо образуют кристаллы с мочевиной, то, предпринятое нами техническое решение продемонстрировало, что, как оказывается, при правильно выбранных соотношения компонентов, этот процесс можно сдвинуть в нужном направлении, применяя более низкие температуры при кристаллизации. Однако при этом есть особенность: растворы с высокой концентрацией мочевины при низких температурах кристаллизации провоцируют слишком быстрое образование кристаллов. В результате падает селективность разделения полиненасыщенных жирных кислот, что отражается на качестве продукта.Another important indicator characterizing the crystallization system is the ratio of urea to solvent (in this case, ethanol). Since at a temperature of 0-5 0 C, as the prototype shows, a highly enriched DHA concentrate cannot be obtained, since other less unsaturated fatty acids still weakly form crystals with urea, our technical solution showed that, as it turns out, with correctly selected ratios components, this process can be shifted in the right direction, applying lower temperatures during crystallization. However, there is a peculiarity: solutions with a high concentration of urea at low crystallization temperatures provoke too rapid crystal formation. As a result, the selectivity of the separation of polyunsaturated fatty acids decreases, which affects the quality of the product.
Предлагаемое нами соотношение мочевина – этанол 3 : 18 полностью обеспечивает контролируемое протекание кристаллизации с постепенным образованием осадка. Если долю растворителя уменьшать, то мы сталкиваемся с проблемами, указанными выше, если, наоборот, увеличивать, то это приводит к снижению концентрации ДГК, снижению выхода целевого продукта, увеличению технологических объемов и связанного с этим аппаратурного оформления.The urea - ethanol ratio of 3: 18 that we offer fully ensures a controlled crystallization with a gradual formation of a precipitate. If the solvent fraction is reduced, then we encounter the problems mentioned above, if, on the contrary, it is increased, then this leads to a decrease in the concentration of DHA, a decrease in the yield of the target product, an increase in technological volumes, and related hardware design.
При первой кристаллизации используют температуру +18-220С. Снижение температуры менее 180С приводит к неравномерности образования первых кристаллов, а повышение свыше 220С не обеспечивает окончание этого процесса. И в том, и в другом случае, это отражается на целевом продукте – снижается концентрация ДГК в целевом продукте.During the first crystallization, a temperature of + 18-22 0 C is used. A decrease in temperature below 18 0 C leads to uneven formation of the first crystals, and an increase above 22 0 C does not ensure the end of this process. And in that, and in another case, this is reflected in the target product - the concentration of DHA in the target product is reduced.
Время первой кристаллизации, после смешения компонентов, составляет 3-5 часов. Для того чтобы образовались первые кристаллы, которые будут служить центрами, инициирующими процесс образования кристаллов в дальнейшем, необходимо дать выдержку смеси не менее 3-х часов. Если время сократить, то в смеси при кристаллизации при 18-220С начнется хаотичный процесс образования кристаллов, не способствующий желаемому разделению жирных кислот, а полученный концентрат будет менее обогащенным ДГК. Если время кристаллизации будет более 5-ти часов, то никакого влияния на качество конечного продукта это уже не имеет. 5 час - время достаточное для полной кристаллизации ДГК, дальнейшее увеличение времени нецелесообразно.The time of the first crystallization, after mixing the components, is 3-5 hours. In order for the first crystals to form, which will serve as centers that initiate the process of crystal formation in the future, it is necessary to give an exposure of the mixture for at least 3 hours. If time is shortened, then in the mixture during crystallization at 18-22 0 С a chaotic process of crystal formation will start, which does not contribute to the desired separation of fatty acids, and the resulting concentrate will be less enriched with DHA. If the crystallization time is more than 5 hours, then this already has no effect on the quality of the final product. 5 hours - time sufficient for the complete crystallization of DHA, a further increase in time is impractical.
