RU2696096C2 - Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени - Google Patents
Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2696096C2 RU2696096C2 RU2017142686A RU2017142686A RU2696096C2 RU 2696096 C2 RU2696096 C2 RU 2696096C2 RU 2017142686 A RU2017142686 A RU 2017142686A RU 2017142686 A RU2017142686 A RU 2017142686A RU 2696096 C2 RU2696096 C2 RU 2696096C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reaction
- compound
- deoxy
- acid
- copper
- Prior art date
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 102000005427 Asialoglycoprotein Receptor Human genes 0.000 title claims abstract description 32
- 108010006523 asialoglycoprotein receptor Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 title description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title description 3
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 title 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 title 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical class CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 52
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 34
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 32
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 claims description 26
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 25
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 22
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 20
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims description 19
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 claims description 19
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 18
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 17
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 16
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 claims description 16
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 claims description 15
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 15
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 claims description 15
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 claims description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 9
- -1 tetrohydrofuran Chemical compound 0.000 claims description 9
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DHQJPCIPZHPDSL-HOTMZDKISA-N N-[(2R,3R,4R,5R,6R)-2-(2-azidoethoxy)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OCCN=[N+]=[N-] DHQJPCIPZHPDSL-HOTMZDKISA-N 0.000 claims description 8
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 claims description 8
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 8
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 5
- CCZCDCDASZJFGK-JAJWTYFOSA-N CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N=[N+]=[N-] Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N=[N+]=[N-] CCZCDCDASZJFGK-JAJWTYFOSA-N 0.000 claims description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 claims description 5
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 claims description 5
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 claims description 5
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 claims description 5
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims description 3
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 2
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 claims 2
- ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M bromocopper(1+) Chemical compound Br[Cu+] ODWXUNBKCRECNW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- GBRBMTNGQBKBQE-UHFFFAOYSA-L copper;diiodide Chemical compound I[Cu]I GBRBMTNGQBKBQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 239000005749 Copper compound Substances 0.000 claims 1
- 150000001345 alkine derivatives Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001880 copper compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 5
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 4
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229930182475 S-glycoside Natural products 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 2
- 150000003569 thioglycosides Chemical class 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAWSQZCWOQZXHI-FQEVSTJZSA-N 10-Hydroxycamptothecin Chemical compound C1=C(O)C=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 HAWSQZCWOQZXHI-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 2,2,5,8-tetramethyl-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound C1CC(C)(C)OC2=C1C(C)=C(O)C=C2C MEKOFIRRDATTAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 101150075175 Asgr1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N Doxorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MWWSFMDVAYGXBV-RUELKSSGSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001244 Poly(D,L-lactide) Polymers 0.000 description 1
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000000738 acetamido group Chemical group [H]C([H])([H])C(=O)N([H])[*] 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 125000005336 allyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108700000711 bcl-X Proteins 0.000 description 1
- 102000055104 bcl-X Human genes 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004662 cellular morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M copper(i) bromide Chemical compound Br[Cu] NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M copper(i) iodide Chemical compound I[Cu] LSXDOTMGLUJQCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229960002918 doxorubicin hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008290 endocytic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006359 hepatoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010820 immunofluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000002353 niosome Substances 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
- A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
- A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается лиганда, характеризующегося аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору и предназначенного для доставки противоопухолевого соединения, используемого при терапии гепатоцеллюлярной карциномы, представляющего собой производное N-ацетилгалактозамина. Группа изобретений также касается соединения для терапии гепатоцеллюлярной карциномы, представляющего собой конъюгат указанного лиганда с противоопухолевым соединением; способа получения этого соединения путем проведения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения. Группа изобретений обеспечивает лечение гепатоцеллюлярной карциномы. 4 н. и 23 з.п. ф-лы, 15 пр., 3 ил., 1 табл.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области органической и медицинской химии, а также молекулярной биологии и касается способа получения нового класса биологически активных веществ - низкомолекулярных ковалентно связанных конъюгатов противоопухолевых соединений с высокоселективными лигандами асиалогликопротеинового рецептора (ASGP-R), которые могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).
Уровень техники
Гепатоцеллюлярная карцинома занимает 5-е по распространенности и 3-е по смертности среди злокачественных опухолей человека. Ежегодно в мире диагностируют более 600000 новых случаев заболевания [Kumar Y. et al. Transarterial therapies for hepatocellular carcinoma: a comprehensive review with current updates and future directions // Asian Рас J Cancer Prev. - 2016. - T. 17. - C. 473-478]. В связи с широким спектром побочных эффектов и высокой общей токсичностью противоопухолевых препаратов, актуальной задачей является поиск систем для их адресной доставки в пораженные ткани. Адресная доставка - перспективный метод модификации лекарственных агентов, позволяющий улучшить фармакологический профиль, локализовать терапевтические агенты в целевой ткани, органе или клетке, повысить терапевтический индекс и эффективность лекарственных препаратов за счет увеличения его действенной концентрации и снижения общего содержания в организме [Maklakova S. Yu. et al. A new approach to the synthesis of ligands of asialoglycoprotein receptor for targeted delivery of oligonucleotides to hepatocytes // Russian Chemical Bulletin. - 2015. - T. 64. - №. 7. - C. 1655-1662]. Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R) - одна из наиболее удобных мишеней для адресной доставки лекарственных агентов в клетки печени. Это обусловлено такими факторами, как: 1) высокая селективность ASGP-R по отношению к производным галактозы, 2) расположение ASGP-R только на поверхности гепатоцитов и 3) высокая концентрация (более 500000 рецепторов на каждой клетке) [Spiess М. The asialoglycoprotein receptor: a model for endocytic transport receptors // Biochemistry. - 1990. - T. 29. - №. 43. - C. 10009-10018; Stockert R.J. The asialoglycoprotein receptor: relationships between structure, function, and expression // Physiological reviews. - 1995. - T. 75. - №. 3. - C. 591-609]. Важным преимуществом ASGP-R является механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза, за счет которого лекарственный агент попадает в гепатоцит и освобождается от молекулы-доставщика, а рецептор в течение часа возвращается на поверхность мембраны [Bareford L.М., Swaan P.W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery // Advanced drug delivery reviews. - 2007. - T. 59. - №. 8. - C. 748-758]. Характерной особенностью ASGP-R является его повышенная экспрессия в клетке в присутствии биотина [Collins J.С. et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2 // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. №. 23. P. 11280-11283]. В связи с этим возможна направленная доставка терапевтических молекул в печень с помощью адресных систем, включающих в себя тканеспецифический лиганд на основе N-ацетилгалактозамина и его производных [Maklakova S. Yu. et al. A new approach to the synthesis of ligands of asialoglycoprotein receptor for targeted delivery of oligonucleotides to hepatocytes // Russian Chemical Bulletin. - 2015. - T. 64. - №. 7. - C. 1655-1662].
Существует ряд примеров систем для направленного транспорта противоопухолевых препаратов в клетки ГЦК с помощью лигандов ASGP-R [Ivanenkov Y.A. et al. Modern approaches for treatment of liver diseases via targeted drug delivery strategies // Russ Chem Rev. - 2017. - T. 86]. В подавляющем большинстве это сополимеры, наночастицы, липосомы или мицеллы, модифицированные остатками галактозы или N-ацетилгалактозамина. Например, полимерный носитель PK2, разработанный Pfizer и исследовавшийся в фазе I/II на пациентах с первичным или метастатическим раком печени [Seymour L.W. et al. Hepatic drug targeting: phase I evaluation of polymer-bound doxorubicin // Journal of clinical oncology. - 2002. - T. 20. - №. 6. - C. 1668-1676]. Доксорубицин (Dox) связывался через расщепляемую тетрапептидную последовательность с N-(2-гидроксипропил)метакриламидным сополимером, содержащим фрагменты N-ацетилгалактозамина. Было продемонстрировано, что таким образом можно обеспечить селективный транспорт доксорубицина в клетки, и препарат был рекомендован для дальнейшего исследования (фазы II), которое тем не менее в результате было приостановлено. Основными недостатками высокомолекулярных систем направленного транспорта (мицеллы, наночастицы, липосомы и т.п.), являются: 1) низкая проницаемость через клеточную мембрану и стенки кровеносных сосудов [Ivanenkov Y.A. et al. Modern approaches for treatment of liver diseases via targeted drug delivery strategies // Russ Chem Rev. - 2017. - T. 86; Goodman Т.Т., Olive P.L., Pun S.H. Increased nanoparticle penetration in collagenase-treated multicellular spheroids // International journal of nanomedicine. - 2007. - T. 2. - №. 2. - C. 265]; 2) низкая стабильность в плазме крови [
R. et al. Assessment of the integrity of poly (caprolactone)-b-poly (ethylene oxide) micelles under biological conditions: a fluorogenic-based approach // Langmuir. - 2006. - T. 22. - №. 8. - C. 3570-3578; R., Eisenberg A., Maysinger D. Block copolymer micelles as delivery vehicles of hydrophobic drugs: micelle-cell interactions // Journal of drug targeting. - 2006. - T. 14. - №. 6. - C. 343-355; Burt H.M. et al. Development of copolymers of poly (D,L-lactide) and methoxypolyethylene glycol as micellar carriers of paclitaxel // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. - 1999. - T. 16. - №. 1. - C. 161-171]; 3) сравнительно короткое время полувыведения [Hong М. et al. Efficient tumor targeting of hydroxycamptothecin loaded PEGylated niosomes modified with transferrin // Journal of Controlled Release. - 2009. - T. 133. - №. 2. - C. 96-102].
