RU2698205C2

RU2698205C2 - Способ определения антител, вызывающих комплемент-зависимую цитотоксичность

Info

Publication number: RU2698205C2
Application number: RU2017124512A
Authority: RU
Inventors: Зоня ОФФНЕР; Карлхайнц ЦИК
Original assignee: Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2019-08-23
Also published as: WO2016096788A1; CA2966551A1; EP3234598A1; EP3633371A1; CN107002114A; BR112017011170A2; MX2017007209A; RU2017124512A3; US20180017572A1; EP3234598B1; JP2018503368A; KR20170094787A; RU2017124512A

Abstract

Изобретение относится к определению комплемент-зависимой цитотоксичности композиции. Способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции, содержащей первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, конъюгированный со вторым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, включает следующие стадии: инкубацию человеческой клетки, экспрессирующей первый антиген или первый антиген и второй антиген, с композицией, добавление к смеси стадии (а) кроличьего комплемента, определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности композиции. Изобретение обеспечивает улучшенный тест по определению комплемент-зависимой цитотоксичности. 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 13 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к анализу и способам определения/отбора антител и комбинаций антител, опосредующих эффекторные функции.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммуноглобулины содержат два сайта связывания для определенных Fc рецепторов, таких как FcRn, а также для Clq, по одному в Fc-области каждой тяжелой цепи.

Для активации комплемента необходимо более одной молекулы иммуноглобулина, поскольку аффинность мономерного IgG в отношении Clq является достаточно низкой (аффинность приблизительно 10^-4 М) (см., например, Sledge et al., J. Biol. Chem. 248 (1973) 2818-2813, Hughes-Jones et al., Mol. Immunol. 16 (1979) 697-701). Связывание мультивалентного C1q и, следовательно, активация комплемента, могут быть усилены в результате опосредованной антигенами ассоциации молекул иммуноглобулинов (аффинность приблизительно 10^-8 М) (см., например, Burton et al., Mol. Immunol. 22 (1990) 161-206).

Трехмерная структура Clq напоминает букет тюльпанов, включающий в себя шесть глобулярных головок, которые содержат области связывания антитела (см., например, Perkins et al., Biochem. J. 228 (1985) 13-26, Poon et al., J. Mol. Biol. 168 (1983) 563-577, Reid et al., Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 1-12, and Weiss et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 573-581).

US 5,851,528 описывает способы ингибирования активации комплемента. Рекомбинантные антитела против CD55 и CD59 и их применение описано в US 8,034,902. US 2012/0226020 описывает гибридные и химерные полипептиды, регулирующие активацию комплемента. Новые модуляторы и способы применения описаны в US 2013/0302355. US 2010/0255011 описывает композиции и способы для модулирования активности регулирующих комплемент белков на клетках-мишенях.

В WO 2008/007648 описано, что классификация антител включает приведение в контакт антитела, способного распознавать антиген клеточной поверхности, с клетками того же вида, анализ каждой клетки и сравнение полученных данных и классификацию отдельных антител на основе сходства.

US 2010/120541 описывает композиции и способы для модулирования активности регулирующих комплемент белков на клетках-мишенях.

Mekhaiel, D.N.A., et al, описывают полимерные белки, слитые с Fc человека, обладающие модифицированными эффекторными функциями (Nature Sci. Rep. 1 (2011) 1-11). Варианты полипептидов с измененной эффекторной функцией описаны в WO 00/42072. US 2008/0089892 описывает варианты Fc области. Измененные Fc области антител и их применения описаны в WO 2006/105062.

Комплемент новорожденного крольчонка использовали для обеднения лимфоцитами различных сложных популяций иммунных клеток с помощью антител для улучшения трансплантации (см., например, Herve, P., et al., Transplant. 39 (1985) 138-143).

Попытки вызвать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC, от англ. complement dependent cytotoxicity), направленную против клеток карциномы почки, используя комплемент крольчонка и мышиные антитела, оказались неудачными (см., например, Vessella, R.L., et al., Canc. Res. 45 (1985) 6131-6139).

При использовании одиночных и спаренных мышиных IgG2a антител, связывающих р97 (= меланотрансферрин), сыворотка кролика могла вызывать гибель клеток меланомы человека SK-Mel28 (не эпителиальные = не карцинома) благодаря CDC (см., например, Hellstroem, I., et al., Int. J. Canc. 31 (1983) 553-555).

Уровень экспрессии мембраносвязанных белков, регулирующих комплемент (mCRPs, от англ. membrane-bound complement regulatory proteins), на лимфоцитах более низкий по сравнению с моноцитами и нейтрофилами (см., например, Nuutila, J., et al., Hum. Immunol. 74 (2013) 522-530).

Увеличение экспрессии mCRPs как механизм ускользания от иммунологического надзора более выражен у клеток большинства карцином, например, по сравнению с лимфомами или меланомами (см., например, Fishelson, Z., et al., Mol. Immunol. 40 (2003) 109-123).

Антитела использовали для демонстрации CDC либо с изогенной сывороткой (например, нормальной сывороткой человека (NHS, от англ. normal human serum) вместе с клетками карциномы человека и человеческими антителами) без ингибирующего CDC влияния mCRPs (см., например, Dechant et al., 2008, Cancer Research) или с изогенной сывороткой (например, нормальной сывороткой человека (NHS) вместе с клетками карциномы человека и человеческими антителами), демонстрирующими выраженное mCRP-зависимое ингибирующее CDC действие, которое требовалось преодолеть посредством siRNA-зависимого снижения экспрессии mCRPs CD46, CD55 и CD59 (см., например, Mamidi, S., et al., Mol. Onc. 7 (2013) 580-594).

Konishi, E., et al. описали использование комплемент-зависимой цитотоксичности для измерения низких уровней антител: использование неструктурного белка 1 на модели вируса японского энцефалита (Clin. Vac. Immunol. 15 (2008) 88-94). Klitgaard, J., et al. описали синергетическое действие комбинации двух моноклональных антител к CD5 при индукции комплемент-зависимой цитотоксичности, направленной против клеток хронического лимфоидного лейкоза (Brit. J. Hematol. 163 (2013) 182-193). Hellstrom, I., et al. опубликовали, что моноклональные антитела к двум детерминантам антигена р97 меланомы проявляют синергетическое действие при комплемент-зависимой цитотоксичности (J. Immunol. 127 (1981) 157-160. Maddipatla, S., et al., описали повышенную противоопухолевую активность комбинации моноклональных антител, направленных против Trail-R1 и CD20, при В-клеточной лимфоме (Clin. Cancer Res. 13 (2007) 4556-4564). Huang, J., et al. описали, что экспрессия человеческих DAF, CD59 и МСР обеспечивает защиту ксеногенных клеток от лизиса, опосредованного комплементом человека (FEMS Immunol. Med. Microbiol. 31 (2001) 253-529. Qu, Z., et al. описали рекомбинантное биспецифическое моноклональное антитело (bsMab) к CD20 и CD22, проявляющее активность in vitro и in vivo в отношении В-клеточных лимфом (Blood 108 (2006) 713а-714а).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описан улучшенный тест для анализа способности антител, связывающих поверхностный антиген клеток карциномы, опосредовать CDC, направленную против клеток карциномы. Данный тест не требует использования трудоемких, сложных и плохо воспроизводимых методик, например, таких как снижение экспрессии mCRPs с помощью siRNA. Данный подход позволяет преодолеть повышенную экспрессию mCRPs в клетках карциномы в качестве механизма ускользания от иммунологического надзора, позволяющего избежать действие CDC в организме. Предложенный анализ обеспечивает средства для определения CDC, которую опосредуют антитела, связывающие поверхностный антиген клеток карциномы, не способные индуцировать CDC в других условиях из-за влияния mCRPs.

Обнаружили, что для надежной индукции комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), направленной против клеток человека, в частности, клеток карциномы человека, можно применять не являющуюся изогенной сыворотку, такую как кроличий комплемент, вместе с человеческими или гуманизированными антителами и клетками карциномы человека. Благодаря применению BRC для определения способности человеческих или гуманизированных антител, специфически связывающихся с поверхностными антигенами клеток карциномы, опосредовать CDC:

- повышение экспрессии mCRPs на клетках карциномы не подавляет индуцирующее CDC действие человеческих или гуманизированных антител, что наблюдалось в других исследованиях,

- устраняется тот недостаток, что в некоторых случаях нормальная человеческая сыворотка (NHS) вызывала CDC в присутствии человеческих или гуманизированных антител и человеческих опухолевых клеток только после снижения экспрессии mCRPs при помощи siRNA, и

- становится возможным высокопроизводительный скрининг способности различных антител, различных форматов антител или различных конъюгатов антител опосредовать CDC.

Описанный в данном документе способ можно применять на опухолевых клетках, таких как клетки лимфомы или клетки карциномы, имеющие эпителиальное происхождение, а также на клетках, вызывающих аутоиммунный ответ.