При второй кристаллизации используют температуру минус 20-250С. Понижение температуры, менее минус 250С, приводит к снижению селективности процесса кристаллизации – в кристаллы, наряду с другими жирными кислотами, включаются значительные количества ДГК. Это отражается на выходе продукта – он снижается и на составе – падает концентрация ДГК. Увеличение температуры, свыше минус 200С, не обеспечивает необходимой концентрации ДГК в продукте.In the second crystallization, a temperature of minus 20-25 0 C is used. Lowering the temperature, less than minus 25 0 C, leads to a decrease in the selectivity of the crystallization process - significant amounts of DHA are included in the crystals, along with other fatty acids. This is reflected in the yield of the product — it decreases and in the composition — the concentration of DHA decreases. An increase in temperature, above minus 20 0 С, does not provide the necessary concentration of DHA in the product.
Время второй кристаллизации составляет 12-24 часа. Уменьшение времени, менее 12-ти часов, приводит к снижению выхода целевого продукта, а его увеличение, свыше 24-х часов, на выходе и концентрации ДГК не отражается.The second crystallization time is 12-24 hours. A decrease in time, less than 12 hours, leads to a decrease in the yield of the target product, and its increase, over 24 hours, does not affect the output and concentration of DHA.
Для получения чистой фракции ДКГ целевой продукт подвергают очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.To obtain a pure fraction of DCG, the target product is subjected to purification by high performance liquid chromatography.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Гидролиз морского жираHydrolysis of Sea Fat
Морской (рыбный) жир загружали в стеклянную емкость с подогревом и мешалкой и добавляли раствор NaOH или КОН в 70%-м этанола. Смесь перемешивали 1 час при температуре 650С. Далее реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и подкисляли 10%-ной соляной кислотой до рН=2. Свободные жирные кислоты экстрагировали гексаном, 3 х 150 мл. Объединенный гексановый экстракт промывали дистиллированной водой, 2 х 200 мл. Упаривали под вакуумом.Sea (fish) fat was loaded into a glass container with heating and stirrer and a solution of NaOH or KOH in 70% ethanol was added. The mixture was stirred for 1 hour at a temperature of 65 0 C. Then the reaction mixture was cooled to room temperature and acidified with 10% hydrochloric acid to pH = 2. Free fatty acids were extracted with hexane, 3 x 150 ml. The combined hexane extract was washed with distilled water, 2 x 200 ml. Evaporated under vacuum.
Кристаллизация жирных кислот с мочевинойCrystallization of urea fatty acids
Мочевину добавляли к 96%-ному этанолу (из расчета 3 : 18, кг/л) и нагревали до 500С при перемешивании. После полного растворения мочевины добавляли свободные жирные кислоты. Кристаллизацию проводили в два этапа: первый - при температуре 18-220С в течение 3-5 ч, второй при температуре минус 20-250С в течение 12-24 часов. Образовавшиеся кристаллы отделяли от супернатанта фильтрованием при температуре кристаллизации. К фильтрату добавляли три объема воды и экстрагировали свободные жирные кислоты гексаном. Объединенные гексановые экстракты дважды промывали дистиллированной водой. Для обезвоживания экстракты пропускали через слой сульфата натрия и упаривали под вакуумом в токе азота.Urea was added to 96% ethanol (based on 3: 18, kg / l) and heated to 50 ° C with stirring. After complete dissolution of the urea, free fatty acids were added. Crystallization was carried out in two stages: the first at a temperature of 18-22 ° C for 3-5 hours, the second at a temperature of minus 20-25 0 C for 12-24 hours. The resulting crystals were separated from the supernatant by filtration at a crystallization temperature. Three volumes of water were added to the filtrate and the free fatty acids were extracted with hexane. The combined hexane extracts were washed twice with distilled water. For dehydration, the extracts were passed through a layer of sodium sulfate and evaporated in vacuo in a stream of nitrogen.