В отличие от высокомолекулярных систем доставки, в литературе практически не описаны низкомолекулярные конъюгаты лигандов ASGP-R с противоопухолевыми препаратами, в которых векторный фрагмент и действующее вещество соединены с помощью сравнительно небольшого биоразлагаемого фрагмента (линкера). Хотя добавление галактозного фрагмента в структуру низкомолекулярных конъюгатов достаточно распространенно [Ma Y. et al. Galactose as Broad Ligand for Multiple Tumor Imaging and Therapy // Journal of Cancer. - 2015. - T. 6. - №.7. - C. 658-670; Melisi D. et al. D-Galactose as a vector for prodrug design // Current topics in medicinal chemistry. - 2011. - T. 11. - №. 18. - C. 2288-2298], данные работы не рассматривают его в качестве лиганда ASGP-R, а в частности предполагают увеличение растворимости в водных растворах и сродство к другому рецептору. Заявляемое изобретение представляет собой первый случай, описывающий конъюгаты противоопухолевых лекарственных соединений, связанных с ASGP-R-специфическим лигандом через относительно короткий биодеградируемый линкер. Был произведен синтез новых лигандов асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина, а также синтез их ковалентно связанных низкомолекулярных конъюгатов с противоопухолевыми лекарственными средствами и биологические испытания полученных конъюгатов на клеточных линиях HepG2, Hek293.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание новых низкомолекулярных ковалентно связанных конъюгатов противоопухолевых лекарственных соединений с лигандами асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина для терапии онкологических заболеваний печени.
Техническим результатом является получение новых соединений, обладающих выраженной аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору и токсичностью по отношению к клеточным линиям гепатоцеллюлярной карциномы, низкой токсичностью по отношению к другим тканям и улучшенной биодоступностью действующего противопухолевого соединения.
Поставленная задача решается низкомолекулярными конъюгатами противоопухолевых соединений с лигандами асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина, общей структурной формулы:
где лиганд представляет собой производное N-ацетилгалактозамина структурных формул 1, 2, 3:
a «Antineoplastic agent» (противоопухолевое соединение) представляет собой соединение, содержащее свободную гидроксильную или амино группу, образующую ковалентную связь с лигандом и обладающее противоопухолевым действием для терапии онкологических заболеваний печени. При этом в качестве противоопухолевого соединения, содержащего свободную гидроксильную предпочтительно использовать паклитаксел, или гемцитабин, или цитарабин, или азацитидин, а в качестве противоопухолевого соединения, содержащего свободную амино группу предпочтительно использовать доксорубицин (Dox*HCl) или даунорубицин. Лиганды формул 1, 2 и 3 характеризуются аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору и предназначены для доставки противоопухолевых соединений, используемых при терапии гепатоцеллюлярной карциномы.
Способ получения низкомолекулярных конъюгатов, заключается в проведении двух последовательных реакций, сначала реакции карбодиимидного синтеза путем смешения противоопухолевого соединения и алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью, взятых из расчета, что на 1 мольный эквивалент противоопухолевого соединения берут не менее 1.0 эквивалента алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью, в присутствии активатора карбоксильной группы, взятом из расчета на 1 мольный эквивалент алкиниловой кислоты берут 1 эквивалент активатора карбоксильной группы, в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, и выделение промежуточного продукта путем колоночной хроматографии - противоопухолевого соединения, модифицированного алкинильной кислотой с теминальной тройной связью, а затем реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения промежуточного продукта и компонента, содержащего азидо-группу, в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, в среде, обеспечивающей протекание реакции циклоприсоединения, при этом на 1 мольный эквивалент промежуточного продукта используют по меньшей мере 1.0 эквивалент компонента, содержащего азидо-группу, и по меньшей мере 0.2 эквивалент катализатора, после прохождения реакции осуществляют удаление среды с последующим выделением конечного продукта при помощи колоночной хроматографии. Предпочтительно в качестве противоопухолевого соединения использовать паклитаксел, или гемцитабин, или цитарабин, или азацитидин, или доксорубицин (Dox*HCl), или даунорубицин, при этом в качестве алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью использовать проп-2-иновую кислота, бут-3-иновую кислота, пент-4-иновую кислота, гекс-5-иновую кислота, гепт-6-иновую кислоту, а в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, использовать ДМФА (диметилформамид), CH2Cl2 (дихлорметан), CHCl3 (хлороформ), тетрогидрофуран, ClCH2CH2Cl (1,2-дихлорэтан). В качестве активатора карбоксильной группы предпочтительно использовать растворимые в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, карбодиимиды, а именно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC). Выделение промежуточного продукта предпочтительно проводить с использованием прямой колоночной хроматографии в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. Для проведения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения в качестве компонента, содержащего азидо-группу предпочтительно использовать производное N-ацетилгалактозамина, выбранное из группы, включающей 1-Азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-О-Аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы. При этом в качестве соединения одновалентной одновалентной меди, предпочтительно использовать одновалентные соли меди растворимые в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения, а именно иодид меди (CuI), бромид меди (CuBr), хлорид меди (CuCl), а в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения, предпочтительно использовать ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, диметилсульфоксид (ДМСО). Для выделения конечного продукта - низкомолекулярного конъюгата предпочтительно использовать обращено-фазовую колоночную хроматографию в системе Н2О-MeCN.
Для получения низкомолекулярного конъюгата с противоопухолевым соединением, включающим доступную для модификации аминогруппу, в качестве которых предпочтительно использовать доксорубицин или даунорубицин, сначала получают лиганд формул 1, 2 и 3 путем проведения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент, и соединения, содержащего азидо-группу, взятых в мольном соотношении 1:1, в присутствии катализатора - соли одновалентной меди, взятой из расчета на 1 мольный эквивалент компонента, содержащего азидо-группу, по меньшей мере 0.25 эквивалента катализатора в среде обеспечивающей протекание реакции циклоприсоединения, после прохождения реакции удаляют среду и выделяют лиганд при помощи колоночной хроматографии, с последующим проведением реакции карбодиимидного синтеза между полученным лигандом и противоопухолевым соединением с доступной для модификации аминогруппой, взятых в мольном соотношении 1:1, в присутствии активатора карбоксильной группы, взятом из расчета на 1 мольный эквивалент лиганда по п. 1 не менее 1 эквивалента активатора, в ДМФА, после прохождения реакции удаляют ДМФА и выделяют конъюгат при помощи колоночной хроматографии. При этом в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции [3+2] азид-алкинового присоединения, используют ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, ДМСО. В качестве соединения, содержащего терминальный алкиновый фрагмент, предпочтительно использовать алкиниловые кислоты с терминальной тройной связью, а именно проп-2-иновую кислоту, бут-3-иновую кислоту, пент-4-иновую кислоту, гекс-5-иновую кислоту, гепт-6-иновую кислоту, а в качестве соединения, содержащего азидо-группу предпочтительно использовать производные N-ацетилгалактозамина, а именно 1-Азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозу. Предпочтительно в качестве солей одновалентной меди использовать растворимые в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения, соли меди, а именно CuI, CuBr, CuCl. Пр этом для выделения полученного лиганда предпочтительно использовать прямую колоночную хроматографию системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. При проведении реакции карбодиимидного синтеза в качестве активатора карбоксильной группы предпочтительно использовать растворимые в ДМФА карбодиимиды, а именно 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC). Для выделения полученного конъюгата предпочтительно использовать две последовательные колоночные хроматографии прямую колоночную хроматографию системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (20:1) → МеОН и обращено-фазовую колоночную хроматографию в системе Н2О-MeCN.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены снимки, сделанные при помощи микроскопа, конъюгатов (4) - А, (5) - В, (6) - С. Время инкубирования - 24 часа.