Одним аспектом данного описания является способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции, содержащей i) первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и ii) второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, конъюгированный со вторым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, где способ включает следующие стадии:

а) инкубацию клетки, экспрессирующей первый антиген и второй антиген, с композицией,

б) добавление к смеси стадии (а) кроличьего комплемента и

в) определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности композиции.

Одним аспектом данного описания является способ отбора композиции, содержащей i) первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и ii) второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, конъюгированный со вторым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, обладающей CDC-активностью, где способ включает следующие стадии:

а) отдельную инкубацию клетки, экспрессирующей первый антиген и второй антиген, с двумя или несколькими композициями,

б) добавление к смеси стадии (а) кроличьего комплемента,

в) определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности композиции и

г) отбор композиции, обладающей CDC-активностью, на основании результатов стадии (в).

Одним аспектом данного описания является способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности антитела, содержащего i) по меньшей мере первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, ii) необязательно, второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, где способ включает следующие стадии:

а) инкубацию клетки, экспрессирующей по меньшей мере первый антиген и, необязательно, второй антиген, с антителом,

в) определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности антитела.

Одним аспектом данного описания является способ преодоления видоспецифичного mCRP-индуцированного ингибирования комплемент-зависимой цитотоксичности антитела, содержащего i) по меньшей мере первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, ii) необязательно, второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, где способ включает следующие стадии:

В одном воплощении антитело представляет собой формат антитела.

В одном воплощении две или более композиций различаются по первому и/или второму эпитопу или антигену.

В одном воплощении всех аспектов композиция содержит первое человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, и второе человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена.

В одном воплощении всех аспектов композиция содержит человеческое или гуманизированное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым эпитопом первого антигена и вторым эпитопом второго антигена.

В одном воплощении всех аспектов первый антиген и второй антиген представляют собой один и тот же антиген, а первый эпитоп и второй эпитоп различаются. В одном воплощении первый эпитоп и второй эпитоп представляют собой неперекрывающиеся эпитопы.

В одном воплощении всех аспектов клеточный лизис определяют через 0,5-3 часа после добавления комплемента.

В одном воплощении всех аспектов клетка представляет собой опухолевую клетку. В одном воплощении опухолевая клетка представляет собой клетку карциномы. В одном воплощении опухолевая клетка представляет собой клетку карциномы эпителиального происхождения.

В одном воплощении всех аспектов клетка представляет собой человеческую клетку. В одном воплощении человеческая клетка представляет собой человеческую опухолевую клетку. В одном воплощении человеческая клетка представляет собой клетку В-клеточной лимфомы человека. В одном воплощении человеческая опухолевая клетка представляет собой клетку карциномы человека. В одном предпочтительном воплощении человеческая опухолевая клетка представляет собой человеческую клетку карциномы эпителиального происхождения.

В одном воплощении всех аспектов способ представляет собой бессывороточный способ.

В одном предпочтительном воплощении всех аспектов кроличий комплемент представляет собой комплемент крольчонка.

В одном воплощении соотношение первого сайта связывания и второго сайта связывания составляет от 10:1 до 1:10. В одном предпочтительном воплощении соотношение составляет от 0,5:1 до 1:0,5.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1А: Специфическую CDC, направленную против клеток ВТ-474, определяли по высвобождению ЛДГ и выражали в % CDC; черные круги: трастузумаб; черные квадраты: пертузумаб; треугольники с вершиной вверху: комбинация трастузумаба и пертузумаба; треугольники с вершиной внизу = биспецифическое антитело к HER2, общая легкая цепь; ромбы = биспецифическое антитело к HER2, общая легкая цепь, с модифицированной схемой гликозилирования; белые круги = биспецифическое антитело к HER2, формат CrossMab.

Б: Специфическая CDC, направленная против клеток ВТ-474 (верхний график) и SK-Br3 (нижний график); 1 = трастузумаб; 2 = пертузумаб; 3 = комбинация трастузумаба и пертузумаба; 4 = контроль, IgG1 человека, легкая каппа-цепь; левые столбцы: специфическая CDC в присутствии комплемента крольчонка; правые столбцы: специфическая CDC в отсутствие комплемента крольчонка; % CDC и специфическая CDC означает специфическую цитотоксичность [%].

Фиг. 2. Динамика клеточного индекса (АСЕА); 1 = трастузумаб; 2 = пертузумаб; 3 = только среда; 4 = контроль с комплементом; 5 = комбинация трастузумаба и пертузумаба; 6 = биспецифическое антитело к HER2, общая легкая цепь; 7 = биспецифическое антитело к HER2, общая легкая цепь, с модифицированной схемой гликозилирования; 8 = биспецифическое антитело к HER2, формат CrossMab.

Фиг. 3. Динамика клеточного индекса (АСЕА); 1 = только среда; 2 = контроль с комплементом; 3 = с антителом к CD55, пулированной сывороткой человека, трастузумабом, пертузумабом; 4 = с антителом к CD59, пулированной сывороткой человека, трастузумабом, пертузумабом; 5 = с антителом к CD55, антителом к CD59, пулированной сывороткой человека, трастузумабом и пертузумабом; 6 = трастузумаб, пертузумаб и комплемент крольчонка.

Фиг. 4. Результаты исследования CDC с использованием клеток SK-OV-3 с нокдауном CD46, CD55, CD59 (тройной нокдаун). Клетки инкубировали с каждым антителом в концентрации 10 мкг/мл, комплементом крольчонка и нормальной сывороткой человека, соответственно.

СВЕДЕНИЯ. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. ТЕРМИНОЛОГИЯ

Термин «связывание Clq» обозначает связывание Clq с антителом, связанным со своим антигеном. Связывание антитела с его антигеном определяют, без ограничений, in vivo и in vitro, в рамках способов и исследований, согласно данному описанию.

В одном воплощении связывание Clq определяют способом, включающим i) иммобилизацию антитела с концентрацией в диапазоне от 0,007 до 25,0 мг/мл в ФСБ в многолуночном планшете (например, 96-луночный планшет для ИФА) в течение ночи при 4°С, ii) отмывание планшетов, iii) блокирование оставшихся реакционноспособных поверхностных остатков смесью 0,5 × ФСБ/0,025% Tween 20/0,1% желатин, iv) инкубацию многолуночных планшетов в течение 1 часа при 37°С с а) 3% пулированной сывороткой человека, б) антителом кролика к Clq человека и в) антителом свиньи к IgG кролика, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP), включая промежуточное отмывание, v) инкубацию в течение примерно 30 мин с 1 мг/мл 2,2'-азино-бис 3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислотой, vi) добавление 100 мкл 2% щавелевой кислоты и vii) определение оптической плотности при 405 нм с использованием считывающего устройства для планшетов.

Связывание антителом C1q в данном документе обозначает мультивалентное взаимодействие, результатом которого является высокоавидное связывание.

Термин «активация комплемента» обозначает запуск классического пути комплемента. Запуск происходит вследствие связывания компонента комплемента Clq с комплексом антитело-антиген. Clq является первым белком классического каскада комплемента. Он задействован в серии реакций, результатом которых является образование активной конвертазы С3, которая расщепляет компонент комплемента С3 на C3b и С3а. C3b связывается с мембраносвязанным С5, в результате образуется так называемый C5b, который запускает поздние этапы активации комплемента (сборку C5b, С6, С7, С8 и С9 в мембрано-атакующий комплекс (МАК)). В итоге каскад комплемента приводит к образованию пор в клеточной стенке, что вызывает лизис клеток (т.н. комплемент-зависимую цитотоксичность, CDC).

Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)» обозначает процесс антитело-опосредованной активации комплемента, приводящий к лизису клетки в соответствии с механизмом, описанным выше, при связывании антитела с его антигеном, расположенным на этой клетке. CDC можно определить in vitro с помощью специфичного анализа CDC. В области техники в качестве источника комплемента используют сыворотку человека.

Термин «комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность (CDCC, от англ. complement-dependent cellular cytotoxicity)» обозначает процесс гибели клеток, опосредованный клетками, экспрессирующими рецепторы комплемента, которые распознают продукты расщепления 3 компонента комплемента (С3) (расположенные на клетках-мишенях и образующиеся в результате антитело-опосредованной активации комплемента).

«Аффинность» относится к прочности всех суммарных нековалентных взаимодействий между единственным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном описании «аффинность связывания» обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антитела и антигена). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно в целом охарактеризовать константой диссоциации (k_d). Аффинность можно определить стандартными способами, известными в области техники, включая описанные в данном документе. Ниже в качестве иллюстрации и примера приведено описание конкретных воплощений определения аффинности связывания.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность и могут вызывать CDC, но не ограничиваясь ими.