Высокоэффективная жидкостная хроматографияHigh Performance Liquid Chromatography
При необходимости и, в большей степени при наличии соответствующего оборудования, ДГК можно получить в очень концентрированном виде, используя метод препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) известным методом (Патент РФ № 2 620 164 «Способ получения арахидоновой кислоты из морской красной водоросли рода Gracilaria», 23.05.2017, МКП А61К 31/20, А61К 36/04).If necessary, and to a greater extent with the appropriate equipment, DHA can be obtained in a very concentrated form using the preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) method of the known method (RF Patent No. 2 620 164 "Method for producing arachidonic acid from seaweed of the genus Gracilaria" , 05.23.2017, MKP A61K 31/20, A61K 36/04).
Концентрат докозагексаеновой кислоты для разделения ВЭЖХ предварительно переводили в этиловые эфиры жирных кислот (ЭЭЖК). К свободным жирным кислотам добавляли 5%-ный раствор хлористого ацетила в безводном этаноле. Реакционную смесь перемешивали при температуре 400С в течение 1 ч. Контроль за прохождением реакции осуществляли тонкослойной хроматографией, как описано выше. После завершения реакции к смеси добавляли дистиллированную воду и экстрагировали ЭЭЖК гексаном. Гексан промывали водой, обезвоживали пропуская через слой безводного сульфата натрия, упаривали под вакуумом в токе азота.The docosahexaenoic acid concentrate for HPLC separation was previously converted to fatty acid ethyl esters (EEFA). A 5% solution of acetyl chloride in anhydrous ethanol was added to the free fatty acids. The reaction mixture was stirred at 40 0 C for 1 h. Control of the progress of the reaction was carried out by thin layer chromatography, as described above. After completion of the reaction, distilled water was added to the mixture, and the EECA was extracted with hexane. Hexane was washed with water, dehydrated by passing through a layer of anhydrous sodium sulfate, and evaporated under vacuum in a stream of nitrogen.
ВЭЖХ была выполнена на хроматографе LC-8A (Shimadzu, Япония) с детекторами UV/VIS SPD-20A (210 нм) и RID-10A. Препаративное разделение проводили на колонке Discovery HS С-18, 10 µм 25 см Ч 50 мм (Supelco, США). Элюирование осуществляли в изократическом режиме системой растворителей этанол-вода (80:20, об./об.). Скорость элюирования составила 50 мл/мин. Элюаты этиловых эфиров ДГК объединяли и упаривали под вакуумом в токе азота.HPLC was performed on an LC-8A chromatograph (Shimadzu, Japan) with UV / VIS SPD-20A (210 nm) and RID-10A detectors. Preparative separation was performed on a Discovery HS C-18 column, 10 μm 25 cm × 50 mm (Supelco, USA). Elution was carried out in an isocratic mode with an ethanol-water solvent system (80:20, v / v). The elution rate was 50 ml / min. DHA ethyl esters were combined and evaporated in vacuo under a stream of nitrogen.
Изобретение иллюстрируется следующими материалами: на фиг.1. приведена структурная формула докозагексаеновой кислоты, на фиг.2. – хроматограмма ВЭЖХ целевого продукта, в табл. представлен состав главных жирных кислот исходных жиров и концентратов ДГК, полученных кристаллизацией с мочевиной, полученных по примерам 1 и 2.The invention is illustrated by the following materials: figure 1. shows the structural formula of docosahexaenoic acid, figure 2. - HPLC chromatogram of the target product, in table. presents the composition of the main fatty acids of the starting fats and DHA concentrates obtained by crystallization with urea obtained in examples 1 and 2.
Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.
Реактивы и общие аналитические процедуры для всех примеровReagents and general analytical procedures for all examples
Все используемые реактивы и растворители были марки «хч»; гидроксид натрия, гидроксид калия, этанол, гексан и петролейный эфир, 400-600С («Реагент», Москва), мочевина (карбамид) (АО «ЛенРеактив»).All reagents and solvents used were brand name “hch”; sodium hydroxide, potassium hydroxide, ethanol, hexane and petroleum ether, 40 0 -60 0 С ("Reagent", Moscow), urea (urea) (JSC "LenReaktiv").