На фиг. 2 представлены снимки необработанных клеток Hepg2, которые фиксировали, пермеабилизировали и иммунизировали антителом против α-тубулина
На фиг. 3 представлены снимки клеточной линии Hepg2, обработанных конъюгатами (8-10). Клетки фиксировали, пермеабилизировали и иммунизировали антителом против α-тубулина. На снимках: А - клетки после обработки конъюгатом 8 (6 часов), В - клетки после обработки конъюгатом 8 (39 часов), С - клетки после обработки конъюгатом 9 (3 часа), D - клетки после обработки конъюгатом 9 (17 часа), Е - клетки после обработки конъюгатом 10 (24 часа), F - клетки после обработки конъюгатом 9 (17 часов).
Осуществление изобретения
Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.
«Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGP-R)» - трансмембранный белок, преимущественно экспрессируемый гепатоцитами, селективно распознающий производные D-галактозы и D-галактозамина и участвующий в их транспорте в клетку.
«Конъюгат» - комплекс, формирующийся при помощи ковалентных связей между противоопухолевым соединенем и его лигандом-носителем.
«Лиганд» - химическое соединение, которое образует нековалентный комплекс с той или иной биомолекулой (чаще всего белком, например клеточным рецептором, но иногда, например, с ДНК) и производит, вследствие такого связывания, те или иные биохимические, физиологические или фармакологические эффекты.
«Противоопухолевое лекарственное соединение (агент)» - вещество, используемое в качестве активного компонента в препаратах для лечения онкологических заболеваний. Примеры используемых противоопухолевых агентов и их ковалентная связь с заявляемым лигандом приведены на схеме (I)
где «Ligand» (лиганд) - это выше описанные производные N-ацетилгалактозамина с структурными формулами 1, 2, 3.
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, выпаривание растворителя осуществляли с использованием роторного испарителя, при пониженном давлении при температуре бани примерно 50°С; контроль за ходом реакции осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ), и время реакции указано только для иллюстрации; структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ с предварительно нанесенным силикагелем 60 F254 Merck), масс-спектрометрия или ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Выход продукта приведен только для иллюстрации. Колоночную флэш-хроматографию осуществляли, используя Merck силикагель 60 (230-400 меш ASTM). Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) зарегистрированы на спектрометре Bruker microTOF II. Спектры ЯМР регистрировали на приборах Bruker Avance-400 (рабочая частота 400.1 и 100.6 МГц для 1Н и 13С, соответственно) и Agilent 400-MR (рабочая частота 400.0 и 100.6 МГц для 1Н и 13С, соответственно), используя дейтерированный хлороформ (99,8% D) или метанол (99.9%) или ДМСО (99,9% D) в качестве растворителя, если не указано иное, относительно тетраметилсилана (TMS) в качестве внутреннего стандарта, миллионных долях (м.д.); обычные используемые сокращения следующие: с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квартет, м - мультиплет, шир. - широкий и так далее.
Способ получения конъюгатов противоопухолевых лекарственных соединений с лигандами асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина для терапии онкологических заболеваний печени проводят по реакции карбодиимидного синтеза с последующей реакцией [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения. Для противоопухолевых соединений с доступной для модификации аминогруппой возможен путь синтеза с первоначальным получением лиганда путем реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения и последующим проведением реакции карбодиимидного синтеза между лигандом и противоопухолевым соединением.
Образование конъюгата лиганда асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина с противоопухолевыми соединениями, содержащими амино и гидроксильную группы, доступные для ацилирования алкиновой кислотой с терминальной тройной связью, заключается двух последовательных реакциях. Сначала проводят модификацию противоопухолевого соединения алкиновой кислотой с терминальной тройной связью при помощи реакции карбодиимидного синтеза, которая осуществляется посредством смешения противоопухолевого соединения и алкиновой кислоты с терминальной тройной связью в присутствии активатора карбоксильной группы в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, при этом на 1 мольный эквивалент противоопухолевого соединения берут не менее 1 эквивалента кислоты и не менее 1.0 эквивалента активатора карбоксильной группы. После чего проводят выделение противоопухолевого соединения, модифицированного алкиновой кислотой с терминальной тройной связью, путем прямой колоночной хроматографии в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. Затем проводят реакцию [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения модифицированного противоопухолевого соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент, и соединения, содержащего азидо-группу в мольном соотношении из расчета, что на 1 мольный эквивалент соединения, содержащего азидо-группу, используют по меньшей мере 1.0 эквивалента соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент. Реакцию проводят в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, взятого из расчета на 1 мольный эквивалент соединения, содержащего азидо-группу берут по меньшей мере 0.2 эквивалент катализатора, при этом реакцию проводят в среде, обеспечивающей растворение соединений. После прохождения реакции осуществляют удаление среды с последующим выделением продукта при помощи колоночной хроматографии.
В качестве противоопухолевого соединения используют паклитаксел, или гемцитабин, или цитарабин, или азацитидин, или доксорубицин, или даунорубицин.
В качестве алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью используют проп-2-иновую кислота, бут-3-иновую кислота, пент-4-иновую кислота, гекс-5-иновую кислота, гепт-6-иновую кислоту.
В качестве среды, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, используют диметилформамид, дихлорметан, хлороформ, тетрогидрофуран, 1,2-дихлорэтан.
В качестве активатора карбоксильной группы используют растворимые в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, карбодиимиды: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC).
Для выделения промежуточного продукта используют прямую колоночную хроматографию в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН.
В качестве среды, обеспечивающей протекание реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения, используют ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, ДМСО или любой другой растворитель, обеспечивающий растворение и инертный к компонентам смеси.
В качестве компонента, содержащего азидо-группу - производные N-ацетилгалактозамина: 1-Азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозу.
В качестве катализатора - соединений одновалентной меди используют любую растворимую в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения, соль одновалентной меди. Например, CuI, CuBr, CuCl и т.п.
Для выделения полученного продукта используют обращено-фазовую колоночную хроматографию в системе Н2О-MeCN.
Верхняя граница содержания используемых реагентов не ограничивается, т.к. избыток какого-либо реагента не уменьшает выходов реакций, однако при большом избытке может понадобиться дополнительная очистка продуктов реакций.
Для противоопухолевых соединений с доступной для модификации аминогруппой присоединение лиганда проводят следующим образом.
На первом этапе получают заявляемые лиганды путем проведения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент, и соединения, содержащего азидо-группу, при этом на 1.0 мольный эквивалент соединения, содержащего азидо-группу, используют по меньшей мере 1.0 эквивалента соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент. Реакцию проводят в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, взятую в количестве из расчета по меньшей мере 0.25 эквивалент катализатора на 1.0 мольный эквивалент соединения, содержащего азидо-группу. Реакцию проводят в среде, обеспечивающей растворение компонентов. При этом в качестве среды, обеспечивающей растворение соединений, используют ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, ДМСО или любой другой растворитель, обеспечивающий растворение и инертный к компонентам смеси. После прохождения реакции осуществляют удаление среды с последующим выделением продукта при помощи колоночной хроматографии.
В качестве соединений, содержащих терминальный алкиновый фрагмент, используют алкиниловые кислоты с терминальной тройной связью. Длина углеродного фрагмента кислоты не имеет принципиального значения, в качестве алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью может выступать: проп-2-иновая кислота, бут-3-иновая кислота, пент-4-иновая кислота, гекс-5-иновая кислота, гепт-6-иновая и т.д.