«Эффекторные функции» относятся к такой биологической активности, присущей Fc области антитела, которая варьируется в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: Связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC, от англ. complement dependent cytotoxicity), связывание Fc рецепторов, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC, от англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), фагоцитоз, снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточных рецепторов) и активацию В клеток.

Термин «Fc область» в данном документе обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую по меньшей мере часть константной области. Термин охватывает последовательности нативных Fc областей и вариантов Fc областей. В одном воплощении Fc область тяжелой цепи IgG человека располагается между Cys226 или Pro230 и карбокси-концом тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или отсутствовать. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков Fc области или константной области соответствует системе нумерации EU, также обозначаемой EU-индекс, описанной Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков этих клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей. Потомство может не быть абсолютно идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может иметь мутации. Термины также охватывают потомков с мутациями, обладающих такой же функцией или биологической активностью, как и исходно трансформированные клетки, прошедшие скрининг или отбор.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки HVR, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки FR человеческого происхождения. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и все или по существу все FR соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое прошло гуманизацию.

Термин «гипервариабельный участок», или «HVR» (от англ. hypervariable region) в данном документе обозначает каждый из участков вариабельных доменов антитела, имеющих гипервариабельную последовательность («участки, определяющие комплементарность», или CDR (от англ. complementarity determining regions)) и формирующих петли определенной структуры ("гипервариабельные петли») и/или содержащих остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в составе VH (Н1, Н2, Н3) и три в составе VL (L1, L2, L3).

В данном документе HVR включают:

(а) гипервариабельные петли, образованные аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, С. and Lesk, А.М., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(б) CDR, образованные аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat, Е.А. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);

(в) контакты с антигеном, образованные аминокислотными остатками 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (Н1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (Н1), 26-35b (Н1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в составе вариабельного домена (например, остатки FR) пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.

«Выделенное» антитело обозначает антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения. В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99% согласно определению, например, электрофоретическими (например, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПАГ), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографическими методами (например, с помощью ионообменной или обращенно-фазовой ВЭЖХ). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman et al., J. Chromatogr. 848 (2007) 79-87).

«Выделенная» нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, как правило содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от ее естественного положения на хромосоме.

Термин «моноклональное антитело» в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих естественные мутации или образующиеся в ходе получения препарата моноклональных антител, указанные варианты обычно присутствуют в незначительном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Так, прилагательное «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть получены множеством способов, включая гибридомную технологию, способы ДНК-рекомбинации, способы фагового дисплея и способы, в которых применяют трансгенных животных, содержащих все или часть иммуноглобулиновых локусов человека, но не ограничиваясь ими, такие способы и другие приведенные в качестве примера способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

Мышиное моноклональное антитело 4D5 специфически взаимодействует с HER2 в опухолевых клетках с повышенной экспрессией HER2, при этом не оказывая влияния на клетки с физиологическим уровнем экспрессии HER2. Гуманизированное (4D5) моноклональное антитело (hu4D5) известно как лекарство с коммерческим названием Герцептин® (трастузумаб, rhuMab HER2, US 5,821,337), получившее разрешение FDA на применение в конце 1998.

Пертузумаб (PERJETA™, rhuMab 2С4, US 7,862,817) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, разработанное специально для предупреждения связывания (димеризации) рецептора HER2 с другими рецепторами HER (EGFR/HER1, HER3 и HER4) на поверхности клеток, процесса, который, как предполагают, играет ключевую роль в росте и выживаемости опухолевых клеток. PERJETA одобрен к применению в комбинации с Герцептином (трастузумаб) и доцетакселем у взрослых пациентов с НЕР2-положительным метастатическим или местно рецидивирующим неоперабельным раком молочной железы и получил одобрение FDA для неоадъювантного лечения рака молочной железы в сентябре 2013.

Пертузумаб связывается со II доменом HER2, необходимым для димеризации, тогда как трастузумаб связывается с внеклеточным IV доменом HER2.

Термин «рак» в данном документе относится к пролиферативным заболеваниям, таким как лимфомы, лимфоцитарные лейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), бронхоальвеолярный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, злокачественные новообразования головы и шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак заднего прохода, рак желудка, рак ЖКТ, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, вагинальная карцинома, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, злокачественные опухоли эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или уретры, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, гепатоцеллюлярный рак, рак желчных протоков, неоплазии центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефрактерные формы любых из вышеупомянутых видов рака или комбинации одного или более из вышеупомянутых видов рака. В одном воплощении рак представляет собой карциному.

Термины «сайт связывания антигена», используемый в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Антигенсвязывающая часть антитела содержит аминокислотные остатки из «областей, определяющих комплементарность», или «CDR» (от англ. complementary determining regions). «Каркасные участки», или «области FR (от англ. Framework)», представляют собой такие области вариабельных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельных областей, определенных выше. Таким образом, вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антитела содержат в направлении от N-конца к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является областью, которая вносит наибольший вклад в связывание антигена и определяет свойства антитела. CDR и FR-области определяют в соответствии со стандартным определением Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) и/или по остаткам «гипервариабельной петли».

Специфичность антитела обозначает избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Например, антитела естественного происхождения являются моноспецифическими. Термин «моноспецифическое» антитело в данном документе обозначает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.

«Биспецифические антитела» представляют собой антитела, обладающие специфичностью в отношении двух различных эпитопов. Термин «биспецифическое» антитело в данном документе обозначает антитело, которое имеет по меньшей мере два сайта связывания, каждый из которых связывается с различными эпитопами.

Термин «валентность» в данной заявке обозначает наличие определенного числа сайтов связывания в молекуле антитела. Таким образом, термины «двухвалентное», «четырехвалентное» и «шестивалентное» обозначают наличие в молекуле антитела двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания, соответственно. Биспецифические антитела согласно изобретению, являются по меньшей мере «двухвалентными» и могут быть «трехвалентными» или «мультивалентными» (например, «четырехвалентными» или «шестивалентными»).

Используемые в данном документе термины «связывающийся» или «специфически связывающийся» относятся к связыванию антитела с эпитопом антигена в исследовании in vitro, предпочтительно в исследовании методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR, от англ. surface plasmon resonance, BIAcore, GE-Healthcare, Упсала, Швеция). Аффинность связывания определяется значениями k_a (константа скорости ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), k_d (константа диссоциации) и K_D (k_d/k_a). «Связывание» или «специфическое связывание» означает аффинность связывания (K_D), равную 10^-7 моль/л или менее.

Термин «эпитоп» включает любую полипептидную детерминанту, способную специфически связываться с антителом. В некоторых воплощениях эпитопная детерминанта включает химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, углеводные боковые цепи, фосфорил или сульфонил, а в некоторых воплощениях может иметь специфические характеристики трехмерной структуры и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп является областью антигена, которая связывается антителом.

II. СПОСОБЫ, ОПИСАННЫЕ В ДАННОМ ДОКУМЕНТЕ

Карциномы имеют эпителиальное происхождение и в клетках зачастую повышается экспрессия mCRPs (особенно CD55 и CD59), как механизм ускользания от иммунологического надзора, позволяющий избежать действия CDC in vivo. В некоторых случаях антитела, связывающиеся с поверхностным антигеном клеток карциномы, не способны вызывать CDC из-за влияния/присутствия mCRPs. В прошлом для клеток карциномы для решения этой проблемы использовали трудоемкие, сложные и плохо воспроизводимые подходы, например, такие, как снижение экспрессии mCRPs с помощью siRNA. В данном документе описано улучшенное, т.е. более надежное и совместимое с высокопроизводительными технологиями исследование для анализа способности антител, связывающих поверхностные антигены клеток карциномы, индуцировать CDC.

Обнаружили, что для определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции, содержащей молекулы, которые, с одной стороны, специфически связываются с одним или несколькими антигенами клеточной поверхности и, с другой стороны, содержат полипептид Fc-области человеческого происхождения, следует использовать, например, комбинацию двух или более человеческих или гуманизированных антител или человеческое или гуманизированное биспецифическое антитело, а также комплемент, который не является изогенным, т.е. кроличий комплемент, например, комплемент крольчонка. Неожиданно обнаружили, что при применении изогенного комплемента способ оказывался неработоспособным. Аналогично, при применении комплемента морских свинок (специфического не являющегося изогенным комплемента) способ также оказывался неработоспособным.

В данном документе описан способ определения CDC-активности комбинаций антител или биспецифических антител. Способ может оказаться особенно эффективен в случаях, когда инкубация с человеческой сывороткой и человеческими опухолевыми клетками не обеспечивает надежного результата.

Обнаружили, что моноспецифические антитела не работают в исследовании, описанном в данном документе.

Неожиданно обнаружили, что при комбинировании человеческих опухолевых клеток, человеческого или гуманизированного антитела и не являющегося изогенным комплемента кроличьего происхождения способ оказывался работоспособным.

В одном воплощении клетка экспрессирует первый эпитоп и второй эпитоп.