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) липидов для контроля за процессами осуществляли на пластинках с закрепленным слоем силикагеля («Sorbfil», Россия) при использовании элюирующей системы 80:20:1, гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота, об./об./об., для определения состава нейтральных липидов.Thin layer chromatography (TLC) of lipids for monitoring the processes was carried out on plates with a fixed layer of silica gel (Sorbfil, Russia) using an eluting system of 80: 20: 1, hexane-diethyl ether-acetic acid, v / v / v. , to determine the composition of neutral lipids.
Метиловые эфиры жирных кислот липидов для ГЖХ-анализа получали согласно методике (Carreau J.P., Dubacq J.P. «Adaptation of a macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts» // J. Chromatogr. – 1978. – Vol. 151, № 3. - 384–390). Анализ метиловых эфиров жирных кислот проводили газовой хроматографией на хроматографе Shimadzu GC-17A («Shimadzu», Kyoto, Japan) с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой 30 m × 0.25 mm i.d. «Supelcowax 10» (Bellefonte, USA), условия анализа: температура колонки 1900С, инжектора и детектора 2400C, газ-носитель гелий. Идентификацию пиков метиловых эфиров жирных кислот проводили по временам удерживания индивидуальных эфиров жирных кислот и с использованием стандартных смесей ПНЖК («Supelco», Bellefonte, USA) и с использованием значений эквивалентной длины цепи (Christie W.W. «Lipid Analysis: Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids». - The oily Press, Bridgwater (UK), 2003. – 416 р.).Lipid fatty acid methyl esters for GLC analysis were prepared according to the methodology (Carreau JP, Dubacq JP "Adaptation of a macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts" // J. Chromatogr. - 1978. - Vol. 151, No. 3. - 384–390). Fatty acid methyl esters were analyzed by gas chromatography on a Shimadzu GC-17A chromatograph (Shimadzu, Kyoto, Japan) with a flame ionization detector and a 30 m × 0.25 mm id Supelcowax 10 capillary column (Bellefonte, USA), analysis conditions: column temperature 190 0 С, injector and detector 240 0 С, carrier gas helium. Identification of peaks of fatty acid methyl esters was carried out by retention times of individual fatty acid esters and using standard mixtures of PUFAs (Supelco, Bellefonte, USA) and using equivalent chain lengths (Christie WW “Lipid Analysis: separation, identification and structural analysis of lipids ". - The oily Press, Bridgwater (UK), 2003. - 416 p.).
Пример 1Example 1
Гидролиз морского жира (жир дальневосточного лосося, Берингово море)Hydrolysis of sea fat (fat of Far Eastern salmon, the Bering Sea)
100 г морского (рыбного) жира загружали в 2 л стеклянную емкость с подогревом и мешалкой и добавляли раствор 14,5 г NaOH в 500 мл 70%-ного этанола. Смесь перемешивали 1 час при температуре 650С. Контроль за окончанием реакции гидролиза жира проводили тонкослойной хроматографией продуктов реакции на пластинках со слоем силикагеля («Sorbfil», Россия) в системе 80:20:1, гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (объемные %). Далее реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и подкисляли 10%-ной соляной кислотой до рН=2. Свободные жирные кислоты экстрагировали гексаном, 3 х 150 мл. Объединенный гексановый экстракт промывали дистиллированной водой, 2 х 200 мл. Упаривали под вакуумом.100 g of sea (fish) fat was loaded into a 2 L glass container with heating and stirrer and a solution of 14.5 g of NaOH in 500 ml of 70% ethanol was added. The mixture was stirred for 1 hour at a temperature of 65 ° C. The end of the fat hydrolysis reaction was monitored by thin-layer chromatography of the reaction products on plates with a layer of silica gel (Sorbfil, Russia) in a 80: 20: 1 system, hexane-diethyl ether-acetic acid (volume %). Next, the reaction mixture was cooled to room temperature and acidified with 10% hydrochloric acid to pH = 2. Free fatty acids were extracted with hexane, 3 x 150 ml. The combined hexane extract was washed with distilled water, 2 x 200 ml. Evaporated under vacuum.