В качестве компонента, содержащего азидо-группу, используют производные N-ацетилгалактозамина: 1-Азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-Аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозу.
В качестве катализатора - соединения одновалентной меди используют любую растворимую в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения, соль одновалентной меди. Например, CuI, CuBr, CuCl и т.д.
Для выделения полученного продукта используют прямую колоночную хроматографию системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН.
Образование конъюгата полученного лиганда асиалогликопротеинового рецептора на основе производных N-ацетилгалактозамина с противоопухолевыми соединениями с доступной для модификации аминогруппой заключается в проведении реакции карбодиимидного синтеза посредством смешения соединения, содержащего карбоксильную группу - лиганда формулы 1, или 2, или 3, соответственно, и противоопухолевого соединения, включающего аминогруппу, например доксорубицина или даунорубицина, в мольном соотношении 1:1, в присутствии активатора карбоксильной группы. При этом количество активатора берут из расчета на 1,0 мольный эквивалент противоопухолевого агента по меньшей мере 1.1 эквивалент активатора. Реакцию карбодиимидного синтеза проводят в среде, обеспечивающей растворение соединений и инертной к компонентам смеси. Предпочтительно использовать ДМФА. После прохождения реакции осуществляют удаление среды с последующим выделением продукта при помощи колоночной хроматографии.
В качестве активаторов карбоксильной группы используют любой активатор карбоксильной группы карбодиимидного ряда, например: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC), N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC), N,N'-дициклогексилкарбодиимид (DCC) и т.п
Для выделения полученного продукта используют две последовательные колоночные хроматографии прямую колоночную хроматографию системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (20:1) → МеОН и обращено-фазовую колоночную хроматографию в системе Н2О-MeCN.
Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1. Получение 4-(1-(3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутановой кислоты (1).
К раствору 108 мг (0,44 ммоль) 1-Азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы, полученной согласно методике, описанной в работе [
N. et al. Iron (III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu (0) for the subsequent click chemistry // Chemical Communications. - 2011. - T. 47. - №. 37. - C. 10440-10442], в 15 мл сухого ДМФА добавили 60 мг (0,528 ммоль, 1,2 экв.) гекс-5-иновой кислоты и 21 мг (0,11 ммоль, 0,25 экв.) CuI. Полученную смесь перемешивали в течение 48 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом колоночной хроматографии в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. В результате получили соединение 1 в виде светло-желтого аморфного вещества 125 мг (79%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 8.03 (с, 1Н, Н-16); 5.75 (д, 1H, J=9.8 Гц, Н-5); 4.51-4.63 (м, 1Н, Н-1); 4.06 (д, 1Н, J=3.1 Гц, Н-2); 4.21-4.30 (м, 1Н, Н-3); 3.73-3.97 (м, 4Н, Н-3,4,7); 2.68-2.80 (м, 2Н, Н-17); 2.20-2.32 (м, 2Н, Н-19); 1.88-2.01 (м, 2Н, Н-18); 1.79 (с, 1H, -NHAc).
МСВР (m/z) для C14H22N4O7: [М+Н]+ 359.1561 (найдено), 359.1562 (рассч.); [M+Na]+ 381.1381 (найдено), 381.1381 (рассч.).
Пример 2. Получение 4-(1-(2-((3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2Н-пиран-2-ил)окси)этил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутановой кислоты (2).
К раствору 30 мг (0,103 ммоль) 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы, полученной согласно методике, описанной в работе [Hasegawa A. et al. Studies on the thioglycosides of N-acetylneuraminic acid 10: Synthesis of S-(α-sialosyl)-(2→6)-O-2-acetamido-2-deoxy-β-d-hexopyranosyl ceramide and its related compounds // Journal of carbohydrate chemistry. - 1992. - T. 11. - №. 3. - C. 319-331], в 15 мл сухого ДМФА добавили 13,9 мг (0,124 ммоль, 1,2 экв.) гекс-5-иновой кислоты и 4,9 мг (0,026 ммоль, 0,25 экв.) CuI. Полученную смесь перемешивали в течение 48 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом колоночной хроматографии в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. В результате получили соединение (2) в виде светло-желтого аморфного вещества 31 мг (75%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 8.21 (с, 1H, Н-19); 4.67-4.77 (м, 2Н, Н-1,2); 4.40 (д, 1Н, J=8.4 Гц, Н-5); 4.21-4.30 (м, 1H, Н-3); 3.90-4.03 (м, 2Н, Н-4, 13); 3.80-3.90 (м, 1Н, Н-13); 3.48-3.80 (м, 4Н, Н-7,14); 2.86 (т, 2Н, J=7.4 Гц, Н-20); 2.45 (т, 2Н, J=7.4 Гц, Н-22); 1.92-2.08 (м, 5Н, H-21, -NHAc).
МСВР (m/z) для C16H26N4O8: [М+Н]+ 403.1819 (найдено), 403.1823 (рассч.).
Пример 3. Получение 4-(1-((5-ацетамидо-6-(аллилокси)-3,4-дигидрокситетрагидро-2Н-пиран-2-ил)метил)-1Н-1,2,3-триазол-4-ил)бутановой кислоты (3).
К раствору 30 мг (0,105 ммоль) 1-O-Аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы, полученной согласно ранее описанной методике [Wong С.Н. et al. A library approach to the discovery of small molecules that recognize RNA: use of a 1, 3-hydroxyamine motif as core // Journal of the American Chemical Society. - 1998. - T. 120. - №. 33. - C. 8319-8327] в 15 мл сухого ДМФА добавили 14,1 мг (0,125 ммоль, 1,2 экв.) гекс-5-иновой кислоты и 5 мг (0,026 ммоль, 0,25 экв.) CuI. Полученную смесь перемешивали в течение 48 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом колоночной хроматографии в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1) → МеОН. В результате получили соединение (3) в виде светло-желтого аморфного вещества (28 мг, 67%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 7.99 (с, 1Н, Н-19); 5.65-5.78 (м, 1Н, Н-14); 5.04-5.19 (м, 2Н, Н-15); 4.81 (д, 1H, J=3.6 Гц, Н-2); 4.63-4.71 (м, 2Н, Н-1,5); 4.30 (дд, 1Н, J=3.5 и 11.0 Гц, Н-3); 4.19-4.24 (м, 1Н, Н-4), 3.95 (д, 1Н, J=2.6 Гц, Н-7), 3.84 (дд, 1H, J=3.1 и 11.0 Гц, Н-7), 3.63-3.75 (м, 2Н, Н-13), 2.74-2.86 (м, 2Н, Н-20), 2.32-2.42 (м, 2Н, Н-22), 1.91-2.05 (м, 5Н, Н-21, -NHAc).
МСВР (m/z) для C17H26N4O7: [М+Н]+ 399.1876 (найдено), 399.1874 (рассч.); [M+Na]+ 421.1692 (найдено), 421.1694 (рассч.).
Пример 4. Получение соединения (4).
К раствору 6 мг (0,01 ммоль) доксорубицина гидрохлорида в 6 мл сухого ДМФА добавили 3,95 мг (0,01 ммоль, 1 экв.) соединения (1) в присутствии 1,15 мг (0,011 ммоль) Et3N, 1,31 мг (0,011 ммоль, 1,1 экв.) NHS, 2,11 мг (0,011 ммоль, 1,1 экв.) EDC в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали двумя последовательными хроматографированиями: 1) колоночная хроматография на силикагеле (градиентное элюирование CH2Cl2:МеОН (20:1) → МеОН), 2) ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (4) в виде темно-красного порошка (7.3 мг, 80%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 7.72-8.04 (м, 3Н, Н-1,6, 61); 7.56 (д, 1Н, J=7.6 Гц, Н-2); 5.61 (д, 2Н, J=9.2 Гц, Н-51); 5.09-5.22 (м, 1H, Н-32); 4.65 (с, 2Н, Н-20); 4.46 (т, 1Н, J=10.0 Гц, Н-53); 4.09-4.33 (м, 3Н, Н-54,55,56); 4.04 (с, 5Н, Н-29,57); 3.69-3.87 (м, 5Н, Н-31,34,35,36, ОН); 3.62 (уш.с, 1Н, ОН); 2.91-3.18 (м, 2Н, Н-45); 2.27-2.44 (м, 2Н, Н-16); 2.06-2.22 (м, 2Н, Н-42); 1.84-2.03 (м, 4Н, Н-44,33); 1.77 (с, 3H, -NHAc); 1.20-1.34 (м, 5Н, Н-18,38).