В одном воплощении первый антиген и второй антиген представляют собой антигены клеточной поверхности.

Клетки, экспрессирующие антигены клеточной поверхности, могут быть любыми клетками. В одном воплощении клетка представляет собой опухолевую клетку. В одном воплощении опухолевая клетка представляет собой клетку карциномы.

Комплемент-зависимую цитотоксичность следует определять через один или два часа после добавления комплемента. Так, в одном воплощении клеточный лизис определяют через 0,5-3 часа после добавления комплемента, т.е. комплемента крольчонка. В одном воплощении клеточный лизис определяют через 1-2 часа после добавления комплемента.

Клеточный лизис можно определять любым подходящим способом, например, таким как высвобождение ЛДГ или определение жизнеспособности клеток. Так, в одном воплощении клеточный лизис определяют по высвобождению ЛДГ или по жизнеспособности клеток.

Описанный здесь способ не требует присутствия сыворотки. Так, в одном воплощении способ представляет собой бессывороточный способ.

Описанный здесь способ можно применять для отбора комбинаций антител, которые не будут перекрестно реагировать друг с другом за связывание, но будут вызывать CDC в комбинации (не по-отдельности).

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции,

где композиция содержит:

i) первый сайт связывания, которые специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и

ii) второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена, конъюгированный со вторым полипептидом Fc-области человеческого происхождения,

где способ включает следующие стадии:

а) инкубацию человеческой клетки, экспрессирующей первый антиген или первый антиген и второй антиген, с композицией,

Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности комбинации двух моноспецифических антител или биспецифического антитела,

где

i) первое моноспецифическое антитело специфически связывается с первым эпитопом первого антигена и второе моноспецифическое антитело специфически связывается со вторым эпитопом первого антигена или второго антигена, или

ii) биспецифическое антитело содержит первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, и второй сайт связывания, который специфически связывается со вторым эпитопом первого антигена или второго антигена,

где способ включает следующие стадии:

а) инкубацию человеческой клетки карциномы эпителиального происхождения, экспрессирующей первый антиген или первый антиген и второй антиген, с комбинацией двух моноспецифических антител или с биспецифическим антителом,

в) определение клеточного лизиса и, таким образом, определение комплемент-зависимой цитотоксичности комбинации двух моноспецифических антител или биспецифического антитела.

Гуманизированные антитела

Как правило, не являющееся человеческим антитело, которое предполагают использовать в терапевтических целях, гуманизируют для снижения иммуногенности в отношении человека, при этом сохраняя специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. Обычно гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части) происходят от антитела, не являющегося человеческим, a FR (или их части) происходят от последовательностей человеческих антител. Гуманизированное антитело необязательно может также содержать по меньшей мере часть константной области или полноразмерную константную область человеческого антитела. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещают соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела, из которого происходят остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.

Гуманизированные антитела и способы их получения описаны, например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и дополнительно описаны, например, Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 и US 7,087,409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описание пересадки областей, определяющих специфичность (SDR)); Padlan, Е.А., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описание «изменения поверхности»); Dall'Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описание «перетасовки FR»); Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68; and Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описание подхода «направленного отбора» при перетасовке FR).

Каркасные области человеческого происхождения, которые можно использовать для гуманизации, включают: каркасные области, выбранные с помощью метода «наилучшего соответствия» (см., например, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные области, происходящие от консенсусной последовательности человеческих антител, имеющих определенную подгруппу вариабельных участков легких или тяжелых цепей (см., например, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); зрелые каркасные области человеческого происхождения (с соматическими мутациями) или каркасные области первичных антител (см., например, Almagro, J.С. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Васа, М., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; and Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618), но не ограничиваются ими.

Мультиспецифические антитела

В некоторых воплощениях антитело, которое используют в способе, предложенном в данном изобретении, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, специфически связывающиеся по меньшей мере с двумя различными сайтами/антигенами/эпитопами. В некоторых воплощениях биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами одного и того же антигена. Биспецифические антитела можно получать в форме полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики получения мультиспецифических антител включают совместную рекомбинантную экспрессию пар тяжелая цепь-легкая цепь двух иммуноглобулинов с различной специфичностью (см. Milstein, С. and Cuello, А.С., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829 и Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), а также технологию "knob-in-hole" (см., например, US 5,731,168), но не ограничиваются ими. Мультиспецифические антитела также можно получать, используя эффект электростатического взаимодействия для конструирования гетеродимерных молекул антител с Fc фрагментом (см., WO 2009/089004); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, US 4,676,980 и Brennan, М., et al., Science 229 (1985) 81-83); используя лейциновые застежки для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); используя технологию "diabody" для получения биспецифических фрагментов антител (см., например, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); используя димеры одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374) и получать триспецифические антитела, например, согласно описанию Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Изобретение также охватывает рекомбинантные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими сайтами, например, антитела-«осьминоги» (см., например, US 2006/0025576).

Антитело также охватывает антитела двойного действия, или «DAF» (от англ. Dual Acting Fab (см., например, US 2008/0069820)).

Антитела или фрагменты также охватывают мультиспецифические антитела, описанные в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2010/145793.

Рекомбинантные способы и композиции

Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США 4,816,567 Для экспрессии требуются нуклеиновые кислоты, кодирующие отдельные полипептидные цепи антитела. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В следующем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессирующие векторы), содержащие такую нуклеиновую кислоту. В следующем воплощении предложены клетки-хозяева, содержащие такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких воплощений клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации): 1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения антитела, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, согласно описанию выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клетки-хозяина).

Для получения антитела рекомбинантным способом нуклеиновую(ые) кислоту(ы), кодирующую(ие) антитело, например, согласно описанию выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетках-хозяевах. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).

Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают клетки прокариот или эукариот, описанные в данном документе. Например, антитела могут производиться в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. По вопросу экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты США 5,648,237, 5,789,199 и 5,840,523; (см. также Charlton, К.А., Methods in Molecular Biology Vol.248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp.245-254, описывающие экспрессию фрагментов антител в Е. coli.). После экспрессии антитело может быть выделено из бактериальной массы в виде растворимой фракции и затем очищено.

Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, подходят микроорганизмы-эукариоты, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых пути гликозилирования были «гуманизированы» для обеспечения продукции антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, Н., et al., Nat. Biotech. 24 (2006)210-215.

Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированных антител, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Также были найдены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые могут использоваться совместно с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также могут использоваться культуры клеток растений (см., например, патенты US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 и US 6,417,429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях)).

В качестве хозяев также могут использоваться клетки позвоночных. Например, могут применяться линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами линий клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); линия эмбриональных клеток почки человека (293 или клетки 293, описанные, например, Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); мышиные клетки сертоли (клетки ТМ4, описанные, например, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени крысы буффало (BRL 3А); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие линии клеток млекопитающих, используемые в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR- СНО (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для получения антител, представлен, например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), 255-268.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антител изготавливают путем смешивания таких антител, имеющих необходимую степень чистоты, с одним или несколькими возможными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают: буферы, например, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил аммоний хлорид; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) пептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG), но не ограничиваются ими. Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном документе также включают средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как активные в нейтральных условиях растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Примеры некоторых sHASEGPs и способов их применения, включая rHuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP дополнительно комбинируют с одним или более гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных препаратов антител описаны в патенте US 6,267,958. Водные препараты антител включают описанные в патентах US 6,171,586 и WO 2006/044908, последние включают гистидин-ацетатный буфер.

Композиции могут также содержать более одного активного ингредиента, которые предпочтительно имеют комплементарную активность и не оказывают друг на друга отрицательного влияния, что бывает необходимо при конкретных показаниях к терапии. Такие активные ингредиенты соответственно находятся в комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, с помощью технологии коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли-(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.)(1980).

Могут быть изготовлены препараты с пролонгированным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, в которых матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, в виде пленок или микрокапсул.

Композиции, применяющиеся для введения in vivo, как правило, стерильны. Стерильность может быть достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Терапевтические способы и композиции

Любая из композиций, т.е. комбинации антител или мультиспецифических антител, отобранные способом, предложенным в данном изобретении, могут применяться в терапевтических способах.

В одном аспекте предложена композиция, отобранная способом, предложенным в данном изобретении, для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых воплощениях предложена композиция, отобранная способом, предложенным в данном изобретении, для применения в способе лечения. В некоторых воплощениях изобретения предложена композиция, отобранная способом, предложенным в данном изобретении, для применения в способе лечения индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений предпочтительно является человеком.

В следующем аспекте изобретения предложено применение композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении, в изготовлении или получении лекарства. В следующем воплощении композиция, отобранная способом, предложенным в данном изобретении, предназначена для применения в способе лечения заболевания, включающем введение индивидууму, имеющему заболевание, эффективного количества композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.