Получено 91,5 г свободных жирных кислот.Received 91.5 g of free fatty acids.
Кристаллизация жирных кислот с мочевинойCrystallization of urea fatty acids
Мочевину в количестве 274,5 г добавляли к 1647 мл 96%-ного этанола (из расчета 3 : 18, кг/л) и нагревали до 500С при перемешивании. После полного растворения мочевины добавляли свободные жирные кислоты. Кристаллизацию проводили в два этапа: первый - при температуре 180С в течение 5 ч, второй при температуре минус 250С в течение 12 часов. Образовавшиеся кристаллы были отделены от супернатанта фильтрованием при температуре кристаллизации. К фильтрату добавляли три объема воды и экстрагировали свободные жирные кислоты гексаном, 3 х 150 мл. Объединенные гексановые экстракты промывали дистиллированной водой. Для обезвоживания пропускали через слой сульфата натрия и упаривали под вакуумом в токе азота.Urea in the amount of 274.5 g was added to 1647 ml of 96% ethanol (at a rate of 3: 18, kg / l) and heated to 50 ° C with stirring. After complete dissolution of the urea, free fatty acids were added. Crystallization was carried out in two stages: the first at a temperature of 18 0 C for 5 hours, the second at a temperature of minus 25 0 C for 12 hours. The resulting crystals were separated from the supernatant by filtration at crystallization temperature. Three volumes of water were added to the filtrate and free fatty acids were extracted with hexane, 3 x 150 ml. The combined hexane extracts were washed with distilled water. For dehydration, it was passed through a layer of sodium sulfate and evaporated in vacuo under a stream of nitrogen.
Состав жирных кислот липидов экстракта определяли газо-жидкостной хроматографией (Таблица).The fatty acid composition of the extract lipids was determined by gas-liquid chromatography (Table).
Получено: 4,77 г концентрата с содержанием 53,18% ДГК.Received: 4.77 g of concentrate containing 53.18% of DHA.
Выход: 35,0% в расчете на ДГК.Yield: 35.0% based on DHA.
Для выделения из концентрата чистой докозагексаеновой кислоты использовали следующий метод.The following method was used to isolate pure docosahexaenoic acid from the concentrate.
Очистка докозагексаеновой кислоты препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографиейPurification of docosahexaenoic acid by preparative high performance liquid chromatography
Концентрат докозагексаеновой кислоты, 4,77 г, для разделения высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) предварительно переводили в этиловые эфиры жирных кислот (ЭЭЖК). К свободным жирным кислотам добавляли 50 мл 5%-ного раствора хлористого ацетила в безводном этаноле. Реакционную смесь перемешивали при температуре 400С в течение 1 ч. Контроль за прохождением реакции осуществляли тонкослойной хроматографией, как описано выше. После завершения реакции к смеси добавляли дистиллированную воду, 50 мл, и экстрагировали ЭЭЖК гексаном, 3 х 30мл. Гексан промывали водой, 2 х 20мл, обезвоживали пропуская через слой безводного сульфата натрия, упаривали под вакуумом.A docosahexaenoic acid concentrate, 4.77 g, for separation by high performance liquid chromatography (HPLC) was previously converted to fatty acid ethyl esters (EEFA). To the free fatty acids was added 50 ml of a 5% solution of acetyl chloride in anhydrous ethanol. The reaction mixture was stirred at 40 0 C for 1 h. Control of the progress of the reaction was carried out by thin layer chromatography, as described above. After completion of the reaction, distilled water, 50 ml was added to the mixture, and 3 × 30 ml of EEC was extracted with hexane. Hexane was washed with water, 2 x 20 ml, dehydrated by passing through a layer of anhydrous sodium sulfate, and evaporated in vacuo.