МСВР (m/z) для C41H49N5O17: [М+Н]+ 884.3196 (найдено), 884.3196 (рассч.); [M+Na]+ 906.3025 (найдено), 906.3016 (рассч.).
Пример 5. Получение соединения (5).
К раствору 6 мг (0,01 ммоль) Dox*HCl в 6 мл сухого ДМФА добавили 4,16 мг (0,01 ммоль, 1 экв.) соединения (2) в присутствии 1,15 мг (0,011 ммоль, 1,1 экв.) Et3N, 1,31 мг (0,011 ммоль, 1,1 экв.) NHS, 2,11 мг (0,011 ммоль, 1,1 экв.) EDC в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали двумя последовательными хроматографированиями: 1) колоночная хроматография на силикагеле (градиентное элюирование CH2Cl2:МеОН (20:1) → МеОН), 2) ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (5) в виде темно-красного порошка (6,7 мг, 70%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 8.00 (д, 1H, J=7.5 Гц, Н-6); 7.85 (т, J=7.5 Гц, Н-1); 7.74 (с, 1Н, Н-61); 7.58 (д, 1H, J=7.5 Гц, Н-2); 5.43 (м, 1Н, ОН); 5.19 (м, 1Н, Н-32); 4.74 (м, 2Н, Н-55); 4.61 (с, 2Н, Н-20); 4.51 (т, 2Н, J=6.2 Гц, Н-56); 4.33 (д, 1H, J=8.4 Гц, Н-47); 4.28 (д, 1Н, J=6.6 Гц, Н-43); 4.08-4.22 (м, 2Н, Н-44,45); 4.04 (с, 3Н, Н-29); 3.66-3.96 (м, 6Н, Н-31,34,35,36,46, ОН); 3.62 (уш.с, 1Н, ОН); 3.51-3.57 (м, 1Н, Н-49); 3.44-3.50 (м, 1Н, Н-49); 3.00-3.18 (м, 2Н, Н-62); 2.37 (м, 2Н, Н-16); 2.23 (т, 2Н, J=7.8 Гц, Н-64); 1.85-2.05 (м, 7Н, -NHAc, Н-33,63); 1.24-1.34 (м, 5Н, Н-18,38).
МСВР (m/z) для C43H53N5O18: [М+Н]+ 928,3458 (найдено), 928,3456 (рассч.); [M+Na]+ 950,3277 (найдено), 950,3270 (рассч.).
Пример 6. Получение соединения (6).
К раствору 10 мг (0,017 ммоль) Dox*HCl в 10 мл сухого ДМФА добавили 6,87 мг (0,017 ммоль, 1 экв.) соединения (3) в присутствии 1,92 мг (0,019 ммоль, 1,1 экв.) Et3N, 2,18 мг (0,019 ммоль, 1,1 экв.) NHS, 3,64 мг (0,019 ммоль, 1,1 экв.) EDC в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали двумя последовательными хроматографированиями: 1) колоночная хроматография на силикагеле (градиентное элюирование CH2Cl2:МеОН (20:1) → МеОН), 2) ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (6) в виде темно-красного порошка (6 мг, 38%). 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 7.94 (д, 1Н, J=7.5 Гц, Н-6); 7.83 (т, J=7.5 Гц, Н-1); 7.73 (с, 1H, Н-59); 7.56 (д, 1H, J=7.5 Гц, Н-2); 5.56-5.72 (м, 1H, Н-54); 5.42 (м, 1H, ОН); 4.96-5.23 (м, 3Н, Н-32,55); 4.75 (м, 2Н, Н-53); 4.48-4.56 (м, 2Н, Н-20); 4.20-4.33 (м, 2Н, Н-41,45); 4.08-4.19 (м, 1H, Н-42,43); 4.02 (с, 3Н, Н-29); 3.88 (с, 1H, ОН); 3.74-3.84 (м, 1Н, Н-44) 3.46-3.70 (м, 5Н, Н-31,34,35,36,47); 2.95-3.18 (м, 2Н, Н-64); 2.11-2.42 (м, 4Н, Н-16, 61); 1.81-2.07 (м, 5Н, -NHAc, Н-63); 1.54-1.76 (м, 2Н, Н-33).
МСВР (m/z) для C44H53N5O17: [М+Н]+ 924,3509 (найдено), 924,3543 (рассч.); [M+Na]+ 946,3340 (найдено), 946,3329 (рассч.).
Пример 7. Синтез моноацилированного гекс-5-иновой кислотой паклитаксела (7). [[Pilkington-Miksa М. et al. Design, synthesis, and biological evaluation of novel cRGD-paclitaxel conjugates for integrin-assisted drug delivery // Bioconjugate chemistry. - 2012. - T. 23. - №. 8. - C. 1610-1622.]
К раствору 40,9 мг (47,87 мкмоль) паклитаксела в 20 мл сухого CH2Cl2 добавили 5,9 мг (52,66 мкмоль, 1,1 экв.) гекс-5-иновой кислоты и 8,2 мг (52,66 мкмоль, 1,1 экв.) EDC, а также каталитическое количество DMAP в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре, затем CH2Cl2 удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом обращенно-фазовой колоночной хроматографии на приборе INTERCHIM PURIFLASH 430 на обращенно-фазовой колонке PURIFLASH С18-НР 15UM F0012 в системе с градиентом концентраций H2O:MeCN (1:0) → H2O:MeCN (0:1). В результате получили соединение (7) в виде белого порошка (41,3 мг, 91%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 8.15 (д, 2Н, J=7.2 Гц, Н-орто-(Ar1)); 7.75 (д, 2Н, J=7.3 Гц, Н-орто-(Ar3)); 7.62 (т, 1Н, J=7.4 Гц, H-пара-(Ar1)); 7.57-7.48 (м, 3Н, Ароматика); 7.47-7.32 (м, 7Н, Ароматика); 6.90 (д, 1Н, J=9.2 Гц, NH); 6.23-6.32 (м, 2Н, Н-10, 13); 5.97 (дд, 1Н, J=2.9 и 9.2 Гц, H-3'); 5.69 (д, 1Н, J=7.1 Гц, Н-2); 5.51 (д, 1H, J=3.1 Гц, Н-2'); 4.98 (дд, 1Н, J=1.8 и 9.5 Гц, Н-5); 4.45 (дд, 1Н, J=6.7 и 10.8 Гц, Н-7); 4.33 (д, 1H, J=8.4 Гц, Н-20); 4.21 (д, 1H, J=8.6 Гц, Н-20); 3.82 (д, 1Н, J=7.1 Гц, Н-3); 2.48-2.70 (м, 3Н, Н-6, 4'',); 2.47 (с, 3Н, 4-ОАс); 2.13-2.44 (м, 8Н, Н-14, 6'', 10-ОАс, Н-2''); 2.00-1.78 (м, 6Н, Н-6,18, 3''); 1.69 (с, 3Н, Н-19); 1.24 (с, 3Н, Н-17); 1.14 (с, 3Н, Н-16).
Пример 8. Синтез конъюгата паклитаксела (8).