В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания. В одном воплощении способ включает введение индивидууму, имеющему такое заболевание, эффективного количества композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.

В следующем аспекте изобретения предложены фармацевтические композиции, включающие композицию, отобранную способом, предложенным в данном изобретении, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любую из композиций, отобранных способом, предложенным в данном изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любую из композиций, отобранных способом, предложенным в данном изобретении, и по меньше мере один дополнительный терапевтический агент.

Композиции, отобранные способом, предложенным в данном изобретении, могут применяться при терапии либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами. Например, композицию, отобранную способом, предложенным в данном изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.

Такие комбинированные терапии, упомянутые выше, включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агентов включены в состав одной или нескольких композиций) и раздельное введение, когда введение композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении, может осуществляться до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или агентов. В одном воплощении введение композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении, и введение дополнительного терапевтического агента происходит в течение приблизительно одного месяца или в течение приблизительно одной, двух или трех недель, или с интервалом не более чем приблизительно один, два, три, четыре, пять или шесть дней.

Композицию, отобранную способом, предложенным в данном изобретении, (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при необходимости местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым подходящим способом, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. В данном описании предусматриваются различные режимы дозирования, включающие однократное или многократное введение через различные промежутки времени, болюсное введение и пульсовое введение, но не ограничивающиеся ими.

Композиции, отобранные способом, предложенным в данном изобретении, изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Композиция, отобранная способом, предложенным в данном изобретении, не обязательно, но возможно находится в сочетании с одним или несколькими агентами, используемыми на данный момент для предупреждения или лечения обсуждаемого нарушения. Эффективное количество этих иных агентов зависит от количества компонентов, присутствующих в композиции, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Как правило, их применяют в таких же дозировках и вводят такими же способами, как описанные в данном документе, или как приблизительно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым способом, который эмпирически/клинически считаются подходящим.

Соответствующая дозировка композиции, отобранной способом, предложенным в данном изобретении, (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами) для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа композиции, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли композицию в превентивных или в терапевтических целях, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на композицию, а также от выбора лечащего врача. Композицию, отобранную способом, предложенным в данном изобретении, вводят пациенту единовременно или на протяжении серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания возможная исходная дозировка для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг композиции (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг), например, в виде одного или нескольких отдельных введений, или в виде длительной инфузии. Одна типичная дозировка может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторном введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение должно длиться до тех пор, когда не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одним из примеров дозировки композиции может быть диапазон от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Эти дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получил от приблизительно двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно производить введение первоначальной ударной дозы с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Однако, можно применять и другие режимы дозирования. Успешность такой терапии легко отслеживать при помощи известных методик и тестов.

III. ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что возможны и другие варианты воплощений, в соответствии с приведенным выше описанием.

Материалы и методы

Методы рекомбинирования ДНК

Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали в соответствии с инструкциями производителя.

Синтез генов и олигонуклеотидов

Необходимые генные сегменты получали при помощи химического синтеза в компании Geneart GmbH (Регенсбург, Германия). Синтезированные фрагменты генов клонировали в плазмиды для наработки/амплификации в Е. coli. Последовательности ДНК субклонированных фрагментов генов верифицировали при помощи секвенирования ДНК. В альтернативном варианте, короткие фрагменты ДНК собирали путем отжига олигонуклеотидов, полученных путем химического синтеза или при помощи ПЦР. Соответствующие олигонуклеотиды получали в компании metabion GmbH (Планегг-Мартинсрид, Германия).

Реагенты

Все приобретенные реагенты, антитела и наборы использовали согласно протоколам, представленным производителями, если не указано иное.

Антитела

трастузумаб

легкая цепь:

тяжелая цепь:

пертузумаб

легкая цепь:

тяжелая цепь:

биспецифическое антитело к HER2, общая легкая цепь

общая легкая цепь:

тяжелая цепь 1(«выступ», трастузумаб)

тяжелая цепь 2 («впадина», пертузумаб)

биспецифическое антитело к HER2, формат CrossMab:

тяжелая цепь 1:

тяжелая цепь 2:

легкая цепь 1:

легкая цепь 2:

Экспрессия

а) Конструирование экспрессирующих плазмид

Для конструирования всех экспрессирующих плазмид, кодирующих тяжелые и легкие цепи, использовали следующие экспрессирующие векторы. Вектор включал следующие элементы:

- ген резистентности к гигромицину в качестве маркера селекции,

- ориджин репликации, oriP, вируса Эпштейна-Барр (EBV),

- ориджин репликации вектора pUC18, позволяющий данной плазмиде реплицироваться в Е. coli,

- ген бета-лактамазы, обеспечивающий Е. coli резистентность к ампициллину,

- немедленный ранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека (HCMV),

- последовательность иммуноглобулина человека, являющуюся сигналом к началу полиаденилирования («поли А»).

Гены иммуноглобулина, содержащие тяжелую или легкую цепи, получали путем синтеза генов и клонировали в плазмиды pGA18 (ampR), как описано выше. Конструкции вариабельных областей тяжелой цепи встраивали путем направленного клонирования, используя уникальные сайты рестрикции. Конструкции вариабельных областей легкой цепи синтезировали как гены, содержащие VL и CL, и встраивали путем направленного клонирования, используя уникальные сайты рестрикции. Готовыми экспрессирующими векторами трансформировали клетки Е. coli, выделяли ДНК экспрессирующих плазмид (Miniprep) и проводили рестрикционный анализ и секвенирование ДНК. Правильные клоны культивировали в 150 мл среды LB-Amp, вновь выделяли плазмидную ДНК (Maxiprep) и подтверждали сохранность последовательности путем секвенирования ДНК.

б) транзиторная экспрессия вариантов иммуноглобулинов в клетках HEK293

Рекомбинантные иммуноглобулины экспрессировали путем транзиторной трансфекции клеток почки эмбрионов человека 293-F с использованием системы экспрессии Freestyle™ 293 согласно инструкциям производителя (Invitrogen, USA). Для маломасштабной экспрессии в эксперименте высаживали клетки HEK293F в концентрации 0,5×10⁶/мл в объеме 30 мл за день до трансфекции. На следующий день смешивали плазмидную ДНК (1 мкг ДНК на миллилитр культуры) и 1,2 мл среды с пониженным содержанием сыворотки Opti-MEM® I (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) с последующим добавлением 40 мкл реагента для трансфекции 293Fectin™ (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Смесь инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре и добавляли по каплям к клеткам. Через день после трансфекции в каждый флакон добавляли 300 мкл L-глутамина (200 мМ, Sigma-Aldrich, Штайнхайм, Германия) и 600 мкл питательной смеси, содержащей аминокислоты, углеводы, микроэлементы, среду Freestyle без RPMI. Через три дня после трансфекции определяли концентрацию клеток, жизнеспособность и концентрацию глюкозы в среде с помощью автоматического анализатора жизнеспособности клеток (Vi-CELL™ XR, Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния, США) и глюкометра (Accu-CHEK® Sensor comfort, Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). Кроме того, в каждый флакон добавляли 300 мкл L-глутамина, 300 мкл раствора заменимых аминокислот (PANTM Biotech, Айденбах, Германия), 300 мкл пирувата натрия (100 мМ, Gibco, Invitrogen), 1,2 мл питательной смеси и 5 г/л глюкозы (45% раствор D-(+)-глюкозы, Sigma). Наконец, через шесть дней после трансфекции собирали антитела путем центрифугирования при 3500 об/мин в центрифуге X3R Multifuge (Heraeus, Букингемшир, Англия) в течение 15 мин при комнатной температуре, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрованием через фильтрующий модуль Steriflip (0,22 мкм мембрана Millipore Express PLUS PES, Millipore, Бедфорд, Массачусетс) и хранили при -20°С до последующего использования. Для крупномасштабных трансфекций в объемах до 5 л применяли линейное масштабирование.

в) Выделение

Биспецифические антитела выделяли из культуральной надосадочной жидкости с помощью аффинной хроматографии с использованием Protein А-Sepharose™ (GE Healthcare, Швеция) и эксклюзионной хроматографии на колонках Superdex200. Вкратце, стерилизованную фильтрованием культуральную надосадочную жидкость наносили на колонку HiTrap Protein A HP (5 мл), уравновешенную буфером ФСБ (10 мМ Na₂HPO₄, 1 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl, рН 7,4). Несвязанные белки отмывали с помощью уравновешивающего буфера. Антитела и варианты антител элюировали 0,1 М цитратным буфером, рН 2,8, и содержащие белок фракции нейтрализовали 0,1 мл 1 М Tris, рН 8,5. Элюированные белковые фракции объединяли, концентрировали с использованием центрифужных фильтров Amicon Ultra (номинальное отсечение по молекулярной массе 30 К, Millipore) до объема 3 мл и загружали в колонку для гель-фильтрации Superdex200 HiLoad 120 мл 16/60 (GE Healthcare, Швеция), уравновешенную 20 мМ гистидина, 140 мМ NaCl, рН 6,0. Фракции, содержащие очищенные биспецифические и контрольные антитела с содержанием высокомолекулярных агрегатов менее 5%, объединяли и хранили в аликвотах с концентрацией 1,0 мг/мл при -80°С.