ВЭЖХ была выполнена на хроматографе LC-8A (Shimadzu, Япония) с детекторами UV/VIS SPD-20A (210 нм) и RID-10A. Препаративное разделение проводили на колонке Discovery HS С-18, 10 µм 25 см Ч 50 мм (Supelco, США). Элюирование осуществляли в изократическом режиме системой растворителей этанол-вода (80:20, об./об.). Скорость элюирования составила 50 мл/мин. Элюаты этиловых эфиров ДГК объединяли и упаривали под вакуумом в токе азота. Состав жирных кислот препарата ДГК в виде этилового эфира приведен в Таблице 1 а на и Фиг. 2 приведена хроматограмма анализа. HPLC was performed on an LC-8A chromatograph (Shimadzu, Japan) with UV / VIS SPD-20A (210 nm) and RID-10A detectors. Preparative separation was performed on a Discovery HS C-18 column, 10 μm 25 cm × 50 mm (Supelco, USA). Elution was carried out in an isocratic mode with an ethanol-water solvent system (80:20, v / v). The elution rate was 50 ml / min. DHA ethyl esters were combined and evaporated in vacuo under a stream of nitrogen. The fatty acid composition of the DHA preparation in the form of ethyl ester is shown in Table 1 a and FIG. 2 shows the chromatogram analysis.
Получено: 2,40 г концентрата с содержанием 94,11% ДГК в виде этилового эфира.Received: 2.40 g of concentrate with a content of 94.11% DHA in the form of ethyl ether.
Выход на стадии ВЭЖХ: 89,1%.Yield at HPLC: 89.1%.
Общий выход: 31,1% в расчете на ДГКTotal yield: 31.1% based on DHA
Пример 2.Example 2
Все операции в данном примере проводили также как в примере 1, за исключением того, что:All operations in this example were carried out as in example 1, except that:
- в качестве морского жира использовали жир из печени сельдевой акулы (Охотское море);- as sea fat used fat from the liver of herring shark (Sea of Okhotsk);
- гидролиз жира проводили калиевой щелочью, КОН;- fat hydrolysis was carried out with potassium alkali, KOH;
- первую кристаллизацию проводили при температуре 220С и продолжительностью 3 часов;- the first crystallization was carried out at a temperature of 22 0 C and a duration of 3 hours;
- вторая кристаллизация проведена при температуре минус 200С и продолжительностью 24 часа;- the second crystallization was carried out at a temperature of minus 20 0 C and a duration of 24 hours;
- в качестве инертного газа при упаривании применяли аргон.- argon was used as an inert gas during evaporation.
Получено: 18,97 г концентрата с содержанием 73,01% ДГК.Received: 18.97 g of concentrate containing 73.01% of DHA.
Выход: 35,9% в расчете на ДГК.Yield: 35.9% based on DHA.
Состав главных жирных кислот исходных жиров и концентратов ДГК, полученных кристаллизацией с мочевиной, полученных по примерам 1 и 2 представлен в таблице.The composition of the main fatty acids of the starting fats and DHA concentrates obtained by crystallization with urea obtained in examples 1 and 2 are presented in the table.
Как видно из представленных результатов, осуществление способа в заявленных режимах обеспечивает получение высокообогащенного ДКГ препарата практически в одну стадию. Способ прост в исполнении, не использует агрессивные реактивы и может быть реализован в практических целях в любой лаборатории.As can be seen from the presented results, the implementation of the method in the claimed modes provides highly enriched DKG preparation in almost one stage. The method is simple to implement, does not use aggressive reagents and can be implemented for practical purposes in any laboratory.