К раствору 10 мг (10,54 мкмоль) соединения (7) в 7 мл сухого ДМФА добавили 2,6 мг (10,54 мкмоль, 1 экв.) 1-Азидо-2-ацетамидо-2-дезокси-3,4,6-три-O-ацетил-β-D-галактопиранозы, полученной согласно методике, описанной в работе [
N. et al. Iron (III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu (0) for the subsequent click chemistry // Chemical Communications. - 2011. - T. 47. - №. 37. - С. 10440-10442] в присутствии 0,4 мг (2,11 мкмоль, 0,2 экв.) CuI и 0,2 мг (2,11 мкмоль, 0,2 экв.) Et3N в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (8) в виде белого порошка (10 мг, 79%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 8.04 (д, 2Н, J=7.8 Гц, Н-орто-(Ar1)); 7.99 (м, 1H, -NH-); 7.82 (с, 1H, Н-6''); 7.69 (д, 2Н, J=6.5 Гц, Н-орто-(Ar3)); 7.29-7.57 (м, 11Н, Ароматика); 6.26 (с, 1H, Н-10); 6.08 (т, 1Н, J=8.7 Гц, Н-13); 5.84-5.91 (м, 1H, Н-3'); 5.60-5.68 (м, 2Н, Н-2, Н-10''); 5.34-5.42 (м, 1Н, Н-2'); 4.91 (д, 1Н, J=9.8 Гц, Н-5); 4.12-4.42 (м, 4Н, Н-7,20, 12''); 3.93-4.00 (м, 1Н, Н-13''); 2.53-2.73 (м, 3Н, Н-6,4''); 2.30-2.50 (м, 5Н, 4-Ас, 2''); 2.10-2.27 (м, 5Н, Н-14, 10-Ас); 1.75-2.06 (м, 6Н, Н-6,3'', -NHAc); 1.65 (с, 3Н, Н-18); 1.60 (с, 3Н, Н-19); 1.11 (с, 3Н, Н-17); 1.07 (с, 3Н, Н-16).
МСВР (m/z) для C61H71N5O20: [М+Н]+ 1194.4771 (найдено), 1194.4765 (рассч.); [M+Na]+ 1216.4585 (найдено), 1216.4585 (рассч.).
Пример 9. Синтез конъюгата паклитаксела (9).
К раствору 10 мг (10,54 мкмоль) соединения (7) в 7 мл сухого ДМФА добавили 3,1 мг (10,54 мкмоль, 1 экв.) 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы, полученной согласно методике, описанной в работе [Hasegawa A. et al. Studies on the thioglycosides of N-acetylneuraminic acid 10: Synthesis of S-(α-sialosyl)-(2→6)-O-2-acetamido-2-deoxy-β-d-hexopyranosyl ceramide and its related compounds // Journal of carbohydrate chemistry. - 1992. - T. 11. - №. 3. - C. 319-331], в присутствии 0,4 мг (2,11 мкмоль, 0,2 экв.) CuI и 0,2 мг (2,11 мкмоль, 0,2 экв.) Et3N в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (9) в виде белого порошка (7 мг, 54%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3, δ, м.д.): 8.07 (д, 2Н, J=7.5 Гц, Н-орто-(Ar1)); 8.00 (м, 2Н, -NH-, Н-6''); 7.71 (д, 2Н, J=7.0 Гц, Н-орто-(Ar3)); 7.30-7.60 (м, 12Н, Ароматика, -NH-); 6.27 (с, 1Н, Н-10); 6.09 (т, 1H, J=8.7 Гц, Н-13); 5.87 (д, 1Н, J=4.4 Гц, Н-3'); 5.63 (д, 1Н, J=7.0 Гц, Н-2); 5.33-5.42 (м, 1Н, Н-2'); 4.93 (д, 1H, J=9.3 Гц, Н-5); 4.08-4.56 (м, 9Н, Н-7,20, 11'', 13'',15'',16'', +ОН); 3.67-3.98 (м, 7Н, Н-3, 10'', 17'', 18'', 19''); 2.62-2.77 (м, 3Н, Н-6,4''); 2.31-2.52 (м, 5Н, 4-Ас, 2''); 2.09-2.26 (м, 5Н, Н-14, 10-Ас); 1.76-1.99 (м, 9Н, H-6,18,3'', NHAc); 1.62 (с, 1H, Н-19); 1.19 (с, 3Н, Н-17); 1.14 (с, 3Н, Н-16).
МСВР (m/z) для C63H75N5O21: [М+Н]+ 1238.5035 (найдено), 1238.5027 (рассч.); [M+Na]+ 1260.4848 (найдено), 1260.4847 (рассч.).
Пример 10. Синтез конъюгата паклитаксела (10).
К раствору 6,5 мг (6,85 мкмоль) соединения (7) в 7 мл сухого ДМФА добавили 2,2 мг (6,85 мкмоль, 1 экв.) 1-O-Аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы, полученной согласно ранее описанной методике [Wong С.Н. et al. А library approach to the discovery of small molecules that recognize RNA: use of a 1, 3-hydroxyamine motif as core // Journal of the American Chemical Society. - 1998. - T. 120. - №. 33. - C. 8319-8327] в присутствии 0,3 мг (1,58 мкмоль, 0,2 экв.) CuI и 0,2 мг (1,58 мкмоль, 0,2 экв.) Et3N в инертной атмосфере. Полученную смесь перемешивали в течение 24 часов, затем ДМФА удалили на роторном испарителе. Полученное вещество очищали методом ВЭЖХ в обращено-фазовой системе (Н2О - AcCN). В результате получили конъюгат (31) в виде белого порошка (6,5 мг, 77%).
1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD, δ, м.д.): 8.11 (д, 2Н, J=7.2 Гц, Н-орто-(Ar1)); 7.80 (д, 2Н, J=7.2 Гц, Н-орто-(Ar3)); 7.77 (с, 1Н, Н-6''); 7.62-7.70 (м, 2Н, -NH-, H-пара-(Ar1)); 7.38-7.60 (м, 9Н, Ароматика); 7.27 (т, 1Н, J=7.1 Гц, Н-пара-(Ar2)); 6.43 (с, 1Н, Н-10); 6.08 (т, 1Н, J=9.1 Гц, Н-13); 5.84 (д, 1H, J=6.1 Гц, Н-3'); 5.70-5.81 (м, 1Н, Н-19''); 5.65 (д, 1Н, J=7.2 Гц, Н-2); 5.46 (д, 1H, J=6.0 Гц, Н-2'); 4.95-5.15 (м, 3Н, Н-5,20''); 4.59-4.66 (м, 1H, Н-11''); 4.17-4.39 (м, 4Н, Н-7, 13'',20); 4.09 (дд, 1Н, J=4.7, 13.3 Гц, Н-14''); 3.76-4.00 (м, 5Н, Н-3, 15'',16'',18''); 3.60 (дд, 1H, J=3.0, 10.7 Гц, Н-10''); 3.42-3.50 (м, 1H, Н-10''); 2.68-2.79 (м, 2Н, Н-4''); 2.44-2.54 (м, 3Н, Н-2'',6); 2.40 (с, 3Н, 4-ОАс); 2.11-2.23 (м, 5Н, Н-14, 10-ОАс); 1.76-2.06 (м, 7Н, Н-6,3'', 18, -NHAc); 1.66 (с, 3Н, Н-19); 1.14 (с, 6Н, Н-16, 17).
МСВР (m/z) для C64H75N5O20: [М+Н]+ 1234.5084 (найдено), 1234.5078 (рассч.); [M+Na]+ 1256.4896 (найдено), 1256.4898 (рассч.).
Пример 11. Измерение константы диссоциации комплекса лиганд-ASGP-R
Эксперимент проводился на приборе Biacore X100 (Biacore АВ, Уппсала, Швеция) с использованием чипа-носителя СМ5, состоящего из золотой пластины, покрытой слоем карбоксиметилированного декстрана. Поверхность чипа включает в себя две проточных ячейки: на одной иммобилизуется анализируемый белок, вторая ячейка - ячейка сравнения.
Использовалась буферная смесь, содержащая 150 mM NaCl, 50 mM CaCl2, 50 mM Tris, рН 7.4. Обе ячейки были активированы смесью, содержащей 0,05 М N-гидроксисукцинимид (NHS) и 0,2 М N-этил-N'-диметиламинопропил карбодиимид (EDC) в течении 7 минут, скорость потока смеси 10 мкл/мин. Поверхность ячейки 1 не модифицировалась. На поверхности ячейки 2 был иммобилизован фермент ASGRP печени кролика, растворенный в буфере: 10 mM Tris-HCl, рН 7.0. Раствор фермента подавался в течении 15 минут со скоростью 10 мкл/мин. Обе ячейки были обработаны 0.1 М раствором этаноламина (рН 8.5) для деактивации. Количество иммобилизированного белка ASGPR - 2000 RU.