г) Количественное определение белка

Для количественного определения белка с помощью аффинной хроматографии использовали автоматизированную систему Ultimate 3000 (Dionex, Идштайн, Германия) с предварительно заполненными колонками Poros® A Protein А (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния, США). Все образцы наносили в буфере А (0,2 М Na₂HPO₄⋅[2 H₂O], рН 7,4) и элюировали буфером В (0,1 М лимонная кислота, 0,2 М NaCl, рН 2,5). Для определения концентрации белка использовали коэффициент поглощения 1,62 для всех образцов.

д) Анализ очищенных белков

Концентрацию белка в образцах очищенного белка определяли путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Степень чистоты и молекулярный вес биспецифических и контрольных антител анализировали с помощью электрофореза в присутствии ДСН, в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотрейтол) и окрашивания Кумасси бриллиантовым синим. Готовые системы гелей NuPAGE® (4-20% Трис-Глициновые гели, Invitrogen, США) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Содержание агрегатов в образцах биспецифических и контрольных антител анализировали с помощью высокопроизводительной эксклюзионной хроматографии с использованием аналитических колонок для эксклюзионной хроматографии Superdex 200 (GE Healthcare, Швеция) в проточном буфере 200 мМ KH₂PO₄, 250 мМ KCl, рН 7,0 при 25°С. На колонку наносили 25 мкг белка со скоростью тока 0,5 мл/мин и элюировали в изократическом режиме в течение 50 минут. Сохранность аминокислотного остова легких и тяжелых цепей биспецифического антитела в восстанавливающих условиях верифицировали с помощью масс-спектрометра NanoElectrospray Q-TOF после удаления N-гликанов при помощи ферментативной обработки пептид-N-гликозидазой F (Roche Molecular Biochemicals).

е) Аналитическая ВЭЖХ

Антитела анализировали с помощью Agilent HPLC 1100 (Agilent Technologies, Пало Альто, калифорния, США) с использованием колонок для гель-фильтрации TSK-GEL G3000SW (7,5 мм ID × 30 см, Tosohaas Corp., Монтгомервиль, Пенсильвания, США). 18 мкл элюированных белков загружали в колонку в буфере А (0,05 М К₂НРО₄/КН₂РО₄ в 300 мМ NaCl, рН 7,5) и разделяли в зависимости от размера.

Пример 1

Исследование с использованием комплемента из различных источников

Исследование с красителем аламаровый синий и комплементом морской свинки (GPC)

Клетки СНО-К1 Nxre19 (СНО-К1, трансфицированные IL15R) высаживали в плотности 20000 клеток/лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты для клеточных культур (NUNC, 100 мкл/лунку) в среде DMEM/F12 с добавлением GlutaMax (Gibco, кат. номер 31331-028). Добавляли 25 мкл слитого полипептида IL15-FC (концентрация в 6 раз превышающая конечную) и инкубировали в течение 1 часа. Затем добавляли 25 мкл комплемента морской свинки (Sigma Aldrich, кат. номер S1639) и инкубировали в течение 3,5 часов. Затем добавляли 50 мкл аламарового синего (Promega) и инкубировали в течение ночи при 37°С/5% CO₂. Измеряли оптическую плотность в планшетах при длине волны 550 нм (возбуждение) и 595 нм (эмиссия).

Данные свидетельствуют, что комплемент морской свинки является токсичным во всех разведениях даже в отсутствие Fc-области.

Определение ЛДГ с комплементом человека (HUC)

Клетки СНО-К1 Nxre19 (СНО-К1, трансфицированные IL15R) высаживали в плотности 10000 клеток/лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты для клеточных культур (NUNC, 100 мкл/лунку) и культивировали в течение ночи в среде DMEM/F12 с добавлением GlutaMax (Gibco, кат. номер 31331-028). Добавляли слитый полипептид IL15-Fc (25 мкл/лунку, концентрация в 5 раз превышающая конечную) и инкубировали в течение 1 часа. Удаляли питательную среду и отмывали клетки один раз бессывороточной средой. Затем добавляли 190 мкл/лунку бессывороточной среды и 10 мкл комплемента человека (Sigma Aldrich, кат. Номер S1764, концентрация = 1 мг/мл). Через 4 часа планшеты центрифугировали при 200 g и переносили 100 мкл/лунку в другой 96-луночный плоскодонный планшет. Затем добавляли 100 мкл реакционной смеси ЛДГ (набор для определения цитотоксичности, Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). После инкубации в течение 20 минут при 37°С определяли оптическую плотность (ОП) при 492/690 нм на считывающем устройстве Tecan Sunrise.

Приведенные данные свидетельствуют, что комплемент человека не вызывает дозозависимой комплемент-зависимой цитотоксичности.

Определение ЛДГ с комплементом детеныша кролика (BRC)

Клетки СНО-К1 Nxre19 (СНО-К1, трансфицированные IL15R) высаживали в плотности 10000 клеток/лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты для клеточных культур (NUNC, 100 мкл/лунку) и культивировали в течение ночи в среде DMEM/F12 с добавлением GlutaMax (Gibco, кат. номер 31331-028). Добавляли слитый полипептид IL15-FC (25 мкл/лунку, концентрация в 5 раз превышающая конечную) и инкубировали в течение 1 часа. Затем содержимое одного флакона с комплементом крольчонка (Cedarlane, кат. Номер CL3441) восстанавливали в 1 мл бидистиллированной воды. Раствор комплемента разбавляли средой и добавляли в лунки по 25 мкл. Через 1 час планшеты центрифугировали при 200 g и переносили 100 мкл/лунку в другой 96-луночный плоскодонный планшет. Затем добавляли 100 мкл реакционной смеси ЛДГ (набор для определения цитотоксичности, Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). После инкубации в течение 20 минут при 37°С определяли оптическую плотность (ОП) при 492/690 нм на считывающем устройстве Tecan Sunrise.

Можно отметить, что BRC имеет низкую фоновую цитотоксичность и демонстрирует дозозависимую комплемент-зависимую цитотоксичность.

Пример 2.

Связывание C1q антителами к HER2 на клетках ВТ-474

Приблизительно 3×10⁵ клеток ВТ-474 инкубировали с 10 мкг/мл указанного антитела в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Через 30 мин инкубации на льду добавляли 1 мкг/мл C1q (Sigma Aldrich, кат. номер С1740). После этого продолжали инкубировать на льду еще в течение 20 минут. После отмывания клетки ресуспендировали в 200 мкл среды и окрашивали меченным РЕ антителом к C1q (Cedarlane, кат. номер CL7611PE-SP). После инкубации в течение 30 минут на льду клетки дважды отмывали и анализировали на приборе FACS Canto II.

Данное определение C1q иллюстрирует связывание рекомбинантного фактора комплемента C1q с различными антителами на клетках ВТ-474.

Пример 3.

Ингибирование пролиферации антителами к HER2 на клетках ВТ-474

Клетки ВТ-474 культивировали в количестве 1×10⁴/лунку в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 96-луночных плоскодонных планшетах. Через 24 часа удаляли питательную среду и добавляли титрованное количество указанных антител (предварительно смешанных с культуральной средой; 200 нМ, 66,7 нМ, 22,2 нМ, 7,4 нМ, 2,5 нМ, 0,8 нМ, 0,3 нМ, 0,1 нМ) в конечном объеме 100 мкл. Для определения количества жизнеспособных клеток в культуре выполняли анализ CellTiterGlo Luminescent Cell Viability Assay согласно инструкциям производителя (количественное определение уровня АТФ, как индикатора метаболически активных клеток). Для этого через 6 дней культивирования к клеткам добавляли 100 мкл реакционной смеси CellTiterGlo (Promega, кат. номер G7571) и инкубировали в течение 2 минут при встряхивании. Затем 75 мкл лизата переносили в отдельный 96-луночный плоскодонный планшет (Costar, кат. номер 3917). После дополнительного перемешивания измеряли люминесценцию согласно инструкциям производителя с помощью считывающего устройства, Tecan Infinite и рассчитывали соответствующее значение IC₅₀.

Исследование пролиферации показало, что антитела ингибировали пролиферацию ВТ-474.

Пример 4.