Таблица Table
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019118773A RU2698720C1 (en) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | Method of producing docosahexaenoic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019118773A RU2698720C1 (en) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | Method of producing docosahexaenoic acid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2698720C1 true RU2698720C1 (en) | 2019-08-29 |
Family
ID=67851678
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019118773A RU2698720C1 (en) | 2019-06-18 | 2019-06-18 | Method of producing docosahexaenoic acid |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2698720C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540116A (en) * | 2022-02-24 | 2022-05-27 | 海南潜龙生物科技有限公司 | Refining method of alligator oil |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989011521A1 (en) * | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Staroil Limited | Process for preparing polyunsaturated fatty acids |
| SU1581737A1 (en) * | 1988-06-23 | 1990-07-30 | Институт биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР | Method of a concentrate of ethyl esters of eukosapentaenic and decosahexaenic acids |
-
2019
- 2019-06-18 RU RU2019118773A patent/RU2698720C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989011521A1 (en) * | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Staroil Limited | Process for preparing polyunsaturated fatty acids |
| SU1581737A1 (en) * | 1988-06-23 | 1990-07-30 | Институт биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР | Method of a concentrate of ethyl esters of eukosapentaenic and decosahexaenic acids |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Wright, S.W. et al. An effective process for the isolation of Docosahexaenoic acid in quantity from cod liver oil. J.Org.Chem., 1987, 52(19), 4399-4401. * |
| Wright, S.W. et al. An effective process for the isolation of Docosahexaenoic acid in quantity from cod liver oil. J.Org.Chem., 1987, 52(19), 4399-4401. Е.В. Ермоленко и др. Комплексная переработка липидов печени командорского кальмара BERRYTEUTHIS MAGISTER. Известия ТИНРО, 2014, том 176, 288-294. * |
| Е.В. Ермоленко и др. Комплексная переработка липидов печени командорского кальмара BERRYTEUTHIS MAGISTER. Известия ТИНРО, 2014, том 176, 288-294. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114540116A (en) * | 2022-02-24 | 2022-05-27 | 海南潜龙生物科技有限公司 | Refining method of alligator oil |
| CN114540116B (en) * | 2022-02-24 | 2024-02-13 | 海南潜龙生物科技有限公司 | Crocodile oil refining method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5777141A (en) | Process for recovering unsaturated fatty acids and derivatives thereof | |
| CA2114422A1 (en) | Triglycerides (ii) | |
| KR102289886B1 (en) | Chromatographic method for producing polyunsaturated fatty acids | |
| JPH0225447A (en) | Production of highly unsaturated fatty acids | |
| Latyshev et al. | Concentration and purification of polyunsaturated fatty acids from squid liver processing wastes | |
| WO2009063500A2 (en) | Novel methods of isolation of poly unsaturated fatty acids | |
| CN105848748B (en) | Chromatographic Purification of Fatty Acids | |
| US20110033595A1 (en) | Fatty acid fractionation process, fatty acid products and use thereof | |
| AU2025201537A1 (en) | DHA Enriched Polyunsaturated Fatty Acid Compositions | |
| AU2025203346A1 (en) | DHA Enriched Polyunsaturated Fatty Acid Compositions | |
| JP6467426B2 (en) | Purification of fatty acids by chromatographic methods. | |
| AU2020201738A1 (en) | Free-polyunsaturated-fatty-acid-containing composition and method for manufacturing same | |
| RU2698720C1 (en) | Method of producing docosahexaenoic acid | |
| AU2018428607B2 (en) | ALA enriched polyunsaturated fatty acid compositions | |
| JP6464144B2 (en) | Method for purifying stearidonic acid | |
| AU2018428608B2 (en) | DHA enriched polyunsaturated fatty acid compositions | |
| WO2011018096A1 (en) | Phytanic acid fractionation process, fatty acid products and use thereof | |
| US7365219B2 (en) | Solid phase extraction method for obtaining high-purity unsaturated compounds or derivatives of said compounds | |
| RU2537252C1 (en) | Method of obtaining docosahexaenoic acid | |
| CN111979051A (en) | A kind of method for extracting polyene unsaturated fatty acid from microalgae algal oil | |
| RU2627273C1 (en) | Method for arachidonic acid production |