Отбор и подготовка проб
Лиганды формул 1, 2, 3, исследуемые на аффинность к белку ASGP-R, были растворены в рабочей буферной смеси (150 mM NaCl, 50 mM CaCl2, 50 mM Tris, рН 7.4). К образцам с низкой растворимостью был добавлен диметилсульфоксид (ДМСО), вплоть до объема, равного половине объема использованной буферной смеси. Более высокие концентрации ДМСО не были использованы ввиду непереносимости белковой структуры экстремальных условий и опасностью необратимой денатурации.
Каждый лиганд был представлен в широком диапазоне концентраций, от 10-2 М до 5*10-11 М. Скорость потока 20 мкл/мин, лиганд подавался в течение 180 с (время связывания), и далее в течение 60 с изучалась диссоциация комплекса. Для восстановления чип-носитель обрабатывался 20 мкл 20 мМ раствором ЭДТА. Эксперименты проводились при 25°С. Все буферные растворы были дегазированы и профильтрованы.
Результаты приведены в таблице 1.
Полученные данные свидетельствуют о большей аффинности к ASGP-R полученных лигандов по отношению к нативному лиганду - N-ацетилгалактозамину.
Пример 12. Изучение токсичности конъюгатов по отношению клеточным линиям гепатоцеллюлярной карциномы.
Результаты исследования представлены в таблице 1. Экспериментальные данные цитоксичности самого паклитаксела на клеточной линии HepG2 представлены в работе Луо и соавторов [Luo D. et al. Effects of Bcl-2 and Bcl-XL protein levels on chemoresistance of hepatoblastoma HepG2 cell line // Biochemistry and Cell Biology. - 2000. - T. 78. - №. 2. - С. 119-126.], а так же получены в настоящей работе.
Для полученных конъюгатов измеренные значения цитотоксичности (СС50) на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы сравнимы со значением цитотоксичности для противоопухолевого соединения.
Пример 13. Исследование устойчивости конъюгатов 8-10 в моделях биологических сред при рН 5.0 и 7.4.
Были приготовлены буферные растворы (НСООН, NH4OH) с рН 5.0 и 7.4. После растворения 200 мкг конъюгата в 2 мл буфера было отобрано по 200 мкл полученного раствора в заданные временные точки (0; 0.5; 1; 2; 4; 8; 12; 24 часа). Затем образцы подвергали заморозке при -20°С. После чего образцы были исследованы методом ВЭЖХ-МС на приборе Shimadzu Prominence LC-20 с одиночным квадрупольным масс-спектрометром Shimadzu LCMS-2020 с двойным источником ионизации DUIS-ESI-APCI. Аналитической и препаративной колонкой была Phenomenex Luna 3u C18 100A.
Для всех исследованных конъюгатов площадь пика вещества с течением времени оставалась одинаковой в пределах погрешности, из чего следует, что полученные конъюгаты не подвергаются деградации и являются устойчивыми в этих биологических средах.
Пример 14. Исследования накопления доксорубицина и конъюгатов 4-6 в клеточной культуре HepG2 методом флуоресцентной микроскопии.
Флуоресцентная микроскопия осуществлена с использованием системы для визуализации флюоресценции EVOS FL Cell Imaging System. С 40 - кратным увеличением. На фиг. 1 представлены снимки, сделанные при помощи микроскопа, конъюгатов (4) - А, (5) - В, (6) - С. Время инкубирования - 24 часа. Как свидетельствуют представленные, снимки конъюгаты накапливаются в цитоплазме и, следовательно, доставляются лигандами внутрь клетки.
Пример 15. Анализ морфологии ядра и цитоскелета клеточной культуры линии гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) при воздействии на них конъюгатов 8-10 при помощи иммунно-флуоресцентной микроскопии.
Клетки HepG2 выращивали на покрытых поли-L-лизином покровных стеклах в течение 24 часов с последующим воздействием паклитаксела и конъюгатов в концентрации 1 мкмоль. После 24-часового лечения клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma-Aldrich) в PBS в течение 10 минут, три раза промывали в PBS, а затем инкубировали в течение часа с блокирующим раствором (1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 1% Triton Х-100 в PBS). Затем клетки инкубировали в течение ночи с альфа-тубулином Alexa Fluor 488 Mouse Monoclonal Antibody (Invitrogen # 322588) при 2 мкг/мл. Клетки дважды промывали PBS, а ядра окрашивали 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Invitrogen). Клетки наблюдали с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200 М.
Необработанные клетки показали типичные ядерные и цитоскелетные структуры с образованием нормальных митотических веретен. Микротрубочки, организованные как диффузные в цитоплазме (фиг. 2).
После обработки клеток с помощью паклитаксела характерны изменения морфологии: митозы с более чем двумя полюсами; многие аномальные ядра (микроядра или многоядерные), измененная структура микротрубочек (более толстые и более плотные пучки микротрубочек). Подобные клеточные морфологические изменения наблюдались для обработанных паклитакселем конъюгатов (фиг. 3).
Claims (28)
1. Лиганд, характеризующийся аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору и предназначенный для доставки противоопухолевого соединения, используемого при терапии гепатоцеллюлярной карциномы, представляющего собой производное N-ацетилгалактозамина формул 1, 2 и 3
2. Соединение для терапии гепатоцеллюлярной карциномы, характеризующееся тем, что представляет собой конъюгат лиганда по п. 1 с противоопухолевым соединением, содержащим свободную гидроксильную или аминогруппу, образующую ковалентную связь с лигандом.
3. Соединение по п. 2, характеризующееся тем, что в качестве противоопухолевого соединения, содержащего свободную гидроксильную группу, используют паклитаксел, или гемцитабин, или цитарабин, или азацитидин.
4. Соединение по п. 2, характеризующееся тем, что в качестве противоопухолевого соединения, содержащего свободную аминогруппу, используют доксорубицин или даунорубицин.
5. Способ получения соединения по п. 2, характеризующийся тем, что осуществляют проведение двух последовательных реакций, сначала реакции карбодиимидного синтеза путем смешения противоопухолевого соединения и алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью, взятых из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент противоопухолевого соединения берут не менее 1.0 мольного эквивалента алкиниловой кислоты, в присутствии активатора карбоксильной группы, взятого из расчета - на 1.0 мольный эквивалент алкиниловой кислоты берут 1.0 эквивалент активатора, в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, с последующим выделением промежуточного продукта путем колоночной хроматографии - противоопухолевого соединения, модифицированного алкинильной кислотой с терминальной тройной связью, а затем реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения промежуточного продукта и компонента, содержащего азидогруппу, в качестве которого используют производное N-ацетилгалактозамина, выбранное из группы, включающей 1-азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-Аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозы, в присутствии соединения одновалентной меди в качестве катализатора, в среде, обеспечивающей протекание реакции циклоприсоединения, при этом на 1.0 мольный эквивалент промежуточного продукта используют по меньшей мере 1.0 эквивалент компонента, содержащего азидогруппу, и по меньшей мере 0.2 эквивалент катализатора, после прохождения реакции осуществляют удаление среды с последующим выделением конечного продукта при помощи колоночной хроматографии.
6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве противоопухолевого соединения используют паклитаксел, или гемцитабин, или цитарабин, или азацитидин, или доксорубицин, или даунорубицин.
7. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью используют проп-2-иновую кислота, бут-3-иновую кислота, пент-4-иновую кислота, гекс-5-иновую кислота, гепт-6-иновую кислоту.
8. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, используют диметилформамид, дихлорметан, хлороформ, тетрогидрофуран, 1,2-дихлорэтан.
9. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве активатора карбоксильной группы используют растворимые в среде, обеспечивающей протекание реакции карбодиимидного синтеза, карбодиимиды.
10. Способ по п. 9, характеризующийся тем, что в качестве карбодиимидов используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N,N'-диизопропилкарбодиимид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид.
11. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что для выделения промежуточного продукта используют прямую колоночную хроматографию в системе с градиентом концентраций СН2С12:МеОН (10:1)→МеОН.
12. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве соединения одновалентной меди используют одновалентные соли меди, растворимые в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения.
13. Способ по п. 12, характеризующийся тем, что в качестве одновалентных солей меди используют иодид меди, или бромид меди, или хлорид меди.
14. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения, используют ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, ДМСО.
15. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что для выделения конечного продукта используют обращенно-фазовую колоночную хроматографию в системе Н2О-MeCN.
16. Способ получения конъюгата по п. 2, характеризующийся тем, что получают лиганд по п. 1 путем проведения реакции [3+2] азид-алкинового циклоприсоединения посредством смешения соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент, и соединения, содержащего азидогруппу, взятых в мольном соотношении 1:1, в присутствии катализатора - соли одновалентной меди, взятой из расчета на 1.0 мольный эквивалент компонента, содержащего азидогруппу, по меньшей мере 0.25 эквивалента катализатора в среде, обеспечивающей протекание реакции, после прохождения реакции удаляют среду и выделяют лиганд при помощи колоночной хроматографии, с последующим проведением реакции карбодиимидного синтеза между полученным лигандом и противоопухолевым соединением с доступной для модификации аминогруппой, взятыми в мольном соотношении 1:1, в присутствии активатора карбоксильной группы, взятого из расчета - на 1.0 мольный эквивалент лиганда берут не менее 1.0 мольного эквивалента активатора карбоксильной группы, в ДМФА, после прохождения реакции удаляют ДМФА и выделяют полученный конъюгат при помощи колоночной хроматографии.
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве среды, обеспечивающей протекание реакции [3+2] азид-алкинового присоединения, используют ДМФА, смесь вода-тетрогидрофуран в объемном соотношении 1:1, ДМСО.
18. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве противоопухолевого соединения с доступной для модификации аминогруппой используют доксорубицин или даунорубицин.
19. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве соединения, содержащего терминальный алкиновый фрагмент, используют алкиниловые кислоты с терминальной тройной связью.
20. Способ по п. 19, характеризующийся тем, что в качестве алкиниловой кислоты с терминальной тройной связью используют проп-2-иновую кислоту, бут-3-иновую кислоту, пент-4-иновую кислоту, гекс-5-иновую кислоту, гепт-6-иновую кислоту.
21. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве соединения, содержащего азидогруппу используют производные N-ацетилгалактозамина: 1-азидо-1-дезокси-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-(2'-азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозу, 1-O-аллил-2-ацетамидо-2-дезокси-6-азидо-6-дезокси-β-D-галактопиранозу.
22. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве солей одновалентной меди используют соли меди, растворимые в среде, обеспечивающей прохождение реакции циклоприсоединения.
23. Способ по п. 22, характеризующийся тем, что в качестве солей меди используют иодид меди, или бромид меди, или хлорид меди.
24. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что для выделения лиганда используют прямую колоночную хроматографию в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (10:1)→МеОН.
25. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что в качестве активатора карбоксильной группы используют растворимые в ДМФА карбодиимиды.
26. Способ по п. 25, характеризующийся тем, что в качестве карбодиимидов используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N,N'-диизопропилкарбодиимид, N,N'-дициклогексилкарбодиимид.
27. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что для выделения конъюгата используют две последовательные колоночные хроматографии: прямую колоночную хроматографию в системе с градиентом концентраций CH2Cl2:МеОН (20:1)→МеОН и обращенно-фазовую колоночную хроматографию в системе H2O-MeCN.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142686A RU2696096C2 (ru) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017142686A RU2696096C2 (ru) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017142686A RU2017142686A (ru) | 2019-06-07 |
| RU2017142686A3 RU2017142686A3 (ru) | 2019-06-07 |
| RU2696096C2 true RU2696096C2 (ru) | 2019-07-31 |
Family
ID=66793148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017142686A RU2696096C2 (ru) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2696096C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816947C2 (ru) * | 2022-04-11 | 2024-04-08 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | КОНЪЮГАТ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ-КоА РЕДУКТАЗЫ С ЛИГАНДОМ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080227710A1 (en) * | 2005-09-20 | 2008-09-18 | Luigi Fiume | Use of Conjugates of Doxorubicin with Lactosaminated Albumin |
| US20130004427A1 (en) * | 2009-12-11 | 2013-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Targeted dendrimer-drug conjugates |
| RU2573994C2 (ru) * | 2010-02-10 | 2016-01-27 | Иммьюноджен, Инк | Антитела против cd20 и их применение |
-
2017
- 2017-12-07 RU RU2017142686A patent/RU2696096C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080227710A1 (en) * | 2005-09-20 | 2008-09-18 | Luigi Fiume | Use of Conjugates of Doxorubicin with Lactosaminated Albumin |
| US20130004427A1 (en) * | 2009-12-11 | 2013-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Targeted dendrimer-drug conjugates |
| RU2573994C2 (ru) * | 2010-02-10 | 2016-01-27 | Иммьюноджен, Инк | Антитела против cd20 и их применение |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MONESTIER M. et al. ASGPR-Mediated Uptake of Multivalent Glycoconjugates for Drug Delivery in Hepatocytes. Chembiochem. 2016 Apr 1; 17(7): 590-4. doi: 10.1002/cbic.201600023. Epub 2016 Mar 2. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816947C2 (ru) * | 2022-04-11 | 2024-04-08 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) | КОНЪЮГАТ ИНГИБИТОРА 3-ГИДРОКСИ-3-МЕТИЛГЛУТАРИЛ-КоА РЕДУКТАЗЫ С ЛИГАНДОМ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА |
| RU2853934C1 (ru) * | 2023-06-29 | 2025-12-26 | СиКьюэ Тайвань Ко., Лтд. | Конъюгат лекарственного средства, фармацевтическая композиция и способ лечения гепатита |
| US12508320B2 (en) | 2024-05-30 | 2025-12-30 | SeeCure Taiwan Co., Ltd. | Drug conjugate, pharmaceutical composition and method of treating hepatitis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017142686A (ru) | 2019-06-07 |
| RU2017142686A3 (ru) | 2019-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11850286B2 (en) | Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation | |
| CN115175894A (zh) | 纳米材料 | |
| EP1619210A1 (en) | DDS compounds and method for assaying the same | |
| CN114555610A (zh) | 硼酸酯前药及其用途 | |
| CA3198788A1 (en) | Camptothecine antibody-drug conjugates and methods of use thereof | |
| IL106023A (en) | Polymer-bound paclitaxel derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions containing them | |
| AU2009238298A1 (en) | Compounds and methods for inhibiting selectin-mediated function | |
| Petrov et al. | Synthesis and biological evaluation of novel mono-and bivalent ASGP-R-targeted drug-conjugates | |
| Tai et al. | A novel rapamycin-polymer conjugate based on a new poly (ethylene glycol) multiblock copolymer | |
| Honcharenko et al. | New alkyne and amine linkers for versatile multiple conjugation of oligonucleotides | |
| US8637468B2 (en) | Synthetic cholesterylamine-linker derivatives for agent delivery into cells | |
| JP5019524B2 (ja) | 新規ポリ（メタ）アクリレート共重合体ならびに小胞体及びゴルジ体への送達方法 | |
| JP2021515765A (ja) | 放出可能な抗体コンジュゲート | |
| RU2696096C2 (ru) | Низкомолекулярные конъюгаты противоопухолевых агентов и высокоселективных лигандов асиалогликопротеинового рецептора для терапии онкологических патологий печени | |
| EP2420518A1 (en) | Polycationic amphiphilic cyclooligosaccharides and the use thereof as molecular transporters | |
| WO2019013707A1 (en) | MIMETALS OF GLYCOSAMINOGLYCAN PENETRATING CELLS | |
| CA3203849A1 (en) | Dual-cleavage ester linkers for antibody-drug conjugates | |
| EP3378495B1 (en) | Composition comprising novel glutamic acid derivative and block copolymer, and use thereof | |
| EP2405944B1 (en) | Prodrugs | |
| US12285437B2 (en) | Reversing the undesirable pH-profile of doxorubicin via activation of a disubstituted maleamic acid prodrug at tumor acidity | |
| Greco et al. | Mono-and dialdehyde of trehalose: new synthons to prepare trehalose bio-conjugates | |
| JP2025513000A (ja) | 標的療法に用いるコンジュゲート | |
| HK40082129A (en) | Nanomaterial | |
| HK40082129B (zh) | 纳米材料 | |
| HK40074614A (en) | Boronic ester prodrugs and uses thereof |