Активация CDC антителами к HER2 на клетках ВТ-474, клетках SK-Br3 и клетках SK-OV-3

10000 клеток/лунку (клетки ВТ-474, SK-Br3 или SK-OV-3) высаживали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 20 часов при 37°С, 5% CO₂. Затем удаляли питательную среду и отмывали клетки один раз 100 мкл среды AIM-V (Gibco, кат. номер 0870112 DK). В каждую лунку вносили 50 мкл среды AIM-V. Затем добавляли 50 мкл раствора антитела (в концентрации в 3 раза превышающей финальную) и инкубировали в течение 3 минут при 37°С/5% CO₂. Добавляли 50 мкл комплемента крольчонка (Cedarlane, кат. номер CL3441, номер партии 6312), разведенного 1:10 в среде AIM-V, и продолжали инкубировать в течение 2 ч. Затем 50 мкл надосадочной жидкости переносили и смешивали с 50 мкл реакционной смеси для определения ЛДГ (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). После инкубации в течение 15 минут при 37°С определяли оптическую плотность (ОП) при 490/620 нм на считывающем устройстве Tecan Sunrise. Рассчитывали специфическую антитело-зависимую токсичность (среднее арифметическое +/- стандартное отклонение при n=4) следующим образом: антитело-зависимая токсичность, % = (ОП образца - ОП спонтанный лизис / ОП максимальный лизис - спонтанный лизис)×100. Результаты показаны на Фиг. 1.

Клетки ВТ474, SkBr3 и SK-OV-3 инкубировали с трастузумабом, пертузумабом или их комбинацией (суммарная концентрация антител 10 мкг/мл или 1 мкг/мл) с последующей двухчасовой инкубацией с комплементом крольчонка. В качестве изотипического контроля использовали IgG1 человека с легкой каппа-цепью. Показатели клеточного лизиса (высвобождение ЛДГ) снимали с использованием считывающего устройства Tecan sunrise и набора LDH Cytotoxicity (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. номер 11644793001). Специфический лизис выражали как величину сигнала относительно клеток, обработанных 3% Triton-X (максимальный лизис). Эксперимент проводили в пяти параллельных определениях.

Данное определение CDC демонстрирует высвобождение ЛДГ как маркера погибающих/мертвых клеток при обработке различными антителами (форматы, комбинация) в присутствии комплемента крольчонка.

Пример 5.

Определение соотношения антител для CDC

Клетки SK-OV-3 высаживали в 96-луночные круглодонные планшеты (Thermo Scientific, Nunclon Delta Surface) в количестве 10000 на лунку в 100 мкл/лунку среды AIM-V (Gibco, кат. номер 0870112-DK) и инкубировали в течение 20 часов при 37°С и 5% CO₂. После окончания периода инкубации добавляли 50 мкл матричных растворов антител, содержащих трастузумаб и пертузумаб в конечной концентрации 0,1, 0,5, 1, 5 или 10 мкг/мл. IgG1 человека, легкая каппа-цепь (Sigma, кат. номер 15154-1MG) использовали в качестве контроля. Triton-X (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. номер 11332481001) в конечной концентрации 1% добавляли для определения максимального лизиса. После инкубации в течение 30 минут при 37°С добавляли 50 мкл матричного раствора комплемента крольчонка (Cedarlane, кат. номер CL3441) в конечном разведении 1/30. Затем планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С (конечный объем/лунку = 150 мкл). Клеточный лизис определяли по активности ЛДГ с использованием набора LDH Cytotoxicity (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. номер 11644793001). Определяли поглощение при 490 нм и 620 нм с помощью считывающего устройства Tecan Sunrise.

В качестве положительного контроля использовали следующие образцы:

контроль со средой: клетки SK-OV-3 со средой AIM-V

спонтанный лизис: клетки SK-OV-3 с активным BRC

максимальный лизис: клетки SK-OV-3 с 1% Triton-X

изотипический контроль: клетки SK-OV-3 с 10 мкг/мл IgG человека, каппа и BRC

отрицательный контроль: клетки SK-OV-3 с 10 мкг/мл композиции антитела и инактивированным нагреванием BRC

контроль анализа: клетки SK-OV-3 с 10 мкг/мл трастузумаба и пертузумаба и активным BRC.

Оптимальный цитолиз наблюдался при соотношении трастузумаб/пертузумаб от 0,5:1 до 1:1, а также при соотношении пертузумаб/трастузумаб от 0,5:1 до 1:1. В целом, исследование оказалось очень стабильным с точки зрения соотношения антител, поскольку даже соотношение 1:10 не оказывало кардинального влияния на CDC.

Пример 6.

CDC-опосредованная гибель клеток ВТ-474 под воздействием антител к HER2

Клетки ВТ-474 высаживали в 96-луночные планшеты E-Plates (АСЕА Biosciences Inc.) по 10 000/лунку и культивировали в течение ночи в системе Xcelligence в среде AIM-V. Удаляли питательную среду и отмывали клетки один раз бессывороточной средой AIM-V (Gibco). Добавляли 50 мкл/лунку среды AIM-V и 50 мкл антитела AIM-V (в концентрации в 3 раза превышающей конечную концентрацию) и инкубировали в течение 20 мин. Затем добавляли 50 мкл комплемента крольчонка (Cedarlane) и определяли клеточный индекс (КИ, отражающий жизнеспособность клеток) каждые 5 минут. Специфическую CDC рассчитывали по формуле, где КИ представляет собой нормализованный клеточный индекс:

В двух репрезентативных моментах времени (через 1 ч и 2 ч после начала реакции) рассчитывали специфический лизис (т.е. CDC-индуцированную клеточную гибель), результаты представлены на Фиг. 2 и в следующей Таблице (среднее арифметическое +/- стандартная ошибка среднего для n=4).

Данное определение CDC демонстрирует изменение клеточного индекса как маркера погибающих/мертвых клеток при обработке различными антителами (форматы, комбинация) в присутствии комплемента крольчонка.

Пример 7 (сравнительный)

Попытка разработки анализа CDC с использованием комплемента человеческого происхождения

Клетки SkBr3 сенсибилизировали трастузумабом, пертузумабом или комбинацией трастузумаба и пертузумаба (суммарная концентрация антител 10 мкг/мл) с последующей инкубацией в течение 2 часов с комплементом крольчонка (BCR, как описано в Примере 4) или с нормальной человеческой сывороткой (NHS), полученной от трех здоровых доноров (разведение 1:50, NHS 1, NHS 2, NHS 3). В качестве изотипического контроля использовали IgG1 человека с легкой каппа-цепью.

Показатели клеточного лизиса (высвобождение ЛДГ) снимали с использованием считывающего устройства Tecan sunrise и набора LDH Cytotoxicity (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. номер 11644793001). Средний лизис (в %) представляет собой сигнал относительно клеток, обработанных 3% Triton-X (максимальный лизис). Эксперимент проводили в трех параллельных определениях.

Пример 8 (сравнительный)

Нокдаун CD55, CD59 и CD46, опосредованный siRNA

Создание клеточных линий

Для нокдауна CD46, CD55 и CD59 клетки SK-OV-3 обрабатывали соответствующими siRNA (Biospring; CD46 кат. номер 203525-А, CD55 кат. номер 203526-А, CD59 кат. номер 203527-А), одной контрольной siRNA (Biospring, кат. номер 203524-А) и реагентом для трансфекции LipofectAmine (Invitrogen, кат. номер 13778-100). Использованные количества соответствовали протоколу производителя. Через три дня культивирования определяли количество CD46, CD55 и CD59 на поверхности клеток с помощью FACS-анализа с использованием клеточной суспензии с 1-2×10⁵ клетками в 50 мкл и общей реакционной смесью антител для FACS. Общая реакционная смесь антител содержала по 1 мкл каждого из: антитела к CD55, конъюгированного с АРС (BD Pharmingen, кат. номер 555696) и антитела к CD59, конъюгированного с РЕ (BD Pharmingen, кат. номер 555764) и 10 мкл антитела к CD46, конъюгированного с FITC (BD Pharmingen, кат. номер 555949), 10% мышиной сыворотки (Southern Biotech, кат. номер 0050-01) и буфера для FACS (5 мл DPBS с добавлением 20 мкл бычьего сывороточного альбумина). Антитела для FACS титровали для определения необходимой концентрации. В качестве изотипического контроля использовали 20 мкл IgG2a, k-FITC (BD Pharmingen, кат. номер 556652), IgG2a, k-APC (BD Pharmingen, кат. номер 552893), IgG2a, k-PE (BD Pharmingen, кат.номер 551438), каждый с 10% мышиной сывороткой и буфером для FACS. Клетки инкубировали с указанными выше антителами для FACS в течение 30 минут при 4°С и 20 об/мин, отмывали 600 мкл ледяного буфера DPBS и ресуспендировали в 200 мкл Cytofix (BD Pharmingen, кат. номер 554655). FACS-анализ проводили на приборе FACS Canto II.

Происходил выраженный нокаут CD55 (нокдаун приблизительно 80%). Экспрессия CD59 снижалась приблизительно на 45%. Уровень экспрессии CD46 не изменялся.

CDC после нокдауна

Для нокдауна CD46, CD55 и CD59 клетки SK-OV-3 обрабатывали соответствующими siRNA (Biospring; CD46 кат. номер 203525-А, CD55 кат. номер 203526-А, CD59 кат. номер 203527-А) и реагентом для трансфекции LipofectAmine (Invitrogen, кат. номер 13778-100). Использованные количества соответствовали протоколу производителя. Через три дня культивирования определяли количество CD46, CD55 и CD59 на поверхности клеток с помощью FACS-анализа (см. выше). На четвертый день проводили исследование CDC с клетками SK-OV-3 дикого типа (=не обработанными siRNA), клетками SK-OV-3-triple (трансфицированными всеми тремя siRNAs) и клетками SK-OV-3-Contrl. siRNA (трансфицированными неспецифической контрольной siRNA). Для исследования CDC высаживали по 10000 клеток на лунку в 96-луночные плоскодонные планшеты (Thermo Scientific, Nunclon Delta Surface), содержащие по 100 мкл на лунку среды AIM-V (Gibco, кат. номер 0870112-DK) и инкубировали в течение 20 часов при 37°С и 5% CO₂. Затем исследовали трастузумаб, пертузумаб, IgG1 человека, каппа (Sigma, кат. Номер I5154) и биспецифическое антитело к HER2 (общая легкая цепь) в конечной концентрации 10 мкг/мл. Triton-X (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. Номер 11332481001) в конечной концентрации 1% использовали для определения максимального лизиса. Все образцы инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Затем добавляли комплемент крольчонка (Cedarlane, кат. Номер CL3441) и нормальную человеческую сыворотку (NHS) в конечном разведении 1/30 и инкубировали планшеты в течение 2 часов при 37°С (конечный объем/лунку = 150 мкл). Клеточный лизис определяли по активности ЛДГ с использованием набора для определения цитотоксичности (Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия, кат. номер 11644793001). Определяли оптическую плотность при 490 нм и 620 нм с помощью считывающего устройства Tecan Sunrise.

спонтанный лизис: клетки SK-OV-3 с активным BRC

максимальный лизис: клетки SK-OV-3 с 1% Triton-X

Результаты показаны на Фиг. 4.

Для индукции CDC в присутствии NHS в качестве источника комплемента был абсолютно необходим нокдаун CD55 и CD59. Трудоемкую процедуру нокдауна с использованием siRNA можно избежать благодаря использованию BRC. Присутствие mCRPs на клетках карциномы не влияло на исследование. Это необходимо для применения исследования, описанного в данном документе, в высокопроизводительном скрининге антител различных форматов (помимо скрининга различных комбинаций антител) или просто в качестве положительного контроля в других исследованиях CDC.

Положительный контроль продемонстрировал работоспособность исследования CDC. Сравнение ОП 490/620 нм и специфической цитотоксичности (%) SK-OV-3, SK-OV-3-triple-KO и SK-OV-3-Contrl.siRNA продемонстрировало, что контрольная siRNA не индуцировала цитотоксичность.

Пример 9 (сравнительный)

Попытка разработки анализа CDC с воздействием на мембраносвязанные белки, регулирующие комплемент (mCRPs)

Чтобы установить, влияют ли на исследование ограничивающие факторы клеток-мишеней, специфически направленные против NHS (в противоположность BRC), предприняли попытку понизить экспрессию mCRP, группы белков, ингибирующих различные стадии процесса CDC.

Нейтрализующие антитела, направленные против CD55 и CD59

Ингибирование mCRP осуществляли с помощью нейтрализующих антител, направленных против CD55 и CD59, при инкубации по-отдельности и в комбинации (общая концентрация нейтрализующих антител 10 мкг/мл) после обработки трастузумабом и/или пертузумабом (см. Zhao, W.P., et al., Onc. Rep. 21 (2009) 1405-1411).

Исследование проводили, как описано в Примере 6, со следующими изменениями: Клетки SK-OV-3 инкубировали с нейтрализующим антителом (neu mAb), направленным против CD55, CD59 или обоих (общая концентрация neu mAb 10 мкг/мл) с последующей инкубацией с трастузумабом и/или пертузумабом (или изотипическим контролем) и добавлением сыворотки (разведение 1:30). Результаты наблюдений показаны на Фиг. 3.

Эксперимент повторяли с пулированной сывороткой человека с аналогичными результатами.

В обоих экспериментах BRC вызывал приблизительно 50% относительную CDC, тогда как относительная CDC, наблюдавшаяся с сывороткой человека, составляла менее 15%.

siRNA-опосредованный нокдаун CD46, CD55 и CD59

Снижение экспрессии mCRP осуществляли с помощью технологии РНК-интерференции (RNAi) путем трансфекции клеток малыми интерферирующими РНК (siRNA), специфичными к мРНК mCRP, которая приводила к деградации соответствующих молекул мРНК в цитоплазме. Экспрессию mCRPs на поверхности клеток-мишеней исследовали методом проточной цитометрии через 48 ч после трансфекции siRNA для определения эффективности нокдауна генов (см., например, Mamidi, S., et al., Mol. Onc. 7 (2013) 580-594).

Клетки BT474, SkBr3 и SK-OV-3 трансфицировали siRNA для CD46 (SEQ ID NO: 12 и 13), CD55 (SEQ ID NO: 14 и 15), CD59 (SEQ ID NO: 16 и 17) или рандомизированными siRNA (SEQ ID NO: 18 и 19) (обычно 25 нМ), используя липофекцию (Dharmafect 1) согласно протоколу производителя (Biospring).

Через 48 ч после трансфекции 2×10⁵ клеток окрашивали меченными антителами против CD46, CD55 и CD59 (5 мкг/мл каждого; CD46-FITC кат.номер 555949, CD55-APC кат. номер 555696, CD59-PE кат. номер 555764; BD Pharmingen) и анализировали поверхностную экспрессию указанных рецепторов, включая контроли. Относительное снижение экспрессии CD46, которую определяли методом проточной цитометрии, показано в следующей Таблице.

Относительное снижение экспрессии CD46, CD55 и CD59 в клетках, трансфицированных тремя siRNA, которую определяли методом проточной цитометрии, показано в следующей Таблице.

(*) клетки SK-OV-3 очень чувствительны к трансфекции siRNA. Трансфекция пустым вектором и трансфекция рандомизированной РНК приводила к увеличению экспрессии CD46 вплоть до 27%, а экспрессии CD59 - вплоть до 610%.

Исследование ЛДГ клеток SkBr3 осуществляли через 96 часов после трансфекции, как описано в Примере 4, с использованием комплемента крольчонка или пулированной нормальной человеческой сыворотки (в присутствии или в отсутствие упомянутой siRNA или контролей). В следующей Таблице показаны средние значения выраженного в процентах специфического лизиса клеток SkBr3, трансфицированных siRNA для CD46, CD55 и CD59 (клетки, трансфицированные тремя siRNA) с комплементом крольчонка (+/- SD для n=3).

В следующей Таблице показаны средние значения выраженного в процентах специфического лизиса клеток SkBr3, трансфицированных siRNA для CD46, CD55 и CD59 (клетки, трансфицированные тремя siRNA) с пулированной сывороткой человека (+/- SD для n=3).

Несмотря на то, что вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно, все иллюстрации и примеры приведены исключительно для лучшего понимания изобретения, описание и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Содержание всех патентов и научных публикаций, процитированных в данном документе, включено во всей полноте путем ссылки.

Claims

1. Способ определения комплемент-зависимой цитотоксичности композиции,

где композиция содержит:

i) первый сайт связывания, который специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, конъюгированный с первым полипептидом Fc-области человеческого происхождения, и

где способ включает следующие стадии:

2. Способ по п. 1, где композиция содержит первое человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с первым эпитопом первого антигена, и второе человеческое или гуманизированное антитело, которое специфически связывается со вторым эпитопом второго антигена.

3. Способ по п. 1, где композиция содержит первое человеческое или гуманизированное биспецифическое антитело, которое специфически связывается с первым эпитопом первого антигена и со вторым эпитопом второго антигена.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где композиция связывается с первым эпитопом первого антигена и со вторым эпитопом первого антигена и первый эпитоп и второй эпитоп различаются.

5. Способ по п. 4, где первый эпитоп и второй эпитоп представляют собой неперекрывающиеся эпитопы.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где клеточный лизис определяют через 0,5-3 часа после добавления комплемента.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где человеческая клетка представляет собой человеческую опухолевую клетку или человеческую клетку, вызывающую аутоиммунный ответ.

8. Способ по п. 7, где человеческая опухолевая клетка представляет собой человеческую клетку карциномы эпителиального происхождения.

9. Способ по п. 7, где человеческая опухолевая клетка представляет собой клетку В-клеточной лимфомы человека.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где способ представляет собой бессывороточный способ.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где кроличий комплемент представляет собой комплемент крольчонка.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где соотношение первого сайта связывания и второго сайта связывания составляет от 0,5:1 до 1:0,5.